JP4773352B2 - コンセンサス/先祖免疫原 - Google Patents
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Description
融合中間体免疫原の概念は、gp41 HR−2領域ペプチドDP178が、コイル化されていない高次構造のgp41を捕捉することができるという観察(Furata et al, Nature Struct. Biol. 5:276(1998))、ホルマリン固定されたHIV感染細胞は中和抗体を広く生成することができるという観察(LaCasse et al, Science 283:357(1997))と合致する。最近、コイルドコイル領域に対するモノクローナル抗体は、コイルドコイルgp41構造のHR1及びHR2領域中のgp41の高次構造決定基に結合したが、HIVを中和しなかった(Jiang et al, J. Virol. 10213(1998))。しかしながら、この後者の研究は、正しい抗体が生成されれば、抗体が結合するためにコイルドコイル領域を使用できることを証明した。
実験の詳細
組換えワクシニアウイルス(VV)におけるCON6 gp120及びgp140タンパク質の発現。分泌型のHIV−1 CON6エンベロープタンパク質を発現及び精製するために、それぞれ、gp120切断部位(REKR)の後、及び膜貫通ドメイン(YIKIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVN)の前に停止コドンを導入することによって、CON6 gp120及びgp140CFプラスミドを構築した。140CFタンパク質中では、gp120/gp41切断部位及びgp41の融合ドメインを欠失した。CON6gp120及びgp140CF DNA構築物の両者を、pSC65ベクター(Bernard Moss, NIH, Bethesda, MDから購入)中のSalI及びKpnI制限酵素部位にクローニングした。このベクターは、p7.5プロモーターによって調節されるlacZ遺伝子を含有する。CON6 env遺伝子を発現するために、逆並列P E/Lプロモーター(back−to−back P E/Lプロモーター)を使用した。BSC−1細胞を、6ウェルプレート中の各ウェル中に、2×105個で播種し、0.1pfu/細胞のMOIで野生型ワクシニアウイルス(WR)で感染させ、感染の2時間後に、CON6 env遺伝子を含有するpSC65由来のプラスミドをVV感染細胞中に形質移入し、記載どおりに(Moss and Earl, Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel et al (John Wiley & Sons, Inc. Indianapolis, IN) pp. 16.15.1−16.19.9(1998))、組換え(r)VVを選択した。PCR及び配列決定分析によって、CON6 env遺伝子を含有する組換えVVを確認した。CON6エンベロープタンパク質の発現は、SDS−PAGE及びウェスタンブロットアッセイによって確認した。アガロース ガランサス・ニヴァリスレクチンビーズ(Vector Labs, Burlingame, CA)で、組換えCON6 gp120及びgp140CFを精製し、使用するまで、−70℃に保存した。組換えVV発現JRFL(vCB−28)又は96ZM651(vT241R)gp160は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda,MD)から入手した。
gp120(A32)、gp120 V3ループ(F39F)及びCCR5結合部位(17b)上の高次構造決定基に対するヒトmabは、Jame Robinsonから頂いた(Tulane Medical School, New Orleans, LA)(Wyatt et al, Nature 393;705-711(1998), Wyatt et al, J. Virol. 69:5723-5733(1995))。Mab 2F5、447、bl2、2G12及び可溶性CD4は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda, MD)(Gorny et al, J. Immunol. 159:5114-5122(1997), Nyambi et al, J. Virol. 70:6235-6243(1996), Purtscher et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:1651-1658(1994), Trkola et al, J. Virol 70:1100-1108(1996))から入手した。T8は、gp120C1領域に位置するマウスのmapである(P.Earl, NIH, Bethesda, MDから頂いた。)。BaL(サブタイプB)、96ZM651(サブタイプC)及び93TH975(サブタイプE)gp120は、QBI, Inc.及びNIHのAIDS部門によって提供された。92U037(サブタイプA)及び93BR029(サブタイプF)gpl40(分泌及び非切断)を発現するCHO細胞株は、イギリスのNICBSから入手した。
SPRバイオセンサー測定は、BIAcore 3000装置(BIAcore Inc., Uppsala, Sweden)装置上で行い、データ解析は、BIAevaluation 3.0 software (BIAcore Inc, Upsaala, Sweden)を用いて行った。タンパク質固定化に対する標準的なアミンカップリングプロトコールを用いて、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.5中の抗gp120mab(T8、A32、17b、2G12)又はsCD4を、CM5センサーチップに直接固定した。FPLC精製されたCON6 gp120単量体又はgp140CFオリゴマー組換えタンパク質を、それぞれ、100及び300μg/mLの濃度で、CM5センサーチップ上に流した。非特異的応答又は一括応答を差し引くために、(アミンカップリングに対して活性化及び脱活性化された)盲検の直列参照表面又は非結合mab対照を使用した。それぞれ、陽性対照及び陰性対照として、CON6 Envタンパク質を注入する前に各mab表面の活性を確保するために、可溶性89.6 gp120及び無関係のIgGを使用した。CON6エンベロープタンパク質の結合は、PBS(150 mM NaCl、0.005%界面活性剤P20)、pH7.4を、10から30μL/分で連続的に流して、25℃でリアルタイムにモニターした。結合したタンパク質を除去し、5ないし10μLの再生溶液(10mM グリシン−HCl、pH2.9)を単回又は二回、短時間与えることによって、各結合サイクルの後に、センサー表面を再生した。記載のとおり(Haynes et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:211−221(1995))、CON6 gp120及びgp140CFタンパク質に対する様々なのmabの反応性を決定するために、ELISAを行った。ヒトmabのrgp120又はgp140タンパク質への結合のアッセイの場合、終点力価は、mabが結合したCON6 gp120及びgp140CF Envタンパク質がバックグラウンド対照(非結合ヒトmab)に比べて3倍以上である、mabの最高力価(20μg/mLで開始)として定義した。
HIV−1/SG3Δenv及びCON6又は対照envプラスミドをヒト293T細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ろ過し、p24濃度を定量した(DuPont/NEN Life Sciences, Boston, MA)。JC53−Bl細胞を感染させて、感染性を決定するために、各擬ビリオンに対して等量のp24(5ng)を使用した(Derdeyn et al, J. Virol. 74:8358−8367(2000), Wei et al, Antimicrob Agents Chemother. 46:1896−1905(2002))。JC53−BL細胞は、CD4、CCR5及びCXCR4受容体を発現し、HIV−1末端反復配列(LTR)の転写調節下で安定的に組み込まれたβ−ガラクトシダーゼ(β−gal)遺伝子を含有する。これらの細胞は、β−gal発現を染色し、1μgの擬ビリオンのp24当たりの青い細胞の数(感染単位)(IU/μg p24)を計数することによって、擬ビリオン株の感染性力価を定量するために使用することができる(Derdeyn et al, J. Virol. 74:8358−8367(2000), Wei et al, Antimicrob Agents Chemother. 46:1896−1905(2002))。CON6 env遺伝子の共同受容体の使用を決定するために、JC53BL細胞を、1.2AM AMD3100及び4μM TAK−799により、1時間37℃で処理した後、等量の各Env偽型ウイルスのp24(5ng)に感染させた。遮断効率は、遮断剤なしの対照培養から得たものと比較した、遮断実験由来の感染単位のパーセントとして表した。対照グループからの感染性(遮断剤なし)を任意に100%として設定した。
70μmのNylon細胞ろ過器(BD Labware, Franklin Lakes, NJ)を通して細分し、絞り取ることによって、免疫された各マウスから得た脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。CON6 gp140の重複するEnvペプチド(159ペプチド、11重複する15マー)は、BostonBioscence, Inc(Royal Oak, MI)から購入した。MN gp140の重複するEnvペプチド(サブタイプB;170ペプチド、11重複する15マー)及びChnl9 gp140(サブタイプC;69ペプチド、10重複する20マー)は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (Bethesda, MD)から取得した。CON6、サブタイプB及びサブタイプC Envタンパク質から得られた重複するENVペプチドのプールにより、各マウスから得た脾細胞(5マウス/グループ)をインビトロで刺激した。96ウェルPVDFプレート(MultiScreen−IP, Millipore, Billerica, MA)を、抗IFNγ mab(5μg/ml, AN18; Mabtech, Stockholm, Sweden)でコートした。完全なHepes緩衝化RPMI培地を用いて、37℃で2時間、プレートをブロッキングし、50μLの前記プールされた重複するエンベロープペプチド(13のCON6およびMNプール、各プール中に13から14のペプチド;9のChn19プール、各プール中に7から8のペプチド)を、それぞれ5μg/mLの最終濃度でプレートに添加した。次いで、1.0×107/mLの濃度の脾細胞50μを二つ組みでウェルに添加し、5%CO2を与え、16時間37℃でインキュベートした。100μLの1:1000希釈のストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(Mabtech, Stockholm, Sweden)とともにプレートをインキュベートし、100μLのBCIP/NBT(Plus)Alkaline Phosphatase Substrate (Moss, Pasadena, MD)を使用して、紫色のスポットを発生させた。Immunospot計数システム(CTL Analyzers, Cleveland, OH)を使用して、スポット形成細胞(SFC)を測定した。各エンベロープペプチドのプールに対する総応答は、106個の脾細胞当たりのSFCとして表される。
CON6エンベロープ遺伝子の設計、構築及び発現。人工グループMコンセンサスenv遺伝子(CON6)は、Los Alamos HIV Sequence Database中の配列から各HIV−1サブタイプに対するenv遺伝子のコンセンサス配列を作製し、次いで、重度に配列決定されたサブタイプを避けるために、全てのサブタイプコンセンサスのコンセンサス配列を作製することによって構築した(Gaschen et al, Science 296:2354−2360(2002), Korber et al, Science 288:1789−1796 (2000))。CRF08_BC組換え株(98CN006)から得た5つの高度可変領域(V1、V2、V4、V5及びgp41の細胞質ドメイン中の領域)をCON6配列中の欠損領域中に充填するために使用した。CON6 V3領域は、グループMコンセンサスである(図1A)。高レベルの発現を得るために、高度に発現されたヒト遺伝子に対するコドン使用に基づいて、CON6 env遺伝子のコドンを最適化した(Haas et al, Curr. Biol. 6:315−324(2000), Andre et al, J. Virol. 72:1497−1503(1998))(図1D参照)。コドンが最適化されたCON6 env遺伝子を構築し、pcDNA3.1 DNAのEcoRI及びBamHI部位中にサブクローニングした(Gao et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 19:817−823(2003))。293T細胞中への形質移入後、ウェスタンブロットアッセイを用いて、高レベルのタンパク質発現を確認した。性質決定のために組換えCON6 Envタンパク質を取得し、免疫原として使用し、分泌されたgp120及び非切断gp140CFを発現するためにrVVを作製した(図1B)。還元条件下のクマシーブルーゲルによって測定したところ、各タンパク質に対する純度は90%以上であった(図1C)。
CON6 Env免疫原によって誘導されるT細胞免疫応答を、サブタイプ特異的な免疫原によって誘導されたT細胞免疫応答と比較するために、さらに2つのマウスの群を、サブタイプB又はサブタイプC DNA及び対応するrVV発現サブタイプB又はCエンベロープタンパク質で免疫した。サブタイプB(JRFL)又はサブタイプC(96ZM651) Env免疫原で免疫したマウスは、主として、サブタイプ特異的なT細胞免疫反応を有した(図5)。サブタイプB(MN)ペプチドプールで刺激した後には、JRFL(サブタイプB)で免疫されたマウスから得られたIFN−γSFC免疫原が検出されたが、サブタイプC(Chnl9)又はCON6ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。サブタイプC(Chnl9)及びCON6ペプチドプールで刺激した後には、96ZM651(サブタイプC)免疫原で免疫されたマウスから得られたIFN−γ SFCが検出されたが、サブタイプB(MN)ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。これに対して、CON6ペプチドプール並びにサブタイプB又はCペプチドのプールで刺激すると、CON6 Env免疫原で免疫されたマウスからIFN−γ SFCが同定された(図5)。CON6 gp140によって誘導されたT細胞応答は、CON6 gp120によって誘導されたT細胞応答より強固であるように思われた。これらのデータを総合すると、CON6 gp120及びgp140CF免疫原は、野生型サブタイプB及びCエンベロープのT細胞エピトープを認識するT細胞応答を誘導することができることが実証された。
CON6エンベロープ免疫原が、HIV−1初代単離株を中和する抗体を誘導することができるかどうかを決定するために、CON6 gp120又はgp140CFタンパク質でモルモットを免疫した。中和アッセイのために、4又は5回の免疫化の後に集めた血清を使用し、対応する出血前の血清と比較した。分胞体阻害アッセイ(表5A)で、2つのAT−2不活化HIV−1単離株(ADA及びAD8)を検査した。2つのサブタイプB SHIV単離株、8つのサブタイプ初代単離株、4つのサブタイプC並びに1つの各サブタイプA、D及びE初代単離株を、MT−2又はルシフェラーゼを使用するアッセイの何れかで検査した(表5B)。分胞体阻害アッセイでは、CON6 gp120及びgp140CFタンパク質によって誘導された抗体は、AT−2不活化ADA及びAD8によって誘導された分胞体を強力に阻害することが見出された(表5A)。MT−2アッセイでは、2つのSHIV単離株のうちの1つ(SHIV SF162P3)が2つのgp120及び1つのgp140CF血清によって弱く中和されることが見出された(表5B)。ルシフェラーゼを利用するアッセイでは、8つのサブタイプB初代単離株のうち4つ(BX08、SF162、SS1196及びBAL)が全てのgp120及びgp140CF血清によって強力に中和されることが見出され、8つのサブタイプB単離株のうち2つ(6101、0692)が多くのgp120及びgp140CF血清によって弱く中和されることが見出された。HIV−1 PAVOに対しては、中和は検出されなかった(表5B)。次に、CON6抗gp120及びgp140CF血清を4つのサブタイプC HIV−1単離株に対して検査すると、4つの単離株のうち3つ(DU179、DU368及びS080)で、主として抗CON6 gp120血清によって弱い中和が見られた。1つのgp140CF血清no.635は、DU179を強く中和し、S080を弱く中和した(表5B)。最後に、抗CON6 Env血清は、サブタイプD単離株(93ZR001)を強く中和し、サブタイプE(CM244)単離株を弱く中和したが、サブタイプA(92W020)単離株は中和しなかった。
ウイルスの侵入を媒介するためにCCR5共同受容体を使用することができる機能的Envタンパク質をコードする人工HIV−1グループMコンセンサスenv遺伝子(コード配列)(CON6及びCon−S)の作製について説明してきた。重要なことは、これらのグループMコンセンサスエンベロープ遺伝子が、サブタイプB及びC HIV−1初代単離株のエピトープを認識するT及びB細胞応答を誘導できるということである。さらに、Con−Sは、サブタイプC及びA HIV−1株を強力に中和する抗体を誘導する(表3参照)。
実験の詳細
HIV−1サブタイプC先祖及びコンセンサスenv遺伝子をLos Alamos HIV Molecular Immunology Database(http://hiv−web.lanl.gov/immunology),から取得し、哺乳類細胞の発現に対してコドンの使用を最適化し、合成した(図6)。最適な発現を確保するために、Kozak配列(GCCGCCGCC)を、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長の遺伝子の他に、gp41膜貫通ドメイン(IVNR)及びgp120/gp41切断部位(REKR)の直後に停止コドンを導入することによって、末端切断された2つのenv遺伝子を作製し、それぞれ、gp140及びgp120形態の糖タンパク質を得た(図8)。
コドンを最適化されたサブタイプC先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子(gp160、gp140、gp120)は、哺乳類細胞中で高レベルのenv糖タンパク質を発現する(図9)。
HIV−1サブタイプCウイルスは、最も広く流行している単離株であり、世界中の新しい感染のうち約50%を占める。世界的に流行しているHIV−1株における遺伝的多様性は、ワクチン設計に対して困難な問題を提起する。HIV−1 Envタンパク質は可変性が高いが、感染した宿主中で液性免疫と細胞性免疫をともに誘導することができる。70のHIV−1完全サブタイプC env配列を分析することによって、コンセンサス及び先祖サブタイプC env遺伝子が作製された。両配列は、現サブタイプC株と概ね等距離にあり、このため、さらに優れた交叉保護免疫を誘導すると予想される。再構築された先祖又はコンセンサス配列由来の免疫原は、ワクチン候補と現単離株間の遺伝的差異の程度を最小限に抑える。しかしながら、コンセンサス及び先祖サブタイプC env遺伝子は、アミノ酸配列が5%異なる。コンセンサス配列と先祖配列の両方を分析のために合成した。コドンを最適化されたサブタイプC先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子を構築し、発現された糖タンパク質のインビトロでの生物特性を決定した。合成サブタイプCコンセンサス及び先祖env遺伝子は、現サブタイプC野生型エンベロープ糖タンパク質と構造、機能及び抗原性が類似する糖タンパク質を発現する。
サブタイプCウイルスは、グループMウイルスの全サブタイプ中、世界で最も多く蔓延しているウイルスとなった。現在、50%を超えるHIV−1感染者が、HIV−1サブタイプCウイルスを保有している。さらに、サブタイプC内にかなりの可変性が存在する。すなわち、異なるサブタイプCウイルスは、Gag、Pol、Env及びNefタンパク質がそれぞれ10%、6%、17%及び16%も異なることがある。最も重要なことは、ある国から得られるサブタイプCウイルスは、世界の他の地域から単離されたウイルスと同程度に異なり得ることである。唯一の例外は、サブタイプCがより最近に導入されたインド/中国、ブラジル及びエチオピア/ジブチから得られるHIV−1株である。単一の国内でさえ、サブタイプCウイルスの遺伝的多様性は高いので、単一のウイルス単離株に基づく免疫原は、同じ地域中で流行する他の単離株に対して防御免疫を誘発しない場合がある。
合成された「コンセンサスenv遺伝子のコンセンサス」(CON6)では、可変領域が、現サブタイプCウイルス由来の対応する領域(98CN006)で置換されている。さらに、コンセンサス可変領域も有するcon/con遺伝子(CON−s)も設計された。Con−S env遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。(アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図14A及び14Bを参照。)
3’末端が20bp重複し、5’末端及び3’末端に不変の配列(それぞれ、制限酵素部位EcoRI及びBbsI並びにBsmBI及びBamHIを含む。)を含有する、対を成すオリゴヌクレオチド(80マー)を設計した。BbsI及びBamHIは、それらの認識配列の外側を切断するII型の制限酵素である。それらは、18bpの不変領域に隣接する最初の4つの残基を切断して、後続の連結工程のために各断片の末端に、4塩基の5’突出を残すように、オリゴマー中に配置された。PCR及び18bpの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなす26のオリゴマーを個別に連結した。
サブタイプAウイルスは、70%を超えるHIV−1感染が文献で報告されているアフリカ大陸において、二番目に多く広まっているHIV−1である。アフリカ及び世界で最も多く蔓延しているサブタイプCウイルスに対するコンセンサスgag、env及びnef遺伝子は既に作製された。サブタイプAとCウイルスの遺伝的距離は、env遺伝子中では、30%にも達し、両サブタイプ間の交叉反応性又は保護は最適ではないであろう。全てのサブタイプに対して、2つのグループMコンセンサスenv遺伝子も作製した。しかしながら、サブタイプコンセンサス遺伝子と同じサブタイプから得られる野生ウイルス間の遺伝的距離は、グループMコンセンサス遺伝子とこれらの同じウイルス間の遺伝的距離より小さいので、特定のサブタイプウイルスを標的とするためには、サブタイプ特異的コンセンサス遺伝子がより効果的であろう。従って、サブタイプA特異的免疫原を開発するためには、コンセンサス遺伝子を作製することが必要である。A.con.env遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。(アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図18A及び18Bを参照。)
オリゴの各対を増幅し、クローニングし、連結し、配列を決定した。A.con env遺伝子のオープンリーディングフレームを、インビトロでの転写及び翻訳系によって確認した後、A.con env遺伝子を293T細胞中に形質移入し、タンパク質の発現と特性をウェスタンブロットアッセイを用いて確認した(図18)。次いで、A.conエンベロープが生物学的に機能的であるか否かを決定した。これを、env欠損SG3プロウイルスクローンとともに、293T細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、JC53BL細胞を感染させるために使用した。A.con Env擬ビリオンに感染したJC53−BL細胞中に青い細胞が検出され、A.con Envタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された(表6)。しかしながら、A. con Env擬ビリオンの感染力価は、野生型サブタイプCエンベロープを有する擬ビリオンの約1/7であった(表6)。総合すると、生物学的に機能的なA.con Envタンパク質は、A.con Envタンパク質が正しく折り畳まれており、Env免疫原として使用されれば、直鎖及び高次構造のT及びB細胞エピトープを誘導し得ることを示唆する。
グループMコンセンサス遺伝子については、ウイルス特異的な可変領域を有するenv遺伝子(CON6)とコンセンサス可変領域を有するenv遺伝子(Con−S)という2つの異なるenv遺伝子を構築した。しかしながら、免疫又はワクチン接種された動物及びヒトでのT細胞免疫応答の解析は、env遺伝子が通常T細胞免疫応答に対する主要な標的ではないが、中和抗体を誘導し得る唯一の遺伝子であることを示している。代わりに、HIV−1 Gag、Pol及びNefタンパク質が、強力なT細胞免疫応答を誘導するために重要であることが見出される。全てのサブタイプに対して、さらに広い液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる免疫原のレパートリーを作製するためには、env遺伝子のみ以外に、他のグループMコンセンサス遺伝子を構築することが必要であるかもしれない。gag、pol及びnef遺伝子「コンセンサスのコンセンサス」(M.con.gag、M.con.pol及びM.con.nef)が設計された。サブタイプコンセンサスpol遺伝子を作製するために、サブタイプCコンセンサスpol遺伝子(C.con.pol)も設計した。M.con.gag.、M.con.pol、M.con.nef及びC.con.po.遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて、最適化された。(核酸配列及びアミノ酸配列については、図19を参照。)
実験の詳細
それぞれ、37及び137個の現HIV−1株から、サブタイプBコンセンサスgag及びenv配列を得て、哺乳類細胞発現に対してコドン使用を最適化し、合成した(図20A及び20B)。最適な発現を確保するために、Kozak配列(GCCGCCGCC)を、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長のenv遺伝子に加えて、gp145遺伝子を作製するために、gp41膜貫通ドメイン(IVNR)の直後に停止コドンを導入することにより、末端切断されたenv遺伝子を作製した。インビトロ転写/翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。(サブタイプBコンセンサスGag及びEnv配列は、それぞれ、図20C及び20Dに記載されている。)
サブタイプBコンセンサスエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、gp160及びgp145遺伝子をHIV−1/SG3Δenvプロウイルスとともに同時形質移入し、JC53−BL細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した。JC53−BL細胞は、高レベルのCD4並びにHIV−1共同受容体CCR5及びCXCR4を発現するHeLa細胞から派生した細胞である。JC53−BL細胞は、それぞれ、HIV−1 LTRから発現されるルシフェラーゼとガラクトシダーゼのレポーターカセットも含有している。レポーター遺伝子の発現は、HIV−1 Tatの産生に依存する。簡潔に述べると、細胞を24ウェルプレート中に播種し、37℃で24時間インキュベートし、37℃で30分間、DEAE−Dextranで処理した。1% DMEM中にウイルスを系列希釈し、DEAE−デキストラン中でインキュベートしている細胞に加え、37℃で3時間インキュベートした後、さらに500μLの細胞培地を各ウェルに添加する。37℃で48時間、最終インキュベーションを行った後、細胞を固定し、X−Galを用いて染色し、青色の病巣を顕微鏡で計数するために、PBSを重層した。偽感染されたウェルに対するカウント(バックグラウンドを決定するために使用)を、試料ウェルに対するカウントから差し引く。JC53−BLアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。サブタイプBコンセンサスGagタンパク質が、Env糖タンパク質を取り込んだウイルス様粒子(VLP)を産生できるかどうかを決定するために、293T細胞をサブタイプBコンセンサスgag及びenv遺伝子で同時形質移入した。形質移入から48時間後に、VLPを含有する細胞上清を集め、卓上遠心機で清澄にし、0.2mMのフィルターを通してろ過し、20%のショ糖クッションを通して沈降させる。VLPペレットをPBS中に再懸濁し、20から60%の連続スクロース勾配上に転写した。100,000×gで一晩遠心した後、0.5mLの画分を集め、p24含量をアッセイした。各画分の屈折率も測定した。VLPに対する正しい密度を有し、最高レベルのp24を含有する画分をプールし、最後に沈降する。VLP含有ペレットをPBS中に再懸濁し、4から20%のSDS−PAGEゲル上に載せた。タンパク質をPVDF膜に転写し、サブタイプBのHIV−1に感染した個体から得た血清でプローブした。
コドン使用を最適化されたサブタイプBコンセンサスエンベロープ(gp160、gp145)及びgag遺伝子は、哺乳類細胞中で高レベルの糖タンパク質を発現する(図21)。
合成サブタイプBコンセンサスenv及びgag遺伝子は、現サブタイプB Env及びGagタンパク質と構造、機能及び抗原性が類似するウイルスタンパク質を発現する。サブタイプBコンセンサス遺伝子を基礎とする免疫原は、幅広い一群のHIV−1単離株に対して保護的であるCTL及び中和免疫応答を惹起するであろう。
Claims (7)
- 図1Aに記載された配列番号1のアミノ酸配列を含んでなる単離されたタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
- CON6 HIV gp160タンパク質(配列番号1)をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、該ヌクレオチド配列はヒト細胞中での発現のために最適化されたコドンを含む核酸。
- 請求項3に記載の核酸であって、前記核酸が、図1Dに記載された配列番号2のヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
- 請求項2または3に記載の核酸を含んでなるベクター。
- 請求項1、2または3の何れか1項に記載の少なくとも一つのタンパク質または核酸と、キャリアとを含有してなるワクチン組成物。
- 哺乳動物に免疫応答を誘導するための医薬の製造における、前記哺乳動物に免疫応答を誘導するのに十分な量の請求項1、2または3の何れか1項に記載の少なくとも一つのタンパク質および/または核酸の使用。
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