JP2003523188A - Ａｉｄｓ先祖ウイルスおよびワクチン - Google Patents

Ａｉｄｓ先祖ウイルスおよびワクチン

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ジー． ロドリゴ，アレン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、先祖HIV核酸およびアミノ酸配列、このような配列の製造方法およびその使用、例えば予防的および診断的使用に向けられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 HIV-1は、ワクチン開発のための非常に難しい標的であることが立証されてい
る。HIV-1感染に対する防御免疫の免疫相関物は、依然として不明である。ウイ
ルスは感染個体中で持続的に複製して、活発な体液性および細胞性免疫応答の発
生にもかかわらず、容赦なく疾患を引き起こす。HIV-1は感染中に急速に突然変
異を起こして、免疫認識を逃れ得るウイルスの生成を引き起こす。他の高度多様
性ウイルス（例えばインフルエンザ）と違って、一原型株が連続均一系統により
置き換えられる一連の変異体であるとは思えない。むしろ、多数のHIV-感染個体
からサンプリングされたウイルス配列の進化系統樹は、系統樹の中心からほぼ等
距離の変異体のほとんどに関してスターバーストパターンを形成する。HIV-1ウ
イルスはまた、後に個体中で複製し得る潜在プロウイルスDNAとして無期限に存
続し得る。
【０００２】 今日、いくつかのHIV-1ワクチンアプローチが開発中であり、各々がそれ自体
の相対的強さおよび弱さを有する。これらのアプローチは、生弱毒ワクチン、ア
ジュバントペプチドを用いた不活性化ウイルスおよびサブユニットワクチン、生
ベクターベースのワクチンならびにDNAワクチンの開発を包含する。エンベロー
プ糖タンパク質は、それらが理想的免疫原ではないことが明白になるまで、それ
らの表面曝露によるワクチンレジメンにおける主要抗原と考えられていた。これ
は、これらのウイルスの進化を推進する免疫学的選択力の予測結果である。天然
感染における不十分な免疫原性を指図するエンベロープ糖タンパク質の同一特徴
がワクチン開発を妨げる、と考えられる。しかしながらワクチン製法の修正は、
これらの問題を克服し得る。例えば融合競合免疫原を有する感染個体からの一次
単離物の好結果の中和（マウスにおける）についての近年の報告は、この考えを
支持する。
【０００３】 別のアプローチは、ワクチン製法においてHIV-1の天然単離物を使用すること
である。しかしながら初期変異体の同定は、AIDS流行を開始しそうな保存検体か
らでさえ、非常に見込みがない。天然単離物は、ワクチン候補のための理想であ
る特徴（例えばエピトープ）を具体化することも見込みがない。さらに任意の所
定天然ウイルス単離物は、その特定のヒト宿主内の特異的相互作用による適応を
反映する特徴を有する。これらの個体特異的特徴は、ウイルスの全てのまたはほ
とんどの系統に見出されるとは予測されず、したがって個々の単離物をベースに
したワクチンは広範囲の循環性ウイルスに対して有効であるとは考えられない。
【０００４】 別のアプローチは、HIV-1試験に対する広範な防御を引き出すための努力に際
してワクチン製法においてできるだけ多数の多様性HIV-1単離物を包含すること
である。先ず、1つまたはそれ以上の系統が、HIVの多数の循環系統の中から選択
される。このアプローチの利点は、このような系統が感染形態の成育可能ウイル
スであることが既知であるということである。しかしながらこのような系統は循
環中の他の系統に対して遺伝的に全く似ておらず、したがって広範な防御を引き
出せない。関連アプローチは、循環系統をまたはデータベース中の系統を基礎に
したコンセンサス配列を構築することである。コンセンサス配列は循環系統から
遺伝的意味でそれほど離れていないと考えられるが、しかし任意の実際のウイル
スの概算はなく、したがって広範な防御を提供し得ない。 したがってHIV感染を予防および治療するためのワクチン開発のための候補配
列を同定する新規の有効な方法に対する当業界での必要性が存在する。本発明は
、このそしてその他の必要を満たす。
【０００５】 発明の要約 本発明は、先祖ウイルス遺伝子配列およびウイルス先祖タンパク質配列を確定
するための組成物および方法を提供する。一つの観点では、高度多様性ウイルス
、例えばHIV-1、HIV-2またはC型肝炎に関する先祖ウイルス配列を確定するため
に用いられ得る計算方法が提供される。これらの計算方法は、最大見込み系統発
生分析により先祖ウイルス配列を確定するために循環性ウイルスの試料を用いる
。
【０００６】 先祖ウイルス配列は、例えばHIV-1先祖ウイルス遺伝子配列、HIV-2先祖ウイル
ス遺伝子配列またはC型肝炎先祖ウイルス遺伝子配列であり得る。別の実施態様
では、先祖ウイルス遺伝子配列は、HIV-1サブタイプA、B、C、D、E、F、G、H、J
、AGまたはAGI；HIV-1群M、NまたはO；あるいはHIV-2サブタイプAまたはBのもの
である。先祖ウイルス遺伝子配列は、広範分散性HIV-1変異体、地理的制限性HIV
-1変異体、広範分散性HIV-2変異体または地理的制限性HIV-2変異体のものでもあ
り得る。典型的には、先祖遺伝子はenv遺伝子またはgag遺伝子である。
【０００７】 先祖ウイルス遺伝子配列は、平均して任意の他の変異体より任意の所与の循環
性ウイルスの遺伝子配列とより密接に関連する。いくつかの実施態様では、先祖
ウイルス遺伝子は、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号6で記述さ
れる配列と少なくとも70%の同一性を有するが、しかし任意の循環変異体と100%
の同一性を有するというわけではない。
【０００８】 一つの観点において、本発明は、HIV-1サブタイプBのenv遺伝子に関する先祖
配列を提供する。HIV-1サブタイプBは、西半球および欧州において大半の感染を
生じる。確定先祖ウイルス配列は、平均して、任意の他の変異体より任意の所与
の循環性ウイルスとより密接に関連する。Env先祖遺伝子配列は、884アミノ酸長
である、envの遺伝子産物gp160に関するオープンリーディングフレームをコード
する。
【０００９】 別の観点では、本発明は、HIV-1サブタイプCのenv遺伝子に関する先祖配列を
提供する。サブタイプCは、世界中で最も流布しているサブタイプである。この
配列は、平均して、任意の他の変異体より任意の所与の循環性ウイルスとより密
接に関連する。この配列は、853アミノ酸長である、envの遺伝子産物gp160に関
するオープンリーディングフレームをコードする。
【００１０】 単離されたHIV先祖タンパク質またはその断片も提供される。単離された先祖
タンパク質は、例えばHIV-1サブタイプBenv先祖タンパク質（配列番号2）または
HIV-1サブタイプCenv先祖タンパク質（配列番号4）の連続配列であり得る。先祖
タンパク質は、HIV-1サブタイプA、B、C、D、E、F、G、H、J、AGまたはAGI；群M
、NまたはO；あるいはHIV-2サブタイプAまたはBのものでもあり得る。
【００１１】 本発明は、他の先祖ウイルス配列を確定するための計算方法も提供する。計算
方法は、例えば他のHIVサブタイプ、例えば発展途上国において広範に蔓延して
いるHIV-1サブタイプEに関する先祖ウイルス配列を確定することにおよび得る。
計算方法は、すべての既知のならびに新規出現高度多様性ウイルス、例えばHIV-
1系統、サブタイプおよびグループに関する先祖ウイルス配列を確定することに
も及ぶ。例えば先祖ウイルス配列は、タイまたはブラジルにおけるHIV-1-B、中
国、インド、南アフリカまたはブラジルにおけるHIV-1-C等に関して確定され得
る。他の実施態様では、先祖ウイルス配列は、HIV-1nef遺伝子またはポリペプチ
ド、pol遺伝子またはポリペプチドあるいはその他の補助遺伝子またはポリペプ
チドに関して確定される。
【００１２】 本発明は、発現構築物、例えば転写プロモーター；先祖タンパク質をコードす
る核酸；および転写ターミネーターも提供する。核酸は、例えばHIV-1先祖タン
パク質（例えば配列番号2または配列番号4）をコードし得る。核酸は、例えばHI
V-1サブタイプBまたはCenv遺伝子配列(例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5
または配列番号6)であり得る。一実施態様では、核酸配列は宿主細胞中での発現
のために最適化される。プロモーターは異種プロモーター、例えばサイトメガロ
ウイルスプロモーターであり得る。発現構築物は、原核または真核生物細胞中で
発現され得る。適切な細胞としては、例えば哺乳類細胞、人細胞、大腸菌細胞お
よびビール酵母菌S. cerevisiae細胞が挙げられる。一実施態様では、発現構築
物は、セムリキ森林熱ウイルスレプリコンと作用可能に連結された核酸配列を有
し、この場合、その結果生じた組換えレプリコンはサイトメガロウイルスプロモ
ーターと作用可能に連結される。
【００１３】 別の観点では、組成物は哺乳類における免疫応答を誘導するために提供され、
組成物はウイルス先祖タンパク質または先祖タンパク質の免疫原性断片を含有す
る。先祖タンパク質は、HIV-1サブタイプBまたはCenv先祖タンパク質から、ある
いはその他のHIV-1、HIV-2またはC型肝炎先祖タンパク質から得られる。組成物
は、高度多様性1型ヒト免疫不全ウイルスワクチン（HIV-1）により感染に対して
防御するための例えばAIDSワクチン、あるいはHIV-2またはC型肝炎感染を防御す
るためのワクチンとして用いられ得る。先祖ウイルス配列は、HIV-1グループ先
祖（例えばグループM）、HIV-1サブタイプ（例えばB、CまたはE）、広範蔓延性
変異体（widely spread variant）、地理的制限性変異体（geographycally-rest
ricted variant）または新規発現変異体であり得る。
【００１４】 別の観点では、ウイルス先祖タンパク質と特異的に結合し、そして複数の循環
子孫ウイルス先祖タンパク質と特異的に結合する単離抗体が提供される。先祖タ
ンパク質は、例えばHIV-1、HIV-2またはC型肝炎からであり得る。抗体は、モノ
クローナル抗体またはその抗原結合断片であり得る。一実施態様では、抗体はヒ
ト化モノクローナル抗体である。その他の適切な抗体またはその抗原結合断片は
、一本鎖抗体、一本重鎖抗体、抗原結合F(ab’)2断片、抗原結合Fab’断片、抗
原結合Fab断片または抗原結合Fv断片であり得る。
【００１５】 先祖ウイルス配列を確定することのほかに、本発明は、先祖ウイルス配列を基
礎にした免疫原性組成物を調製し、試験するための方法も提供する。特定の実施
態様では、免疫原性組成物（先祖ウイルス配列に基づいた）が調製され、適切な
モデル、例えばマウスモデルまたはサル−ヒト免疫不全ウイルス（SHIV）アカゲ
ザルモデルを用いて、哺乳類に投与される。免疫原性組成物は、単離先祖ウイル
ス遺伝子配列またはポリペプチド配列あるいはその一部を用いて調製され得る。 さらに別の観点では、先祖ウイルス配列を基礎にした核酸、ペプチドまたは抗
体を用いて、被験者におけるHIVおよび／またはAIDSを検出するための診断方法
が提供される。
【００１６】 特定の実施態様の説明 本発明をさらに詳細に記述する前に、本明細書中で以後用いられるようなある
種の用語の定義を記述することは、そのさらなる理解に有用であると思われる。
【００１７】 定義 別記しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術および科学用語は、本
発明が属する業界の当業者により一般的に理解されたのと同じ意味を有する。本
明細書中に記載されたものと同様の任意の方法および材料が本発明の実施または
試験に用いられ得るが、しかし例示的方法および材料のみを記載する。本発明の
目的のために、以下の用語は下記のように定義する。
【００１８】 本発明の情況において、「先祖配列」とは、典型的には、平均して任意の他の
変異体より任意の所定変異体とより密接に関連するものである決定された始祖配
列（determined founder sequence）を指す。「先祖ウイルス配列」とは、典型
的には、平均して任意の他の変異体に対してより任意の所定の循環性ウイルスに
対してより密接に関連するものである決定された始祖配列を指す。「先祖ウイル
ス配列」は、循環性ウイルスの核酸および／またはアミノ酸配列を用いて最大見
込み系統発生分析（本明細書中により十分に記載されているような）の適用によ
り確定される。「先祖ウイルス」とは、「先祖ウイルス配列」を含むウイルスで
ある。「先祖タンパク質」とは、アミノ酸先祖ウイルス配列を有するタンパク質
、ポリペプチドまたはペプチドである。
【００１９】 「循環性ウイルス」という用語は、感染個体中に見出されるウイルスを指す。 「変異体」という用語は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸
による他のウイルス、遺伝子または遺伝子産物と配列が異なるウイルス、遺伝子
または遺伝子産物を指す。
【００２０】 「免疫学的な」または「免疫応答」という用語は、レシピエント被験者におけ
るHIVペプチドに対して向けられる有益な体液性（即ち抗体媒介性）および／ま
たは細胞性（即ち抗原特異的T細胞またはそれらの分泌産物により媒介される）
応答の発現を指す。このような応答は、特に、免疫原の投与により誘導される活
性応答であり得る。細胞免疫応答は、抗原特異的CD4+Tヘルパー細胞（即ちヘル
パーTリンパ球）および／またはCD8+細胞傷害性T細胞を活性化するために、クラ
スIまたはクラスIIMHC分子に関連したエピトープの提示により引き出される。
【００２１】 細胞媒介性免疫学的応答の存在は、例えばCD4+T細胞の増殖検定（即ち、HTL（
ヘルパーTリンパ球）応答を測定する）により、あるいはCTL（細胞傷害性Tリン
パ球）検定により確定され得る（例えば、Burke et al., J. Inf. Dis. 170:111
0-19(1994); Tigges et al., J. Immunol. 156:3901-10(1996)参照）。免疫原の
防御的または治療的作用に対する体液性および細胞性応答の相対的寄与は、免疫
感作同質遺伝子的動物（immunized syngeneic animal）からIgGおよびT細胞を別
々に単離し、二次被験者における防御的または治療的作用を測定することにより
区別され得る。例えばエフェクター細胞は削除され、その結果生じる応答が分析
され得る（例えば、Schmitz et al., Science 283:857-60(1999); Jin et al.,
J Exp. Med. 189:991-98(1999)参照）。
【００２２】 「抗体」とは、分析物（抗原）を特異的に結合し、認識する単数または複数の
免疫グロブリン遺伝子またはその断片により実質的にコードされるポリペプチド
を指す。認識免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ
定常部遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変部遺伝子が挙げられる。軽鎖
は、κまたはλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類
され、これらは順次、それぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgDおよび
IgEを限定する。
【００２３】 例示的免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポ
リペプチド鎖の2つの同一対で構成され、各対は1つの「軽（約25 kD）」鎖およ
び1つの「重」鎖（約50〜70 kD）を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識に関
与する約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変部を有する。可変軽鎖（VL）
および可変重鎖（VH）という用語は、それぞれこれらの軽および重鎖を指す。
【００２４】 抗体は、例えば無傷免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用い
た消化により産生される多数の十分特性化された抗原結合断片として存在する。
例えばペプシンは、ヒンジ部のジスルフィド結合より下で抗体を消化して、それ
自体はジスルフィド結合によりVH-CH1に連結された軽鎖であるFabの二量体であ
るF(ab’)2断片を産生する。F(ab’)2断片は、穏やかな条件下で還元されて、ヒ
ンジ部のジスルフィド結合を壊し、それによりF(ab’)2二量体をFab’単量体に
転換し得る。
【００２５】 Fab’単量体は、本質的にはヒンジ部の一部を伴うFabである（Fundamental Im
munology, Third Edition, W.E.Paul (ed.), Raven Press, N.Y. (1993)参照）
。種々の抗体断片は無傷抗体の消化により限定されるが、一方、このような断片
は化学的にまたは組換えDNA法を利用することによりde novoで合成され得る、と
当業者は理解する。したがって抗体という用語は、本明細書中で用いる場合、抗
体断片、例えば一本鎖抗体、抗原結合F(ab’)2断片、抗原結合Fab’断片、抗原
結合Fab断片、抗原結合Fv断片、一本重鎖またはキメラ抗体も含む。このような
抗体は、全抗体の修飾により産生され得るか、あるいは組換えDNA法を用いてde
novoで合成され得る。
【００２６】 「生物学的試料」という用語は、ゲノムまたはウイルスDNAあるいはその他の
核酸（例えばmRNA、ウイルスRNA等）もしくはタンパク質を有する任意の組織ま
たは液体試料を指す。「生物学的試料」はさらに、無細胞ウイルスを含有する流
体、例えば血清および血漿を含み、そして正常健常細胞およびHIV感染が疑われ
る細胞もともに含む。
【００２７】 「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド
またはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。特定的に限定されない限り
、当該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類
似体を含有する核酸を包含する。別記しない限り、特定の核酸配列は、その保存
的修飾化変異体（例えば縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明瞭に示さ
れた配列も暗黙的に包含する。特に縮重コドン置換は、1つまたはそれ以上の選
定（またはすべての）コドンの第三位置が、混合塩基および／またはデオキシイ
ノシン残基で置換される配列を生成することにより達成され得る（例えば、Batz
er et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Che
m. 260:2605-08(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)
参照）。
【００２８】 核酸は、少なくとも10連続ヌクレオチドの断片（例えばハイブリッド可能部分
）も包含する；別の実施態様では、核酸は少なくとも25ヌクレオチド、50ヌクレ
オチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチドあるいは250ヌク
レオチドまでまたはそれ以上を含む。「核酸」という用語は、遺伝子、cDNAおよ
び遺伝子によりコードされるmRNAと互換的に用いられる。
【００２９】 本明細書中で用いる場合、「核酸プローブ」とは、1つまたはそれ以上の種類
の化学結合により、通常は相補塩基対合により、例えば水素結合形成により、相
補配列の標的核酸（例えばHIV-1核酸）と結合し得る核酸と定義される。本明細
書中で用いる場合、プローブは天然（例えばA、G、CまたはT）または修飾化塩基
（例えば7-デアザグアノシン、イノシン等）を包含し得る。さらにプローブ中の
塩基は、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合
以外の結合により連結され得る。したがって、例えばプローブは、組成塩基がホ
スホジエステル結合よりむしろペプチド結合により連結されるペプチド核酸であ
り得る。ハイブリダイゼーション条件の緊縮度によるレベルで、プローブ配列と
の完全相補性を欠く標的配列をプローブが結合し得る、ということは、当業者に
より理解される。
【００３０】 核酸プローブは、DNAまたはRNA断片であり得る。DNA断片は、例えばプラスミ
ドDNAを消化することにより、PCRの使用により、または化学合成により、例えば
BeaucageとCarruthers (Tetrahedron Lett. 22:1859-62(1981))により記載され
ているホスホロアミダイト法により、あるいはMatteucci等（J. Am. Chem. Soc. 103:3185(1981)）によるトリエステル法により調製され得る。次に、所望によ
り、適切な条件下で化学合成一本鎖を一緒にアニーリングすることにより、また
は適切なプライマー配列を有するDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を合成するこ
とにより、二本鎖断片が得られる。核酸プローブに関する特定の配列が示される
場合、相補鎖も同定され、包含されると理解される。相補鎖は、標的が二本鎖化
核酸である情況で等しく良好に機能する。
【００３１】 「標識化核酸プローブ」とは、プローブに結合された標識の存在を検出するこ
とによりプローブの存在が検出されるように、共有的に、リンカーにより、また
はイオン、ファンデルワールスまたは水素結合により、標識と結合される核酸プ
ローブである。 「作用可能に連結される」という用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモー
ター、シグナル配列、または転写因子結合部位の任意のアレイ）と二次核酸配列
との間の機能的連結を指すが、この場合、発現制御配列は、二次配列に対応する
核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００３２】 「増幅プライマー」は、選定核酸配列の増幅のための基準として役立ち得る天
然または類似ヌクレオチドを含む核酸、典型的にはオリゴヌクレオチドである。
それらの例としては、例えばポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびリガーゼ連
鎖反応オリゴヌクレオチドの両方が挙げられる。 「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ
酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。本用語は、1
つまたはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸ならびに天然アミノ酸
ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーの人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマ
ーに当てはまる。
【００３３】 「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、本明細書中で用いられる
場合、さらに以下に記載されるような天然L-アミノ酸またはD-アミノ酸を指す。
アミノ酸に関して一般的に用いられる一文字および三文字略号が本明細書中で用
いられる（例えば、Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland
Publishing, Inc., New York(3d ed. 1994); Creighton, Proteins, W.H. Free
man and Company(1984)参照）。
【００３４】 「保存的置換」とは、タンパク質を説明する場合、タンパク質の活性を実質的
に変えるとは思われないタンパク質のアミノ酸組成の変化を指す。したがって、
特定アミノ酸配列の「保存的修飾化変異」とは、重要でさえあるアミノ酸の置換
が活性を実質的に変えないような、タンパク質活性に関して重要であるとは思わ
れないアミノ酸のアミノ酸置換、あるいは同様の特性（例えば、酸性、塩基性、
正または負荷電、極性または非極性等）を有する他のアミノ酸を用いたアミノ酸
の置換を指す。しばしば機能的に同様であるアミノ酸を提示する保存的置換表は
、当業界で周知である（例えば、Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Comp
any(1984)参照）。さらに、単一アミノ酸またはコード配列中の小パーセンテー
ジのアミノ酸を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加も「保存
的修飾化変異」である。
【００３５】 2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の情況において、「同一の
」または「同一性パーセント」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1
つを用いて、または手動アラインメントおよび視覚的検査により測定した場合、
比較ウインドウまたは意図された領域に亘って最大対応性に関して比較し、整列
した場合に、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド
の特定パーセンテージ（即ち特定領域に亘って60%同一性、任意に65%、70%、75%
、80%、85%、90%または95%同一性）を有する2つまたはそれ以上の配列または亜
配列を指す。このような配列はその場合、「実質的に同一である」といわれる。
この定義は、試験配列の相補体も指す。任意に、同一性は、少なくとも約30アミ
ノ酸またはヌクレオチド長である領域に亘って、典型的には50、75または150ア
ミノ酸またはヌクレオチドである領域に亘って存在する。一実施態様では、配列
はコード領域の全長に亘って実質的に同一である。
【００３６】 2つまたはそれ以上のポリペプチド配列の情況において、「類似性」または「
類似性パーセント」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて
、または手動アラインメントおよび視覚的検査により測定した場合、比較ウイン
ドウまたは意図された領域に亘って最大対応性に関して比較し、整列した場合に
、前記の保存的アミノ酸置換で限定されるように同一であるかまたは類似する特
定パーセンテージのアミノ酸残基（即ち特定領域に亘って少なくとも60%、任意
に65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%類似する）を有する2つまたはそれ以
上の配列または亜配列を指す。このような配列はその場合、「実質的に類似する
」といわれる。任意に、この同一性は、少なくとも約25アミノ酸長である領域に
亘って、さらに好ましくは約50、75または100アミノ酸長である領域に亘って存
在する。
【００３７】 配列比較に関しては、典型的には一配列は、試験配列が比較される参照配列と
して作用する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験および参照配列は、典
型的にはコンピューターに入力され、必要ならば亜配列同等物が指示され、そし
て配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指示される。配列比較アルゴリズ
ムは次に、指定プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して試験配
列（単数または複数）に関する配列同一性パーセントを算定する。
【００３８】 比較のための配列の最適アラインメントは、例えばSmithとWaterman（Adv. Ap
pl. Math. 2:482(1981)）の局所相同アルゴリズムにより、NeedlemanとWunsch（
J. Mol. Biol. 48:443(1970)）の相同アラインメントアルゴリズムにより、Pear
sonとLipman（Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)）の同一性に関する検
索法により、これらのアルゴリズムのコンピューター処理実行（Wisconsin Gene
tics Software Package, Genetics Conputer Group, 575 Science Dr. Madison,
WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)により、または視覚的検査（一般に、A
usubel et al., Current protocols in Molecular Biology, John Wiley and So
ns, New York(1996)参照）により実行され得る。
【００３９】 有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、関係および配列同一
性パーセントを示すために累進対合式アラインメントを用いて関連配列の一群か
ら多重配列アラインメントを作製する。それは、アラインメントを作製するため
に用いられる群生関係を示す系統樹または系統発生樹もプロットする。PILEUPは
、FengとDoolittle（J. Mol. Evol. 35:351-60(1987)）の累進アラインメント法
の単純化を用いる。用いられる方法は、HigginsとSharp（Gene 73: 237-44 (198
8); CABIOS 5: 151-53(1989)）により記載されたCLUSTAL法に類似する。プログ
ラムは300配列まで並べ得るし、各々、5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸の最大
長を有する。多重アラインメント手法は、2つの最もよく似た配列の対合方式を
用いて開始し、2つの整列化配列の一群を生じる。
【００４０】 この一群はその後、次のもっとも関連した配列または整列化配列団に整列され
る。2つの群の配列は、2つの個々の配列の対合式アラインメントの単純延長によ
り整列される。最終アラインメントは、一連の累進対合式アラインメントにより
達成される。プログラムは、配列比較の領域に関して特定の配列およびそれらの
アミノ酸またはヌクレオチド同等物を指示することにより、そしてプログラムパ
ラメーターを指示することにより、実行される。例えば参照配列は、以下のパラ
メーター：デフォルトgap重量（3.00）、デフォルトgap長重量（0.10）および計
量末端gapを用いて、配列同一性パーセント関係を確定するために、他の試験配
列と比較され得る。
【００４１】 配列同一性パーセントおよび配列類似性を確定するのに適したアルゴリズムの
別の例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschul等（J. Mol. Biol. 215:4
03-10(1990)）に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、
National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.g
ov/）を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース中の
同一長のワードを用いて整列される場合、何らかの正評価閾値得点Tに適合する
かまたはそれを満たす疑問配列中の長さWの短いワードを同定することにより、
高得点配列対（HSP）を先ず同定することを包含する。Tは、隣接ワード得点閾値
として示される（Altschul et al.,上記）。
【００４２】 これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いHSPを見出すた
めの検索を開始するための核として作用する。ワードヒットは次に、累積アライ
ンメント得点が増大され得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積得
点は、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターM（マッチング残基対に関する
応報得点；常に>0）およびN（ミスマッチング残基に関するペナルティー得点；
常に<0）を用いて算定される。アミノ酸配列に関しては、採点マトリックスを用
いて、累積得点を算定する。各方向のワードヒットの延長は、累積アラインメン
ト得点がその最大達成値から量Xを減じる場合；1つまたはそれ以上の負の採点残
基アラインメントの蓄積のために、累積得点がゼロまたはそれ以下になる場合；
あるいは配列の末端が到達される場合に、停止される。
【００４３】 BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および
速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォル
トとして、3のワード長（W）、10の予測数量（E）、100の遮断、M=5、N=-4およ
び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関しては、BLASTNプログラムは、デフォ
ルトとして、3のワード長（W）、10の予測数量（E）、およびBLOSUM62採点マト
リックスを用いる（Henikoff and Henikoff, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 89:10
915(1989)参照）。
【００４４】 配列同一性パーセントを算定するほかに、BLASTアルゴリズムは、2つの配列間
の類似性の統計学的分析も実施する（例えば、Karlin and Altschul, Pro. Natl
. Acad. Sci. USA 90:5873-87(1993)参照）。BLASTアルゴリズムにより提供され
る類似性の一測定値は最小合計確率（P (N)）であり、これは、2つのヌクレオチ
ドまたはアミノ酸配列間の適正が偶然により起こる確率の指標を提供する。例え
ば核酸は、参照核酸との試験核酸の比較における最小合計確率が典型的には約0.
35〜約0.1である場合には、参照配列に類似すると考えられる。
【００４５】 2つの核酸が実質的に同一であるという別の指標は、2つの分子が緊縮条件下で
互いにハイブリダイズするということである。「〜と特異的にハイブリダイズす
る」という語句は、その配列が複合混合物（例えば全細胞性）DNAまたはRNA中に
存在する場合に緊縮条件下での特定のヌクレオチド配列のみとの分子の結合、重
複またはハイブリダイゼーションを指す。「実質的に結合する（単数または複数
）」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指
し、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼー
ション培地の緊縮を低減することにより収容され得る小不適正を包含する。
【００４６】 サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼー
ション実験の情況における「緊縮ハイブリダイゼーション条件」および「緊縮ハ
イブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメーター
下で異なる。より長い配列は、高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイ
ブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Laboratory Techniques i
n Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Pro
bes, part I, chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the
strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, N.Y.(1993)に見出され
る。一般に、高緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、限定イオン強度
およびpHでの特定配列に関する融点（Tm）より約5℃低いよう選定される。典型
的には、「緊縮条件」下では、プローブはその標的亜配列とハイブリダイズする
が、しかし他の配列とはハイブリダイズしない。
【００４７】 Tmは、標的配列の50%が完全適正プローブとハイブリダイズする温度（限定イ
オン強度およびpH下で）である。極緊縮条件は、特定プローブに関するTmと等し
いよう選択される。サザンまたはノーザンブロットのフィルター上に100より多
い相補残基を有する相補核酸のハイブリダイゼーションに関する緊縮ハイブリダ
イゼーション条件の一例は、4〜6ｘSSCまたはSSPEを含有する水性溶液中で42℃
または65〜68℃で4〜6ｘSSCまたはSSPE中の50%ホルムアミドである。高緊縮洗浄
条件の一例は、72℃で約15分間の0.15 MNaClである。緊縮洗浄条件の一例は、65
℃で15分間の0.2ｘSSC洗浄である（一般的に、Sambrook et al., Molecular clo
ning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Sp
ring Harbor, NY (1989)参照）。
【００４８】 しばしば、高緊縮洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するため
に低緊縮に先行される。例えば100より多いヌクレオチドの二重鎖に関する中緊
縮洗浄の一例は、45℃で15分間の1ｘSSCである。例えば100より多いヌクレオチ
ドの二重鎖に関する低緊縮洗浄の一例は、40℃で15分間の4〜6ｘSSCである。短
いプローブ（例えば約10〜50ヌクレオチド）に関しては、緊縮条件は典型的には
、pH7.0〜8.3で約1.0 M未満のNaイオンの塩濃度、典型的には約0.01〜1.0 MNaイ
オン濃度（またはその他の塩）を包含し、温度は典型的には少なくとも約30℃で
ある。
【００４９】 緊縮条件は、脱安定剤、例えばホルムアミドの付加によっても達成され得る。
概して、特定ハイブリダイゼーション検定における非関連プローブに関して観察
されたものの2倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリ
ダイゼーションの検出を示す。緊縮条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は
、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、実質的に同
一である。これは、例えば遺伝暗号により可能にされる最大コドン縮重を用いて
核酸のコピーが作製される場合に起こる。
【００５０】 2つの核酸またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、
一次核酸によりコードされるポリペプチドが、二次核酸によりコードされるポリ
ペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差はのせいであるかまたはそれと特
異的に結合することである。したがって、ポリペプチドは典型的には、例えば2
つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる二次ポリペプチドと実質的に同一
である。
【００５１】 「抗体と特異的に（または選択的に）結合する」または「〜と特異的に（また
は選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質またはペプチドに言
及する場合、タンパク質およびその他の生物学的物質の異種集団の存在下でのタ
ンパク質の存在の決定因である結合反応を指す。したがって指定イムノアッセイ
条件かでは、特異化抗体は特定タンパク質と結合し、試料中に存在する他のタン
パク質と有意量で結合しない。このような条件下でのタンパク質との特異的結合
は、特定タンパク質に対するその特異性のために選定される抗体を要する。例え
ば本発明の核酸のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質
に対して生じる抗体は、そのタンパク質とは特異的に免疫反応性であるが、多形
変異体を除いて他のタンパク質とは特異的免疫反応性でない抗体を得るよう選定
され得る。
【００５２】 種々のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定タンパク質と特異的に免疫
反応性である抗体を選定し得る。例えば固相ELISAイムノアッセイ、ウエスタン
ブロットまたは免疫組織化学法は、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノ
クローナル抗体を選定するためにルーチンに用いられる（例えば特異的免疫反応
性を確定するために用いられ得るイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明
に関しては、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Publications, N.Y.(1988)参照）。典型的には、特異的または選択的
反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍、さらに典型
的にはバックグラウンドの10〜100倍である。
【００５３】 「免疫原性組成物」という用語は、特異的免疫原に対して抗体を生じる免疫応
答または細胞媒介性免疫応答を引き出す組成物を指す。免疫原性組成物は、注射
用として、液体溶液、懸濁液、乳濁液等として調製され得る。 「ワクチン」という用語は、疾患、特にウイルス疾患に対する防御を付与する
ための、霊長類、特にヒト宿主であり得る宿主へのin vivo投与のための免疫原
性組成物を指す。
【００５４】 「単離された」という用語は、その天然細胞環境から取り出されたウイルス、
核酸またはポリペプチドを指す。単離ウイルス、核酸またはポリペプチドは、典
型的には、細胞核酸、ポリペプチドおよびその他の構成成分から少なくとも部分
的に精製される。 本発明の情況では、「合一事象」とは、それらの最新の共通先祖の時点での系
統学上の2つの直系の結合を指す。 「合一間隔」とは、合一事象間の時間を説明する。各合一間隔に関する予測時
間は指数関数的に分布され、n<<Nに関して平均E［tnyn-1］=2N/n（n-1）生成で
ある。
【００５５】 先祖配列の系統発生的確定 一つの観点において、先祖配列を確定するための計算方法が提供される。この
ような方法は、例えばウイルスに関する先祖配列を確定するために用いられ得る
。これらの計算方法は、典型的には高度多様性ウイルス集団として存在するウイ
ルスの先祖配列を確定するために用いられる。例えばいくつかの高度多様性ウイ
ルス（例えばHIV-1、HIV-2、C型肝炎等）は、一原型系統が連続均一系統により
置き換えられる連続変異体により進化するとは考えられない。代わりに、ウイル
ス配列の進化系統樹は「スターバーストパターン」を形成し、ほとんどの変異体
がスターバーストの中心からほぼ等距離にある。このスターバーストパターンは
、多重多様性循環系統が共通先祖から進化することを示す。このような高度多様
性ウイルス、例えばHIV-1、HIV-2、C型肝炎およびその他のウイルスに関する先
祖配列を確定するために、計算方法が用いられ得る。
【００５６】 先祖配列の確定方法は、典型的には循環性ウイルスの核酸配列を基礎にする。
ウイルス核酸配列は複製されるので、それは複製過程におけるエラーによる塩基
変化を獲得する。例えばいくつかの核酸配列が複製される場合、チミン（T）は
その正常相補体であるシトシン（C）よりむしろグアニン（G）と結合し得る。こ
れらの塩基変化（または突然変異）のほとんどはその後の複製事象で再生されな
いが、しかし一定の割合の突然変異は子孫配列に受け渡される。多くの複製サイ
クルを用いるほど、核酸配列が獲得する突然変異は多い。1つまたはそれ以上の
突然変異を保有する核酸配列が2つの別個の直系を生じる場合には、その結果生
じる2つの直系は同一親核酸配列を共有し、同一親突然変異（単数または複数）
を有する。これらの直系の「歴史」を遡及すると、それらは、2つの直系が共通
先祖から生じた共通分枝点を有する。同様に、現在の循環性ウイルス核酸配列の
歴史を遡ると、この歴史の分枝点も、単一先祖が子孫直系を生じた点（節点とし
て指示されている）に対応する。
【００５７】 本発明の計算方法は、最大見込みの原理を基礎にしており、循環性ウイルスの
核酸配列の試料を用いる。試料中のウイルスの配列は、典型的には共通の特徴を
共有し、例えば同一ウイルス系統、サブタイプまたは群からである。系統発生は
、ウイルス核酸の複製に際してヌクレオチド置換の確率を特定する進化のモデル
を用いることにより構築される。ヌクレオチドが異なる配列中の位置（即ち突然
変異の部位）で、観察されたウイルス配列を得る確率が最大になるよう、当該方
法は、節点（即ち直系の分枝点）にヌクレオチドの1つを割り当てる。
【００５８】 節点へのヌクレオチドの割当は、単数または複数の予測系統発生を基礎にする
。各データ組に関しては、異なるウイルス系統、サブタイプまたは群からのいく
つかの配列は、当該配列を捜し出すための外群として用いられる。配列置換のモ
デル、次いで最大見込み系統発生は、各データ組（例えばサブタイプおよび外群
）に関して確定される。最大見込み系統発生の1つは、試料中に観察核酸配列を
生じる最高確率を有する。最大見込み系統発生の基礎節点での配列は、先祖配列
（または最新の共通先祖）と呼ばれる（例えば、図1および2参照）。したがって
この先祖配列は、試料内の異なる配列からほぼ等距離にある。
【００５９】 最大見込み系統発生は、循環性ウイルスの配列の試料を用いる。循環性ウイル
スの配列は、例えば感染者の血液、組織またはその他の生物学的試料から核酸を
抽出し、そしてウイルス核酸をシーケンシングすることにより確定され得る（例
えば、Sambrook et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.,
Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y.(1989); Kriegler, G
ene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman, N.Y.(199
0); Ausubel et al.,上記、参照）。
【００６０】 一実施態様では、抽出ウイルス核酸はポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、
次にDNAがシーケンシングされる。循環性ウイルスの試料は、保存生物学的試料
からおよび／または循環性ウイルスの試料から予測的に（例えば、インド対エチ
オピアにおけるHIV-1サブタイプCをサンプリングする）得られる。ウイルス配列
は、データベース（例えばGenBankおよびLos Alamos配列データベース）からも
同定され得る。
【００６１】 一旦循環性ウイルスの試料が収集されれば（典型的には約20〜約50試料）、本
発明の計算方法を用いて、1つまたはそれ以上の遺伝子に関する核酸配列が分析
される。一方法では、配列中の任意の指定部位に関して、系統樹上の全ての節点
にヌクレオチドが割り当てられる。循環性ウイルスの観察配列を得る確率を最大
にするすべての節点に関するヌクレオチドの形状が確定される。この方法を用い
て、全節点にまたがる状態の連結見込みが最大にされる。
【００６２】 第二の方法は、系統樹上の指定ヌクレオチド部位および指定節点に関して、循
環性ウイルスの観察配列を得る確率を最大にし、系統樹上の他の節点でのヌクレ
オチドのすべての考え得る割当を可能にするヌクレオチドを選択することである
。この第二の方法は、特定の割当の限界見込みを最大にする。これらの方法に関
しては、先祖配列の再構築（即ち先祖状態）は、しかしながら単一確定配列のみ
を生じる必要がない。それらの見込み順にランクされた多数の先祖配列を選択す
ることができる。
【００６３】 HIV集団に関しては、モデリングの第二層が最大見込み系統発生分析に付加さ
れ、特に当該層は分析に用いられる進化のモデルに付加される。この第二層は、
合一見込み分析を基礎にする。合一とは、配列の系統の数学的説明であり、集団
に作用する過程を考慮に入れる。これらの過程が何らかの確実性を伴って既知で
ある場合、合一の使用は、各種類の系統樹に従来の確率を割り当てるために用い
られ得る。系統樹の見込みを用いて考慮すると、データが示されれば確定系統発
生樹が正しいという後期確率が確定され得る。一旦系統樹が選定されれば、先祖
状態は、前記と同様に確定され得る。したがって合一見込み分析は、先祖ウイル
ス配列（例えば、始祖または最新の共通先祖（MRCA）の配列）の配列を確定する
ためにも適用され得る。
【００６４】 典型的実施態様では、最大見込み系統発生分析は、先祖配列（例えば先祖ウイ
ルス配列）を決定するために適用される。典型的には、ウイルス系統、サブタイ
プまたは群のような共通の特徴を有する20〜50核酸配列試料が用いられる（例え
ば、同一サブタイプの世界的多様性を包含する試料）。他のウイルス（例えば別
の系統、サブタイプまたは群）からの付加的配列が得られ、分析中のウイルス配
列を捜し出すための外群として用いられる。ウイルス配列の試料は、データベー
ス（例えばGenBankおよびLos Alamos配列データベース）から、あるいは配列情
報の同様の供給源から同定された目下の循環性ウイルスから確定される。
【００６５】 配列は、CLUSTALW（Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-80(1994)
)(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）を用いて整列され、これ
らのアラインメントは、GDE（Smith et al., CABIOS 10:671-75(1994))(この記
載内容は、参照により本明細書中に含まれる）を用いて精製される。アミノ酸配
列は、核酸配列から翻訳される。ギャップは、それらがコドン間に挿入されるよ
う操作される。このアラインメント（アラインメントI）は、明瞭に整列され得
ない領域が除去されるよう、系統発生的分析にために修飾され（Learn et al.,
J. Virol. 70:5720-30(1996))(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれ
る）、アラインメントIIを生じる。
【００６６】 これらの配列（アラインメントII）に関する系統発生および先祖状態再構築の
ための適切な進化モデルは、Modeltest 3.0（Posada and Crandall, Bioinforma
tics 14:817-8(1998))(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）で
実行される場合、Akaike情報判定基準（AIC)(Akaike, IEEE Trans. Autom. Cont
r. 19: 716-23 (1974))(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）を
用いて選定される。
【００６７】 例えばサブタイプC先祖配列のための分析に関しては、最適モデルは、転写の
両クラスに関しては等速度であり、トランスバージョンの4つのクラス全てに関
しては異なる速度であって、不変部位、ならびに可変部位の部位−部位速度変動
性のX分布を伴う（TVM+I+Gモデルとして言及される）。この場合のモデルのパラ
メーターは、例えば平衡ヌクレオチド頻度：fA=0.3576、fC=0.1829、fG=0.2314
、fT=0.2290；不変部位の割合=0.2447；X分布の形状パラメーター（α）=0.7623
；速度マトリックス（R）マトリックス値：RA→C=1.7502、RA→G=RC→T=4.1332
、RA→T=0.6825、RC→G=0.6549、RG→T=1。
【００６８】 配列（アラインメントII）に関する進化系統樹は、PAUPバージョン4.0b（Swof
ford, PAUP 4.0: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (And Other Methods
); Sinauer Associates, Inc. (2000))(この記載内容は、参照により本明細書中
に含まれる）で実行される場合、最大見込み概算（MLE）法を用いて推定される
。例えば、HIV-1サブタイプC配列に関しては、10の異なる亜系統樹−剪定−再移
植（SPR）発見的検索が、各々異なる無作為付加順を用いて実施され得る。先祖
ウイルスヌクレオチド配列は、系統発生を用いて基礎節点での配列であることが
確定され、データベース（アラインメントII）、ならびに前記のTVM+I+Gモデル
からの配列は、限界見込み概算（下記参照）を用いて確定される。
【００６９】 いくつかの場合、確定配列は可変部（例えば、HIV-1-Cに関する可変部V1、V2
、V4およびV5）の一部に関する先祖配列を含み得ないし、あるいはいくつかの短
い領域は明瞭には整列され得ない。以下の手法は、最適には、高可変部（例えば
アラインメントIから欠失されたもの）を含めた完全配列に関するアミノ酸配列
を予測するために用いられ得る。確定先祖配列は視覚的にアラインメントIと一
列に整列されて、GDE（Smith et al., 上記）を用いて翻訳される。高可変部は
完全コドンとして欠失され得るため、翻訳リーディングフレームは保存され、コ
ドンは維持され得る。アラインメントIIから欠失された領域に関する先祖アミノ
酸配列は視覚的に予測され、コンピュータープログラムMacCladeバージョン3.08
ａ（Maddison and Maddison. MacClade-Analysis of Phylogeny and Character
Evolution -Version 3. Sinauer Associates, Inc.(1992)）を用いたこれらの部
位に関する最節約ベースの配列再構築を用いて精製される。
【００７０】 先祖アミノ酸配列は、任意に、特定細胞型における発現のために最適化される
。アミノ酸配列は、例えばWisconsin配列分析パッケージ（GCG）、バージョン10
のBACKTRANSLATEプログラムならびにコドン使用データベース（http://www.kazu
sa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=Homo+sapiens+[gbpri])(これ
らの記載内容はともに、参照により本明細書中に含まれる）からのヒト遺伝子コ
ドン表を用いて、ある種の細胞型（例えばヒト細胞）中での発現のために最適化
されたDNA配列に転換され得る。
【００７１】 最適化配列は、非最適化先祖配列と同一のアミノ酸配列を、当該遺伝子（例え
ばenv遺伝子）に関してコードする。最適化配列を有する合成ウイルスは、RNA二
次構造的特徴（例えばHIV-1のRev応答素子（RRE））等の存在下での異なるリー
ディングフレーム中の補助遺伝子の崩壊のために完全に機能的であるというわけ
ではない。最適化過程は補助遺伝子（例えばHIV-1のvpu、tatおよびrev遺伝子）
のコード領域に影響を及ぼし得るし、RNA二次構造を破壊し得る。したがって先
祖配列は、半最適化され得る。半最適化配列は、他の特徴に亘らない配列の部分
に関する最適化配列を有するが、この場合、非最適化先祖配列が代わりに用いら
れる。例えばHIV-1先祖配列に関しては、最適化先祖配列は、vpu、tat、revおよ
びRRE領域に亘らない配列の部分に関して用いられ、一方、「非最適化」先祖配
列は、vpu、tat、revおよびRRE領域を重複する配列の部分に関して用いられる。
【００７２】 HIV先祖ウイルス配列の系統発生的決定 先祖ウイルス配列は、１型HIV（HIV-1）、2型HIV（HIV-2）またはその他のHIV
ウイルス、例えばHIV-1サブタイプ、HIV-2サブタイプに関する、その他のHIVサ
ブタイプに関する、出現性HIVサブタイプに関する、ならびにHIV変異体、例えば
広範分散性または地理的単離変異体からの任意の単数または複数の遺伝子に関し
て確定され得る。
【００７３】 例えば先祖ウイルス遺伝子配列は、HIV-1、例えばHIV-1サブタイプA、B、C、D
、E、F、G、H、J、AG、AGIのenvおよびgag遺伝子に関して、ならびに群M、N、O
に関して、あるいはHIV-2ウイルスまたはHIV-2サブタイプAまたはBに関して確定
され得る。特定の実施態様では、先祖ウイルス配列は、HIV-1サブタイプBおよび
／またはCのenv遺伝子に関して、またはサブタイプBおよび／またはCからのgag
遺伝子に関して確定される。他の実施態様では、先祖ウイルス配列は、その他の
HIV遺伝子またはポリペプチド、例えばnef、polまたはその他の補助遺伝子また
はポリペプチドに関して確定される。
【００７４】 現在および／または以前の循環性ウイルスからの選定HIV-1またはHIV-2遺伝子
の核酸配列は、既存のデータベース（例えばGenBanKまたはLos Alamos配列デー
タベース）から同定され得る。循環性ウイルスの配列は、組換えDNA法によって
も確定され得る（例えば、Sambrook et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y.(
1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman, N.Y.(1990); Ausubel et al.,上記、参照）。
【００７５】 各データ組に関しては、異なるウイルス系統、サブタイプまたは群からのいく
つかの配列は、当該配列を捜し出すための外群として用いられる。配列置換のモ
デル、次いで最大見込み系統発生は、各データ組（例えばサブタイプおよび外群
）に関して確定される。先祖ウイルス配列は、変異体配列の基礎節点での配列と
して確定される（例えば、図1および2参照）。したがってこの先祖配列は、サブ
タイプ内の異なる配列からほぼ等距離にある。
【００７６】 一実施態様では、先祖HIV-1群M、サブタイプB、env配列は、41の異なる単離物
を用いて確定された（確定核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ表1および2（配
列番号1および配列番号2）に図示されている）。図2を参照しながら、38のサブ
タイプB配列および3つのサブタイプD（外群）配列を用いて、サブタイプB配列を
捜し出した。サブタイプB配列は、9カ国からのものであり、サブタイプB多様性
の広範な試料を示す：オーストラリア、8配列；中国、1配列；フランス、5配列
；ガボン、1配列；ドイツ、2配列；英国、2配列；オランダ、2配列；スペイン、
1配列；米国、15配列。
【００７７】 確定先祖タンパク質は、884アミノ酸長である。この先祖ウイルス配列とそれ
を確定するために用いられた循環系統との間の距離は、平均で12.3%（8.0〜21.0
%の範囲）であったが、一方、利用可能な検体は、互いに17.3%異なっていた（13
.3〜23.2%の範囲）。したがって先祖配列は、平均で、任意の他の変異体より任
意の所定循環性ウイルスにより密接に関連する。他のサブタイプB系統と比較し
た場合、先祖配列は、アミノ酸レベルで94.6%の同一性を有して、USAD8（Theodo
re et al., AIDS Res. Human Retrovir. 12: 191-94 (1996)）に最も類似する。
【００７８】 意外なことに、HIV-1サブタイプBenv遺伝子の確定先祖ウイルス配列は、抗原
提示のために処理された場合、広範囲の種々の免疫学的に活性ペプチドをコード
する。ほぼすべての既知のサブタイプB CTLエピトープコンセンサスアミノ酸（3
87/390; 99.23%）が、サブタイプB、gp160配列に関して確定先祖ウイルス配列中
に表示される．これに対比して、HIV-1サブタイプBの大半のその他の変異体は、
95%より低いエピトープ配列保存を示す（これは先祖ウイルス配列の必要な特徴
というわけではないが、しかしHIV-1の急速延長の結果である）。したがって、
このサブタイプB先祖タンパク質に対する免疫原性組成物は、同一サブタイプPの
HIV-1単離物に対して広範な中和抗体を引き出す。このサブタイプB先祖タンパク
質に対する免疫原性組成物は、抗原特異的T細胞により媒介される広範な細胞応
答も引き出す。
【００７９】 別の実施態様では、同様の計算方法を用いて、HIV-1サブタイプCenv遺伝子配
列の先祖ウイルス配列を確定した。HIV-1サブタイプCは、発展途上国において蔓
延している。サブタイプCは、世界的に最も一般的なサブタイプであって、HIV-1
感染のおよそ30%に関与し、アフリカ、インドおよび中国における流行の主要構
成成分である。HIV-1群MサブタイプCenv遺伝子に関する先祖ウイルス配列は、57
の異なる単離物（39のサブタイプC配列および18の外群配列（2つは他の群Mサブ
タイプの各々から）；図8）を用いて確定された。確定アミノ酸配列は、表4（配
列番号4）に示されている。ヒト細胞中での発現のために最適化された確定核酸
配列は、表3（配列番号3）に示されている。
【００８０】 サブタイプC配列は、12のアフリカおよびアジア諸国からであり、世界規模の
サブタイプC多様性の広範な試料を表示する：ボツワナ、8配列；ブラジル、2配
列；ブルンジ、8配列；中華人民共和国、1配列；ジブチ、2配列；エチオピア、1
配列；インド、8配列；マラウイ、3配列；セネガル、1配列；ソマリア、1配列；
ウガンダ、1配列；およびザンビア、3配列。確定先祖タンパク質は、853アミノ
酸長である。この先祖ウイルス配列とそれを確定するために用いられる循環系統
との間の距離は、平均で11.7%（9.3〜14.3%の範囲）であり、一方、利用可能な
検体は、平均で互いに16.6%異なっていた（7.1〜21.7%の範囲）。したがって先
祖タンパク質配列は、平均して、任意の他の変異体より任意の指定循環性ウイル
スにより密接に関連する。他のサブタイプC系統と比較した場合、先祖配列はMW9
65（Gao et al., J Virol. 70:1651-67(1996)）と最も類似し、アミノ酸レベル
で89.5%の同一性を有する。
【００８１】 意外なことに、確定先祖ウイルス配列は、抗原提示のために処理された場合、
広範な種々の免疫学的活性ペプチドをコードする。ほぼすべての既知のサブタイ
プC CTLエピトープコンセンサス配列（389/396; 98.23%）が、サブタイプCgp160
配列に関する確定先祖ウイルス配列中に表示される．これに対比して、HIV-1サ
ブタイプCの典型的変異体（先祖配列を確定するために用いられるもの）は、95.
19%未満のエピトープ配列保存（平均90.36%、64.56〜95.19%の範囲）を有する。
したがって、このサブタイプC先祖ウイルス配列に対するワクチンは同一サブタ
イプのHIV-1単離物に対する広範な中和抗体を引き出す。このサブタイプC先祖タ
ンパク質に対する免疫原性組成物も、抗原特異的T細胞により媒介される広範な
細胞性応答を引き出す。
【００８２】 HIV先祖配列に関する最適化および半最適化配列も提供される。先祖ウイルス
配列は、特定の宿主細胞中での配列のために最適化され得る。最適化先祖配列は
非最適化配列と同一の遺伝子に関するアミノ酸配列をコードし、一方、最適化配
列は、異なるリーディングフレーム、RNA二次構造の崩壊等における補助遺伝子
の崩壊のために、合成ウイルス中で十分には機能し得ない。例えばHIV-1env配列
の最適化は、vpu、tatおよび／またはrev、および／またはRNA二次構造Rev応答
性素子（RRE）に関する補助遺伝子を崩壊し得る。
【００８３】 半最適化配列は、他の遺伝子、RNA二次構造等に及ばない配列の一部に関する
最適化配列を用いることにより調製される。このような特徴を重複する配列の一
部に関して、「非最適化」先祖配列が用いられる（例えばvpu、tat、revおよび
／またはRREを重複する領域に関して）。特定の実施態様では、HIV-1サブタイプ
BおよびCに関する半最適化先祖ウイルス配列が提供される（表5（配列番号5）お
よび表6（配列番号6）参照）。
【００８４】 他の実施態様では、先祖ウイルス配列は、広範循環変異体または地理的制限性
変異体に関して確定される。例えば、広範囲に分散される（例えば、多数の国に
または明白な地理的境界のない地域に存在する）HIV-1サブタイプについて試料
が収集され得る。同様に、地理的に（例えば、国、地域またはその他の物理的限
定領域に）制限されたHIV-1サブタイプの試料が収集される。試料中の遺伝子（
例えばgagまたはenv）の配列は、組換えDNA法（例えば）により、あるいはデー
タベース中の情報から確定される。典型的には、試料の数は、それらの一般的利
用可能性、ならびにウイルスが当該領域中で循環されていた時間（例えばウイル
スが循環されていた時間が長いほど、多様性は大きく、試料から収集される情報
は多い）によって、約20〜約50の範囲である。次に核酸またはアミノ酸である先
祖ウイルス配列が、本明細書中に記載した計算方法を用いて確定される。
【００８５】 先祖ウイルス配列をコードする核酸 本明細書に記載された方法により先祖ウイルス配列が確定されれば、組換えDN
A法を用いて、当該先祖ウイルス配列をコードする核酸を調製し得る。適切な方
法としては、（1）先祖ウイルス配列に最も類似する既存ウイルス系統を修飾す
ること；（2）より短いオリゴヌクレオチド（例えば160〜200ヌクレオチド長）
を連結することにより先祖ウイルス配列をコードする核酸を合成すること；また
は（3）これらの方法の組合せ（例えば、より発散性配列をde novoで合成しなが
ら、先祖ウイルス配列との極高度類似性を有する断片を用いて既存配列を修飾す
ることによる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】 核酸配列が生成され、ルーチン技法を用いて操作され得る（例えばSambrook e
t al.,上記、Kriegler, 上記、Ausubel et al., 上記、参照）。別記しない限り
、酵素はすべて、メーカーの使用説明書にしたがって用いられる。
【００８７】 典型的実施態様では、先祖ウイルス配列をコードする核酸は、長いオリゴヌク
レオチドを連結することにより合成される。核酸をde novoで合成することによ
り、所望の特徴が遺伝子中に容易に組入れられる。このような特徴としては、核
酸配列のさらなる操作を可能にするのに便利な制限部位、ポリペプチド配列の免
疫原性を付与し得るin vivo発現レベルを大いに強化するためのコドン頻度（例
えばヒトコドン頻度）の最適化等が挙げられるが、これらに限定されない。長い
オリゴヌクレオチドは、固相法を用いて極低誤差率で合成され得る。5‘および3
’末端の両方で20〜25ヌクレオチド相補配列を用いて設計された長いオリゴヌク
レオチドは、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼなどを用いて連結され得る。必要な
らば、合成核酸の配列は、DNA配列分析により立証され得る。
【００８８】 市販されていないオリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得る。適切な方法
としては、例えばBeaucageとCarruthers (Tetrahedron Lett. 22:1859-62(1981)
)により最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法、ならびに自
動合成機の使用（例えば、Needham Van Devanter et al., Nucleic Acids Res.
12:6159-68(1984)参照）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの精製は、例えばネ
イティブアクリルアミドゲル電気泳動によるか、またはPearsonとReanier (J. C
hrom. 255:137-49(1983))に記載されたような陰イオン交換HPLCによる。
【００８９】 核酸の配列は、例えばMaxam等（Methods in Enzymology 65: 499-560(1980)）
の化学分解法または二本鎖鋳型をシーケンシングするためのチェインターミネー
ター法（例えば、Wallace et al., Gene 16: 21-26(1981)参照）を用いて立証さ
れ得る。サザンブロットハイブリダイゼーション技法は、Southern等（J. Mol.
Biol. 98: 503(1975)）、Sambrook等（上記）またはAusubel等（上記）にしたが
って実行され得る。
【００９０】 先祖ウイルス配列の発現 先祖ウイルス配列をコードする核酸は、適切な発現ベクター（即ち、挿入ポリ
ペプチドコード配列の転写および翻訳に必要な素子を含有するベクター）中に挿
入され得る。種々の宿主ベクター系は、ポリペプチドコード配列（単数または複
数）を発現するために利用され得る。これらの例としては、例えばウイルス（例
えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルス、ベネズエラウ
マ脳脊髄炎（VEE）ウイルス等）を感染させた哺乳類細胞系、ウイルス（例えば
バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、微生物、例えば酵母ベクターを含
有する酵母、またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA
で形質転換された細菌が挙げられる。
【００９１】 ベクターの発現素子は、それらの強度および特異性が変化する。利用される宿
主−ベクター系によって、多数の適切な転写および翻訳素子のいずれかが用いら
れ得る。特定の実施態様では、先祖ウイルス配列は、ヒト細胞、その他の哺乳類
細胞、酵母または細菌中で発現される。さらに別の実施態様では、配列の免疫学
的に活性な領域を含む先祖ウイルス配列の断片が発現される。
【００９２】 発現ベクター中葉の先祖ウイルス配列をコードする核酸の挿入のために、任意
の適切な方法が用いられ得る。適切な発現ベクターは、典型的には、適切な転写
および翻訳制御シグナルを含む。適切な方法としては、in vitro組換えDNAおよ
び合成技法、ならびにin vivo組換え技法（遺伝子組換え）が挙げられる。核酸
配列の発現は、コード化核酸が組換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現さ
れるように、二次核酸配列により調節され得る。例えば、先祖ウイルス配列の発
現は、当業界で既知の適切なプロモーター／エンハンサー素子により制御され得
る。
【００９３】 適切なプロモーターとしては、例えばSV40初期プロモーター領域（Beoist and Chambon, Nature 290:304-10(1981)）、ラウス肉腫ウイルスの3‘長末端反復中
に含入されるプロモーター（Yamamoto et al., Cell 22:787-97(1980)）、ヘル
ペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U
SA 78: 1441-45 (1981)）、サイトメガロウイルスプロモーター、翻訳延長因子E
F-1αプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., Na
ture 296:39-42(1982)）、原核生物プロモーター、例えばβ-ラクタマーゼプロ
モーター（Villa-Komaroff et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-31(19
78)）またはtacプロモーター（deBoer et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 80:
21-25(1983)）、植物発現ベクター、例えばカリフラワーモザイクウイルス35SRN
Aプロモーター（Gardner et al., Nucl. Acids Res. 9:2871-88(1981)）、なら
びに光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（He
rrera-Estrella et al., Nature 310:115-20(1984)）、酵母またはその他の真菌
からのプロモーター素子、例えばGAL7およびGAL4プロモーター、ADH（アルコー
ルデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロ
モーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター等が挙げられる。
【００９４】 その他の哺乳類プロモーターの例としては、例えば、組織特異性を示す以下の
動物転写制御領域が挙げられる：膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼI遺
伝子制御領域（Swift et al., Cell 38:639-46 (1984); Ornitz et al., Cold S
pring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology
7(1 Suppl.): 42S-51S(1987)）；膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子制
御領域（Hanahan, Nature 315:115-22(1985)）；リンパ細胞中で活性である免疫
グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., Cell 38: 647-58(1984); Adam
s et al., Nature 318:533-38(1985); Alexander et al., Mol. Cell. Biol. 7:
1436-44(1987)）；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞中で活性であるマウス
乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., Cell 45:485-95(1986)）；
【００９５】 肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., Genes Dev. 1:268-76(1987)）；肝臓中で活性であるα-フェトプロテイン遺伝子制御領域（
Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-48(1985); Hammer et al., Scienc
e 235:53-58(1987)）；肝臓中で活性であるα1-抗トリプシン遺伝子制御領域（K
elsey et al., Genes and Devel. 1:161-71(1987)）；骨髄細胞中で活性である
β-グロブリン遺伝子制御領域（Magram et al., Nature 315:338-40(1985); Kol
lias et al., Cell 46:89-94(1986)）；脳の乏突起膠細胞中で活性であるミエリ
ン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., Cell 48:703-12(1987)
）；骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Shani, Nature 314:
283-86(1985)）；ならびに視床下部中で活性であるゴナドトロピン放出ホルモン
遺伝子制御領域（Mason et al., Science 234:1372-78(1986)）。
【００９６】 特定の実施態様では、先祖ウイルス配列コード核酸と操作可能的に連結される
プロモーター、1つまたはそれ以上の複製起点、ならびに任意に1つまたはそれ以
上の選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが用いられ
る。選択可能マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオ
マイシン、G418等に対する耐性を付与するものが挙げられる。発現構築物は、例
えば先祖ウイルス配列をコードする核酸をpRSECT発現ベクターの制限部位中にサ
ブクローニングすることにより作製され得る。このような構築物は、発現ポリペ
プチドのアフィニティー精製のためのヒスチジンアミノ末端フラッグ配列を用い
たT7プロモーターの制御下での先祖ウイルス配列の発現を可能にする。
【００９７】 例示的実施態様では、以下でさらに考察されるように、最大タンパク質発現を
達成するために極高効率RNA／タンパク質発現構成成分（例えばセムリキ森林熱
ウイルスから）を有する高効率性DNA伝達ベクター（pJW4304 SV40/EBVベクター
）を用いる高効率性発現系が用いられ得る。pJW4304SV40/EBVは、Robinson等（A
nn. New York Acad. Sci. 27:209-11(1995)）およびYasutomi等（J. Virol. 70:
678-81(1996)）により記載されているpJW4303から調製される。
【００９８】 先祖ウイルス配列を発現する発現ベクター／宿主系は、当業者に周知の一般的
アプローチにより、例えば（a）核酸ハイブリダイゼーション、（b）「マーカー
」遺伝子機能の存在または非存在、（c）挿入配列の発現、あるいは（d）標準組
換えDNA法による形質転換化細胞のスクリーニングにより同定され得る。第一の
アプローチでは、宿主細胞中に挿入された先祖ウイルス配列核酸の存在は、挿入
核酸と相同である配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによ
り検出され得る。
【００９９】 第二のアプローチでは、発現ベクター／宿主系は、所望の核酸を含有するベク
ターの挿入により引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能（例えばチミ
ジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス
中での閉塞体形成等）の存在または非存在に基づいて同定され、選択され得る。
例えば、核酸がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、先祖ウイル
ス配列を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る
。
【０１００】 第三のアプローチでは、発現ベクター／宿主系は、組換え宿主生物により発現
される先祖ウイルス配列ポリペプチドに関して検定することにより同定され得る
。このような検定は、例えば、in vitro検定系における先祖ウイルス配列ポリペ
プチドの物理的または機能的特性（例えば抗体による結合）を基礎にし得る。第
四のアプローチでは、発現ベクター／宿主細胞は、既知の組換えDNA法により形
質転換化宿主細胞をスクリーニングすることにより同定され得る。
【０１０１】 適切な発現ベクター宿主系および増殖状態が一旦確立されれば、当業界で既知
の方法を用いてそれを増殖させ得る。さらに、挿入核酸配列の発現を調整する、
あるいは所望の特定の方式で遺伝子産物を修飾またはプロセシングする宿主細胞
が選択され得る。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘導物質の存在
下で増大され得る；したがって先祖ウイルス配列の発現が制御され得る。さらに
、ポリペプチドの翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えばグリコシル
化またはリン酸化）のための特徴的および特異的メカニズムを有する異なる宿主
細胞が用いられ得る。適切な細胞株または宿主系が選定されて、発現ポリペプチ
ドの所望の修飾およびプロセシングを保証する。例えば、細菌系における発現を
用いて、非グリコシル化ポリペプチドを生成し得る。
【０１０２】 先祖タンパク質 本発明はさらに、確定先祖ウイルス配列を基礎にした先祖タンパク質に関する
。このような先祖タンパク質としては、例えば全長タンパク質、ポリペプチド、
その断片、誘導体および類似体が挙げられる。一局面において、本発明は先祖タ
ンパク質のアミノ酸配列を提供する（例えば、表2および4；配列番号2；配列番
号4参照）。いくつかの実施態様では、先祖タンパク質は機能的に活性である。
先祖タンパク質、断片、誘導体および類似体は、典型的には所望の免疫原性また
は抗原性を有し、そして、例えばイムノアッセイに、免疫感作に、ワクチン等に
用いられ得る。特定の実施態様は、抗体に結合され得る先祖タンパク質、断片、
誘導体または類似体に関する。このような先祖タンパク質、断片、誘導体または
類似体は、当業界で既知の手法により、所望の免疫原性に関して試験され得る（
例えば、Harlow and Lane、上記、参照）。
【０１０３】 別の局面では、先祖タンパク質の少なくとも8〜10連続アミノ酸を有する断片
からなるかまたはそれを含むポリペプチドが提供される。他の実施態様では、断
片は先祖タンパク質の少なくとも20または50連続アミノ酸を含む。その他の実施
態様では、断片は35、100または200アミノ酸以下である。
【０１０４】 先祖タンパク質誘導体および類似体は、当業界で既知の種々の方法により製造
され得る。それらの産生を生じる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こ
り得る。例えば先祖タンパク質をコードする核酸は、当業界で既知の多数の戦略
のいずれかにより（例えば、Sambrook et al., 上記、参照）、例えば保存的置
換、欠失、挿入等を作製することにより修飾され得る。核酸配列は、制限エンド
ヌクレアーゼ（単数または複数）を用いて適切な部位で切断され、その後さらに
酵素修飾され、所望により単離され、そしてin vitroで結繋され得る。
【０１０５】 先祖タンパク質の断片、誘導体または類似体をコードする核酸の産生に際して
、リーディングフレームが翻訳停止シグナルあるいは断片、誘導体または類似体
の合成を妨げるその他のシグナルにより中断されないように、修飾化核酸は典型
的には適正翻訳リーディングフレーム内に残存する。先祖ウイルス配列核酸は、
in vitroまたはin vivoでも突然変異化されて、翻訳開始および／または終止配
列を作製および／または破壊し得る。先祖ウイルス配列コード核酸は突然変異化
されて、コード領域内に変異を作製し、および／または新規の制限エンドヌクレ
アーゼ部位を形成するかまたは既存のものを破壊し、そしてさらにin vitro修飾
を促し得る。当業界で既知の突然変異誘発のための任意の技法が用いられ得るが
、その例としては、化学的突然変異誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発等が
挙げられる（これらに限定されない）。
【０１０６】 先祖ウイルス配列の操作は、タンパク質レベルでなされ得る。本発明の範囲内
に含まれるのは、合成中または合成後に区別的に修飾される（例えばin vivoま
たはin vitro翻訳）先祖タンパク質断片、誘導体または類似体である。このよう
な修飾としては、保存的置換、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化
、既知の保護／遮断基による誘導化、タンパク質分解的切断、抗体分子またはそ
の他の細胞性リガンドとの連結等が挙げられる。多数の化学的修飾のいずれかが
、既知の技法により実行され、その例としては特異的化学切断（例えば臭化シア
ンによる）；酵素的切断（例えばトリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プ
ロテアーゼ等による）；例えばNaBH4アセチル化、ホルミル化、酸化および還元
による修飾；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成等が挙げられる。
【０１０７】 さらに、先祖タンパク質の断片、誘導体および類似体は、化学的に合成され得
る。例えば、所望のドメインを含む先祖タンパク質の一部または断片に対応する
ペプチドは、例えば自動ペプチド合成機を用いた化学的合成法の使用により合成
され得る（Hunkapiller et al., Nature 310:105-11(1984); Stewart and Young
, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford,
IL, (1984)も参照）。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的ア
ミノ酸類似体が、置換または付加としてポリペプチド配列中に導入され得る。
【０１０８】 非古典的アミノ酸としては、一般的アミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸
，4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-ア
ミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリ
ン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラ
ニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、セロノシス
テイン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ-メチルアミノ酸、C
α-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、ならびにその他のアミノ酸類似体が
挙げられるが、これらに限定されない。さらにアミノ酸は、D（右旋性）またはL
（左旋性）であり得る。
【０１０９】 先祖タンパク質、断片、誘導体または類似体は、そのアミノまたはカルボキシ
末端で、ペプチド結合により異なるタンパク質のアミノ酸配列と連結される先祖
タンパク質、その断片、誘導体または類似体（典型的には先祖タンパク質の少な
くとも一ドメインまたはモチーフ、あるいは先祖タンパク質の少なくとも10連続
アミノ酸からなる）を含むキメラまたは融合タンパク質でもあり得る。一実施態
様では、このようなキメラタンパク質は、キメラタンパク質をコードする核酸の
組換え体発現により産生される。キメラ核酸は、適切な核酸配列を適正リーディ
ングフレーム内で互いに結繋し、そして当業界で一般に既知の方法によりキメラ
産物を発現することにより作製され得る。あるいは、キメラタンパク質は、タン
パク質合成技法により（例えば自動ペプチド合成機の使用により）製造され得る
。
【０１１０】 先祖タンパク質は、標準的方法により、例えばクロマトグラフィー（例えば、
イオン交換、アフィニティー、サイジングカラムクロマトグラフィー、高圧液体
クロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度により、またはタンパク質の精製
のための任意のその他の標準技法により単離され、精製され得る。
【０１１１】 先祖タンパク質、断片、誘導体および類似体に対する抗体 先祖タンパク質（その断片、誘導体および類似体を含む）は、このような先祖
タンパク質を、ならびに循環変異体と免疫特異的に結合する抗体を生成するため
の免疫原として用いられ得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合抗体断片（例えばFab
、Fab‘、F(ab’)2、Fvまたは超可変部）ならびにFab発現ライブラリーが挙げら
れるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、先祖タンパク質に対
するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が産生される。他の実施
態様では、先祖タンパク質の一ドメインに対する抗体が産生される。さらに他の
実施態様では、免疫原性（例えば親水性）と同定される先祖タンパク質の断片は
、抗体製造のための免疫原として用いられる。
【０１１２】 当業界で既知の種々の手法は、ポリクローナル抗体の製造のために用いられ得
る。このような抗体の製造のためには、種々の宿主動物（例えばウサギ、マウス
、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等が挙げられるが、これらに限定されない）は
、先祖タンパク質、断片、誘導体または類似体を用いた注射により免疫感作され
得る。宿主種によって種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大し得るが
、その例としては、フロイントアジュバント（完全および不完全）、無機ゲル、
例えば水酸化亜アルミニウム、界面活性剤、例えばリソレシチン、プルロニック
ポリオール、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルション、カギアナカサガイ
ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに有用であると考えられるヒトアジ
ュバント、例えばBCG（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム属のC
orynebacterium parvumが挙げられる（これらに限定されない）。
【０１１３】 先祖タンパク質、その断片、誘導体または類似体に向けられるモノクローナル
抗体の調製に関しては、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任
意の技法が用いられ得る。このような技法としては、例えばKohlerとMilstein（
例えば、Nature 256:495-97(1975)参照）により最初に開発されたハイブリドー
マ技法、トリオーマ技法（例えば、Hagiwara and Yuasa, Hum, Antibodies Hybr
idomas. 4:15-19(1993); Hering et al., Biomed. Biochim. Acta 47:211-16(19
88)参照）、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（例えば、Kozbor et al., Immunolog
y Today 4:72(1983)参照）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するための
EBV-ハイブリドーマ技法（例えば、Cole et al., In: Monoclonal Antibodies a
nd Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., pp. 77-96(1985)参照）、が挙げられ
る。ヒト抗体が用いられ、そしてヒトハイブリドーマ（例えば、Cote et al., P
ro. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-30(1983)参照）を用いることにより、また
はin vitroでEBVウイルスでヒトB細胞を形質転換する（例えば、Cote et al.,上
記、参照）ことにより得られる。
【０１１４】 さらに本発明のために、「キメラ」または「ヒト化」抗体（例えば、Morrison
et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55(1984); Neuberger et al., N
ature 312:604-08(1984); Takeda et al., Nature 314:452-54(1985)参照）が調
製され得る。このようなキメラ抗体は、典型的には、適切な生物学的活性のヒト
抗体分子からの遺伝子と一緒に、先祖タンパク質に特異的な抗体分子に関する非
ヒト遺伝子をスプライシングすることにより調製される。非ヒト抗体の抗原結合
領域（例えばFab‘、F(ab’)2、Fab、Fvまたは超可変部）を、実質的ヒト分子を
産生するために組換えDNA技法によりヒト抗体の枠組み構造中に移すことが望ま
しい。
【０１１５】 このような「キメラ」分子の製造方法は一般的に周知であり、例えば、米国特
許第4,816,567号、第4,816,397号、第5,693,762号および第5,712,120号；国際特
許公告WO 87/02671およびWO 90/00616；ならびに欧州特許公告EP 239 400（これ
らの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されている。
【０１１６】 あるいはヒトモノクローナル抗体またはその一部は、Huse等（Science 246:12
75-81(1989)）により一般的に記述された方法にしたがって先祖タンパク質と特
異的に結合する抗体をコードするDNA分子に関して、先ずヒトB細胞cDNAライブラ
リーをスクリーニングすることにより同定され得る。次にDNA分子がクローン化
され、所望の特異性を有する抗体（または結合ドメイン）をコードする配列を得
るために増幅され得る。ファージ表示技法は、先祖タンパク質、その断片、誘導
体または類似体と結合する抗体を選定するためのもうひとつの技法を提供する（
例えば、国際特許公告WO 91/17271およびWO 92/01047；Huse et al., 上記、参
照）。
【０１１７】 本発明の別の観点によれば、一本鎖抗体の産生に関して記載された技法（例え
ば、米国特許第4,946,778号および第5,969,108号参照）は、一本鎖抗体を産生す
るために適応され得る。本発明の付加的局面は、Fab発現ライブラリーの構築に
関して記載された技法（例えば、Huse et al., 上記、参照）を利用して、先祖
タンパク質、その断片、誘導体または類似体に対する所望の特異性を有するモノ
クローナルFab断片の迅速且つ容易な同定を可能にする。
【０１１８】 分子のイディオタイプを含有する抗体は、既知の技法により生成され得る。例
えば、このような断片としては、抗体分子のペプシン消化により産生され得るF(
ab‘)2断片、F(ab‘)2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成され得
るFab’断片、パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生成され
得るFab断片、ならびにFv断片が挙げられるが、これらに限定されない。組換えF
v断片も、例えば米国特許第5,965,405号に記載された方法を用いて真核生物細胞
中で産生され得る。
【０１１９】 抗体の産生において、所望の抗体に関するスクリーニングは、当業界で既知の
技法（例えばELISA（酵素結合イムノソルベント検定））により成し遂げられ得
る。一例において、先祖タンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を用いて、
そのドメインを含有するポリペプチドと結合する物質に関して生成されたハイブ
リドーマを検定し得る。先祖タンパク質のドメインに特異的な抗体も提供される
。
【０１２０】 先祖タンパク質（断片、誘導体および類似体を含む）に対する抗体は、当業界
で既知の方法にしたがって、受動抗体処理のために用いられ得る。抗体は、ウイ
ルス感染を予防または治療するために個体に導入され得る。典型的にはこのよう
な抗体療法は、ワクチン接種プロトコールに対するアジュバントとして実施され
る。抗体は前記と同様に製造され、そしてポリクローナルまたはモノクローナル
抗体であり得るし、静脈内に、腸内に（例えば腸溶性被覆錠剤形態として）、エ
ーロゾルにより、経口的に、経皮的に、経粘膜的に、胸膜腔内に、鞘内に、また
はその他の適切な経路により投与され得る。
【０１２１】 免疫学的組成物およびワクチン 本発明は、免疫学的組成物、例えばワクチンも提供する。本発明の配列を用い
るワクチン（「デジタルワクチン」）の開発の一例は、図4に示されている。本
発明は、HIV先祖ウイルス配列（例えばHIVenvまたはgag遺伝子またはポリペプチ
ド）を用いてワクチンを製造するための新しい方法も提供する。このような先祖
ウイルス配列は、典型的には、実際の生物学的存在−創始ウイルス（即ち「ウイ
ルスのイブ」）の構造に対応する。
【０１２２】 処方物 免疫原的有効量の1つまたはそれ以上の先祖ウイルスタンパク質配列あるいは
その断片、誘導体または類似体を含有する免疫原性組成物およびワクチンが提供
される。先祖タンパク質配列中の免疫原性エピトープは当業界で既知の方法によ
り同定され、それらのエピトープを含有するタンパク質、断片、誘導体または類
似体は、種々の方法により、ワクチン組成物中に送達され得る。適切な組成物と
しては、例えばリポペプチド（例えば、Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95
:341(1995)）、ポリ（DL-ラクチド−コグリコリド)(「PLG」）微小球中に封入さ
れたペプチド組成物（例えば、Eldridge et al., Molec. Immunol. 28:287-94(1
991); Alonso et al., Vaccine 12:299-306(1994); Jones et al., Vaccine 13:
675-81(1995)参照）、
【０１２３】 免疫刺激複合体（ISCOMS）中に含入されたペプチド組成物（例えば、Takahash
i et al., Nature 344:873-75(1990); Hu et al., Clin. Exp. Immunol. 113:23
5-43(1998)参照）、多重抗原ペプチド系（MAP)(例えば、Tam, Pro. Natl. Acad.
Sci. USA. 85:5409-13(1988); Tam, J. Immunol. Methods 196:17-32(1996)参
照）、ウイルス送達ベクター（例えば、Perkus et al., In: Concepts in vacci
ne development, Kaufmann(ed.), p.379(1996)参照）、ウイルスまたは合成期限
の粒子（例えば、Kofler et al., J. Immunol. Methods. 192:25-35(1996);
【０１２４】 Eldridge et al., Sem. Hematol. 30: 16 (1993); Falo et al., Nature Med.
7:649(1995)参照）、アジュバント（例えば、Warren et al., Annu. Rev. Immu
nol. 4:369(1986); Gupta et al., Vaccine 11:293(1993)参照）、リポソーム（
例えば、Reddy et al., J. Immunol. 148:1585(1992); Rock, Immunol. Today 1
7:131(1996)参照）、あるいは裸または粒子吸収cDNA（例えば、Shiver et al.,
In: Concepts in vaccine development, Kaufmann(ed.), p.423(1996)参照）が
挙げられる。受容体媒介性ターゲッティングとしても既知の毒素標的化送達技法
、例えばAvant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts)のものも
用いられ得る。
【０１２５】 さらに、本発明の免疫原性組成物およびワクチンとともに用いられ得る有用な
担体は当業界で周知であり、その例としては、例えばチログロブリン、アルブミ
ン、例えばヒト血清アルブミン、破傷風毒素、ポリアミノ酸、例えばポリL-リシ
ン、ポリL-グルタミン酸、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質等
が挙げられる。組成物およびワクチンは、生理学的耐容性（即ち許容可能な）希
釈剤、例えば水または食塩水、典型的にはリン酸塩緩衝化生理食塩水を含有し得
る。
【０１２６】 組成物およびワクチンは、典型的にはアジュバントも含む。アジュバント、例
えば不完全フロイントアジュバント、燐酸アルミニウム、水酸化アルミニウムま
たはミョウバンは、当業界で周知の物質の例である。さらに、本明細書中に開示
されているように、CTL応答は、先祖タンパク質（またはその断片、誘導体また
は類似体）を脂質、例えばトリパルミトイル-S-グリセリルシステイニル−セリ
ル−セリン（P3CSS）と接合させることにより用意され得る。
【０１２７】 本明細書中にさらに詳細に開示されているように、注射、エーロゾル、経口、
経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内またはその他の適切な経路により、本発明にした
がって先祖ウイルス配列タンパク質組成物を含有する組成物またはワクチンで免
疫感作する場合、宿主の免疫系は、大量のCTL、HTLおよび／または所望の抗原に
特異的な抗体を産生することにより組成物またはワクチンに応答する。したがっ
て宿主は、典型的には、後の感染に対して少なくとも部分的に免疫になるか、ま
たは進行中の慢性感染の発症に対して少なくとも部分的に耐性になるか、あるい
は少なくとも何らかの治療利益を得る。
【０１２８】 治療的または予防的免疫感作に関しては、先祖タンパク質（断片、誘導体およ
び類似体を含む）は、ウイルスまたは細菌ベクターによっても発現され得る。発
現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアまたは鶏痘が
挙げられる。一実施態様では、このアプローチは、例えばポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの
使用を包含する。急性または慢性感染宿主中への、あるいは非感染宿主中への導
入時に、組換えワクシニアウイルスは免疫原性タンパク質を発現し、それにより
宿主CTL、HTLおよび／または抗体応答を引き出す。
【０１２９】 免疫感作プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例え
ば米国特許第4,722,848号（この開示内容は、参照により本明細書中に含まれる
）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫感作に有用な広
範な種々のその他のベクター、例えばアデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター
、レトロウイルスベクター、ネズミチフス菌ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクタ
ー、アルファウイルス等も、本明細書中の説明から当業者に明らかになるように
、用いられ得る。用いられ得るアルファウイルスベクターとしては、例えばシン
ドビスおよびベネズエラウマ脳脊髄炎（VEE）ウイルスが挙げられる（例えば、C
oppola et al., J. Gen. Virol. 76:635-41(1995); Caley et al., Vaccine 17:
3124-35(1999); Loktev et al., J. Biotechnol. 44:129-37(1996)参照）。
【０１３０】 1つまたはそれ以上の先祖タンパク質（断片、誘導体または類似体を含む）を
コードするポリヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）も、患者に投与され得る。
このアプローチは、例えばWolff等（Science 247:1465(1990)）に、米国特許第5
,580,859号、第5,589,466号、第5,804,566号、第5,739,118号、第5,736,524号、
第5,679,647号およびWO 98/04720に、そして以下で詳細に記載されている。DNA
ベースの送達技法の例としては、「裸DNA」、促進（ブピビカイン、ポリマーま
たはペプチド媒介性）送達、陽イオン性脂質複合体、粒子媒介性（「遺伝子銃」
）または圧力媒介性送達（例えば、米国特許第5,922,687号参照）が挙げられる
。
【０１３１】 ワクチン接種の一手段としてのタンパク質抗原をコードする裸プラスミドDNA
の直接注入は、過去10年間に開発されたいくつかのHIV送達および発現系の中で
、大いに注意を引くものである。マウスモデルでは、ならびに大型動物モデルに
おいては、体液性および細胞性の両免疫応答が容易に誘導されて、いくつかの場
合には試験感染に対する防御免疫を生じる。セムリキ森林熱ウイルス（SFV）レ
プリコンも、例えば裸DNA免疫感作の情況において用いられ得る。SFVは、アルフ
ァウイルス科に属し、この場合ゲノムは、それ自体のレプリカーゼをコードする
正の極性を有する一本鎖RNAからなる。
【０１３２】 SFV構造遺伝子を当該遺伝子に取り替えることにより、総細胞タンパク質の25%
という高い発現レベルが得られる。プラスミドベクターを上回るこのアルファウ
イルスのもうひとつの利点は、その非持続性である。当該抗原は、高レベルで、
しかし短期間（典型的には<72時間）発現される。これに対比して、プラスミド
ベクターは一般に、長時間に亘って当該抗原の合成を誘導し、外来DNAおよび細
胞形質転換の染色体組込みを危険に曝す。さらに抗原持続性または少量の抗原の
反復接種は、寛容を誘導することが実験的に示されている。したがって長期抗原
合成は、理論的に、免疫よりむしろ非応答性を生じ得る。
【０１３３】 先祖タンパク質、断片、誘導体および類似体は、in vivoまたはex vivoでも被
験者に導入され得る。例えば先祖ウイルス配列は、限定細胞集団中に導入され得
る。遺伝子導入のための適切な方法としては、例えば以下のものが挙げられる： 1）直接遺伝子導入（例えば、Wolff et al., Science 247: 1465-68(1990)参
照）。 2）リポソーム媒介性DNA導入（例えば、Caplen et al., Nature Med. 3:39-46
(1995); Crystal, Nature Med. 1:15-17(1995); Gao and Huang, Biochem. Biop
hys. Res. Comm. 179:280-85(1991)参照）。
【０１３４】 3）レトロウイルス媒介性DNA導入（例えば、Kay et al., Science 262:117-19
(1993); Anderson, Science 256:808-13(1992)参照）。レトロウイルスプラスミ
ドベクターが得られるレトロウイルスとしては、レンチウイルスが挙げられる。
それらの例としてはさらに、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス
、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白
血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性
肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】 一実施態様では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーネズミ白血
病ウイルスから得られる。遺伝子両方におけるレトロウイルスベクターの使用を
示す例としては、以下のものが挙げられる：Clowes et al.(J. Clin. Invest. 9
3:644-51(1994); Kiem et al.(Blood 83:1467-73(1994); Salmons and Gunzberg
(Human Gene Therapy 4:129-41(1993);およびGrossman and Wilson(Curr. Opin.
In Genetics and Devel. 3:110-14(1993))。
【０１３６】 4）DNAウイルス媒介性DNA導入。このようなDNAウイルスとしては、アデノウイ
ルス（例えばAd-2またはAd-5ベースのベクター）、ヘルペスウイルス（典型的に
は単純ヘルペスウイルスベースのベクター）およびパルボウイルス（例えば「欠
陥」または非自律性パルボウイルスベースのベクターまたはアデノ随伴ウイルス
ベースのベクター、例えばAAV-2ベースのベクター)(例えば、Ali et al., Gene
Therapy 1:367-84(1994)；米国特許第4,797,368号および第5,139,941号参照）（
これらの開示内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【０１３７】 アデノウイルスは、広範な宿主範囲を有し、静止性または末期的分化細胞、例
えばニューロンまたは肝細胞を感染し得るし、本質的に非癌性と思われる。アデ
ノウイルスは、宿主ゲノム中に組み込まれるとは思えない。それらは染色体外に
存在するため、挿入性突然変異誘発の危険は大いに低減される。アデノ随伴ウイ
ルスは、アデノウイルスベースのベクターと同様の利点を示す。しかしながらAA
Vは、ヒト第19染色体上での部位特異的組込みを示す。
【０１３８】 KozarskyとWilson（Current Opinion in Genetics and Development 3:499-50
3(1993)）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法の再検討を示す。Bout等（Hum
an Gene Therapy 5:3-10(1994)）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入する
ためのアデノウイルスベクターの使用を実証する。Herman等（Human Gene Thera
py 10:1239-49(1999)）は、段階I臨床試験におけるヒト前立腺中への単純ヘルペ
スチミジンキナーゼ遺伝子を含有する複製欠陥アデノウイルスの前立腺内注入と
、その後のプロドラッグガンシクロビルの静脈内投与を記載する。遺伝子療法に
おけるアデノウイルスの使用のその他の例は、Rosenfeld等（Science 252:431-3
4(1991)）；Rosenfeld等（Cell 68:143-55(1992)）；Mastrangeli等（J. Clin.
Invest. 91:225-34(1993)）；Thompson（Oncol. Res. 11:1-8(1999)）に見出さ
れ得る。
【０１３９】 当該先祖ウイルス配列を導入するための特定のベクター系の選定は、種々の因
子によっている。重要な一因子は、標的細胞集団の性質である。レトロウイルス
ベクターは広範に研究され、そして多数の遺伝子療法用途に用いられてきたが、
しかしこれらのベクターは一般に、非分裂中細胞を感染するには適していない。
さらにレトロウイルスは、腫瘍原性に対する潜在性を有する。しかしながらレン
チウイルスベクターの分野における近年の発達は、これらの制限のいくつかを阻
止し得る（Naldini et al., Science 272:263-67(1996)参照）。
【０１４０】 先祖タンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体をコードする核酸を含
有する任意の適切な発現ベクターは本発明にしたがって用いられ得る、と当業者
は理解する。このようなベクターを構築するための技術は既知である（例えば、
Anderson, Nature 392:25-30(1998); Verma, Nature 389:239-42(1998)参照）。
標的部位へのベクターの導入は、既知の技法を用いて成し遂げられ得る。
【０１４１】 もうひとつの実施態様では、DNA導入ベクター（pJW4304SV40/EBVベクター（pJ
W4304SV40/EBVベクターは、Robinson et al., Ann. New York Acad. Sci. 27:20
9-11(1995)およびYasutomi et al., J. Virol. 70: 678-81 (1996)により記載さ
れているpJW4303から調製された））を用いる新規発現系は、極高高効率性RNA/
タンパク質発現系（セムリキ森林熱ウイルス）とともに、安全且つ安価なワクチ
ンを用いてワクチン接種された宿主細胞中での最大タンパク質発現を達成するた
めに用いられる。SFVcDNAは、例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター
の制御下に置かれる（図7参照）。慣用的DNAベクターと違って、CMVプロモータ
ーは、抗原コード核酸の発現を直接駆動しない。
【０１４２】 代わりにそれは、組換えSFVレプリコンRNA転写体の合成を指図する。このRNA
分子の翻訳は、組換えRNAの細胞質自己増幅を触媒するSFVレプリカーゼ複合体を
生成し、その結果として実際的抗原コードmRNAを高レベルで生成する。ベクター
送達後、トランスフェクト化宿主細胞は2〜3日以内に死ぬ。本発明の情況では、
envおよび／またはgag遺伝子は典型的にはこのベクター中でクローン化される。
ノーザンブロット、ウエスタンブロット、SDS-PAGE、免疫沈降検定およびCD4結
合検定を用いるin vitro実験は、タンパク質発現レベル、タンパク質特性、発現
持続時間およびベクターの細胞障害作用を査定することによりこの系の効率を確
定するために、下記のように実施され得る。
【０１４３】 いくつかの実施態様では、先祖タンパク質（その断片、誘導体または類似体を
含む）は、それを必要とする被験者に投与される。初期治療的免疫感作のための
投与量は一般に、低いほうの値が約1、5、50、500または1,000 μgおよび高いほ
うの値が10,000、20,000、30,000または50,000 μgである単位投与量範囲で生じ
る。ヒトに関する投与量値は、典型的には約500 μg〜50,000 μg／70 kg患者の
範囲である。数週間〜数ヶ月に亘る増強レジメンに準じた約1.0 μg〜約50,000
μgのポリペプチドの増強投与量は、患者の血液から得られたCTLおよびHTLの抗
体レベルまたは特異的活性を測定することにより確定した場合の患者の応答およ
び症状によって投与され得る。
【０１４４】 ヒト単位用量形態のタンパク質または核酸組成物は、典型的には、ヒト単位用
量の許容可能担体、典型的には水性担体を含む製剤組成物中に含入され、そして
ヒトへのこのような組成物の投与のために用いられることが当業者に既知である
流体容積中に投与される（例えば、Remington “Pharmaceutical Sciences”, 1
7 Ed., Gennaro (ed.), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania(1985)参
照）。
【０１４５】 先祖タンパク質および核酸は、リポソームを介しても投与され、これは特定組
織、例えばリンパ組織に対してペプチドを標的化するのに、あるいは感染細胞に
対して選択的に標的化するのに、ならびに組成物の半減期を増大するのに役立つ
。リポソームとしては、エマルション、発泡体、ミセル、不溶性単一層、液体結
晶、リン脂質分散液、薄板層等が挙げられる。これらの調製において、送達され
るタンパク質または核酸は、単独でまたはリンパ細胞の間で流布している受容体
と結合する分子、例えばCD45抗原と結合するモノクロナール抗体と一緒に、ある
いはその他の治療用または免疫原性組成物と一緒に、リポソームの一部として組
入れられる。
【０１４６】 したがって、所望のタンパク質または核酸で満たされたまたは装飾されたリポ
ソームは、リンパ細胞の部位に向けられ、そこでは、リポソームは次に、タンパ
ク質組成物を細胞に送達する。本発明にしたがって用いるためのリポソームは、
一般的に中性および陰性荷電リン脂質およびステロール、例えばコレステロール
を含入する標準小胞形成脂質から生成される。脂質の選定は、一般的には、例え
ばリポソームサイズ、酸不安定性および血流中のリポソームの安定性の考慮によ
り導き出される。種々の方法は、例えばSzoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bio
eng. 9:467(1980)ならびに米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,02
8号および第5,091,369号に記載されたように、リポソームを調製するために利用
可能である。
【０１４７】 免疫系の細胞をターゲッティングするために、リポソーム中に組入れられるリ
ガンドとしては、例えば所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体また
はその断片が挙げられ得る。タンパク質または核酸を含有するリポソーム懸濁液
は、例えば静脈内に、局部的に、局所的等で、とりわけ投与方法、送達中のタン
パク質または核酸等によって変わる用量で、投与され得る。
【０１４８】 固体組成物に関しては、慣用的非毒性固体担体が用いられ、その例としては例
えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシ
ウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、
炭酸マグネシウム等が挙げられる。経口投与に関しては、通常用いられる賦形剤
、例えば前記の担体、および一般的に10〜95%の、典型的には25%〜75%の濃度で
の活性成分、即ち先祖タンパク質または核酸のいずれかを組入れることにより、
製薬上許容可能な非毒性組成物が生成される。
【０１４９】 エーロゾル投与に関しては、免疫原性タンパク質または核酸は、典型的には微
粉砕形態で、界面活性剤および噴射剤とともに存在する。ペプチドの適切なパー
センテージは約0.01重量%〜20重量%、典型的には約1重量%〜10重量%である。界
面活性剤は、もちろん非毒性であり、そして典型的には噴射剤中で可溶性である
。このような作用物質の代表は、約6〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸のエス
テルまたは部分エステル、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミ
チン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸およびオレイン
酸であって、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を伴う。混合エステル
、例えば混合または天然グリセリドが用いられ得る。界面活性剤は、組成物の約
0.1重量%〜約20重量%、典型的には0.25〜5%を構成し得る。組成物の残余は、普
通は噴射剤である。例えば鼻腔内送達のためにレシチンを用いるように、所望に
より担体も含入され得る。
【０１５０】 先祖ウイルス配列により引き出される免疫応答 先祖タンパク質（断片、誘導体および類似体を含む）は、上記のようにワクチ
ンとして用いられ得る。「デジタルワクチン」と呼ばれるこのようなワクチンは
、典型的には、既存ウイルスの任意の配列によりまたはコンセンサス配列により
コードされるタンパク質抗原を含むワクチンより大きい循環系統の分画に対する
中和抗体および／またはウイルス（例えばHIV）特異的CTLを引き出すものに関し
てスクリーニングされる。このようなデジタルワクチンは、典型的には、先祖ウ
イルス配列が得られたサブタイプと同一のウイルス（例えばHIV-1ウイルス）の
サブタイプにより試験された場合に、防御を提供する。
【０１５１】 本発明は、先祖ウイルス遺伝子配列の機能を分析するための方法も提供する。
例えば一実施態様では、gp160先祖ウイルス遺伝子配列は、例えばCD4結合、補助
受容体結合、受容体特異性（例えばCCR5受容体との結合）、タンパク質構造およ
び細胞融合を引き起こす能力といった機能に関する検定により分析される。先祖
配列は成育可能ウイルスを生じ得るが、しかしこのような成育可能ウイルスは好
結果のワクチンを売るためには必要でない。例えば正確に折りたたまれないgp16
0先祖は、普通は免疫系に埋もれさせるエピトープを曝露することにより、より
免疫原性になり得る。さらに先祖ウイルス配列はワクチンとして首尾よく用いら
れ得るが、しかしこのような配列は、免疫原（例えばワクチン）として用いられ
る場合、tatまたはrevのようなタンパク質をコードする代替的オープンリーディ
ングフレームを含む必要がない。
【０１５２】 したがって一つの観点では、マウスは先祖タンパク質で免疫感作され、体液性
および細胞性免疫応答に関して試験される。典型的には、5〜10匹のマウスが、
例えば50 μl容量中に先祖ウイルス配列をコードするgagおよび／またはenv遺伝
子を含有するプラスミドを皮内または筋内注射される。2つの対照群は、典型的
にはその結果を説明するために用いられる。一対照群は、標準実験室系統（例え
ばHIV-1-IIIB）からのgagまたはenv遺伝子を含有する同一ベクターを注射される
。第二対照群は、いかなる挿入物も有さない同一ベクターを注射される。
【０１５３】 Gagまたはenvタンパク質に対する抗体滴定は、下記のように、標準イムノアッ
セイ（例えばELISA）を用いて実施される。中和抗体は、サブタイプ特異的実験
室HIV-1系統、例えばpNL4-3（HIV-1-IIIB）、ならびにHIV-1感染個体からの一次
単離物により分析される。広範な一次単離物を中和する先祖ウイルス配列タンパ
ク質誘導中和抗体の能力は、免疫原性またはワクチン組成物を示す一因子である
。同様の研究は、大型動物、例えば非ヒト動物（例えばマッカク属サル）または
ヒトで実施され得る。
【０１５４】 先祖タンパク質誘導抗体を滴定するためのイムノアッセイ 試料中の抗体を検出するための当業者に既知の種々の検定がある（例えば、Ha
rlow and Lane,上記、参照）。概して、先祖タンパク質ワクチンで免疫感作され
た被験者中の抗体の存在または非存在は、（a）免疫感作被験者から得られた生
物学的試料を1つまたはそれ以上の先祖タンパク質（その断片、誘導体または類
似体を含む）と接触させ；（b）先祖タンパク質（単数または複数）と結合する
抗体のレベルを試料中で検出し；そして（c）抗体のレベルを予定カットオフ値
と比較することにより確定され得る。
【０１５５】 典型的実施態様では、検定は、試料からの抗体と結合しそして除去するために
固体支持体上に固定された先祖タンパク質（断片、誘導体または類似体を含む）
の使用を包含する。結合抗体は次に、レポーター基を含有する検出試薬を用いて
検出され得る。適切な検出試薬としては、抗体／先祖タンパク質複合体およびレ
ポーター基で標識された遊離タンパク質と結合する抗体を含む（例えば半競合検
定において）。あるいは、当該先祖タンパク質と結合する抗体がレポーター基で
標識され、抗原を試料とともにインキュベートした後に免疫感作抗原との結合を
可能にされる競合検定が利用され得る。試料の構成成分が当該先祖タンパク質と
の標識化抗体の結合を抑制する程度は、免疫感作か先祖タンパク質との試料の反
応性を示す。
【０１５６】 抗原が取り付けられ得る固体支持体は、当業者に既知の任意の固体物質であり
得る。例えば固体支持体は、微小滴定プレート中の試験ウエル、あるいはニトロ
セルロースまたはその他の適切な膜であり得る。あるいは支持体は、ビーズまた
は円板、例えばガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはプラスチック材料、例え
ばポリスチレンまたはポリビニルクロリドであり得る。支持体は、磁気粒子また
は繊維光学センサー、例えば米国特許第5,359,681号（この記載内容は、参照に
より本明細書中に含まれる）に開示されているものであり得る。
【０１５７】 先祖タンパク質は、当業者に既知の種々の技法を用いて固体支持体に結合され
得る（これは特許および科学文献中に詳細に記載されている）。本発明の情況に
おいて、「結合された」という用語は、非共有結合、例えば吸着、ならびに共有
結合の両方を指す（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook,
at A12-A13(1991)参照）。
【０１５８】 ある種の実施態様では、検定は酵素結合イムノソルベント検定（ELISA）であ
る。この検定は、当該先祖タンパク質を認識する試料内に存在する抗体が固定タ
ンパク質と結合されるように、まず、固体支持体上に、一般的には微小滴定プレ
ートのウエル上に固定された先祖タンパク質を試料と接触させることにより実施
され得る。次に非結合試料を固定先祖タンパク質から除去し、固定抗体−タンパ
ク質複合体と結合し得る検出試薬が付加される。次に固体支持体に結合されたま
まの検出試薬の量が、特定の検出試薬に関して適切な方法を用いて確定される。
【０１５９】 特に、先祖タンパク質が前記のような支持体上に固定されれば、支持体上の残
りのタンパク質結合部位は、典型的には遮断される。当業者に既知の任意の適切
な遮断剤、例えばウシ血清アルブミンまたはトゥイーンTM20（Sigma Chemical C
o., St Louis, Mo）が用いられ得る。次に固定先祖タンパク質は試料とともにイ
ンキュベートされ、抗体がタンパク質と結合される。試料は、インキュベーショ
ン前に適切な希釈剤、例えばリン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）で希釈され得る
。概して、適切な接触時間（即ちインキュベーション時間）は、免疫感作被験者
の生物学的試料内の抗体の存在を検出するのに十分な時間である。平衡を達成す
るのに必要な時間は、時間中に起こる結合のレベルを検定することにより容易に
確定され得る、と当業者は理解する。室温では、約30分のインキュベーション時
間が一般的に十分である。
【０１６０】 非結合試料は、適切な緩衝液、例えば0.1%トゥイーンTM20を含有するPBSで固
体支持体を洗浄することにより除去され得る。次に検出試薬が固体支持体に付加
され得る。適切な検出試薬は、固定抗体−タンパク質複合体と結合し、そして当
業者に既知の種々の手段のいずれかにより検出され得る任意の化合物である。典
型的には、検出試薬は、レポーター基に接合された結合剤（例えばプロテインA
、プロテインG、免疫グロブリン、レクチンまたは遊離抗原）を含有する。
【０１６１】 適切なレポーター基としては、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダ
ーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）、基質、補因子、阻害剤、染料、放射性
核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられる。結合剤とレポーター基との
接合は、当業者に既知の標準方法を用いて達成され得る。種々のレポーター基に
予備接合される一般結合剤は、多数の商業的供給元（例えばZymed Laboratories
, San Francisco, CAおよびPierce, Rockford, IL）から購入され得る。
【０１６２】 次に検出試薬が、結合抗体を検出するのに十分な長さの時間、固定抗体−タン
パク質複合体とともにインキュベートされる。時間の適切な長さは、一般的にメ
ーカーの使用説明書から、あるいは時間中に起こる結合のレベルを検定すること
により確定され得る。次に非結合検定試薬が除去され、レポーター基を用いて結
合検定試薬が検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レ
ポーター基の性質によっている。放射性基に関しては、シンチレーション計数法
またはオートらジオグラフィー法が一般的に適している。分光分析法は、染料、
発光基および蛍光基を検出するために用いられ得る。ビオチンは、異なるレポー
ター基（一般に、放射性または蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを用い
て検出され得る。酵素レポーター基は一般に、基質を付加し（一般的に特定時間
）、その後反応産物の分光分析またはその他の分析を実施することにより検出さ
れ得る。
【０１６３】 試料中の抗先祖タンパク質抗体の存在または非存在を確定するために、固体支
持体に依然として結合されるレポーター基から検出されたシグナルは、一般的に
、予定カットオフ値に対応するシグナルと比較される。一実施態様では、カット
オフ値は、固定先祖タンパク質が非免疫感作被験者からの試料とともにインキュ
ベートされた場合に得られる平均シグナルである。
【０１６４】 関連実施態様では、検定は迅速フロースルーまたはストリップ試験フォーマッ
トで実施され、この場合、先祖タンパク質は膜、例えばニトロセルロース、ナイ
ロン、PVDF等の上に固定される。フロースルー試験では、試料内の抗体は、試料
が膜を通過すると、固定ポリペプチドと結合する。検出試薬（例えばプロテイン
A-コロイド筋）は次に、検出試薬を含有する溶液が膜を通して流動すると、抗体
−タンパク質複合体に結合する。次に結合検出試薬の検出は、前記のように実施
され得る。ストリップ試験フォーマットでは、先祖タンパク質が結合される膜の
一端は、試料を含有する溶液中に浸漬される。試料は検出試薬を含有する領域を
通って固定先祖タンパク質の領域に、膜に沿って移動する。
【０１６５】 タンパク質での検出試薬の濃度は、試料中の抗先祖タンパク質抗体no存在を示
す。典型的には、その部位での検出試薬の濃度は、視覚的に読取られ得る線のよ
うなパターンを生じる。このようなパターンの非存在は、陰性結果を示す。概し
て、膜上に固定されるタンパク質の量は、生物学的試料が上記のように陽性シグ
ナル（例えばELISAにおいて）を生成するのに十分である抗体のレベルを含有す
る場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるよう選定される。典型的には、膜
上に固定されるタンパク質の量は、約25 ng〜約1 μg、さらに典型的には約50 n
g〜約500 ngの範囲である。このような試験は、典型的には極少量（例えば1滴）
の被験者血清または血液を用いて実施され得る。
【０１６６】 細胞傷害性Tリンパ球検定 HIV-1感染の治療における別の因子は、細胞性免疫応答、特にCD8+細胞傷害性T
リンパ球（CTL）を包含する細胞性免疫応答である。細胞傷害性Tリンパ球検定は
、標準方法を用いて前記と同様に、同種および異種HIV系統に対する先祖ウイル
ス配列を用いたサブゲノム免疫感作後に細胞性免疫応答をモニタリングするため
に用いられ得る（例えば、Burke et al.、上記； Tigges et al.上記、参照）。
【０１６７】 T細胞応答を検出するために利用される慣用的検定としては、例えば増殖検定
、リンホカイン分泌検定、直接細胞傷害性検定、限定希釈検定等が挙げられる。
例えば、先祖タンパク質とともにインキュベートされた抗原提示細胞は、応答者
細胞集団においてCTL応答を誘導する能力に関して検定され得る。抗原提示細胞
は、末梢血単球または樹状細胞のような細胞であり得る。あるいは、内部プロセ
ッシングペプチドをクラスI分子に負荷するそれらの能力を欠く、そして適切な
ヒトクラスI遺伝子でトランスフェクトされた突然変異体非ヒト哺乳類細胞株を
用いて、in vitro一次CTL応答を誘導する当該先祖ペプチドの能力を試験し得る
。
【０１６８】 末梢血単球（PBMC）は、CTL前駆体の応答者細胞供給源として用いられ得る。
適切な抗原提示細胞は、先祖タンパク質とともにインキュベートされ、その後、
タンパク質負荷抗原提示細胞が、最適培養条件下で、応答者細胞集団とともにイ
ンキュベートされる。陽性CTL活性化は、放射能標識化標的細胞、即ち特異的ペ
プチドパルス化標的ならびにペプチド配列が得られた内因的プロセッシング形態
の抗原を発現する標的細胞の両方を殺害するCTLの存在に関して培養を検定する
ことにより確定され得る。
【０１６９】 別の適切な方法は、フルオレセイン標識化HLA四量体複合体を用いて染色する
ことにより、抗原特異的T細胞の直接定量を可能にする（Altman et al., Pro. N
atl. Acad. Sci. USA 90:10330(1993); Altman et al., Science 274:94(1996)
）。その他の相対的に新しい技術開発としては、細胞内リンホカインのための染
色、ならびにインターフェロン放出検定またはELISPOT検定が挙げられる。四量
体染色、細胞内リンホカイン染色およびELISPOT検定は、典型的には、慣用的検
定より少なくとも10倍感受性である（Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859(1
997); Dunbar et al., Curr. Biol. 8:413(1998); Murali-Krishna et al., Imm
unity 8:177(1998)）。
【０１７０】 診断 本発明は、本明細書中に記載した先祖ウイルス配列を用いたウイルス（例えば
HIV）感染および／またはAIDSの診断方法も提供する。ウイルス（例えばHIV）感
染および／またはAIDSの診断は、当業者に周知の種々の方法を用いて実行され得
る。このような方法としては、上記のようなイムノアッセイ、ならびに核酸配列
の存在を検出するための組換えDNA法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】 ウイルス遺伝子配列の存在は、例えば標準技法を用いて、表1または3に記述さ
れた配列またはその一部を用いて設計された特定のプライマーを用いたポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により検出され得る（例えば、Innis et al., PCR Protoco
ls A Guide to Methods and Application(1990)；米国特許第4,683,202号、第4,
683,195号および第4,889,818号；Gyllensten et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U
SA 85: 7652-56 (1988)；Ochman et al., Genetics 120:621-23(1988); Loh et
al., Science 243:217-20(1989)参照）。あるいは、ウイルス遺伝子配列は、当
業者に周知の方法により、表1または3に記述された配列と少なくとも70%の同一
性を有する核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法を用いて生物学的試
料中で検出され得る（例えば、Sambrook et al.,上記、参照）。
【０１７２】 実施例 実施例1．先祖ウイルス配列の確定 HIV-1サブタイプCの遺伝子を表示する配列を、GenBankおよびLos Alamos配列
データベースから選択した。39のサブタイプC配列を用いた。18の外群配列（他
の群Mサブタイプの各々からの2つ（図8））は、サブタイプC配列を捜し出すため
の外群として用いた。CLUSTALW（Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:467
3-80(1994)）を用いて配列を整列させ、GDE（Smith et al., CABIOS 10: 671-5
(1994)）を用いてアラインメントを精製し、そしてアミノ酸配列をそれらから翻
訳した。ギャップを、それらがコドン間に挿入されるように操作した。このアラ
インメント（アラインメントI）を、明瞭に整列され得ない領域を除去するよう
、系統発生分析用に修飾し（Learn et al., J. Virol. 70:5720-30(1996)）、ア
ラインメントIIを生じた。
【０１７３】 これらの配列（アラインメントII）に関する系統発生および先祖状態再構築の
ための適切な進化モデルを、Modeltest 3.0（Posada and Crandall, Bioinforma
tics 14:817-8(1998)）で実行される場合、Akaike情報判定基準（AIC)(Akaike,
IEEE Trans. Autom. Contr. 19: 716-23 (1974)）を用いて選定した。サブタイ
プC先祖配列のための分析に関しては、最適モデルは、転写の両クラスに関して
は等速度であり、トランスバージョンの4つのクラス全てに関しては異なる速度
であって、不変部位、ならびに可変部位の部位−部位率変動性のX分布を伴う（T
VM+I+Gモデルとして言及される）。この場合のモデルのパラメーターを以下に示
す：平衡ヌクレオチド頻度：fA=0.3576、fC=0.1829、fG=0.2314、fT=0.2290；不
変部位の割合=0.2447；X分布の形状パラメーター（α）=0.7623；速度マトリッ
クス（R）マトリックス値：RA→C=1.7502、RA→G=RC→T=4.1332、RA→T=0.6825
、RC→G=0.6549、RG→T=1。
【０１７４】 配列（アラインメントII）に関する進化系統樹は、PAUP*バージョン4.0b（Swo
fford, PAUP 4.0: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (And Other Method
s); Sinauer Associates, Inc. (2000)）で実行される場合、最大見込み概算（M
LE）法を用いて推定した。特にサブタイプC配列に関しては、10の異なる亜系統
樹−剪定−再移植（SPR）発見的検索を、各々異なる無作為付加順を用いて実施
した。10のすべての検索が、同一MLE系統発生を見出した（LnL=-33585.74）。サ
ブタイプCに関する先祖ヌクレオチド配列を、この系統発生、データベース（ア
ラインメントII）、ならびに限界見込み概算（下記参照）を用いた前記のTVM+I+
Gモデルを用いて、このサブタイプの基礎節点での配列であると推定した。
【０１７５】 この推定配列は、いくつかの可変部（V1、V2、V4およびV5）、ならびに明瞭に
整列され得ない4つの付加的短領域の部分に関する予測先祖配列を含まない（こ
れら8つの領域は、アラインメントIIを生成するためにアラインメントIから除去
される）。以下の手法を用いて、高可変部を含めた完全gp160に関するアミノ酸
配列を予測した。推定先祖配列は視覚的にアラインメントIと一列に整列されて
、GDE（Smith et al., 上記）を用いて翻訳される。高可変部を完全コドンとし
て欠失させたため、翻訳は正しいリーディングフレーム内であり、コドンは適正
に維持された。
【０１７６】 アラインメントIIから欠失された領域に関する先祖アミノ酸配列を視覚的に予
測し、コンピュータープログラムMacCladeバージョン3.08ａ（Maddison and Mad
dison. MacClade-Analysis of Phylogeny and Character Evolution -Version 3
. Sinauer Associates, Inc.(1992)）を用いたこれらの部位に関する最節約ベー
スの配列再構築を用いて精製した。このアミノ酸配列を、Wisconsin配列分析パ
ッケージ（GCG）、バージョン10のBACKTRANSLATEプログラムならびにコドン使用
データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?specie
s=Homo+sapiens+[gbpri]）からのヒト遺伝子コドン表を用いて、ヒト細胞中での
発現のために最適化されたDNA配列に転換した。
【０１７７】 実施例2． 所定のサブタイプに関する最大見込み系統発生を確定するためには、異なる方
法が利用可能である。このような一方法は、大型進化手段から得た遺伝子配列の
試料の系図の数学的説明である合一理論に基づいている。合一分析は、in vivo
のならびにより大流行中のHIV集団を考慮に入れ、そして異なる過程をHIV集団に
作用させた場合に、サンプリングした系図がどのように振舞うかを理解する一方
法を提供する。この理論を用いて、先祖ウイルス配列、例えば始祖またはMRCAの
配列を確定し得る。指数関数的増殖集団は、時間を遡ると合一間隔低減を示し、
一方、減少集団に関してはこの逆も言える。
【０１７８】 米国およびタイにおける流行は、指数関数的に増大しつつある。米国およびタ
イにおけるサブタイプB流行に関する合一データは、流行病データと一致する。
タイにおけるサブタイプいい流行に関する合一データは、流行病データから予測
されるよりも早い。この矛盾を説明し得る理由として考えられるものとしては、
例えばHIV-1の多重導入の存在（この点に関する系統発生学的証拠はない）、約7
年間のタイにおけるHIV-1検出の非存在、ならびにHIV-1サブタイプEおよびBにお
けるenv遺伝子に関する突然変異率の差が挙げられる。
【０１７９】 再構築の単位 再構築のこの単位は、再構築される先祖ウイルス配列（即ち、状態）状態に関
する。再構築の3つの考え得る単位が存在する：即ち、ヌクレオチド、アミノ酸
またはコドンである。一実施太陽では、個々のヌクレオチドの状態が再構築され
、次にこの再構築を基礎にしてアミノ酸配列が確定される。別の実施態様では、
アミノ酸先祖状態が直接再構築される。典型的実施態様では、進化のコドンモデ
ルを用いる見込みベースの手法を用いて、コドンが再構築される。進化のコドン
モデルは、コドンの頻度を、そして暗示的にあるヌクレオチドを別のヌクレオチ
ドに置換する確率を考慮に入れる。言い換えれば、それは、単一モデルにおいて
ヌクレオチドおよびアミノ酸置換の両方を組入れる。当業者に理解されるように
、これを実行し得るコンピュータープログラムが利用可能であり、あるいは容易
に開発され得る。
【０１８０】 先祖状態を概算するための限界または合同見込みの使用 限界または合同見込みを用いて、先祖状態を概算し得る。限界および合同見込
みは、系統発生樹における他の節点での先祖状態の概算方法に基づいて、異なる
。任意の特定の系統樹に関しては、根の配列アラインメント上の所定部位の先祖
状態が、例えばAである確率は、異なる方法で確定し得る。
【０１８１】 ヌクレオチドがアデニン（A）であるという見込みは、より高い父子（即ち先
祖ウイルス配列、始祖またはMRCAにより近い節点）がアデニンを有するか、シト
シン（C）か、グアニン（G）かまたはチミン（T）を有するかにかかわらず、確
定し得る。これは先祖状態がAであるという限界見込みである。 あるいは、ヌクレオチドがAであるという見込みは、前記の節点がAであるか、
Cか、GかまたはTであるかによって確定し得る。この概算はAの合同見込みで、そ
の部位に関する他のすべての先祖再構築を伴う。
【０１８２】 合同見込みは、全系統樹に沿ったすべての先祖状態が確定される必要がある場
合には、好ましい方法である。ある所定節点で最も考えられる状態を確立するた
めには、限界見込みが好ましくは用いられる。特定部位での不確定の場合、先祖
状態の見込み概算は、ある状態が統計学的に別のものより良好であるか否かを試
験するのを可能にする。2つの考え得る先祖状態が統計学的に異なる見込みを有
さない場合、あるいは一方が終わりとなる場合には、すべての考え得る配列を構
築する多数の部位に亘る多重状態は望ましくない。しかしながらすべての組合せ
の見込みをコンピューター処理し、ランク付けし得て、そしてある判定基準地よ
り上のものだけを用いる。例えば、A、C、G、Tに関する異なる見込みを各々有す
る配列上の2つの部位が考えられる。
【０１８３】 L（A）L（C）L（G）L（T）* *Lは、-1nL（負の対数見込み）を表し、したがって小さいほど考えられ得る。 部位1 3 2 1.5 1 部位2 10 7 5 1 16の考え得る配列形状が存在し、小野のそれ自体の対数見込みを有する。即ち、
核塩基に関する対数見込みの合計を単純にする：
【０１８４】
【表１】 見込み順に、ランキングを示す： TT、GT、CT、AT、TG、GG、CG、AG、TC、GC、CC、AC、TA、GA、CA、AA
【０１８５】 最初の4つの配列は、第二部位にTを有する。これは、大範囲に亘って拡散され
るその部位での見込みに起因し、この部位にT以外の任意のヌクレオチドを有す
る確率を非常に低くする。しかしながら部位1では、任意のヌクレオチドが全く
同様の見込みで与えられる傾向がある。この種のランキングは、変異が考慮され
る場合に捜し出すための考え得る配列の数を減じる一方法である。
【０１８６】 再構築先祖状態における前記の変異は、進化過程の確率的性質のために、なら
びに典型的に用いられるその過程の蓋然的モデルのために、生じる変異を取り扱
う。変異の別の供給源は、配列のサンプリングに起因する。サンプリングが先祖
状態再構築に如何に影響するかを試験する一方法は、既存データ組におけるジャ
ックナイフ再サンプリングを実施することである。これは、配列の何らかの部分
（例えば半分）の取替えを伴わずに無作為に欠失し、そして先祖状態を再構築す
ることを包含する。あるいは、先祖状態を一組のブートストラップ樹の各々に関
して概算し、そして特定ヌクレオチドが概算された回数を所定部位に関する先祖
状態として記録し得る。ブートストラップ樹はブートストラップデータを用いて
生成するが、しかし先祖状態再構築は、元のデータでのブートストラップ樹を用
いる。
【０１８７】 進化の異なるモデルを用いて、根底節点に関する先祖状態を再構築し得る。モ
デルの例は既知であり、多数のレベルに関して選定し得る。例えば進化のモデル
は、いくつかの発見的手段により、または先祖配列に関する最高見込み（すべて
の部位に亘る見込みを合計することにより得られる）を生じるものを抜き取るこ
とにより選定し得る。あるいは先祖状態は、進化のすべてのモデル全体の各部位
で、合計獲得見込みのすべてで、そして最大見込みを有する選定先祖状態で、再
構築される。
【０１８８】 実施例3． HIV-1サブタイプC CTLアミノ酸コンセンサスエピトープの保存を分析した。エ
ピトープの総数は395であった。以下の表は、CサブタイプCTLコンセンサス配列
との各循環性ウイルス配列の類似性の結果を要約する。HIV-1サブタイプCenvタ
ンパク質（配列番号4）に関する確定先祖ウイルス配列は、最高得点（98.48%）
を有する。切頭化配列を用いたために、いくつかの系統に関する得点が65%より
低いことに留意。
【０１８９】
【表２】
【０１９０】
【表３】
【０１９１】 実施例4． マッカク属のサルにおいて増殖したサル免疫不全ウイルスに関して、先祖配列
再構築を実施した。マッカク属サルを相対的に同種のSIV接種物に感染させ、チ
ャレンジさせた。感染後3年までにウイルス配列を得て、最大見込み系統発生分
析を用いてMRCAを推定するために用いた。その結果生じた配列を、接種物のコン
センサス配列と比較した。MRCA配列は、ウイルス接種物と97.4%同一であること
が判明した。この数値は、5つのグリコシル化部位での収束が除去されると、98.
2%に改善した。この収束は、動物における増殖のための組織培養彼のウイルスの
再適応のためであった（Edmonson et al., J. Virol. 72:405-14(1998)）。MRCA
配列およびコンセンサス配列は、ヌクレオチドレベルで1.5%異なることが判明し
た。図3は、サル免疫不全ウイルスMRCA系統発生の確定を示す。
【０１９２】 実施例5． HIV-1サブタイプB先祖ウイルスenv遺伝子配列の生物学的活性を試験するため
の実験を実施した。HIV-1サブタイプB先祖ウイルスenv遺伝子配列をコードする
核酸配列を、長い（160〜200塩基）オリゴヌクレオチドから収集した。収集遺伝
子をANC1と名づけた。ANC1 HIV-1-B Envの生物学的活性を、補助受容体結合およ
びシンシチウム形成検定で評価した。確定および化学合成HIV-1サブタイプB先祖
gp160Env配列を保有するプラスミドpANC1、またはHIV-1サブタイプB89.6gp160En
vを含有する陽性対照プラスミドを、COS7細胞中にトランスフェクトした。これ
らの細胞は、高効率で外来DNAを取込み、発現し得るので、したがって他の細胞
に対する提示のためのウイルスタンパク質を産生するためにルーチンに用いられ
る。
【０１９３】 次にトランスフェクト化COS7細胞を、2つの主要HIV-1補助受容体タンパク質CC
R5またはCXCR4のうちの1つを発現するGHOST細胞と混合した。CCR5は、感染の初
期にHIVにより用いられる優性受容体である。CXCR4は、感染の後期に用いられ、
後者受容体の使用は疾患の発症と一次的に関連する。COS7-GHOST-補助受容体＋
細胞を次に、巨細胞形成に関しては光学顕微鏡により、そしてウイルスEnvタン
パク質の発現に関してはHIV-Env-特異的抗体染色および蛍光検出によりモニタリ
ングした。
【０１９４】 ANC1 Envを発現する細胞は、HIV-特異的抗体との結合、蛍光検出に基づいて発
現されることが、そしてCCR5補助受容体の存在下で多核化巨細胞の形成を引き起
こすが、CXCR4補助受容体の場合は起こさないことが示された。陽性対照89.6Env
はCCR5およびCXCR4の両方を用い、いずれかの補助受容体を発現する細胞を有す
るシンシチウムを形成した。したがってANC1 Envタンパク質は、補助受容体結合
およびシンシチウム形成により生物学的に活性であることが示された。
【０１９５】 実施例6． コンセンサス配列が配列中の各部位での最も一般的ヌクレオチドまたはアミノ
酸残基の配列を表すため、最大見込み系統発生再構築は伝統的コンセンサス配列
決定とは異なる。したがってコンセンサス配列は、偏りのあるサンプリングを受
ける。特にコンセンサス配列の確定は、多数の試料が同一配列を有する場合には
偏向される．さらにコンセンサス配列は実在するウイルス配列である。 これに対比して、最大見込み系統発生分析は、各位置での各ヌクレオチドの頻
度のみをベースにした最新の共通先祖の配列を確定しないため、偏向試料の影響
をあまり受けないと考えられる。確定先祖ウイルス配列は、サンプリングした循
環性ウイルスの共通の先祖であるウイルスである実際のウイルスの概算である。
【０１９６】 先祖配列を確定するための方法のうち最も簡単なものでは、配列アラインメン
ト上の単一に関して、節点間の変化の総数が最小にされるように、ヌクレオチド
が先祖節点に割り当てられる。このアプローチは「最も最節約型の再構築」と呼
ばれる。最大見込みの原理に基づいた代替的方法は、系統発生の場合に観察され
た配列を獲得する確率を最大にするように、節点にヌクレオチドを割り当てる。
系統発生は、ヌクレオチド置換の確率を特定する進化のモデルを用いることによ
り構築される。最大見込み系統発生は、観察されたデータを生じる最高確率を有
するものである。
【０１９７】 図5を参照すると、先祖ウイルス配列（例えば始祖配列または最新の共通先祖
配列（MRCA））の確定の最節約的方法および最大見込み方法の比較が示されてい
る。最も節約的再構築（「MP」）は、先祖分枝点（即ち節点）で不明瞭な状態を
生じるという望ましくない問題を有し得る。この例では、この節点からの2つの
子孫配列は、配列中の特定の位置にアデニン（A）またはグアニン（G）を有する
。この部位での先祖配列に関する最も節約的再構築（「MP再構築」）は、この位
置でAまたはG（「R」と記号を付す）であり得るため、不明瞭である。これに対
比して、最大見込み系統発生分析は、配列進化についての知識を適用する。例え
ば見込み分析は、部分的に、他の変異体中の同一位置でのヌクレオチドの同定に
頼る。したがってこの例では、隣接節点の変異体も同一位置にGを有するため、G
からAへの突然変異は、AからGへの突然変異より起こりそうである。
【０１９８】 図6を参照すると、別の例は、最新共通先祖を確定するためのこれらの方法に
おける差を示す。この例では、7ヌクレオチドの12の配列が示されている。これ
らの配列は、示された進化歴を共有する。これらの配列から算定したコンセンサ
ス配列は、CATACTGである。パネルAでは、確定先祖節点の最大見込み再構築は、
GATCCTGとして示されている。その他の確定配列は、他の内節点に隣接して示さ
れている。パネルBでは、同一節点での最も節約的再構築が示されている。図示
されているように、最も節約的再構築は、コンセンサス配列GAWCCTGを予測する
。
【０１９９】 この場合、「W」は、AまたはTが第三位置に存在することが等しく可能である
ことを示す符号である。同様に、他の最も節約的再構築は、種々の内節点に示さ
れている。第7内節点では、最後にヌクレオチドは符号「V」で示されており、A
、CまたはGが存在し得ることをあらわす。この例では、コンセンサス配列は少な
くとも2つの部位（第1および第4位置）で、MRCAに関して最大見込み−または最
節約−確定配列と異なることにも留意されたい。
【０２００】 前記から、説明のために本発明の特定の実施態様を本明細書中に記載してきた
が、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り種々の修正がなされ得る、と理解
される。本明細書中に引用した出版物および特許出願はすべて、個々の出版物ま
たは特許出願の各々が参照により組入れられることを特定的に且つ個別に示され
た場合のように、それらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる。前記
の発明は理解を平易にするために図面および実施例により多少詳細に記載してき
たが、しかし、本発明の教示にかんがみて、添付の特許請求の精神または範囲を
逸脱しない限りある種の変更および修正がそれになされ得ることは、当業者には
容易に明らかになる。
【０２０１】
【表４】
【０２０２】
【表５】
【０２０３】
【表６】
【０２０４】
【表７】
【０２０５】
【表８】
【０２０６】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、HIV-1の系統発生的分類を示す。丸で取り囲まれた節点は、HIV-1主要
群（群M）および主要群クレードA〜G、J、AGIおよびAGの先祖状態に近い。
【図２】 図2は、HIV-1サブタイプBの系統発生関係および系統樹上の確定されたサブタ
イプB先祖節点の配置を示す。HIV-1サブタイプDの系統発生的関係は、外集団と
して示されている。
【図３】 図3は、アカゲザルへの感染後3年までにSIV接種物に関して最大見込み再構成
を用いて最新の共通の先祖の先祖ウイルス配列再構成を示す。コンセンサス配列
および最も近年の共通先祖配列はヌクレオチド配列で1.5%異なることが判明した
。
【図４】 図4は、先祖ウイルス配列を用いたデジタルワクチンの開発の一例を提供する
。
【図５】 図5は、「大半の貧弱な再構成」法と「最大見込み再構成法」の比較を示す。
【図６】 図6は、「大半の貧弱な再構成」法と「最大見込み再構成法」の別の比較を示
す。
【図７】 図7は、pJW4304SV40/EBVベクターのマップを示す。
【図８】 図8は、HIV-1サブタイプCの系統発生関係および系統樹上の確定されたサブタ
イプC先祖節点の配置を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラーン，ジェラルド エイチ． アメリカ合衆国，ワシントン 98346，キ ングストン，ノースイースト セカンド ストリート 11316 (72)発明者 リ，フーシェン アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，＃３，ノースイースト セブンテ ィーフィフス ストリート 3818 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA35 BA51 BA61 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA06 DA11 EA02 EA04 GA01 GA11 HA08 4B064 AG26 AG27 AG31 AG32 CA02 CA05 CA10 CA11 CA12 CA19 CA20 CC24 DA03 4B065 AA01X AA26X AA57X AA80X AA88X AA90X AA95Y AB01 AB04 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA45 4C085 AA03 BA65 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 BA41 CA05 DA75 DA76 DA86 EA31 FA72 FA74

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高度多様性ウイルス株、サブタイプまたはグループの決定さ
    れた始祖配列である、単離された先祖ウイルス遺伝子配列およびその断片。
  2. 【請求項２】 先祖ウイルス遺伝子配列がHIV-1先祖ウイルス遺伝子配列、H
    IV-2先祖ウイルス遺伝子配列またはC型肝炎先祖ウイルス遺伝子配列である請求
    項1記載の配列。
  3. 【請求項３】 先祖ウイルス遺伝子配列がHIV-1サブタイプA、B、C、D、E、
    F、G、H、J、AGまたはAGI；HIV-1グループM、NまたはO；あるいはHIV-2サブタイ
    プAまたはBのものである請求項1記載の配列。
  4. 【請求項４】 先祖ウイルス遺伝子配列が広範分散性HIV-1変異体、地理的
    制限性HIV-1変異体、広範分散性HIV-2変異体または地理的制限性HIV-2変異体の
    ものである請求項1記載の配列。
  5. 【請求項５】 先祖ウイルス遺伝子配列がenv遺伝子またはgag遺伝子である
    請求項1記載の配列。
  6. 【請求項６】 先祖ウイルス遺伝子配列が、平均して、任意の他の変異体に
    対してより任意の所与の循環性ウイルスの遺伝子配列に対してより密接に関連す
    る請求項1記載の配列。
  7. 【請求項７】 配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号6で記述さ
    れる配列と少なくとも70%の同一性を有し、そして任意の循環性変異体と100%の
    同一性を有しない請求項1記載の配列。
  8. 【請求項８】 配列番号2または配列番号4の先祖タンパク質をコードする請
    求項1記載の配列。
  9. 【請求項９】 HIV-1、HIV-2またはC型肝炎からの単離された先祖タンパク
    質またはその断片。
  10. 【請求項１０】 配列番号2または配列番号4の連続配列を含む請求項9記載
    の単離された先祖タンパク質。
  11. 【請求項１１】 HIV-1サブタイプA、B、C、D、E、F、G、H、J、AGまたはAG
    I；グループM、NまたはO；あるいはHIV-2サブタイプAまたはBの先祖タンパク質
    である請求項9記載の単離された先祖タンパク質。
  12. 【請求項１２】 HIV-1サブタイプBenv先祖タンパク質またはHIV-1サブタイ
    プCenv先祖タンパク質の少なくとも10連続アミノ酸である請求項11記載の単離さ
    れた先祖タンパク質。
  13. 【請求項１３】 gagまたはenvタンパク質である請求項9記載の単離された
    先祖タンパク質。
  14. 【請求項１４】 以下の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 先祖タンパク質をコードする核酸；および 転写ターミネーター を含む単離された発現構築物。
  15. 【請求項１５】 核酸が配列番号2または配列番号4をコードする請求項14記
    載の発現構築物。
  16. 【請求項１６】 核酸が配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号6
    として記述される配列である請求項14記載の発現構築物。
  17. 【請求項１７】 核酸配列が宿主細胞中での発現のために最適化される請求
    項13記載の発現構築物。
  18. 【請求項１８】 前記転写プロモーターが異種プロモーターである請求項14
    記載の発現構築物。
  19. 【請求項１９】 前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターで
    ある請求項18記載の発現構築物。
  20. 【請求項２０】 請求項14の発現構築物で形質転換またはトランスフェクト
    される培養された原核または真核生物細胞。
  21. 【請求項２１】 哺乳類細胞である請求項20記載の真核生物細胞。
  22. 【請求項２２】 核酸が配列番号2または配列番号4の先祖タンパク質をコー
    ドする請求項20記載の真核生物細胞。
  23. 【請求項２３】 核酸が配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号6
    として記述される配列である請求項20記載の真核生物細胞。
  24. 【請求項２４】 大腸菌細胞である請求項20記載の原核生物細胞。
  25. 【請求項２５】 ビール酵母菌S. cerevisiae細胞である請求項20記載の真
    核生物細胞。
  26. 【請求項２６】 ヒト細胞である請求項20記載の真核生物細胞。
  27. 【請求項２７】 請求項14の発現構築物を含むベクター。
  28. 【請求項２８】 核酸配列がセムリキ森林熱（Semliki Forest Virus）ウイ
    ルスレプリコンと作用可能に連結され、その結果生じた組換えレプリコンがサイ
    トメガロウイルスプロモーターと作用可能に連結される請求項27記載のベクター
    。
  29. 【請求項２９】 請求項27のベクターを含む単離された宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 哺乳類における免疫応答を誘導するための組成物であって
    、高度多様性ウイルス先祖タンパク質または先祖タンパク質の免疫原性断片を含
    む組成物。
  31. 【請求項３１】 前記断片が配列番号2または配列番号4で記述される配列に
    由来する請求項30記載の組成物。
  32. 【請求項３２】 前記ウイルス先祖タンパク質がHIV-1またはHIV-2からであ
    る請求項30記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 ワクチンである請求項30記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 ウイルス先祖タンパク質と特異的に結合し、そして複数の
    循環性子孫ウイルス先祖タンパク質と特異的に結合する単離された抗体。
  35. 【請求項３５】 先祖タンパク質がHIV-1、HIV-2またはC型肝炎からである
    請求項34記載の抗体。
  36. 【請求項３６】 モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である請求項
    34記載の抗体。
  37. 【請求項３７】 ヒト化モノクローナル抗体である請求項34記載の単離され
    た抗体。
  38. 【請求項３８】 抗体またはその抗原結合断片が一本鎖抗体、キメラ抗体、
    一本重鎖抗体、抗原結合F(ab’)2断片、抗原結合Fab’断片、抗原結合Fab断片ま
    たは抗原結合Fv断片である請求項34記載の抗体。
  39. 【請求項３９】 先祖ウイルスアミノ酸配列の製造方法であって、 （a）高度多様性ウイルスの循環性ウイルス配列を選択し、 （b）循環性ウイルス配列の進化系統樹の進化中心を代表する先祖ウイルス配
    列である循環性ウイルス配列の最新の共通の祖先である先祖ウイルス配列を最大
    見込み系統発生分析により確定し、そして （c）循環性ウイルス配列のいずれかと100%同一ではないが、しかしその推定
    アミノ酸配列がそれらのうちのいずれかと少なくとも70%同一であるウイルス配
    列を合成する、 ことを包含する方法。
  40. 【請求項４０】 循環性ウイルス配列がHIV-感染患者からである請求項39記
    載の方法。
  41. 【請求項４１】 循環性ウイルス配列がHIV-1、HIV-2またはC型肝炎からで
    ある請求項39記載の方法。
  42. 【請求項４２】 免疫原性に関して一検定で断片を試験することをさらに包
    含する請求項39記載の方法。
  43. 【請求項４３】 最大見込み系統発生分析が合一見込み分析を包含する請求
    項39記載の方法。
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