ES2642879T3

ES2642879T3 - Flavivirus asociados a la enfermedad de Theiler

Info

Publication number: ES2642879T3
Application number: ES13789453.1T
Authority: ES
Inventors: Sanjay CHANDRIANI; Peter Skewes-Cox; Thomas Divers; Bud TENNANT; Amy Kistler
Original assignee: Novartis Tiergesundheit AG; Cornell University
Current assignee: Elanco Tiergesundheit AG; Cornell University
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2017-11-20
Anticipated expiration: 2033-10-31
Also published as: EP2914618A1; WO2014070975A1; EP2914618B1; US20150292042A1; US9809863B2

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO.: 1 o 2.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

cultivadas y/u otras muestras de cultivo (por ejemplo, que contienen virus) también pueden ser fuentes adecuadas de los ácidos nucleicos de molde. Además, virus, bacteriófagos, bacterias, hongos y otros microorganismos pueden ser la fuente del ácido nucleico para su análisis. El ADN puede ser genómico o puede estar clonado en plásmidos, bacteriófagos, cromosomas bacterianos artificiales (BAC), cromosomas de levadura artificiales (YAC) u otros vectores. El ARN puede aislarse directamente a partir de las células pertinentes o puede ser producido mediante un cebado in vitro a partir de un promotor de ARN adecuado o mediante una transcripción in vitro. También pueden ser adecuadas otras fuentes, como comprendería el experto habitual en la materia.

Las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes a y/o derivadas del y/o que codifican el TDAV y/o un antígeno (o un inmunógeno) del mismo también pueden estar contenidas en un vector (por ejemplo, un vector recombinante) tal como uno o más de vectores no víricos y/o víricos. Dicho vector puede ser utilizado para la administración de dichas moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, a una célula in vitro o in vivo). Cuando dichos vectores se usan para inducir y/o para potenciar una respuesta inmunitaria, el vector también puede codificar otras proteínas (por ejemplo, moléculas coestimulantes, citocinas o quimiocinas) y/o combinarse con otros factores (por ejemplo, citocinas exógenas) (Xiang et al., Immunity, 2: 129-135, 1995; Kim et al., Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103, 1998; Iwasaki et al., J. Immunol. 158: 4591-3601,1997; Sheerlinck et al., Vaccine, 19: 2647-2656, 2001). También pueden utilizarse otras estrategias para mejorar la eficacia de dichos sistemas de administración, que incluyen, por ejemplo, el uso de replicones víricos autorreplicantes (Caley et al., Vaccine, 17: 3124-2135, 1999; Dubensky et al., Mol. Med.

6:: 723-732, 2000; Leitner et al., Cancer Res. 60: 51-55, 2000), optimización de codones (Liu et al., Mol. Ther., 1: 497-500, 2000; Dubensky, supra; Huang, et al., J. Virol. 75: 4947-4951,2001), electroporación in vivo (Widera et al.,

J.: Immunol. 164: 4635-3640, 2000), incorporación de motivos estimulantes tales como CpG (Gurunathan, supra; Leitner, supra), secuencias para el direccionamiento a las rutas endocíticas o de procesado de la ubiquitina (Thomson et al., J. Virol. 72: 2246-2252, 1998; Velders et al., J. Immunol. 166: 5366-5373, 2001), regímenes de sensibilización y refuerzo (Gurunathan supra; Sullivan et al., Nature 408: 605-609, 2000; Hanke et al., Vaccine, 16: 439-445, 1998; Amara et al., Science 292: 69-74, 2001), sitios de escisión sensibles al proteasoma y el uso de una administración en las mucosas. Algunos vectores "no víricos" pueden incluir, por ejemplo, vectores de plásmidos (por ejemplo, compatibles con células hospedadoras bacterianas, de insecto y/o de mamífero). Algunos ejemplos de vectores pueden incluir, por ejemplo, PCR-ii, PCR3 y pADNc3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSii (Stratagene La Jolla, CA), pet15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFp-n2 (Clontech, Palo Alto, CA), pET1 (Bluebacii, Invitrogen), pDSR-alfa (publicación PCT nº WO 90/14363) y pFASTBACdual (Gibco-BRL, Grand island, NY) así como derivados del plásmido Bluescript® (un elevado número de copias del fagémido basado en COLel, Stratagene Cloning Systems La Jolla, CA), plásmidos de clonación de PCR diseñados para la clonación de los productos de la PCR amplificados mediante la TAQ (por ejemplo, el kit de clonación TOPO™ TA®, derivados del plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA). También pueden usarse vectores bacterianos, que incluyen, por ejemplo, Shigella, Salmonella (por ejemplo, por una administración a las mucosas), Vibrio cholerae Lactobacillus, Bacille Calmette Guerin (BCG) y Streptococcus (véase, por ejemplo, el documento WO 88/6626; el documento WO 90/0594; el documento WO 91/13157; el documento WO 92/1796; y el documento WO 92/21376). Los vectores pueden construirse usando las técnicas recombinantes habituales ampliamente disponibles para el experto en la materia. En la materia se conocen y pueden usarse otros muchos vectores de expresión y sistemas de plásmidos no víricos. Varios sectores víricos que han sido utilizados con éxito para la introducción de un ácido nucleico en un hospedador incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus herpes y poxvirus, entre otros. Los vectores víricos pueden construirse usando las técnicas recombinantes habituales ampliamente disponibles para el experto en la materia.

También pueden ser suficientes otras técnicas de administración, que incluyen, por ejemplo, complejos de ADNligando, complejos de adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación con CaPO4, técnicas de cañón de genes, electroporación y sistemas de dispersión coloidales. Algunos sistemas de dispersión coloidales incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido es un liposoma, que son vesículas artificiales con membrana útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos en el interior acuoso y ser administrados a las células en una forma biológicamente activa (Fraley, R. et al. Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). La composición del liposoma es habitualmente una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos con una elevada temperatura de transición de fase, habitualmente junto con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Algunos ejemplos de lípidos útiles en liposomas incluyen, por ejemplo, compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, en los que la fracción lipídica contiene entre 14-18 átomos de carbono, particularmente entre 16-18 átomos de carbono, y está saturada. Algunos fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

Como comprenderían los expertos habituales en la materia, los procedimientos para la preparación y el uso de dichos vectores no víricos, vectores víricos y variaciones de los mismos, están disponibles en la materia. Por ejemplo, pueden encontrarse algunas técnicas útiles en referencias de biología molecular habituales tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Gene

5

10

15

20

25

30

Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990. Academic Press, San Diego, CA), por ejemplo.

Los polipéptidos del TDAV descritos en el presente documento pueden ser los mismos o similares a los específicos del TDAV (por ejemplo, la SEQ ID NO.: 3), y pueden contener y/o estar modificados para que contengan sustituciones que pueden considerarse, por ejemplo, conservativas o no conservativas. Una sustitución conservativa puede ser, por ejemplo, la sustitución de un tipo de resto de aminoácido por un tipo de resto de un aminoácido similar. Una sustitución no conservativa puede ser, por ejemplo, la sustitución de un tipo de resto de aminoácido por un tipo de resto de un aminoácido diferente. Los aminoácidos pueden ser similares entre sí, por ejemplo, si se basan en el tamaño, la hidrofobicidad, la polaridad, la alifaticidad (o no), la aromaticidad (o la ausencia de la misma), la carga (positiva o negativa) u otros atributos. Algunos ejemplos no limitantes y preferidos de sustituciones se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1. Sustituciones de aminoácidos

Restos originales: Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferidas

Ala: Val, Leu, He Val

Arg: Lys, Gln, Asn, His Lys

Asn: Gln Gln

Asp: Glu Glu

Cys: Ser, Ala Ser

Gln: Asn Asn

Glu: Asp Asp

Gly: Pro, Ala Ala

His: Asn, Gln, Lys, Arg Arg

He: Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu: Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe He

Lys: Arg, 1,4 Ácido diaminobutírico, Gln, Asn Arg

Met: Leu, Phe, Ile Leu

Phe: Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro: Ala Gly

Ser: Thr, Ala, Cys Thr

Thr: Ser Ser

Trp: Tyr, Phe Tyr

Tyr: Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val: Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

También se desvela una célula cultivada que comprende moléculas de ácidos nucleicos correspondientes al y/o derivadas del y/o que codifican el TDAV y/o un antígeno (o un inmunógeno) del mismo. La célula cultivada puede ser transfectada y/o infectada por un vector o por la descendencia del mismo, de forma que puede expresar un polipéptido (por ejemplo, un antígeno). Las líneas celulares adecuadas son conocidas por los expertos en la materia y están disponibles en el mercado, por ejemplo, a través de colecciones de cultivo celular establecidas. Dichas células pueden usarse después para la producción de partículas víricas, de polipéptidos, de reactivos para la detección y/o el aislamiento del TDAV, o para otros usos. Un ejemplo de procedimiento puede comprender el cultivo de una célula que comprende la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, opcionalmente bajo el control de una secuencia de expresión) en unas condiciones que permitan la producción de partículas víricas o la expresión de un polipéptido. La partícula vírica, el polipéptido y/u otro reactivo puede aislarse después a partir de la célula o del medio de cultivo celular usando técnicas convencionales.

También se desvelan preparaciones y/o composiciones que comprenden ácidos nucleicos del TDAV (por ejemplo, contenidos en un vector), polipéptidos y/o péptidos correspondientes al mismo. Por ejemplo, una preparación o una composición puede comprender, por ejemplo, un ácido nucleico, un polipéptido y/o un péptido del TDAV en forma de una preparación o una composición parcialmente purificada (por ejemplo, con una pureza de aproximadamente cualquiera del 50 %, el 60 %, el 75 %, el 90 %, el 95 % (por ejemplo, p/p)) o purificada (por ejemplo, de aproximadamente el 98-100 % (p/p)). Normalmente, dichas preparaciones incluyen un tampón tal como solución salina tamponada con fosfato o con tris (PBS o TBS, respectivamente). Las preparaciones también pueden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

formularse para que contengan excipientes, como estabilizantes, por ejemplo.

En algunas realizaciones se proporcionan procedimientos para la detección de las células que comprenden partículas víricas del TDAV y/o antígenos del mismo usando los oligonucleótidos o los cebadores de la invención. En ciertas realizaciones, las células que expresan el (los) antígeno(s) del TDAV en la superficie de la célula de un animal (por ejemplo, un caballo) pueden ser detectadas poniendo en contacto una muestra biológica de prueba con un oligonucleótido y detectando el mismo unido a las células (por ejemplo, usando una citometría de flujo). En ciertas realizaciones, el procedimiento puede comprender la comparación entre la cantidad de unión de la muestra biológica de prueba o los componentes de la misma y la cantidad de unión de una muestra biológica de control o los componentes de la misma, en la que un aumento en la unión a la muestra biológica de prueba o los componentes de la misma con respecto a la muestra biológica de control o los componentes de la misma, indica la presencia de una célula de linfoma en la muestra biológica de prueba. En algunas realizaciones, la muestra biológica es sangre equina. Dichos procedimientos también se proporcionan en un formato in vivo y/o in vitro.

Para ayudar al artesano experto en el uso de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, los mismos pueden proporcionarse en un formato de kit. En el presente documento también se proporciona un kit que incluye dichos ácidos nucleicos y opcionalmente otros componentes necesarios para el uso de los mismos para la detección del TDAV en una muestra biológica (por ejemplo, una célula o un fluido). Los ácidos nucleicos del kit pueden proporcionarse en cualquier forma adecuada, incluyendo congelados, liofilizados o en un tampón farmacéuticamente aceptable tal como TBS o PBS.

Como se ha descrito anteriormente, esta divulgación se refiere a la SEQ ID NO.: 1, 2 o 3. Esta divulgación se refiere, por ejemplo, a una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende la SEQ ID NO.: 1 o 2; una secuencia de ácidos nucleicos aislada que tiene una identidad de al menos el 90 % con la SEQ ID NO.: 1 o 2 una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica la SEQ ID NO.: 3; una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 90 % con la SEQ ID NO.: 3; un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.: 3; un polipéptido que tiene una identidad o similitud de al menos el 90 % con la SEQ ID NO.: 3; un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos hibridable en unas condiciones alta o moderadamente rigurosas con la SEQ ID NO.: 1 o 2; un oligonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO.: 1, la SEQ ID NO.: 2, la SEQ ID NO.: 3, la SEQ ID NO.: 4, la SEQ ID NO.: 5, la SEQ ID NO.: 6, la SEQ ID NO.: 7, la SEQ ID NO.: 8, la SEQ ID NO.: 9, la SEQ ID NO.: 10, la SEQ ID NO.: 11, la SEQ ID NO.: 12, la SEQ ID NO.: 13, la SEQ ID NO.: 14, la SEQ ID NO.: 15, la SEQ ID NO.: 16, la SEQ ID NO.: 17, la SEQ ID NO.: 18 y la SEQ ID NO.: 19; dos o más oligonucleótidos para la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos de un virus (por ejemplo, el TDAV), comprendiendo cada oligonucleótido una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente a al menos una porción de al menos 20 o más nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO.: 1 o 2, complementaria de una porción de al menos 20 o más nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO.: 1 o 2, o complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una porción de al menos 20 o más aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO.: 3, que comprende opcionalmente uno o más marcadores detectables; un par de cebadores seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS.: 4 y 5; las SEQ ID NOS.: 6 y 7; las SEQ ID NOS.: 8 y 9; las SEQ ID NOS.: 10 y 11; las SEQ ID NOS.: 12 y 13; las SEQ ID NOS.: 14 y 15; las SEQ ID NOS.: 16 y 17; y las SEQ ID NOS.: 18 y 19, que opcionalmente comprende uno o más marcadores detectables; procedimientos para la detección y/o la identificación y/o la cuantificación de un virus (por ejemplo, el TDAV) en una muestra (por ejemplo, en una muestra biológica tal como suero), que comprende la amplificación a partir de la muestra de un ácido nucleico correspondiente al TDAV; un kit para la detección de un ácido nucleico de un virus en una muestra, comprendiendo el kit un oligonucleótido, oligonucleótidos y/o un par de cebadores para la detección y/o la identificación y/o la cuantificación del TDAV, comprendiendo opcionalmente adicionalmente el kit un soporte sólido y/o uno o más reactivos de amplificación; un procedimiento de producción de una molécula de ácido nucleico, de un péptido y/o de un polipéptido correspondiente al TDAV, comprendiendo el procedimiento la transfección de una célula hospedadora con un vector de expresión que codifica el péptido o el polipéptido, el cultivo de la célula hospedadora de forma que se exprese la molécula del ácido nucleico, el péptido y/o el polipéptido, y el aislamiento del péptido o del polipéptido. Esta divulgación también proporciona otras realizaciones, como reconocería el experto habitual en la materia.

Cualquier indicación de que una característica es opcional pretende proporcionar un apoyo adecuado a las reivindicaciones que incluyen un lenguaje cerrado o exclusivo o negativo con referencia a la característica opcional. El lenguaje exclusivo excluye específicamente la característica indicada en particular para que no incluya ningún asunto en cuestión adicional. Por ejemplo, si se indica que A puede ser el fármaco X, dicho lenguaje pretende proporcionar apoyo para una reivindicación que especifica explícitamente que A consiste únicamente en X, o que A no incluye ningún otro fármaco aparte de X. Un lenguaje "negativo" excluye explícitamente la propia característica opcional del ámbito de las reivindicaciones. Por ejemplo, si se indica que el elemento A puede incluir X, dicho lenguaje pretende proporcionar apoyo a una reivindicación que explícitamente especifica que A no incluye X. Algunos ejemplos no limitantes de términos exclusivos o negativos incluyen "solo”, "únicamente”, "que consiste en”, "que consiste esencialmente en", "solo”, "sin", "en ausencia de (por ejemplo, otros elementos del mismo tipo, estructura y/o función)" "excluyendo”, "no incluyendo", "no", "no puede”, o cualquier combinación y/o variación de dicho lenguaje.

En los siguientes ejemplos se describen adicionalmente algunas realizaciones. Estas realizaciones se proporcionan únicamente como ejemplos y no pretenden limitar el ámbito de las reivindicaciones en modo alguno.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplos

A continuación se describen los procedimientos utilizados para el aislamiento del genoma de un nuevo virus denominado "virus asociado a la enfermedad de Theiler" (TDAV). El genoma se presenta como la SEQ ID NO: 1; la secuencia de aminoácidos codificante se presenta como la SEQ ID NO.: 2; y la secuencia de aminoácidos se presenta como la SEQ ID NO.: 3.

A. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

1. Extracción del ARN

Los sueros recogidos de los caballos se almacenaron a -80 ºC. El ARN se extrajo a partir de alícuotas de 300 μl de los sueros almacenados usando el reactivo TRIzol LS (Life Technologies) como tal, según el protocolo del fabricante. En resumen, se añadieron 900 μl de TRIzol LS a 300 μl de los sueros; el tubo se agitó a mano; la muestra homogeneizada se incubó durante 5 minutos (min) a la temperatura ambiente; se añadieron 0,24 ml de cloroformo y se agitaron vigorosamente; la muestra se centrifugó a 12.000 x g durante 15 min a 4 ºC; se conservó la parte superior de la fase acuosa; se añadieron 15 μg de GlycoBlue (Life Technologies); se añadieron 600 μl de 2propanol; la muestra se incubó a la temperatura ambiente durante 10 min; la muestra se centrifugó a 12.000 x g durante 10 min a 4 ºC; el sobrenadante se desechó; el sedimento de ARN se lavó con etanol al 75 %; el sedimento se secó y el ARN se disolvió en 20 μl de agua. Las muestras de ARN extraídas se sometieron a un tratamiento con Turbo DNA-free (Life Technologies) como tal, según el protocolo del fabricante con una modificación (incluye inhibidor de la RNasa). En resumen, se añadió una mezcla 2,9 μl de tampón Turbo DNase, 5 μl de H20 y 0,25 μl de inhibidor de la RNasa (Life Technologies) a una muestra de 20 μl de ARN; se añadió 1 μl de Turbo DNase; la muestra se incubó a 37 ºC durante 20 min; se añadieron 3 μl de reactivo de inactivación de DNasa; la muestra se incubó a la temperatura ambiente durante 5 min; la muestra se centrifugó a 10.000 x g durante 1,5 min a la temperatura ambiente; se conservaron 21,5 μl del sobrenadante para un análisis adicional.

2. Preparación y secuenciación de la genoteca

En resumen, se usaron 4 μl de ARN tratado con DNasa como molde para la transcripción inversa en las siguientes condiciones: se mezcló cebador 3Sol_N (concentración final, 8 uM) con ARN y se desnaturalizó a 65 ºC durante 5 min antes de su incubación en hielo durante 5 min. Se añadieron los reactivos transcriptasa inversa Superscript III (10 U/ul) (Life Technologies), tampón Superscript III (1x), MgCl2 (5 mM), DTT (10 mM), dNTP (500 μM) y RNaseOUT (0,4 U/μl), y la muestra se incubó a 42 ºC durante 60 min seguido de 94 ºC durante 4 min. Para la síntesis de la segunda hebra se añadieron 5 μl de una mezcla de tampón Sequenase (0,33x) y Sequenase 2.0 (0,13 U/μl). La temperatura de la reacción se aumentó desde 4 ºC hasta 37 ºC durante 8 min, después se mantuvo a 37 ºC durante 8 min. En una etapa inicial de la PCR, se amplificaron 5 μl de este ADNc con polimerasa de ADN Klentaq LA (0,1 U/μl) (Sigma) en tampón Klentaq (1x), dNTP (200 μM) y cebador 3_Sol (2 mM), y se llevó a cabo la PCR en las siguientes condiciones de ciclación: a 94 ºC durante 3 min, 25 ciclos [a 94 ºC durante 30 segundos (s), a 40 ºC durante 1 min, a 68 ºC durante 1 min], a 68 ºC durante 7 min. Una PCR final con 4 cebadores usó 10 ng de la reacción inicial de PCR como molde con tampón Klentaq (1x), dNTP (200 μM), cebador SolM1 (10 nM), SolM2_barcode (10 nM), dos oligos elaborados con la modificación CleanAmp Precision™ (TriLink BioTechnologies), 5SolM1_18** (200 nM), 5SolM2_19** (200 nM) y polimerasa de ADN Klentaq LA (0,1 U/μl). Se usaron las siguientes condiciones de ciclación para esta etapa de la PCR: a 94 ºC durante 1 min, después dos ciclos [a 94 ºC durante 30 s, a 40 ºC durante 30 s, a 68 ºC durante 1 min], a 94 ºC durante 10 min, siete ciclos [a 94 ºC durante 30 s, a 58 ºC durante 30 s, a 68 ºC durante 1 min] y a 72 ºC durante 5 min. Las genotecas de secuenciación resultantes se purificaron usando DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) según el protocolo del fabricante y eluyendo con 20 μl de H2O. Se seleccionaron por tamaño diez microlitros de las genotecas purificadas (de 423 pb +/7 %) usando LabChip XT (kit de ensayo DNA 750, Caliper/Perkin Elmer) y se purificaron adicionalmente mediante una columna Zymo. Las concentraciones individuales de las genotecas se determinaron mediante una qPCR usando una genoteca de control PhiX (Illumina) con los cebadores 1.1 y 2.1 y Fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies), según el protocolo del fabricante. Después las genotecas se agruparon en concentraciones equimolares y se volvieron a cuantificar antes de la secuenciación. Se llevó a cabo una secuenciación de extremos apareados (100 ciclos para cada extremo apareado) en el HiSeq2000 (Illumina) con los reactivos de generación agregados v3 y los reactivos SBS, según las instrucciones del fabricante.

3. Secuenciación con Illumina

Se llevó a cabo una secuenciación de extremos apareados (100 ciclos para cada extremo apareado) mediante la generación en primer lugar de agregados en una celda de flujo (FC) del cBot según se describe en la "Guía del usuario del cBot" (Parte #: 15006165 Rev. G, Illumina); la FC agregada se sometió a una secuenciación de extremos apareados en el HiSeq200 según se describe en la "Guía del usuario del HiSeq 2000" (Parte #: 15011190 Rev. K, Illumina).

4. Análisis de la secuenciación

Los datos de la secuencia inicial FASTQ fueron categorizados mediante el índice de secuenciación para cada una de las tres muestras. Se eliminaron los pares de lectura de secuencia para los que una de las lecturas tenía 10 o

5

10

15

20

25

30

35

más bases no solicitadas (Ns). Las lecturas de baja complejidad se identificaron mediante el análisis del tamaño de la cadena de secuencia Lempel-Ziv-Welch comprimida después de eliminar las Ns de la cadena para evitar aumentos artificiales en la complejidad. Los pares de lectura de secuencia para los que una de las lecturas tenía un tamaño comprimido por debajo de 37 se eliminaron. Las restantes lecturas de secuencia fueron alineadas con el genoma de caballo (EquCab2.0, GCF 000002305.2) (33) mediante un BLAST de nucleótidos (blastn) con el tamaño de palabra y el valor E por defecto (11 y 10, respectivamente). Los pares de lectura de secuencia para los que una de las lecturas tenía al menos 80/100 nucleótidos (80 % de la identidad de lectura total) que se cartografiaban de forma idéntica al genoma del caballo se consideraron derivados del hospedador y se eliminaron del análisis secuencia abajo. Las lecturas de secuenciación restantes se alinearon mediante blastn como BLAST traducido (blastx) con todos los genomas víricos y secuencias de proteínas de RefSeq (marzo de 2012), respectivamente, con el tamaño de palabra (11 para blastn, 3 para blastx) y el valor E (10 tanto para blastn como para blastx) por defecto. Las secuencias que se emparejaban con la base de datos vírica se aislaron y se consideraron candidatas. Para confirmar el origen vírico en un contexto no sesgado, se alinearon las secuencias víricas candidatas con la base de datos de nucleótidos no redundante (NT; abril de 2012) mediante blastn usando los parámetros por defecto. Las lecturas víricas candidatas que no tenían una alineación con los NT se alinearon con la base de datos de proteínas no redundante (NR; abril de 2012) mediante blastx usando los parámetros por defecto. Las lecturas víricas candidatas cuyas alineaciones de mayor puntuación se cartografiaban únicamente con los genomas víricos se consideraron de origen vírico.

5. Ensamblaje del genoma

Todas las lecturas que se cartografiaban con la familia Flaviviridae de cada una de las tres muestras fueron consolidadas en archivos FASTA que representan el punto de partida para los ensamblajes del genoma. Estas lecturas se usaron como siembra para el ensamblaje metatranscriptómico dirigido usando una versión alfa (v0.16.2) del programa informático ensamblador Paired-Read Iterative Contig Extension (PRICE) (http://derisilab.ucsf.edu/software/price/index.html). El PRICE usa la información de los extremos apareados para generar ensamblajes locales que extienden los cóntigos existentes; en este caso, los cóntigos iniciales eran lecturas con unos emparejamientos de blastx con la familia Flaviviridae, y los cóntigos fueron extendidos repetidamente a lo largo de tantos ciclos como fuera posible. En algunos casos, si se detenía un ensamblaje, los datos de la secuencia no filtrados eran cartografiados con el ensamblaje existente, y las lecturas con un elevado porcentaje de identidad eran desechadas en un esfuerzo por recoger siembras de una calidad más alta para un ensamblaje adicional.

6. Análisis filogenético

Todas las secuencias de poliproteínas de Flaviviridae de la RefSeq, además de las secuencias de poliproteínas de los recientemente descubiertos hepacivirus no primates (NPHV) (Fig. 4 A-N; Tabla 2), fueron alineadas con la secuencia de poliproteínas del TDAV usando MUSCLE. La alineación de secuencia múltiple fue importada en MEGA5, y se construyó un árbol filogenético de Neighbor-Joining con 100 réplicas de muestreo con reposición y se consideró un árbol de radiación (Fig. 3).

Tabla 2. GIs de las secuencias de Flaviviridae referenciadas

Nombre del virus: GI Marcador Nombre del virus GI Marcador

Flavivirus Aedes: 254688377 37 Virus Kamiti River 33620714 38

Virus Alkhurma: 24432114 30 Virus Karshi 62326810 28

Virus Apoi: 20178607 27 Virus Kedougou 226377836 13

Virus Bagaza: 226377838 7 Virus Kokobera 126010839 11

Virus de la enfermedad de Border: 20198946 41 Virus Langat 20260782 31

Virus de la diarrea vírica bovina 1: 9626650 45 Virus Louping ill 9629457 33

Virus de la diarrea vírica bovina 2: 9629507 46 Virus Modoc 20177456 26

Virus de la diarrea vírica bovina 3: 240114605 44 Virus de la leucoencefalitis de Montana myotis 22550316 24

Virus Bussuquara: 126010843 10 Virus de la encefalitis de Murray Valley 9633623 2

Hepacivirus canino: 330722930 64 Nphv#1 (afj20709.1 ) 386686662 60

Agente vírico de fusión celular: 9627243 39 Nphv #2 (afj20708.1) 386686660 61

Virus de la fiebre porcina clásica: 12657942 42 Nphv #3 (afj20707.1) 386686657 58

Flavivirus Culex: 166159178 35 Nphv #4 (afj20706.1) 386686655 62

Virus del Dengue 1: 9626686 17 Nphv #5 (afj20705.1) 386686653 63

Virus del Dengue 2: 159024209 15 Nphv #6 (afj20704.1) 386686651 59

5

10

15

20

25

30

(continuación)

Nombre del virus: GI Marcador Nombre del virus GI Marcador

Virus del Dengue 3: 163644369 16 Nphv #7 (afj20703.1) 386686649 65

Virus del Dengue 4: 12084823 14 Virus de la fiebre hemorrágica Omsk 33589254 32

Virus Donggang: 380877199 18 Pestivirus de jirafa 1 20178633 43

Flavivirus Duck TA: 379764914 9 Virus Powassan 20260780 29

virus Entebbe bat: 119952255 20 Virus Quang Binh 229904920 36

Virus asociado a la enfermedad de Theiler: [TBD] 47 Virus de Rio Bravo 20178609 25

Virus GB A: 9629719 49 Virus Sepik 119952253 23

Virus GB B: 9628102 51 Virus de la encefalitis de san Luis 123205972 5

Virus GB C: 9628706 50 Virus Tamana bat 21397175 40

Virus GB D: 300431402 48 Virus Tembusu 340034687 8

Virus de la Hepatitis C gt1: 22129793 53 Virus de la encefalitis transmitida por garrapatas 9628432 34

Virus de la Hepatitis C gt2: 157781213 57 Virus Usutu 56692442 1

Virus de la Hepatitis C gt3: 157781217 56 Virus Wesselsbron 238801615 22

Virus de la Hepatitis C gt4: 157781209 54 Virus del Nilo occidental 158516888 4

Virus de la Hepatitis C gt5: 157781211 55 Virus de la fiebre amarilla 9627245 21

Virus de la Hepatitis C gt6: 157781215 52 Virus Yokose 33112011 19

Virus Ilheus: 126010841 6 Virus Zika 226377834 12

Virus de la encefalitis japonesa: 9626461 3

7. Recuperación física y validación de la secuencia del TDAV

El ensamblaje del genoma del TDAV fue validado mediante la recuperación y la secuenciación de diez amplicones solapantes de la RT-PCR que abarcan las posiciones 57-10127 (véase a continuación). La recuperación con éxito de cada amplicón requirió la optimización de las condiciones de la RT y de la PCR. Se usaron dos metodologías de transcripción inversa (RT) diferentes junto con 4 condiciones diferentes de la PCR para recuperar los 10 clones solapantes del TDAV mostrados en la Fig. 2D. Los amplicones para cada par de cebadores se clonaron en el vector TOPO T/A pCR4.0 (Life Technologies) y se secuenciaron las hebras directa e inversa de al menos tres clones independientes (Elim Biopharma). A continuación se describió un resumen de las coordenadas del TDAV para cada uno de los 10 amplicones, sus correspondientes condiciones de transcripción inversa, las condiciones de la PCR y los pares de cebadores de la PCR que produjeron los productos específicos. Para la transcripción inversa se usó el sistema de síntesis SuperScript III First-Stry (Life Technologies) según el protocolo del fabricante para hexámeros aleatorios (condición de la RT 1) o cebadores específicos de gen (condición de la RT 2) con un grupo de los siguientes cebadores: EVT-151, -155, -157, -163, -171, -175, -177, -183, -187 y -189 (Tabla 3). Para las condiciones de las PCR 1-3, se ciclaron una mezcla de reacción de PCR de polimerasa Klentaq LA (molde de ADNc, cebadores de PCR 200 nM, dNTP 200 μM, 0,1 U/μl de polimerasa de ADN Klentaq LA (Sigma-Aldrich) en 1X de tampón Klentaq) en las siguientes 3 condiciones diferentes: (1) a 94 ºC durante 60 s, 32 ciclos de 94 ºC durante 30 s, a 55 ºC durante 30 s, a 68 ºC durante 1 min 45 s, seguido de 68 ºC durante 7 min; (2) a 94 ºC durante 60 s, 32 ciclos de 94 ºC durante 30 s, a 59,5 ºC durante 30 s, a 68 ºC durante 1 min 45 s, seguido de 68 ºC durante 7 min; o (3) a 94 ºC durante 60 s, después 1 ciclo de 94 ºC durante 30 s, a 65 ºC durante 30 s, y a 68 ºC durante 1 min 45 s, seguido de 9 ciclos adicionales con una disminución de 1 ºC en la temperatura de hibridación, después 25 ciclos de 94 ºC durante 30 s, a 55 ºC durante 30 s, a 68 ºC durante 1 min 45 s, después a 68 ºC durante 7 min. Para la condición de la PCR 4, se ciclaron una mezcla de reacción de PCR de polimerasa de ADN Phusion (molde de ADNc, cebadores de la PCR 500 nM, dNTP 200 uM y 0,1 U/ul de polimerasa de ADN Phusion (New England Biolabs) en 1X de tampón Phusion HF complementado con DMSO al 3 %) en las siguientes condiciones: a 94 ºC durante 60 s, después 1 ciclo de 94 ºC durante 30 s, a 65 ºC durante 30 s, y a 68 ºC durante 1 min 45 s, seguido de 9 ciclos adicionales con una disminución de 1 ºC en la temperatura de hibridación, después 25 ciclos de 94 ºC durante 30 s, a 55 ºC durante 30 s, 68 ºC durante 1 min 45 s, seguido de 68 ºC durante 7 min (Tabla 4). Finalmente, una de las dos condiciones de RT y una de las cuatro condiciones de PCR produjo un amplicón específico para cada par de cebadores que fue TOPO-clonado según el protocolo del fabricante (Life Technologies, San Diego, CA). Se secuenciaron al menos tres insertos clonados TOPO independientes por parte Elim Biopharma (Hayward, CA).

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

tratar negativo para el TDAV (Granja A), un caballo asintomático positivo para el TDAV (Granja A) y un caballo negativo para el TDAV sin ningún antecedente de tratamiento con la antitoxina (Granja B) (Tabla 7). Por supuesto, esto no excluye un papel del NPHV en la enfermedad hepática (o extrahepática) en otros escenarios epidemiológicos.

Tabla 7. Cribado del NPHV mediante una qPCR *

Caballo ID •: Ct promedio (D.T.)  Solicitud de NPHV

A1: Indeterminado Negativo

A2: Indeterminado Negativo

A3: Indeterminado Negativo

A4: Indeterminado Negativo

A5: Indeterminado Negativo

A6: Indeterminado Negativo

A7: Indeterminado Negativo

A8: Indeterminado Negativo

A9: Indeterminado Negativo

A10: Indeterminado Negativo

A11: 34,122558 (0,269914587) Positivo

A12: Indeterminado Negativo

A13: indeterminado Negativo

A14: indeterminado Negativo

A15: 28,177337 (0,221504356) Positivo

A16: indeterminado Negativo

A17: indeterminado Negativo

A18: indeterminado Negativo

A19: indeterminado Negativo

A20: indeterminado Negativo

A21: indeterminado Negativo

A22: indeterminado Negativo

A23: indeterminado Negativo

A24: indeterminado Negativo

A25: indeterminado Negativo

A26: indeterminado Negativo

A27: indeterminado Negativo

A28: indeterminado Negativo

A29: indeterminado Negativo

A30: indeterminado Negativo

A31: indeterminado Negativo

A32: indeterminado Negativo

A33: indeterminado Negativo

A34: indeterminado Negativo

A35: indeterminado Negativo

A36: indeterminado Negativo

A37: indeterminado Negativo

B1: indeterminado Negativo

B2: indeterminado Negativo

B3: indeterminado Negativo

B4: indeterminado Negativo

B5: indeterminado Negativo

B6: indeterminado Negativo

B7: indeterminado Negativo

B8: indeterminado Negativo

B9: indeterminado Negativo

B10: indeterminado Negativo

B11: indeterminado Negativo

B12: indeterminado Negativo

B13: 33,9393255 (0,791101946) Positivo

B14: indeterminado Negativo

B15: indeterminado Negativo

B16: indeterminado Negativo

B17: indeterminado Negativo

B18: indeterminado Negativo

imagen22

Claims

imagen1