ES2612427T3

ES2612427T3 - Método para purificar teriparatida (PTH1-34)

Info

Publication number: ES2612427T3
Application number: ES14154713.3T
Authority: ES
Inventors: Christoph Reich; Michael Kuechler
Original assignee: Richter-Helm Bio Tec & Co KG GmbH
Current assignee: Richter-Helm Bio Tec & Co KG GmbH
Priority date: 2014-02-11
Filing date: 2014-02-11
Publication date: 2017-05-16
Anticipated expiration: 2034-02-11
Also published as: EP2905289B1; LT2905289T; DK2905289T3; EP2905289A1; PL2905289T3; HUE032904T2

Abstract

Un método para purificar teriparatida (PTH1-34) mediante cromatografía de intercambio iónico, que comprende las etapas de (a) poner en contacto un fluido que comprende el PTH1-34 con un material de intercambio catiónico en condiciones que permitan la unión reversible del PTH1-34 a dicho material de intercambio catiónico; (b) opcionalmente, lavar el material de intercambio catiónico para eliminar el material no unido; (c) eluir el PTH1-34 mediante el aumento del pH y la disminución de la fuerza iónica.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para purificar teriparatida (PTH1-34)

La presente invencion se refiere a un metodo novedoso para purificar teriparatida, un fragmento de polipeptido terapeuticamente activo de la hormona paratiroidea humana de longitud completa. El metodo se basa en la cromatografla de intercambio ionico y es eficaz en la separacion del polipeptido terapeuticamente activo de variantes no deseadas, tales como polipeptidos truncados. El metodo de la invencion puede utilizarse a escala preparativa, lo que permite implementarlo en el proceso de production de la teriparatida. Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un metodo para la produccion de teriparatida que incluye una etapa en la cual la teriparatida se purifica mediante el novedoso metodo de cromatografla de intercambio ionico de la invencion.

Antecedentes de la invencion

La hormona paratiroidea (PTH) es una hormona polipeptldica que se produce de forma natural en la paratiroides de los mamlferos. El polipeptido humano consiste en 84 aminoacidos y esta implicado en la regulation de la concentration de calcio en el plasma sangulneo. Si el nivel de calcio disminuye por debajo de un nivel umbral, las celulas de la glandula paratiroides secretan PTH a la sangre y se induce la liberation de calcio desde el tejido oseo. Al mismo tiempo, la PTH ayuda en la absorcion de calcio desde el intestino delgado y aumenta la reabsorcion de calcio de la pre-orina, evitando de este modo la perdida de calcio por los rinones. Debido a sus efectos de liberacion de calcio, se ha observado que una cantidad excesiva de PTH en la sangre, tal como normalmente se observa en el hierparatiroidismo primario y secundario, esta asociada con una densidad osea reducida y con atrofia osea (osteoporosis). Considerando los efectos fisiologicos de la PTH, resulta extrano que, sin embargo, la hormona haya resultado ser util en el tratamiento de la osteoporosis.

Sin embargo, estudios animales en ratas revelaron por primera vez que una exposition breve a la PTH induce formation de hueso debido a la activation transitoria de los osteoclastos, mientras que una exposicion prolongada da como resultado en ultima instancia atrofia osea. Estudios cllnicos posteriores en seres humanos utilizando el fragmento farmaceuticamente activo PTH1-34 de la PTH humana confirmaron que el fragmento puede utilizarse para tratar la osteoporosis. El PTH1-34 es un polipeptido que tiene una masa molecular de 4,7 kDa que consiste en los primeros 34 aminoacidos de la hormona pTh humana. Se aprobo para el tratamiento de la osteoporosis en 2002 con el nombre del producto "teriparatida". La teriparatida se comercializa por Lilly Pharma bajo la marca Forteo (en los Estados Unidos) y Forsteo (en Europa).

Actualmente, el PTH1-34 para uso terapeutico se produce por expresion heterologa en celulas hospedadoras bacterianas y posterior purification del polipeptido farmacologicamente activo. Sin embargo, se ha descubierto que todos los fragmentos conocidos y variantes del PTH1-34 producidos durante el proceso de produccion demuestran una potencia reducida comparada con el PTH1-34. Ademas se ha observado un efecto negativo en la pureza general. Por ejemplo, se identifico una serie de fragmentos derivados del PTH1-34 en el lote final obtenido tras la expresion heterologa, incluyendo entre otros PTH1-30, PTH2-34, PTH3-34 y PTH4-34. Ademas, las modificaciones qulmicas de ciertos aminoacidos del PTH1-34, por ejemplo, la oxidation de restos de metionina o la desamidacion de restos de asparagina, da lugar a variantes adicionales.

Sin embargo, dado que la homogeneidad de un producto pensado para ser usado como producto terapeutico es de la maxima importancia por motivos de seguridad, cualquier tipo de forma truncada o modificada qulmicamente del PTH1-34 en el producto final es claramente indeseable. Por consiguiente, los procesos de produccion actuales normalmente incluyen una o mas etapas de cromatografla dirigidas a la purificacion del polipeptido PTH1-34. Sin embargo, se ha descubierto que es problematico separar el PTH1-34 de alguna de sus variantes y fragmentos sin perdidas significativas del producto. En particular, se ha observado que el fragmento PTH2-34 muestra esencialmente las mismas propiedades de retention en la cromatografla de intercambio ionico que el PTH1-34. Por consiguiente, el fragmento PTH2-34 se co-eluye con el PTH1-34, lo que dificulta la purificacion del PTH1-34. Ademas, se probaron tecnicas cromatograficas alternativas, por ejemplo, la cromatografla de fase inversa, pero no mostraron potencial para una separacion preparativa de la teriparatida truncada y de longitud completa.

En vista de lo anterior, se necesitan nuevos metodos que sean eficaces en la separacion del PTH1-34 de sus fragmentos y variantes qulmicamente modificadas. El metodo de la presente invencion posibilita una purificacion eficaz del polipeptido PTH1-34 por cromatografla de intercambio cationico utilizando gradientes de pH y fuerza ionica inversamente proporcionales. Tal como se describe con mas detalle a continuation, el metodo es particularmente adecuado para separar el PTH1-34 del PTH2-34.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra la estructura primaria y secundaria del fragmento de la hormona paratiroidea PTH1-34. La

figura 1a muestra la secuencia de aminoacidos y la distribution de cargas en el PTH1-34. La figura 1b muestra la

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estructura secundaria del PTH1-34.

La figura 2 muestra el intento de separar el PTH1-34 del PTH2-34 por cromatografia de intercambio cationico a escala analitica utilizando un gradiente de sal. Volumen de la columna (VC): 1 ml. Resina: Fractogel SO3- (S). Eluyente A: KH2PO4 20 mM, pH 6,5. Eluyente B: KH2PO4 20 mM, KCl 500 mM, pH 6,5. Carga: 1 mg/ml de resina. Gradiente 0-100 % de eluyente B en 60 VC. Caudal: 120 cm/h.

La figura 3 muestra la separacion cromatografica del PTH1-34 y del PTH2-34 utilizando una columna de intercambio cationico con un volumen de columna de 29 ml. Eluyente A: Tris 20 mM, Bis-Tris 20 mM, pH 6,5. Eluyente B: Tris 20 mM, Bis-Tris 20 mM, KCl 4 mM, pH 8,2. Carga: 4,5 mg/ml de resina. Elucion por etapas con 13,5 volumenes de columna con tampon de elucion al 100 %. Resina: Fractogel SO3' (S). Caudal: 150 cm/h.

La figura 4 muestra la separacion cromatografica del PTH1-34 y del PTH2-34 a escala preparativa utilizando una columna de intercambio cationico con un volumen de columna de 26,3 l. Eluyente A: Tris 20 mM, dihidrogenofosfato potasico 20 mM, pH 6,5. Eluyente B: Tris 20 mM, hidrogeno fosfato dipotasico 16 mM, dihidrogenofosfato potasico 4 mM, pH 8,9. Carga: 3,5 g/l de resina. Resina: Fractogel SO3' (S). Caudal: 100 cm/h.

La figura 5 muestra los resultados del analisis por cromatografia liquida de ultra-alto rendimiento en fase reversa (RP-uHPLC) de las fracciones recogidas de la ejecucion de cromatografia de intercambio cationico ilustrada en la figura 4.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se basa en la sorprendente perspectiva de que la teriparatida (tambien citada en el presente documento como PTH1-34) puede purificarse de manera eficaz en un proceso de cromatografia de intercambio cationico aumentando el pH y disminuyendo simultaneamente la fuerza ionica en el fluido utilizado para eluir el polipeptido del material de intercambio cationico. El uso de estos gradientes inversamente proporcionales no ha sido divulgado en la tecnica anterior. En su lugar, es un conocimiento basico en el campo de la cromatografia de intercambio ionico que los polipeptidos, que estan unidos a un intercambiador ionico, pueden eluirse incrementando la fuerza ionica en el eluyente, por ejemplo, aumentando la concentracion de sal en el eluyente (S. Yamamoto, K. Nakanishi, R. Matsuno (1988), "lon Exchange Chromatography of Proteins", Chromatographic Science Series, Volumen 43, Marcel Dekker, Nueva York; C. T. Mant et al. (2007), "HPLC Analysis and Purification of Peptides", Methods in Molecular Biology, Volumen 386, 3-55). La disminucion de la fuerza ionica en el eluyente no es una etapa habitual en la cromatografia de intercambio ionico. Es sorprendente, por lo tanto, que un gradiente dual como el aplicado en la presente invencion sea adecuado para proporcionar PTH1-34 altamente purificado.

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere, por lo tanto, a un metodo para purificar el PTH1-34 mediante cromatografia de intercambio ionico, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(a) poner en contacto un fluido que contiene el PTH1-34 con un material de intercambio cationico en condiciones que permitan la union reversible del PTH1-34 a dicho material de intercambio cationico;

(b) opcionalmente, lavar el material de intercambio cationico para eliminar el material no unido;

(c) eluir el PTH1-34 mediante el aumento del pH y la disminucion de la fuerza ionica.

PTH1-34 e impurezas derivadas del mismo

Se ha observado que el presente metodo es eficaz para purificar el PTH1-34 terapeuticamente activo que esta presente en un fluido de varias variantes y fragmentos no deseados del PTH1-34 que pudieran estar tambien presentes en dicho fluido. Estos fragmentos pueden incluir, por ejemplo, formas truncadas del PTH1-34 que pueden ser consideradas como producto relacionado con impurezas resultantes del proceso de production del polipeptido. Por ejemplo, la manera mas comun de producir el PTH1-34 incluye la expresion heterologa del polipeptido en celulas hospedadoras de E. coli. Se ha descubierto que la expresion heterologa del PTH1-34 puede dar lugar a formas truncadas en N-terminal y en C-terminal del PTH1-34 que no son aceptables y tienen que eliminarse del producto por razones de seguridad.

En particular, se ha observado que el PTH2-34, una forma truncada del PTH1-34 que carece del resto de serina N-terminal, esta regularmente presente despues de la expresion heterologa. La cantidad general del PTH2-34 truncado en producto de la solution obtenida es de hasta el 1 % (p/p). Otras posibles formas truncadas del PTH1-34 pueden carecer de los primeros 2 o 3 aminoacidos en el extremo N-terminal. Estas variantes se citan en el presente documento como PTH3-34 y PTH4-34, respectivamente. En una realization preferida de la invencion, el metodo de cromatografia de intercambio ionico que se proporciona en el presente documento se aplica con el proposito de eliminar uno o varios de los fragmentos de PTH2-34 truncados en N-terminal, PTH3-34 y PTH4-34. En una realizacion

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particularmente preferida, el metodo reivindicado se refiere a la eliminacion de fragmentos truncados PTH2-34.

Aparte de los fragmentos truncados en N-terminal de PTH1-34, el fluido que se va a someter al metodo de purificacion de la presente invencion puede contener tambien formas del PTH1-34 truncadas en el C-terminal. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos que carezcan de 1,2, 3 o 4 de los aminoacidos localizados en el extremo C-terminal del PTH1-34. Por lo tanto, en otra realizacion preferida, el metodo de cromatografla de intercambio ionico proporcionado en el presente documento se aplica con el fin de eliminar uno o varios de los polipeptidos PTH1-33, PTH1-32, PTH1-31 y PTH1-30 truncados en el C-terminal. En una realizacion particularmente preferida, el metodo reivindicado se aplica para eliminar el PTH1-30.

En otra realizacion adicional mas de la presente invencion, el nuevo metodo se realiza con el fin de eliminar variantes qulmicamente modificadas del PTH1-34 que comprenden modificaciones en una o mas cadenas laterales de aminoacidos. Estas variantes pueden surgir como impurezas relacionadas con el producto en la produccion del PTH1-34. Se han identificado una serie de variantes del PTH1-34 que difieren del polipeptido original en que ciertos restos de aminoacidos se han oxidado, desaminado y/o modificado por formacion de succinimida. Por ejemplo, se ha identificado una variante que tiene un resto de asparagina desaminada en la posicion 16 del PTH1-34. Otra variante tiene restos de metionina oxidados en las posiciones 8 y/o 18 del PTH1-34. Como en los fragmentos truncados, es necesario retirar estas variantes del producto final de PTH1-34 por razones de seguridad.

El PTH1-34 que se va a purificar con el metodo de la invencion preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. El polipeptido ilustrado en la SEQ ID NO: 1 se corresponde con los 34 aminoacidos N-terminales de la hormona paratiroidea humana de origen natural. Por comparacion, la secuencia de aminoacidos de la hormona paratiroidea humana de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 2. La figura 1a muestra la distribucion de la carga de aminoacidos dentro de la secuencia del PTH1-34 de SEQ ID NO: 1. En condiciones fisiologicas, la secuencia del PTH1-34 de SEQ ID NO: 1 comprende dos regiones de alfa-helice que estan conectadas mediante una region en bucle (vease la figura 1b). No se ha observado una estructura terciaria para la molecula en condiciones fisiologicas.

Tambien se incluyen en el termino "PTH1-34" los homologos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. Tal como se usa en el presente documento, los homologos del PTH1-34 de SEQ ID NO: 1 son polipeptidos que se diferencian del polipeptido en la SEQ ID NO: 1 en un numero limitado de aminoacidos, por ejemplo en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas aminoacidos. Preferentemente, el homologo difiere en no mas de 15 aminoacidos respecto del polipeptido ilustrado en la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el polipeptido que se va a purificar mediante el metodo de la invencion puede ser un polipeptido que difiere del PTH1-34 que se muestra en la SEQ ID NO: 1 en que no mas de 1,2, 3, 4, o 5 aminoacidos han sido sustituidos por otros aminoacidos. En los casos donde se efectua una sustitucion de aminoacidos, la sustitucion es preferentemente una sustitucion conservativa de aminoacidos, es decir, una sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido de polaridad similar que pueda actuar como un equivalente funcional. Preferentemente, el aminoacido que se usa como sustituto se selecciona del mismo grupo que el resto de aminoacido que se va a sustituir. Por ejemplo, puede sustituirse un resto hidrofobo por otro residuo hidrofobo, o puede sustituirse un resto polar por otro resto polar que tenga la misma carga. Los aminoacidos funcionalmente homologos que pueden utilizarse para una sustitucion conservativa pueden ser, por ejemplo, aminoacidos no polares, tales como glicina, valina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, fenilalanina, y triptofano. Los ejemplos de aminoacidos polares no cargados pueden ser serina, treonina, glutamina, asparagina, tirosina y cistelna. Los ejemplos de aminoacidos polares (basicos) cargados pueden ser histidina, arginina y lisina. Los ejemplos de aminoacidos polares (acidos) cargados pueden ser acido aspartico y acido glutamico.

Es particularmente preferible que el homologo del PTH1-34 que pueda comprender 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones de aminoacidos en comparacion con el PTH1-34 de SEQ ID NO: 1 no comprenda modificaciones qulmicas, tales como oxidaciones, desamidaciones, ciclaciones, y similares. Ademas, es preferible que el homologo comprenda o consista en 34 aminoacidos.

De acuerdo con la invencion, el polipeptido PTH1-34 que se va a someter al metodo de la invencion puede obtenerse por cualquier metodo adecuado que se conozca en la tecnica para producir polipeptidos. El polipeptido puede haberse preparado tanto por metodos ribosomicos como no ribosomicos. Por ejemplo, el PTH1-34 puede haber sido sintetizado qulmicamente en fase solida o en metodos de fase llquida. Se han descrito protocolos para la slntesis qulmica de peptidos en fase de solucion (vease, por ejemplo, Andersson et al., Biopolymers 55:227-250, 2000). Para la slntesis en fase solida se puede usar la tecnica basica descrita por Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85, 2149-2154). En esta estrategia, el peptido en crecimiento esta anclado sobre una resina insoluble, y los reactivos solubles que no hayan reaccionado son eliminados en etapas de filtracion o lavado sin perdidas en la manipulacion. La tecnica de slntesis en fase solida de Merrifield se ha mejorado en la ultima decada y hoy en dla permite la slntesis de polipeptidos de hasta 50 aminoacidos. La slntesis qulmica de fragmentos del PTH1-34 fue divulgada, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 4.427.827 y 4.105.602.

Como alternativa, el polipeptido PTH1-34 que se va a purificar de acuerdo con la invencion puede ser un PTH1-34 producido de manera recombinante, es decir, el polipeptido se ha producido mediante procesos biotecnologicos que

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implican modificaciones geneticas de celulas u organismos. Tlpicamente, se clona una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido PTH1-34 en un vector adecuado que posibilita la expresion o sobreexpresion del polipeptido en la celula hospedadora. El vector se introduce en la celula hospedadora procariota o eucariota, y la celula se cultiva en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido. Normalmente, el polipeptido que se va a expresar estara bajo el control de un promotor inducible de forma que la expresion podrla iniciarse con la adicion de un inductor, por ejemplo, IPTG, al medio de cultivo. Tras la incubacion de las celulas para permitir la expresion, las celulas normalmente se recogen y homogeneizan para liberar el polipeptido PTH1-34 recombinante. Finalmente, el polipeptido se recupera mediante una o mas etapas de purification. De acuerdo con la presente invention, se prefiere particularmente que el polipeptido PTH1-34 sea un polipeptido que haya sido producido de manera recombinante por expresion heterologa en celulas hospedadoras.

Para simplificar su posterior enriquecimiento y purificacion, el PTH1-34 recombinante debe prepararse en forma de un polipeptido de fusion. Tal como se usa en el presente documento, se prefiere un polipeptido de fusion a una fusion de la secuencia de aminoacidos del PTH1-34 a una segunda secuencia de aminoacidos. La segunda secuencia de aminoacidos puede ser, por ejemplo, una etiqueta de afinidad, es decir, una secuencia de aminoacidos que esta fusionada al polipeptido PTH1-34 en N-terminal o en C-terminal, y que tenga una fuerte afinidad por otro compuesto o material, permitiendo de este modo el enriquecimiento y/o la purificacion del polipeptido de fusion como un todo. La etiqueta de afinidad puede ser, por ejemplo, una secuencia de poli-histidina que comprende 6-12 histidinas que interacciona especlficamente con una matriz de quelato de iones de nlquel o con resinas IMAC alternativas. Como alternativa, la etiqueta de afinidad puede ser una glutation S-transferasa que permite la purificacion mediante una matriz de glutation. Se conocen bien en la tecnica etiquetas de afinidad adicionales. Puede eliminarse una secuencia de etiqueta de afinidad de la secuencia del PTH1-34 despues de la purificacion con la matriz de afinidad, por ejemplo, proporcionando un sitio de escision proteolltica entre el PTH1-34 y la etiqueta de afinidad.

El PTH1-34 recombinante puede expresarse en grandes cantidades en las celulas hospedadoras bacterianas, de manera que se forman cuerpos de inclusion en los que los polipeptidos recombinantes estan presentes en formas parcialmente plegadas y agregados mediante interacciones hidrofobas no covalentes o ionicas. En los casos donde el metodo de production del PTH1-34 recombinante proporcione el polipeptido en cuerpos de inclusion, se incluira preferiblemente una etapa en la que se solubilicen y replieguen los polipeptidos en los cuerpos de inclusion. Los metodos para la solubilization y el replegado de polipeptidos de los cuerpos de inclusion son bien conocidos en la tecnica.

Dispositivo cromatografico y material de intercambio cationico

El presente metodo se lleva a cabo preferentemente mediante el uso de un dispositivo de FPLC (cromatografla llquida rapida de protelnas), es decir, un dispositivo automatizado que comprende una columna que incluye el material de intercambio cationico como la fase estacionaria, una o mas bombas que proporcionan una presion que es suficiente para hacer que la fase movil (es decir, los tampones usados para unir, lavar y eluir) fluya a traves del material de intercambio cationico, un aparato que recoge las fracciones eluidas de la columna, y un detector que es capaz de detectar el PTH1-34 que es eluido desde la columna. La detection puede lograrse midiendo la absorbancia a una longitud de onda de, por ejemplo, 280 nm. Ademas, tambien pueden controlarse los cambios en el pH y la conductividad en las fracciones. Hay disponible comercialmente un numero considerable de dispositivos de FPLC automatizados que son adecuados para la cromatografla de intercambio cationico a traves de diferentes fabricantes. Los ejemplos no limitantes de dichos dispositivos cromatograficos incluyen los sistemas AKTApurifier, AKTAavant, AKTApilot, AKTAexplorer o AKT-Aprocess (GE Healthcare), los sistemas K-Prime 40 (Merck Millipore), los sistemas NCG (Bio-Rad), y dispositivos similares. Sin embargo, no es obligatorio el uso de estos dispositivos automaticos para llevar a cabo el metodo de la presente invencion.

El metodo de la invencion puede hacer uso de cualquier material de intercambio cationico que se haya descrito en la tecnica como util para la purificacion de polipeptidos. Tal como se usa en el presente documento, el material de intercambio cationico es una matriz polimerica insoluble que comprende en su superficie grupos funcionales cargados negativamente que son capaces de atraer cationes o moleculas cargadas positivamente. El material de intercambio cationico puede estar en forma de perlas porosas que tienen, por ejemplo, un tamano de entre 10-100 pm, preferentemente de 20-80 pm. En la tecnica se conocen varios materiales de intercambio cationico diferentes, incluyendo pollmeros naturales reticulados, pollmeros organicos y materiales inorganicos. Mientras que normalmente se emplean grupos carboximetilo en intercambiadores cationicos debiles, los intercambiadores cationicos fuertes incluyen a menudo grupos sulfopropilo. Cuando se realiza el metodo de la presente invencion, es preferible que el intercambiador cationico este presente en la forma de una columna rellena adecuada para su uso en un dispositivo FPLC automatizado, como el sistema Akta Purifier 100 FPLC.

En otra realization preferida de la invencion, el material de intercambio cationico utilizado en el metodo de purificacion es un intercambiador cationico fuerte que comprende sulfoetilo, sulfopropilo, sulfobutilo y/o sulfoisobutilo como grupos funcionales. Los materiales de intercambio cationico que comprenden una mezcla de uno o mas de los grupos anteriores pueden utilizarse igualmente en el metodo de la invencion. Ademas, el material de intercambio cationico puede basarse en cualquier material polimerico comun que se haya descrito para su uso en este tipo particular de

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cromatografla. Por ejemplo, el material polimerico de intercambio cationico puede comprender poliestiroldivinilbenzol, polimetacrilato, estireno-divinilbenceno, agarosa reticulada, matrices basadas en sllice, eter de polivinilo, celulosa, y dextrano.

Los materiales o columnas de intercambio cationico que contengan estos materiales pueden obtenerse a traves de diferentes proveedores e incluyen, por ejemplo, la resina Unosphere S 70 (Biorad, Munich, Alemania), la resina Nuvia™ S (Biorad, Munich, Alemania), la resina Poros HS20 o HS50 (Life Technologies, Darmstadt, Alemania), la resina Source 15S o 30S (GE Healthcare, Friburgo, Alemania), la resina de Polisulfoetilo A (PolyLC, Columbia, EE.UU.), la resina Ceramic HyperD F (S) (Pall, Dreieich, Alemania), el medio de bioseparacion Bakerbond™ PolyCSX-35 (Avantor Performance Materials, Center Valley, EE.UU.), las resinas Eshmuno S y CPX (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania), las resinas Toyopearl SP-650M y GigaCap S-650M (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, EE.UU.) y otras fases estacionarias de intercambio cationico que se utilizan con regularidad para la purificacion de protelnas.

La utilizacion de una de las siguientes resinas es particularmente preferida en el metodo de la invention: la resina Eshmuno S, la resina Eshmuno CPX, la resina Poros HS20, y la resina Toyopearl GigaCap S-650M. Un material de resina de intercambio cationico particularmente preferido para el metodo de la invencion es la resina Fractogel® desarrollada por Merck Millipore. La resina Fractogel® utiliza la denominada "tecnologla tentaculo", lo que significa que la superficie de las perlas de resina contiene cadenas polimericas largas que proporcionan una accesibilidad mejorada de las protelnas que se van a purificar a los grupos funcionales del material de resina. El metodo de la invencion se lleva a cabo preferentemente con la resina Fractogel® EMD SE Hicap (M), la resina Fractogel® EMD SO3" (S), o la resina Fractogel® EMD SO3" (M). Se prefiere particularmente el uso de la resina Fractogel® EMD SO3" (S) de acuerdo con la invencion.

Las columnas de intercambio cationico utilizadas en el metodo de purificacion divulgado en el presente documento pueden ser de cualquier tamano. Dado que el metodo de la invencion esta dirigido a la purificacion del PTH1-34 a partir de lotes de production, se prefiere particularmente el uso de columnas preparativas que permitan la union de grandes cantidades del PTH1-34. Se pueden utilizar columnas preparativas que tienen un volumen de lecho de 1-100 l, aunque se prefieren particularmente volumenes de lecho de 10-50 l, por ejemplo, 45 l. Por ejemplo, las columnas preparativas utilizadas en el metodo de purificacion de la presente invencion pueden tener un volumen de lecho de al menos 1 l, al menos 2 l, al menos 3 l, al menos 4 l, al menos 5 l, al menos 10 l, al menos 20 l, al menos 25 l, o mas. Normalmente, las columnas preparativas utiles en el metodo de la invencion tendran un diametro de entre 1-100 cm, aunque se prefiere particularmente un diametro de entre 20-80 cm o 40-60 cm.

Pueden usarse columnas anallticas que tienen un volumen de lecho de 1-5 ml para optimizar adicionalmente las condiciones del metodo de purificacion de intercambio cationico de la invencion, por ejemplo, para ajustar el metodo para otros polipeptidos. Sin embargo, deberla tenerse en cuenta que las condiciones que resultaron altamente utiles para una columna analltica pueden no ser igualmente transferibles a las condiciones en una columna preparativa (veanse los ejemplos mas adelante).

Preparation de la muestra y de la columna

El metodo de la invencion utiliza como material de partida un fluido que contiene el PTH1-34. El fluido puede ser el sobrenadante de un cultivo celular que se utilizo para la expresion heterologa del polipeptido. Por ejemplo, es posible someter directamente el sobrenadante que comprende los polipeptidos PTH1-34 y otros componentes solubles de las celulas hospedadoras al metodo de cromatografla de intercambio ionico de la invencion, ya sea con o sin dilution previa. Sin embargo, es preferible que antes de aplicar el metodo de purificacion de la invencion se haya procesado adicionalmente el sobrenadante obtenido del cultivo celular, por ejemplo, por centrifugation, filtration, cromatografla de exclusion por tamano, cromatografla de afinidad, RP-HPLC, y similares, para eliminar sustancias no deseadas, por ejemplo, nucleotidos y/o polisacaridos, para retirar por escision una etiqueta de afinidad u otro peptido o polipeptido que este fusionado al PTH1-34, y/o para enriquecer el polipeptido PTH1-34. El fluido que se va a utilizar en el metodo de la invencion contiene preferentemente el polipeptido PTH1-34 en forma sustancialmente enriquecida, lo que significa que al menos un 50 % de los componentes polipeptldicos disueltos en el fluido son PTH1-34.

En una realization, el fluido utilizado como material de partida en el metodo de la invencion se obtiene de una ejecucion previa de cromatografla en fase inversa, es decir, el fluido es el eluato de la cromatografla en fase inversa. Este eluato contendra cantidades significativas de disolventes organicos, tales como acetonitrilo, y podrla ser necesario diluirlo con un tampon adecuado antes de aplicarlo al material de intercambio cationico. De manera conveniente, el tampon utilizado para la dilucion puede ser el mismo tampon que se uso para equilibrar el material de intercambio cationico. El eluato de la cromatografla en fase inversa puede diluirse en un factor 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas. Una dilucion de factor 2-4 ha resultado ser particularmente util. Cuando la dilucion no es posible, por ejemplo, debido a una excesiva cantidad de acetonitrilo en el fluido, puede realizarse un intercambio completo del tampon, lo que significa que el PTH1-34 se transfiere desde el eluato de la fase inversa a un tampon que se ajusta a la cromatografla de intercambio ionico posterior. El intercambio del tampon puede lograrse facilmente, por ejemplo, por filtracion de flujo tangencial, cromatografla de exclusion por tamano, diafiltracion o dialisis. Es preferible que el

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PTH1-34 se transfiera al tampon que se utiliza durante la union del polipeptido al material de intercambio cationico (denominado en lo sucesivo como un "tampon de union").

Antes de la aplicacion del fluido que contiene el polipeptido PTH1-34 al material de intercambio cationico, el material de intercambio cationico se equilibrara normalmente mediante lavado de la columna con 1-50, preferentemente 1-25, y mas preferentemente con 1-10 volumenes de columna de un tampon de equilibrado para proporcionar condiciones que promuevan la union del polipeptido al intercambiador cationico. Preferentemente, el tampon de equilibrado y el tampon de union son identicos. Tras el equilibrio, se pone en contacto el fluido que contiene el polipeptido PTH1-34 con el material de intercambio cationico.

Puesta de contacto del PTH1-34 con el material de intercambio cationico

De acuerdo con la etapa (a) del metodo anterior, el fluido que contiene el PTH1-34 se pone en contacto con el material de intercambio cationico en condiciones que posibilitan la union del polipeptido a la matriz polimerica del intercambiador cationico. Esto significa que las condiciones en terminos de temperatura, presion y pH son tales que el PTH1-34 puede desplazar a los cationes que se han unido al material de intercambio cationico despues del equilibrado. En particular, se facilita la union del polipeptido al material de intercambio cationico mediante la seleccion de un pH adecuado del tampon de union.

Para identificar un pH adecuado que permita la union del PTH1-34 a un material de intercambio cationico concreto, puede ponerse en contacto el polipeptido con el intercambiador cationico elegido en diferentes condiciones de pH a la vez que se detecta la cantidad de polipeptido en el flujo pasante. De este modo, puede determinarse facilmente un intervalo de pH adecuado para la union del polipeptido al intercambiador cationico. Es preferible de acuerdo con la invencion que el pH se seleccione de tal forma que el PTH1-34 este presente en forma de un polipeptido cargado positivamente que soporte su union al intercambiador cationico. Para proporcionar moleculas del polipeptido PTH1-34 cargadas positivamente, el pH del tampon utilizado en la etapa de union debe estar preferentemente por debajo del punto isoelectrico del polipeptido. El PTH1-34 expuesto en la SEQ ID NO: 1 tiene un punto isoelectrico de 8,3. Por lo tanto, cuando se pretende purificar el PTH1-34 de la SEQ ID NO: 1 con el metodo de la presente invencion, el pH en la etapa de union debe seleccionarse para que este por debajo de 8,3.

Preferentemente, el tampon de union utilizado para la aplicacion del polipeptido PTH1-34 de SEQ ID NO: 1 al material de intercambio cationico se ajustara a un pH de 8,0 o inferior. Sera particularmente preferible que el pH del tampon de union sea de al menos 0,5 unidades de pH, mas preferentemente de al menos 1,0, al menos 1,5, o al menos 2,0 unidades de pH por debajo del punto isoelectrico del polipeptido que se va a purificar. En los casos donde el metodo de la invencion se lleve a cabo con el PTH1-34 expuesto en la sEq ID NO: 1, la union del polipeptido al material de intercambio cationico se realiza preferentemente en un tampon de union que tenga un pH por debajo de 7,8, por debajo de 7,3, por debajo de 6,8, y mas preferentemente por debajo de 6,3, o incluso por debajo de 6,0. Por ejemplo, el PTH1-34 de SEQ ID NO:1 se une al material de intercambio cationico utilizando un tampon de union a un pH de entre 6,0 y 8,0, preferentemente a un pH de entre 6,5 y 7,5, y mas preferentemente a un pH de entre 6,8 y 7,2. En los casos donde se utilice un homologo de PTH1-34 que difiera del PTH1-34 en la SEQ ID NO: 1 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoacidos, serla posible que el punto isoelectrico de dicho polipeptido modificado sea ligeramente diferente. El experto en la materia sera capaz de determinar facilmente el punto isoelectrico del homologo utilizando metodos rutinarios bien conocidos en la tecnica.

La presente invencion se basa, entre otras, en la perspectiva de que la separacion cromatografica del PTH1-34 de sus fragmentos y variantes puede mejorarse eluyendo el PTH1-34 del material de intercambio cationico mediante el aumento del pH y un descenso simultaneo de la fuerza ionica en la fase movil. Esto puede conseguirse convenientemente mediante el uso de un eluyente que, en comparacion con el tampon de union o lavado, tiene un pH mas elevado y una conductividad mas baja. Por lo tanto, el tampon de union utilizado para unir el PTH1-34 a la resina de intercambio cationico en el metodo de la invencion mostrara una fuerza ionica que es mayor que la del eluyente. Esto es inusual en la cromatografla de intercambio cationico, porque la fuerza ionica del eluyente se incrementa normalmente de manera gradual para garantizar el desplazamiento de los polipeptidos desde el intercambiador cationico. La conductividad (expresada como mS/cm) de los tampones utilizados en el proceso de cromatografla de intercambio ionico es una medida adecuada que refleja la fuerza ionica de dicho tampon. Por consiguiente, los terminos "conductividad" y "fuerza ionica" se utilizan indistintamente en el presente documento.

Es preferible que el tampon de union tenga una conductividad al menos un 30 % superior, al menos un 50 % superior, al menos un 75% superior, al menos un 100% superior, al menos un 150% superior, al menos un 200% superior, o al menos un 300 % superior a la conductividad del eluyente correspondiente. La conductividad del tampon de union estara preferiblemente en el intervalo de 1,5-3,0 mS/cm, por ejemplo, mas de 1,5 mS/cm, mas de 1,6 mS/cm, mas de 1,7 mS/cm, mas de 1,8 mS/cm, mas de 1,9 mS/cm, mas de 2,0 mS/cm, mas de 2,1 mS/cm, mas de 2,2 mS/cm, mas de 2,3 mS/cm, mas de 2,4 mS/cm, mas de 2,5 mS/cm, mas de 2,6 mS/cm, mas de 2,7 mS/cm, mas de 2,8 mS/cm, o mas de 2,9 mS/cm. Preferentemente, la conductividad del tampon de union sera al menos 0,5 mS/cm superior que la conductividad del eluyente correspondiente, mas preferentemente al menos 0,6 mS/cm, al menos 0,7 mS/cm, al menos 0,8 mS/cm, al menos 0,9 mS/cm, al menos 1,0 mS/cm, al menos 1, 1 mS/cm, al menos 1,2 mS/cm, al menos 1,3

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mS/cm, al menos 1,4 mS/cm, al menos 1,5 mS/cm, al menos 1,6 mS/cm, al menos 1,7 mS/cm, al menos 1,8 mS/cm, al menos 1,9 mS/cm, o al menos 2,0 mS/cm.

En un aspecto preferido, la conductividad del tampon de union esta en el intervalo de entre 2,0 y 3,0 mS/cm, y la conductividad del eluyente esta en el intervalo de entre 0,5 y 1,5 mS/cm. En un aspecto aun mas preferido, la conductividad del tampon de union esta en el intervalo de entre 2,5 y 2,8 mS/cm, y la conductividad del eluyente esta en el intervalo de entre 1,0 y 1,3 mS/cm.

Se pueden utilizar varios tampones en el metodo de la presente invencion. Es preferible, de acuerdo con la invention, que el tampon de union y el tampon de elucion se preparen con la misma sustancia tamponadora. El compuesto de tampon utilizado para preparar el tampon de union y el tampon de elucion se seleccionan de forma que su intervalo de pH abarque el punto isoelectrico del polipeptido PTH1-34, es decir, el valor de pKa de la sustancia tamponadora no es mas de una unidad de pH superior o inferior al punto isoelectrico del polipeptido PTH1-34. En los casos donde el polipeptido PTH1-34 que se va a purificar sea el polipeptido de SEQ ID NO: 1, el tampon se seleccionara de manera que su intervalo de pH abarque el pH 8,3, es decir, el compuesto tamponador tiene un pKa de entre 7,3 y 9,3. Un intervalo de pH en el area del punto isoelectrico del PTH1-34 tiene la ventaja particular de que la preparation del tampon de union, que preferentemente tiene un pH por debajo de 7,5, y mas preferentemente un pH de aproximadamente 6,5, requerira cantidades considerables de acido, tal como HCl, para el ajuste del pH. La adicion de HCl u otros acidos al tampon de union aumentara la fuerza ionica del tampon de union con respecto al tampon de elucion, teniendo este ultimo un pH mayor y, en consecuencia, requiere o no solo un ligero ajuste de pH.

Las sustancias tamponadoras adecuadas que tienen un pKa en el intervalo de 8,3 incluyen tris(hidroximetil)aminometano (citado como "Tris" en el presente documento), trietanolamina, y tampon borato. Los tampones adicionales que se ha observado que son adecuados para llevar a cabo el metodo de la invencion incluyen un tampon de barbital que tiene un pH en el intervalo de, por ejemplo, 6,8-9,2, y un tampon de glicilglicina que tiene un pH en el intervalo de, por ejemplo, 7,3-9,3. En el presente documento se prefiere el uso del tampon Tris, porque se descubrio de manera inesperada que da como resultado una separation particularmente buena del PTH1-34. El uso de tampon Tris no fue una medida obvia en el metodo de la invencion, porque se recomienda con frecuencia en la bibliografla el uso de Tris en la cromatografla de intercambio anionico. El Tris es un tampon cationico que es, en principio, capaz de unirse a los grupos funcionales de la resina de intercambio cationico, alterando de este modo la separacion reproducible. En el metodo de la presente invencion, sin embargo, se observa que el uso de Tris no influye negativamente en la purification del PTH1-34 mediante cromatografla de intercambio cationico.

El compuesto tamponador estara presente en el tampon de union en una cantidad de 1-200 mM, preferentemente 10-100 mM, y mas preferentemente 20-80 mM. En los casos donde se utilice Tris en el tampon de union, la concentration preferida estara en el intervalo de 20-40 mM, en donde 20 mM es particularmente preferida. Pueden usarse sales adicionales, tales como NaCl o KH2PO4, como aditivos en cantidades de 1-100 mM, preferentemente 20-80 mM, para ajustar la conductividad del tampon cuando sea necesario. Pueden anadirse otros compuestos tamponadores, tales como Bis-Tris, al tampon Tris. Los ejemplos no limitantes de un tampon de union a base de Tris que sea adecuado para su uso en la purificacion del polipeptido PTH1-34 de SEQ ID NO: 1 incluyen:

Tris: 20 mM, pH 6,5-7,5

Tris: 30 mM, pH 6,5-7,5

Tris: 40 mM, pH 6,5-7,5

Tris: 20 mM, KH2PO4 20 mM, pH 6 ,5-7 ,5

Tris: 30 mM, KH2PO4 30 mM, pH 6 ,5-7 ,5

Tris: 40 mM, KH2PO4 40 mM, pH 6 ,5-7 ,5

Tris: 20 mM, Bis-Tris 20 mM, pH 6, 5-7, 5

Tris: 30 mM, Bis-Tris 20 mM, pH 6, 5-7, 5

Tris: 40 mM, Bis-Tris 20 mM, pH 6, 5-7, 5

Basandose en su experiencia y en la information y los ejemplos particulares que se proporcionan en el presente documento, el experto sera capaz de preparar facilmente tampones de union adicionales que sean adecuados para su uso en el proceso de purificacion de la presente invencion.

La puesta en contacto del polipeptido PTH1-34 con el material de intercambio cationico puede realizarse de diferentes maneras, dependiendo del equipamiento particular que se utilice para llevar a cabo el metodo de la invencion. En los casos donde se utilice un dispositivo FPLc para el proceso de purificacion de la invencion, el polipeptido PTH1-34 puede ponerse en contacto con el material de intercambio cationico mediante la inyeccion del fluido que contiene el PTH1-34 (ya este o no diluido con tampon de union) en un bucle de inyeccion que posteriormente se introduce en el flujo del tampon de union. El caudal durante la union estara en el intervalo de 50-400 cm/h, preferentemente de 100-300 cm/h, mas preferentemente de 150-200 cm/h.

Cuando se utilicen columnas preparativas que tengan tamano de volumen del lecho de 1-50 l, el PTH1-34 se aplicara a la columna de manera que la carga proteica total este en el intervalo de 2,0-4,5 g/l. En las estrategias que utilizan

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columnas que tienen un tamano de volumen del lecho de 10-250 ml, la carga proteica total esta en el intervalo de 10-20 mg/ml. Cuando se utilicen columnas analiticas que tengan tamano de volumen del lecho de menos de 10 ml, por ejemplo, 5 ml o 1 ml, la carga proteica total estara normalmente en el intervalo de 0,1-5 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 1 mg/ml.

Lavado de la resina de intercambio cationico

Despues de la union de la proteina, el material de intercambio cationico se lava opcionalmente para eliminar el material que no se ha unido. Para este fin, el material de intercambio cationico se lava preferentemente con varios volumenes de columna de tampon de lavado. De acuerdo con la invention, el tampon de lavado puede ser identico al tampon de union en cuanto a su pH o fuerza ionica. El tampon de lavado puede contener componentes adicionales no incluidos en el tampon de union. En cualquier caso, sin embargo, el pH y la fuerza ionica del tampon de lavado podrian ajustarse para evitar cualquier elucion prematura del polipeptido PTH1-34 del material de intercambio cationico.

Dependiendo del tamano de la columna utilizada en el metodo de la invencion, sera util lavar la columna despues de la union de polipeptidos con 1-25 volumenes de columna, preferiblemente 1-15 volumenes de columna, y mas preferiblemente 1-10 volumenes de columna. En una realization aun mas preferente de la invencion, la resina de intercambio cationico se lava despues de la union del PTH1-34 hasta que las senales detectadas de absorcion UV, pH y conductividad permanezcan constantes.

Elucion del polipeptido PTH1-34

Tras la union del PTH1-34 al material de intercambio cationico y (cuando sea aplicable) el lavado de dicho material, se eluye el polipeptido PTH1-34. De acuerdo con la invencion, la elucion se efectua aumentando el pH y disminuyendo la fuerza ionica. En comparacion con el tampon de union, el eluyente tendra, por lo tanto, un pH mas alto que es cercano al punto isoelectrico del polipeptido PTH1-34. Al aumentar el pH, se reduce la carga positiva general del polipeptido PTH1-34 y el polipeptido se liberara del material de intercambio cationico. Preferentemente, el eluyente es un tampon de elucion, es decir, comprende al menos un compuesto tamponador.

El aumento del pH puede lograrse de diferentes maneras. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una elucion en gradiente en la que el eluyente se mezcla gradualmente con el tampon de union o el tampon de lavado. De este modo, el pH de la fase movil que fluye sobre el material de intercambio cationico aumenta gradualmente, de manera que los diferentes polipeptidos, que se han unido al material de intercambio cationico, se liberan en funcion de su fuerza de interaction. El gradiente utilizado puede ser un gradiente convexo, concavo o lineal, pero se prefieren particularmente gradientes lineales. Puede variarse la pendiente del gradiente segun sea necesario. Normalmente, son utiles los gradientes lineales con una pendiente del 1-5 % de tampon de elucion por volumen de columna para llevar a cabo el metodo de la invencion. Como alternativa, se puede realizar una etapa de elucion isocratica cambiando los tampones de union o lavado directamente al 100 % de eluyente sin ningun gradiente. En una etapa de elucion isocratica, la composition del eluyente permanece constante durante la elucion, debido a que el eluyente no se mezcla gradualmente con tampon de union o de lavado en el transcurso de la elucion.

El eluyente utilizado para liberar el polipeptido PTH1-34 del material de intercambio cationico se ajustara a un pH de 8,0 o superior. Sera preferible que el pH del eluyente sea 0,1 unidades de pH, 0,2 unidades de pH, o 0,3 unidades de pH superior o inferior al punto isoelectrico del polipeptido PTH1-34 que se va a purificar. En los casos donde el metodo de la invencion se lleve a cabo con el PTH1-34 de la SEQ ID NO: 1, el eluyente tiene preferentemente un pH de al menos 8,0 o mas, al menos 8,1 o mas, al menos 8,2 o mas, al menos 8,3 o mas, al menos 8,4 o mas, al menos 8,5 o mas, o al menos 9,0 o mas. En los casos donde se utilice un homologo del PTH1-34 que difiera del PTH1-34 en la SEQ ID NO: 1 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoacidos, seria posible que el punto isoelectrico de dicho polipeptido modificado sea ligeramente diferente. Por lo tanto, el pH optimo para su uso durante la etapa de elucion podria variar ligeramente del determinado para el PTH1-34 de la SEQ ID NO: 1.

Tal como se ha afirmado anteriormente en el contexto del tampon de union, el eluyente utilizado para la elucion de PTH1-34 tendra una fuerza ionica que es significativamente menor que aquella del tampon de union y/o del tampon de lavado. Preferentemente, el eluyente tendra una conductividad en el intervalo de 0,1 -1,4 mS/cm, por ejemplo, menor de 1,4 mS/cm, menor de 1,3 mS/cm, menor de 1,2 mS/cm, menor de 1,1 mS/cm, menor de 1,0 mS/cm, menor de 0,9 mS/cm, menor de 0,8 mS/cm, menor de 0,7 mS/cm, menor de 0,6 mS/cm, menor de 0,5 mS/cm, menor de 0,4 mS/cm, menor de 0,3 mS/cm, o menor de 0,2 mS/cm. En otro aspecto, la conductividad del eluyente esta en el intervalo de entre 0,2 y 1,4 mS/cm, preferentemente entre 0,5 y 1,3 mS/cm.

El tampon utilizado para preparar el eluyente sera preferiblemente el mismo que el utilizado como tampon de union y/o tampon de lavado, en donde se prefiere el uso de los tampones Tris, trietanolamina y borato. Se prefiere particularmente el uso del tampon Tris.

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La sustancia tamponadora estara presente en el eluyente en una cantidad de 1-200 mM, preferentemente 10-100 mM, y mas preferentemente 20-80 mM. En los casos donde el Tris se utilice en el eluyente, la concentracion preferida estara en el intervalo de 20-40 mM. Se prefiere particularmente una cantidad de 20 mM de Tris en el eluyente. Pueden usarse sales adicionales, tales como NaCl o KH2PO4, como aditivos en cantidades de 1-100 mM, preferiblemente de 20-80 mM. Pueden anadirse otros compuestos tamponadores, tales como Bis-Tris, al tampon Tris. Los ejemplos no limitantes de un eluyente a base de Tris que sea adecuado para su uso en la purification del polipeptido PTH1-34 de SEQ ID NO: 1 incluyen:

Tris: 20 mM, pH 9,0

Tris: 30 mM, pH 9,0

Tris: 40 mM, pH 9,0

Tris: 20 mM, KH2PO4 3 mM, K2HPO4 13 mM, pH 9 0

Tris: 30 mM, KH2PO4 4 mM, K2HPO4 14 mM, pH 9 0

Tris: 40 mM, KH2PO4 5 mM, K2HPO4 15 mM, pH 9 0

Tris: 20 mM, Bis-Tris 20 mM , KCl 5 mM, pH 8,2

Tris: 20 mM, Bis-Tris 20 mM , KCl 5 mM, pH 8,3

Tris: 20 mM, Bis-Tris 20 mM , KCl 5 mM, pH 9,0

Tris: 20 mM, Bis-Tris 20 mM , KCl 5 mM, pH 10,0

La elucion se realizara aplicando 10-50 volumenes de columna al material de intercambio cationico. En caso de usar un gradiente lineal de eluyente al 0-100 %, el gradiente puede aplicarse en 10-50 volumenes de columna. Se espera que los volumenes de gradiente de 10-20 volumenes de columna proporcionen el mejor equilibrio entre el pico de dilucion y la resolucion.

Modos preferidos de llevar a cabo la purificacion

El metodo de purificacion de la invention es capaz de separar el PTH1-34 terapeuticamente activo de subproductos y fragmentos modificados qulmicamente. Se prefiere que el eluato obtenido en la etapa (c) contenga menos del 5 % de impurezas, es decir, compuestos protelnicos que no sean el PTH1-34 sin modificar. Especlficamente, se prefiere que el eluato obtenido en la etapa (c) contenga menos del 5 % (p/p) del fragmento PTH2-34 y/o menos del 5 % del PTH1-34 desamidado. Aun mas preferentemente, el eluato obtenido en la etapa (c) contiene menos del 0,5 % (p/p) del fragmento del PTH2-34 y/o menos del 0,5 % del PTH1-34 desamidado. En una realization lo mas preferida del metodo, el eluato obtenido en la etapa (c) no contiene PTH2-34 detectable.

De acuerdo con una realizacion particularmente preferida de la invencion, el PTH1-34 que se va a purificar es el polipeptido ilustrado en la SEQ ID NO: 1, y el metodo de purificacion se realiza con un sistema de tampon que comprende eluyente A: Tris 20 mM (con o sin Bis-Tris 20 mM), pH 6,5-7,0, y eluyente B: Tris 20 mM (con o sin Bis-Tris 20 mM), pH 8,0-10,0. Se prefiere ademas iniciar la elucion llevando a cabo una etapa de elucion con eluyente B al 75-100%.

De acuerdo con la invencion, es posible anadir compuestos adicionales al eluyente A o B que puedan resultar ventajosos para una serie de realizaciones de la invencion. Por ejemplo, el tampon de elucion puede comprender sacarosa 250 mM, Tween 20 (1%), urea (1-2 M) y/o arginina (50-100 mM).

Preparacion del polipeptido PTH1-34

El metodo de purificacion descrito anteriormente puede ser parte de un proceso para la preparacion del PTH1-34. Esto significa que el metodo de purificacion de la presente invencion puede implementarse en un proceso de fabrication que incluya la expresion heterologa del polipeptido y varias etapas posteriores de procesamiento dirigidas al replegado y purificacion del polipeptido.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion tambien se refiere a un metodo para preparar el PTH1-34, en particular, el PTH1-34 de la SEQ ID NO: 1, que comprende las etapas de

(a) expresar de manera recombinante el PTH1-34 en una celula hospedadora;

(b) opcionalmente, romper las celulas hospedadoras para liberar el PTH1-34 expresado de manera recombinante;

(c) purificar el PTH1-34 mediante un metodo de purificacion como el que se describe anteriormente con mas detalle.

En la etapa (a) del metodo de fabricacion anterior, el PTH1-34, o un homologo del mismo descrito en otras partes del presente documento, se expresa de manera recombinante en una celula hospedadora, tal como en una celula hospedadora procariota o eucariota. En una realizacion preferida del metodo de fabricacion de la invencion, el PTH1-34 se expresa en celulas hospedadoras bacterianas, por ejemplo, en bacterias del genero Escherichia. El

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metodo de fabricacion puede usar, por ejemplo, cepas bacterianas comunes de E. coli para expresar grandes cantidades del polipeptido PTH1-34.

Tras la expresion del polipeptido en las celulas, puede ser necesario romper las celulas para liberar el polipeptido recombinante del citoplasma. Como alternativa, en los casos donde el polipeptido se secreta por la cepa hospedadora al sobrenadante, por ejemplo, como consecuencia del uso de peptidos de senal adecuados, no sera necesario romper las celulas. En su lugar, el polipeptido recombinante puede obtenerse directamente del sobrenadante de cultivo. El polipeptido recombinante, ademas, puede procesarse, por ejemplo, eliminando el peptido de senal.

En la etapa (c) del proceso de fabricacion anterior, el PTH1-34 se purifica mediante el uso del metodo de cromatografla de intercambio cationico citado anteriormente.

Preferentemente, el metodo para preparar el PTH1-34 tambien comprende una o mas etapas cromatograficas adicionales, tales como la cromatografla en fase inversa, que se lleva a cabo antes o despues de la etapa (c).

Ejemplos

Ejemplo 1: Purification del PTH1-34 en una columna analltica

Las condiciones para separar el PTH1-34 del PTH2-34 truncado en N-terminal se analizaron en una columna analltica de intercambio cationico de Fractogel SO3' (S) en un volumen de 1 ml (0,8 mm de diametro, 20 mm de altura). El eluato de una cromatografla en fase inversa que contenla aproximadamente 0,6 mg/ml de PTH1-34 se aplico a la columna a una carga de aproximadamente 1 mg/ml de la resina.

La union de los polipeptidos a la columna se llevo a cabo en el eluyente A (tambien usado como tampon de union) que consiste en KH2PO4 20 mM, pH 6,5. La elucion se realizo utilizando el eluyente B que consiste en KH2PO4 20 mM, KCl 500 mM, pH 6,5. El eluyente se aplico en un gradiente lineal de eluyente al 0-100% en 60 volumenes de columna. El caudal fue de 120 cm/h. Se recogieron fracciones de 1 ml. De cada una de las muestras recogidas, se midio la extincion a 220 nm.

El resultado de la cromatografla se ilustra en la figura 2. Se puede ver que el PTH1-34 y el PTH2-34 co-eluyen en el mismo pico. Evidentemente, en estas condiciones no fue posible separar el PTH1-34 del PTH2-34 en un grado suficiente. No hubo selectividad de union para el PTH1-34 ni para el PTH2-34 con la columna de intercambio cationico de Fractogel SO3' (S). Por consiguiente, se hicieron esfuerzos por conseguir un metodo mejorado para purificar el PTH1-34 y obtener mayores rendimientos.

Ejemplo 2: Purificacion del PTH1-34 en una columna de 29 ml

Para definir condiciones robustas y fiables a mayor escala, se probaron diferentes condiciones en una columna de intercambio cationico de Fractogel SO3" (S) con un volumen de 29 ml. Se observaron mejoras cuando se utilizo un aumento de pH en lugar de un aumento de concentration salina para la elucion. Para proporcionar una baja fuerza ionica durante la elucion, se prepararon los tampones de manera que el eluyente A (que se corresponde con el tampon de union) tuviese una fuerza ionica alta y el eluyente B tuviese una fuerza ionica significativamente menor. Se observo que el tampon Tris era particularmente util para esta estrategia. Se probaron las siguientes condiciones:

Ejecucion del proceso: Condiciones del tampon Gradiente [%B/VC] Carga [mg/cm2 y mg/ml de Resina) Rendimiento de la etapa [%]

P225: Eluyente A Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM pH 6,5 Cond. 2.7 mS/cm Eluyente B Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM KCl 5 mM pH 10,0 Cond. 0,8 mS/cm 2,7 (40% lavado; 40-100% elucion) 60/6 76

P226: Eluyente A: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM pH 6,5 Cond. 2.7 mS/cm Eluyente B: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM KCl 5 mM pH 10,0 Cond. 0,8 mS/cm 2,5 (45% lavado; 45-100% elucion) 65/4,5 73

P242: Eluyente A: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM pH 6,5 Cond. 2.7 mS/cm Eluyente B: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM KCl 5 mM pH 10,0 Cond. 0,8 mS/cm (0% lavado; 75% elucion) 65/4,5 92

P243: Eluyente A: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM pH 6,5 Cond 2.7 mS/cm Eluyente B: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM KCl 4 mM pH 8,3 Cond 13 mS/cm (0% lavado; 100% elucion) 65/4,5 88

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P250: Eluyente A: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM pH 6,5 Cond. 2.7 mS/cm Eluyente B: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM KCl 4 mM pH 8,2 Cond. 1,4 mS/cm (0% lavado; 100% elucion) 65/4,5 75

P251: Eluyente A: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM pH 6,5 Cond. 2.7 mS/cm Eluyente B: Tris 20 mM Bis-Tris 20 mM KCl 4 mM pH 8,1 Cond. 1,3 mS/cm (0% lavado; 100% elucion) 65/4,5 75

El eluato de una cromatografla en fase inversa RP que contiene aproximadamente 0,6 mg/ml de PTH1-34 se diluyo en un factor de 2 para reducir el contenido de acetonitrilo. El eluato RP se aplico a la columna de carga 4,5-6 mg/ml de resina. La columna se lavo con 3 volumenes de columna de tampon de union (eluyente A). La elucion de la resina se realizo con elucion isocratica o gradiente de elucion.

Se recogieron fracciones de 10 ml. De cada una de las muestras recogidas, se midio la extincion a 220 nm.

Como se puede ver en la tabla anterior, El rendimiento del PTH1-34 aumento significativamente en la elucion utilizando un aumento de pH y una disminucion de la fuerza ionica. La figura 3 muestra de manera ilustrativa el resultado del proceso de ejecucion P250. Se puede observar que el perfil modificado de la elucion tiene un efecto tal que el PTH2-34 se eluye en una concentracion separada que permite su separacion del producto PTH1-34.

Ejemplo 3: Purification de PTH1-34 en una columna de 26,3 l

El metodo de la invention se probo en una escala preparativa utilizando una columna de intercambio cationico de Fractogel SO3" (S) que tiene un volumen de 26,3 l (450 mm de diametro de columna, 166 mm de altura de columna). La preparation del PTH1-34 utilizado en esta etapa cromatografica era PTH1-34 expresado recombinantemente que se habla sometido previamente a cromatografla en fase inversa (RP). La preparacion del PTH1-34 obtenido de la etapa de cromatografla RP contenla aproximadamente un 1,2% de PTH2-34.

Para reducir la concentracion de acetonitrilo, la fraction principal obtenida de la cromatografla RP se diluyo con eluyente A (Tris 20 mM, dihidrogenofosfato potasico 20 mM, pH 6,5, conductividad de aproximadamente 4,1 mS/cm) a razon 1:2 y se cargo en la columna. La columna se lavo con un gradiente inicial en el intervalo de 0-35% de eluyente B (Tris 20 mM, hidrogeno fosfato dipotasico 16 mM, dihidrogenofosfato potasico 4 mM, pH 8,9, conductividad de aproximadamente 3,5 mS/cm) en un volumen de columna y, en una etapa posterior, con un 35% de eluyente B para 10 volumenes de columna. El caudal se ajusto a 100 cm/h. La columna se cargo con 3,5 g/l del polipeptido. La elucion se realizo con un gradiente del 35-100% de eluyente B en 22 volumenes de columna.

Se observo que el producto PTH1-34 elula en el pico de lento ascenso mostrado en la Figura 4, mientras que el PTH2-34 eluyo en el area del pico de descenso brusco (es decir, el area mostrada en negro en la Figura 4). Se recogieron fracciones de la concentracion para analisis posteriores por cromatografla llquida de ultra-alto rendimiento (RP-uHPLC). Se recogio una primera fraccion ("fraccion 1" formada por 100,7 l) hasta el comienzo de la fraccion principal. A continuation de la fraccion principal procesada adicionalmente, se recogieron fracciones adicionales comenzando desde el pico maximo. Estas fracciones ("fracciones 2-6), que comprenden diferentes volumenes (fraccion 2: 1,4 (l), fraccion 3: 3,7 (l), fraccion 4: 8,1 (l), fraccion 5: 3,6 l y fraccion 6: 9,7 (l), se recogieron del area del pico descendente.

Los resultados de la RP-uHPLC se muestran en la figura 5. Se puede ver que la preparacion inicial del PTH1-34 obtenida de la cromatografla RP contenla aproximadamente un 1,2 % de PTH2-34, mientras que la fraccion 1 recogida despues de la cromatografla de intercambio cationico contenla solo aproximadamente el 0,1 % del polipeptido truncado. Casi la totalidad del PTH2-34 eluyo en las fracciones 3-6, es decir, en el area del pico descendente. Se cargaron un total de 62,9 g de PTH1-34 en la columna de intercambio cationico. El proceso cromatografico produjo 54,0 g del PTH1-34, lo que representa una recuperation del 86%.

A partir de estos resultados, se puede entonces concluir que el metodo de la presente invencion es altamente eficaz para separar el PTH1-34 del PTH2-34 a una escala preparativa sin perdida significativa del PTH1-34. El metodo es, por tanto, adecuado para su uso en la production del PTH1-34 a gran escala.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para purificar teriparatida (PTH1-34) mediante cromatografla de intercambio ionico, que comprende las etapas de

(a) poner en contacto un fluido que comprende el PTH1-34 con un material de intercambio cationico en condiciones que permitan la union reversible del PTH1-34 a dicho material de intercambio cationico;

(b) opcionalmente, lavar el material de intercambio cationico para eliminar el material no unido;

(c) eluir el PTH1-34 mediante el aumento del pH y la disminucion de la fuerza ionica.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicho PTH1-34 es PTH1-34 producido de manera recombinante.
3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicho PTH1-34 comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoacidos que difiera de la SEQ ID NO: 1 en la sustitucion de 1, 2, o 3 aminoacidos.
4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho material de intercambio cationico comprende grupos de intercambio sulfoetilo, sulfopropilo, sulfobutilo o sulfoisobutilo.
5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho material de intercambio cationico contiene poliestiroldivinilbenzol, polimetacrilato, eter de polivinilo, celulosa, o dextrano.
6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el eluato obtenido en la etapa (c) contiene menos del 0,5% (p/p) del fragmento PTH2-34.
7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la union a dicho material de intercambio cationico se efectua a un pH de entre 6,3 y 6,7.
8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la union a dicho material de intercambio cationico se efectua en presencia de un tampon de union que contenga Tris 10-80 mM, preferentemente Tris 20 mM.
9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde la elucion a parti r de dicho material de intercambio cationico se efectua en presencia de un eluyente que contenga Tris 10-80 mM, preferentemente Tris 20 mM.
10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el aumento de pH y/o la disminucion de la fuerza ionica se efectua mediante el uso de un gradiente lineal, concavo o convexo.
11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el aumento en el pH y/o la disminucion de la fuerza ionica se efectua utilizando una etapa de elucion.
12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho tampon de union tiene una fuerza ionica en el intervalo de 1,8 a 3,0 mS/cm.
13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicho eluyente tiene una fuerza ionica en el intervalo de 0,2 a 1,2 mS/cm.
14. Un metodo para preparar teriparatida (PTH1-34), que comprende las etapas de

(a) expresar de manera recombinante el PTH1-34 en una celula hospedadora;

(b) opcionalmente, romper las celulas hospedadoras para liberar el PTH1-34 expresado de manera recombinante;

(c) purificar el PTH1-34 mediante un metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. El metodo de la reivindicacion 14, en donde dicha celula hospedadora es una celula hospedadora procariota.
16. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en donde el metodo comprende una o mas etapas adicionales previas o posteriores a la etapa (c).