BRPI0721943A2 - Processo ortogonal para purificação do hormônio da paratireoide humano recombinante (rhpth) (1-34) - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO ORTOGONAL PARA PURIFICAÇÃO DO HORMÔNIO DA PARATIREOIDE HUMANO RECOMBINANTE (rhPTH) (1-34)".

PRIORIDADE

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Indiano número

1543/MUM/2007 depositado em 9 de agosto de 2007.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo para preparação de rhPTH (1-34) também conhecido como teriparatida por construção de um novo nucleotídeo, tal como um fragmento Ncol/Xhol conforme estabelecido na SEQ. ID N0: 1 codificando proteína de fusão quimérica conforme estabe- lecida na SEQ. ID N0: 2 compreendendo um parceiro de fusão consistindo em 41 aminoácidos pertencendo ao gene de β-galactosidase de Escherichia coli, um sítio de clivagem de endopeptidase, fragmento de gene hPTH(1-34), clonagem do dito nucleotídeo em um vetor de expressão sob o controle do promotor T7, transformação do Escherichia coli com o dito vetor e expressão da proteína de fusão quimérica na fermentação da batelada alimentada. A presente invenção se refere, adicionalmente, à indução de Iactose de taxa de alimentação baixa para expressão otimizada de rhPTH (1-34) no Escheriehia coli. A presente invenção ainda se refere, adicionalmente, a um único e novo processo de purificação ortogonal de duas etapas para rhPTH (1-34) compreendendo cromatografia de troca de cátion opcionalmente se- guida por cromatografia de preparação selecionada de HIC ou RP-HPLC para render a proteína-alvo ^ 99%. A presente invenção se refere a um pro- cesso simples, barato e que não agride o meio ambiente de produção de rhPTH (1-34) de alta pureza.

Antecedente da Invenção

O hormônio da paratireoide é um peptídeo de 84 aminoácidos secretado pela glândula paratireoide. Seu papel fisiológico é manter o cálcio do soro e remodelagem óssea (Dempstor D.W. e outros, Endocrine Reviews, 1993, 14, 690-709). A remodelagem óssea é constituída de um processo de

3 a 6 meses onde existe um acoplamento entre a ressorção óssea e a formação óssea. Estrogênios, vitamina D, bifosfonatos são conhecidos por inibirem a ressorção óssea onde como rhPTH (1-34), um agente anabólico, aumenta a massa óssea. A osteoporose é uma doença que torna o osso suscetível à ruptura e rhPTH (1-34) é um medicamento de peptídeo que traz 5 um tratamento revolucionário da osteoporose. RhPTH (1-34)quando forneci- do sozinho estimula a formação da massa óssea e causa um aumento líqui- do na massa óssea em cada ciclo de remodelagem, em que a densidade mineral óssea é aumentada em 10% ao ano, tipicamente na área da espinha lombar.

O hormônio da paratireoide (PTH) é secretado pelas glândulas

paratireoides em resposta à diminuição nas concentrações de cálcio no plasma e apresenta vários efeitos severos que atuam para restaurar os ní- veis de cálcio normais. Foi mostrado que PTH possui efeitos anabólico e catabólico sobre o esqueleto. A elevação persistente de PTH causa ressor- 15 ção óssea aumentada, considerando-se que PTH administrado intermiten- temente resulta em formação óssea aumentada (Canalis, E., Hock, J.M., and Raisz, L.G.(1994) in The Parathyroidds: Basic and Clinicai Concepts, editado por Bilezikian, J.P., Marcus1R., and Levine, M.,Raven Press Ltd.,NY) embora o mecanismo celular destes efeitos duplos não esteja ainda claro.

PTH é biossintetizado como um hormônio preproparatireoide

(preproPTH) precursor de 115 aminoácidos. Embora as ações anabólicas de PTH (1-84) sejam conhecidas, o requisito da estrutura real para atividade biológica plena repousa nos resíduos 1 a 34 no terminal-N da molécula (PNAS 68, 63-67, 1971; Endocrinology 93, 1349-1353, 1973). PTH é especi- 25 ficamente sensível à oxidação, especialmente em seus resíduos de metioni- na, Met8 e Met18 e requer a seqüência de terminal-N intacta para preservar sua bioatividade. Frelinger, A. L., e outros, (J. Biol. Chem., (1984) 259 (9), 5507-5513) desenvolveram um método para separar PTH oxidado em meti- onina da molécula nativa e mostraram que a potência da molécula oxidada é 30 dramaticamente menor que a do PTH nativo. Para a sua bioatividade com- parável ao PTH de comprimento pleno, PTH (1-34) requer ambas conforma- ção helicoidal de terminal CeN conforme mostrado por Jin. L. e outros, (J Biol. Chem., (2000) 275 (35), 27238-44. Seu modelo propõe um bolso de ligação de receptor para o término N de PTH(1-34) e uma interface hidrófoba com receptor para o terminal C de PTH(1-34). Pellegrini M1 e outros, J. Biol. Chem. (1998) 273 (17), 10420-427 elucidam as estruturas de resolução altas de hPTH(1-34) na solução aquosa investigando o efeito do pH e concentra- ção de salmoura nas estruturas secundárias e terciárias por CD e RMN. O teor da hélice de PTH(1-34) com base nos espectros CD, aumenta na pre- sença de tampão ácido contra água benigna. Os estudos de RMN confirmam a presença da estrutura helicoidal localizada na parte terminal-N e terminal- C do hPTH(1-34). A molécula fora do contexto de interação do receptor é bastante flexível para preferir qualquer dobra secundária ou terciária defini- da, onde a distância experimental contida em 0,06 Â fornece uma forma de bastão flexível sem interação do receptor e a forma em "U" para a proteína, enquanto interagindo com o receptor. Foi mostrado que a exposição intermi- tente do Iigante ao seu receptor possui efeito anabólico preferido.

A clonagem e expressão de uma proteína terapêutica apresenta um desafio precedente em relação ao material genético apropriado. Os inici- adores de oligonucleotídeo usados para clonagem não sofreriam degenera- ção, teriam uma ancoragem comparativa e maior em um local único no gene 20 de interesse. Foi verificado que a transcrição de RNA do gene PTH(1-84) é positiva no fígado, rins, cérebro e tecidos humanos placentários. Iniciadores específicos para gene quando empregados com reação da cadeia da poli- merase são apropriados em uma reação de RT-PCR para clonagem no fragmento cDNA da seqüência específica. É aconselhável a seqüência plena 25 da inserção antes da reclonagem do gene. São bem-conhecidos na arte os muitos vetores de expressão de Escherichia coli disponíveis para ligação apropriada de um fragmento clonado, por exemplo, HB101, JM109, BL21(DE3), TOPIO para expressão eteróloga de nível alto das proteínas recombinantes. Os pares de iniciadores usados para clonagem na seqüência 30 de nucleotídeo marcador podem ser transformados geneticamente para con- ter sítios de restrição para etapas de clonagem seqüencial que contêm o gene de interesse com sítio de corte de protease e marcador de afinidade. O US5496801 ensina as preparações de hPTH que exibem estabilidade em armazenamento em termos de composição de hormônio e estabilidade. O US5496801 se refere à liofilização de hPTH (1-84) com manitol como um crioprotetor e tampão citrato não volátil na faixa de pH de 5 3,5 a 6,5 para render uma formulação líquida pronta para uso e estabilizada para administração parenteral.

O US4086196 descreve pela primeira vez que todos os fragmen- tos de PTH superiores a 1-27 hPTH e (Ala1)-hPTH (1-27) possuem proprie- dade biológicas úteis. O US4086196 reivindica inerentemente hPTH (1-X) e Ala1 hPTH (1-X) onde X é Ser ou Ala.

O US4086196 também ensina a síntese de hPTH (1-34) pela Síntese de Peptídeo em Fase Sólida (SPPS) pelos métodos bem- conhecidos na arte. O US4086196 também descreve a recuperação de hP- TH (1-34) bioativo por filtração em gel seguido por cromatografia de troca de 15 íon em Whatman-CM-52 e eluição realizada seguindo-se gradiente linear usando íons amônio como contraíons. As limitações principais da cromato- grafia por filtração em gel (GFC) são de separação lenta e resolução de má- xima mais baixa atribuídas aos fatores inclusive seleção de matriz inapropri- ada, comprimento da coluna, razão de fluxo alta e espaços inativos grandes 20 aprisionados dentro da coluna. Contudo, a GFC é na realidade uma opção atraente para dessalinização e troca de tampão para purificação do peptídeo e proteína. Também, a síntese química frequentemente envolve alto risco e custos, e embora a produção através da tecnologia genética recombinante tenha sido esperada para substituição deste processo, o rendimento é muito 25 insuficiente. Além disto, a síntese do mesmo requer utilização de técnicas que requerem um alto nível de prática e conhecimento. Consequentemente, a produção de hPTH usando técnicas de DNA recombinante é desejável. Em razão de seu fácil cultivo, baixo custo e alto potencial de produção, Escherichia coli é um hospedeiro preferido para expressar e purificar proteí- 30 nas farmaceuticamente importantes. Contudo, no caso do hPTH devido a sua instabilidade inerente associada com a expressão direta da proteína (Morelle e outros 1988, Biochim. Biophys. Acta 950, 459-462.) foi adotada uma estratégia de proteína de fusão. Os parceiros de fusão geralmente em- pregados incluem β-galactosidase, cro-β- galactosidase, hGH, Trx e fosfori- bulocinase (Suzuki, Y e outros, AppI.Env.Micro 1998,64, 526-529, Wingen- der E e outros, J. Biol. Chem 264, 4367-4373, Gardella TJ e outros, J. Biol.

5 Chem 26, 15854-15859, Xiang Yang Fu e outros, Biotechnol. Prog 2005, 21, 1429-1435, WO/1999/005277, C12N15/62) para expressão e purificação a jusante desta proteína. Também o número de aminoácidos que foram em- pregados da β-galactosidase como parceiros de fusão era diferente para proteínas diferentes. No caso da insulina e proinsulina (Shen, S-H. (1984), 10 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 4627-4631, Guo, L. (1984), Gene 29: 251-25) o parceiro de fusão β-Gal era muito mais longo que o PTH no mesmo pro- motor de volta (T7 e promotor lac, Massayuki, Y e outros (1997), US5670340). Muitas literaturas reportam a expressão da proteína de fusão como agregados insolúveis por sujeição a uma série de etapas de desnatu- 15 ração e redobramento. Nos casos onde β-galactosidase foi usada como o parceiro de fusão para PTH(1-34), os rendimentos finais variando de 20 mg/L a 500 mg/L foram reportados usando beta galactosídeo (IPTG) como o indutor em concentração de 1 mM. Contudo, o uso de IPTG para produção em grande escala de proteínas recombinantes é indesejável em razão de 20 seu alto custo e toxicidade (Donovan e outros, 1996; Figge e outros, 1988; Gombert and Kilikian, 1998; Ksinski e outros, 1992). Oldenburg K.R., e ou- tros (Protein Exp. Purification 5(3), 278-284, (1994)) descrevem um método para expressão de alto nível de rPTH(1-34) em E.coli, com peptídeo líder de poli-istidina e oito cópias do gene de PTH. Oldenburg K.R., e outros também 25 descrevem a captura da proteína de fusão por cromatografia por quelação em Ni seguido por uma clivagem de brometo de cianogênio (CNBr) e uma purificação por RP-HPLC com um rendimento final de 300 mg/L de hPTH (1- 34) biologicamente ativo e altamente purificado. O uso do brometo de ciano- gênio representa uma ameaça ambiental em termos de manuseio seguro e 30 descarte o que restringe gravemente o seu uso. A EP 794255 descreve a purificação de rhPTH(1-34) empregando corte de Kex2 de sua quimera. Su- zuki.Y, e outros, (Applied and Environmental Microbiology 64(2), 526-529 (1998)) obteve 0,5 g de >99% de hPTH(1-34) puro de um litro de cultura de Escherichia coli empregando comprimentos diferentes de Iigante de β-galactosidase juntamente com seu parceiro de fusão His-tag. Suzuki Y., e outros, descrevem o isolamento dos corpos de inclusão, solubilização em ureia 8M, diluição para ter uma concentração de ureia de 3M seguido por digestão de Kex2 seguido por purificação intermediária por cromatografia de troca de íon e polimento final por duas etapas de cromatografia de fase in- versa. Suzuki e outros ensinam que Kex2 uma protease Kx2 do tipo secreto- ra do Ievedo usada para clivagem enzimática é significativamente afetada pela concentração de 3M ureia necessária para manutenção da proteína de fusão na forma solúvel, mesmo a adição de CaCb a 2,5 mM para suprimir a inativação conduziu à precipitação da proteína de fusão, o que resultou no uso de razão molar de 1:2.000 de enzima para substrato. Suzuki Y. e outros, assim embora reportem o alto rendimento da proteína-alvo, exceto o uso de Kex2 ainda contribui para uma grande proporção do custo primário do pro- cesso de produção. Suzuki Y. e outros também ensinam claramente o uso de fragmentos de 97, 117 e 139 aminoácidos de β-galactosidase com par- ceiros de fusão espaçados por um Iigante possuindo SVKKR como o sítio de clivagem para Kex2 que é responsável pelo alto rendimento da proteína de fusão.

Jin. L., e outros, J Biol. Chem.(2000), 275(35), 27238-27244) descrevem um processo de purificação para rhPTH (1-34) de molécula LY 333334 por solubilização em ureia 7M e captura na coluna de fase inver- sa, seguida por purificação de coluna de troca de cátion FF SP usando um 25 gradiente NaCI subsequentemente seguido por um método RP-HPLC onde o material purificado em 20 mM de tampão de glicina pH 9 é liofilizado. Este é o método pro-solvente e pode ser prejudicial em escala de fabricação. Fu, Xiang-Yang e outros, (Biotechnology Progress (2005), 21(5), 1429-1435) ensina um método para purificação de uma fusão de tioredoxina de PTH (1- 30 34) a partir de células de BL21(DE3) por emprego de Triton-X 100 e purifica- ção parcial induzida por desnaturação térmica por precipitação. O aqueci- mento é realizado a 80°C por 15 minutos. O método trata a proteína em temperatura alta que é geralmente indesejável para proteínas e peptídeos. CN 1417231 descreve um processo para recuperação de recombinante PTH(1-34) por fermentação seguido por purificação do corpo de inclusão, renaturação, digestão com trombina e purificação por cromatografia de troca 5 de cátion. CN 1424325 descreve um peptídeo PTH(1-34) de fusão a GST (com GSP como o sítio de clivagem) digerido com trombina, purificação na coluna de afinidade de quimiotripsina, digestão com prolina endopeptidase e purificação cromatográfica adicional. O processo é trabalhoso e o emprego de duas proteases aumenta o custo do processo de purificação limitando a 10 exploração comercial do mesmo. Biochem. Biophys. Res.Commun., 166, 50- 60 (1990) documenta uma abordagem de cDNA para a síntese de hPTH.

Chen, J. Y. e outros, ((2004), 40 (1), 58-65) descrevem a purifi- cação de PTH(1-34) por expressão de PTH (1-34) como uma quimera com domínio de ligação de celulose, clivagem de PTH(1-34) pelo Fator Xa, purifi- 15 cação com resina de celulose e RP-HPLC para render 3 mg/L que é um pro- cesso de rendimento muito baixo sem viabilidade comercial. A tecnologia de fusão de GST para PTH(1-34) é também bem-conhecida na técnica. Gram Hermann e outros, (Bio/ Technology (1994), 12(10), 1017-23) descrevem um método para purificação de PTH(1-34) usando dipeptidil peptidase IV. Win- 20 gender E., e outros, (J Biol. Chem. (1989), 264(8), 4367-4373) expressaram PTH em E.coli como proteína de fusão cro-P-galactosidase-hPTH. Um ren- dimento de cerca de 250 mg da proteína de fusão foi obtido de 1 L de cultura que eles solubilizaram em ureia e adicionalmente, um tratamento com ácido foi empregado para liberar PTH. As condições de clivagem ácida sofrem de 25 limitações devido à formação de impurezas de proteína relacionadas à oxi- dação ou desaminadas que são difíceis de serem separadas em algumas proteínas e além disso o pH ácido apresenta condições severas e prejudici- ais à bioatividade da proteína.

A EP 0483509B1 se refere a um gene sintético otimizado de có- don que produz hPTH correspondendo à seqüência de aminoácido de hPTH, DNA contendo o mesmo, uma célula hospedeira transformada pelo DNA e um método para produzir hPTH usando o transformante em E.coli com indu- ção de IPTG. A EP0483509B1 descreve a purificação do PTH expresso por RP-HPLC. O uso de solventes orgânicos como eluentes em RP-HPLC pode prejudicar a proteína que apresenta problema de capacidade de vedação. O US 5208041 ensina a produção de hPTH essencialmente puro caracterizado por migração de máxima simples quando analisado por eletroforese capilar em 213 nm e por um EC50 conforme determinado no ensaio com base em UMR 106 de não mais de 2 nM, por purificação do hPTH bruto por RP-HPLC com agente de emparelhamento de íon catiônico como fosfato de trietilami- na. O US5208041 também descreve a sujeição do hPTH obtido tanto do te- cido de mamíferos de fontes microbianas de PTH quanto de fontes sintéticas para pelo menos uma etapa de fracionamento de coluna antes da RP-HPLC. O US5208041 exemplifica o processo de purificação por sujeição do caldo integral para ajuste de pH de 4,0 a 8,0 com ácido acético glacial, clarificação por centrifugação, seguido por carga para uma coluna de cromatografia de troca de íon de S-Sefarose, adicionalmente sujeitando o eluado a uma etapa de purificação intermediária por carga para coluna de HIC de Fenil Sefarose e finalmente purificação por RP-HPLC usando coluna C18 com fosfato de trietilamina e o agente de emparelhamento de íon. O US5208041 cita a de- tecção de eletroforese capilar de 4 máximas menores não detectadas anteri- ormente eluindo a frente da máxima de PTH e algumas máximas rastreadas que não foram detectadas por uso de ácido trifluoracético (TFA) ou ácido heptafluorbutírico (HFBA) como agente de emparelhamento de íon assim conduzindo à recuperação de hPTH essencialmente puro. O US 5208041 não ensina de modo algum o uso de HIC como a etapa de purificação final para obter hPTH (1-34) purificado com > 99% de pureza que é o foco da presente invenção. US 547007 se refere às seqüências de DNA codificando variantes de PTH, vetores de expressão, hospedeiros bacterianos, usos e composições terapêuticas. O US5457047 descreve a purificação de hPH por meio de CM-celulose no modo de batelada seguido por RP-HPLC da proteí- na de fusão hPTH-cro-p-galactosidase.

O US6590081 ensina a síntese da forma cristalina pura da teri- paratida e os métodos de preparação e purificação do PTH fragmentado. O US6590081 ensina explicitamente a vantagem da forma cristalina do hor- mônio para a pureza do produto e estabilidade em armazenamento. Tam- bém para criar análogos mais potentes e oralmente disponíveis de PTH, in- formações estruturais detalhadas em relação ao peptídeo ajudariam na ca- 5 racterização das interações moleculares entre o Iigante e o receptor. O US6590081 também descreve que o PTH cristalino pode também ser formu- lado em outras composições, tais como, por exemplo, comprimidos, cápsu- las ou supositórios, como o mesmo é facilmente dissolvido em solução esté- ril nos frascos. O US6590081 reivindica os cristais semelhantes à forma cú- 10 bica, hexagonal e placa de hPTH(1-34) e processos para purificação do PTH para obter os mesmos. Liu, Q., e outros, em Proteína Expr Purif., agosto de 2007., 54(2): 212-9, descrevem um processo de preparação em larga escala de hPTH (1-84) a partir de E.coli empregando uma estratégia de proteína de fusão solúvel, por construção de um gene sintético otimizado no códon hP- 15 TH(1-84) e clonagem do mesmo no vetor pET32a (+), expressando nas célu- las de E.coli BL21 (DE3) como proteína de fusão His(6)-tiorredoxina- hPTH(1-84). Liu, Q., e outros, seguem uma seqüência de etapas de purifica- ção de captura por cromatografia de afinidade de metal imobilizada, seguido por clivagem de enterocinase e finalmente por sujeição à cromatografia de 20 exclusão por tamanho com um rendimento quantificado de 300 mg/L com uma pureza de 99% após colheita da proteína de fusão solúvel.

O projeto do processo ortogonal é a base dos procedimentos de purificação bem controlados (Gagnon P. The secrets of Orthogonal Process Development. Validated Biosys-

tems,2006:www.validated.com/revalbio/pdffiles/orthopd.pdf). A ideia é que combinando-se as etapas com a maior complementaridade possa prover a melhor purificação total. A concretização mais forte do conceito é geralmente obtida quando respectivas etapas se baseiam nos mecanismos de separa- ção distintos. Um processo de duas etapas que contém a etapa de fracio- 30 namento com base no tamanho do produto e outra na carga do produto seria considerado ortogonal; de modo semelhante, um processo com uma etapa com Bse na carga do produto e outra na hidrofobicidade também seria orto- gonal. Um aspecto importante do projeto de processo ortogonal é que a ca- pacidade de purificação de qualquer uma etapa seja mensurável apenas dentro do contexto de seu parceiro em potencial. A presente invenção com- preende um processo ortogonal para purificação de cromatografia de troca 5 de cátion de acoplamento rhPTH(1-34) em HIC para obter uma pureza >99% com bom rendimento.

A produção em larga escala das proteínas terapêuticas enfrenta vários desafios, tais como, programações de desenvolvimento curtas, consi- derações de custo e requisitos constantes de aumento da qualidade. Tecno- 10 Iogias de isolamento e purificação do estado da técnica especialmente prin- cípios ortogonais de separação são de grande importância para agilizar o desenvolvimento, encurtar tempos de processamento e cortar os custos de produção. A cromatografia de preparação avançou significativamente em relação à estabilidade da matriz ou disponibilidade de seletividades e provê 15 tecnologia avançada na purificação da biomolécula para purezas acima de 95%. A cromatografia de interação hidrófoba (HIC) obteve popularidade nos anos recentes uma vez que oferece energia de separação ortogonal para técnicas de purificação amplamente empregadas com base nas interações iônicas. A HIC é frequentemente uma escolha excelente subsequente à 20 cromatografia de troca de íon em um procedimento de purificação da proteí- na. Ambas as técnicas possuem aplicabilidade extremamente ampla e são abordagens canônicas em relação uma a outra (isto é, separação de acordo com a hidrofobicidade e carga respectivamente). Adicionalmente, o material eluído com um gradiente de sal em uma separação de troca de íon requer 25 um mínimo de tratamento da amostra. Por outro lado, enquanto exercitando seletividade semelhante, HIC é menos desnaturante em comparação à cro- matografia de fase inversa, usando mais Iigantes hidrófobos e solventes or- gânicos. Em uma escala industrial, os locais de produção a prova de explo- são são necessários para o manuseio de solventes orgânicos tóxicos, o des- 30 carte de grandes quantidades dos mesmos sendo caro. Consequentemente uma abordagem ortogonal da cromatografia de troca de íon de acoplamento seguida por HIC é uma tecnologia de plataforma de custo benefício, que não agride o ambiente para produção em ampla escala das proteínas de fusão recombinantes.

A técnica anterior citada acima nunca ensinou de modo claro a abordagem ortogonal da purificação de hTH (1-34) por cromatografia de tro- 5 ca de cátion como uma etapa de purificação intermediária para HIC como a estratégia de purificação final, nem reporta o uso da nova indução de Iactose com bom rendimento de hPTH (1-4) que é o foco principal da presente in- venção.

A presente invenção possui um único e novo aspecto de uso de uma abordagem ortogonal do processo de purificação de duas etapas de cromatografia de troca de cátion seguido por cromatografia de separação selecionada de HIC ou RP-HPLC. A presente invenção descreve um método simples, de custo-benefício, que não agride o meio ambiente para produção de hPTH (1-34) de alta pureza. Outro aspecto único da presente invenção é a indução de Iactose para uma estratégia de produção por batelada para expressão otimizada de hPTH (1-34) no hospedeiro procariótico. Outro as- pecto da presente invenção é a construção de uma proteína de fusão quimé- rica compreendendo um parceiro de fusão consistindo em 41 aminoácidos do gene de β-galactosidase de Eschericia coli (LacZ)1 um sítio de clivagem de endopeptidase, fragmento do gene de rhPTH onde o parceiro de fusão, gene de β-galactosidase, é escolhido sendo uma proteína nativa do Escheri- chia coli, porcentagem alta do teor de GC, estrutura secundária de peptídeo correspondente, a estrutura secundária de ribonucleotídeo traduzindo o mesmo, e o pl do fragmento de fusão como um auxílio facilitando o proces- sarnento a jusante.

Objetivos da Invenção

Um primeiro aspecto da presente invenção é um processo para síntese de rhPTH (1-34), o processo compreendendo:

i. isolamento do RNA total da fonte de tecido,

ii. construção de um nucleotídeo ORF quimérico codificando

cDNA como um fragmento Ncol/Xhol conforme estabelecido na SEQ. ID N0:1 por ampliação do cDNA por RT-PCR empregando iniciadores específi- cos de gene selecionados dentre SEQ. ID N°:3, SEQ. ID N°:4, SEQ. ID N°:5, SEQ. ID N°:6, SEQ. ID N°:7 e SEQ. ID N°:8 codificando proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) conforme estabelecida na SEQ. ID N°:2,

iii. transformação do Escherichia coli com um vetor de expressão contendo nucleotídeo quimérico como um fragmento Ncol/Xhol conforme

estabelecido na SEQ. ID N0:1 codificando proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) conforme estabelecida na SEQ. ID N°:2 onde a proteína de fusão quimérica consiste em uma alça de afinidade, um parceiro de fusão, um sítio de clivagem de endonuclease e peptídeo rhPTH (1-34),

iv. cultivo do Escherichia coli transformado da etapa iii. para ex-

pressão da proteína de fusão quimérica na presença de um indutor,

v. isolamento da proteína de fusão quimérica da cultura na forma de corpos de oclusão,

vi. captura da proteína de fusão quimérica de rhHTH (1-34) da

etapa v.,

vii. digestão da proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) da

etapa vi.,

viii. purificação do rhPTH (1-34) obtido na etapa vii. por um pro- cesso ortogonal.

Um segundo aspecto da presente invenção descreve o emprego

de indução de Iactose de taxa de alimentação baixa para a expressão da proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) onde a indução da Iactose está na faixa de cerca de 10% a 30% da proteína total.

Um terceiro aspecto da presente invenção é um processo orto-

gonal para purificação de rhPTH (1-34), o processo compreendendo:

i. captura da proteína de fusão quimérica solubilizada conforme estabelecida na SEQ. ID N°:2 usando cromatografia por leito expandido,

ii. digestão da proteína de fusão quimérica eluída da etapa i por endopeptidase para render a proteína-alvo,

iii. purificação da proteína-alvo por cromatografia de troca de

ânion para uma pureza igual ou superior a 98%,

iv. polimento opcional da proteína-alvo por HIC ou RP-HPLC pa- ra uma pureza igual ou superior a 99%.

Um quarto aspecto da presente invenção descreve um processo ortogonal para purificação de rhPTH (1-34) em que a proteína de fusão qui- mérica solubilizada é capturada na coluna de Sefarose de quelação de linha 5 de circulação livre de um líquido sob condição desnaturante, a proteína de fusão quimérica capturada é digerida por enterocinase em concentração de ureia em uma faixa de 500 mM a 4.000 mM por um período de 4 a 6 horas, a proteína-alvo digerida sendo purificada a uma pureza igual ou superior a 98% na coluna de troca de cátion SP-XL e a proteína-alvo eluída é opcionalmente 10 polida por HIC em fenil Sefarose a uma pureza igual ou superior a 99%.

Um quinto aspecto da presente invenção é rhPTH (1-34) na for- ma líquida em que rhPTH (1-34) não está na forma cristalina nem na forma amorfa.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção ficaram cla- ros quando da consideração da descrição detalhada que se segue, que in- clui vários exemplos ilustrativos da prática da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos Apensos

A maneira pela qual os objetivos e vantagens da invenção po- dem ser obtidos estará mais clara a partir da descrição detalhada e dos de- senhos apensos, que são como se segue:

a figura 1 mostra o produto ampliado ou PCR em gel de agarose a 1%, onde fragmento de 281 pares de base cobrindo a porção IacZ de ORF e região de 141 pares de base que contém os nucleotídeos correspondentes de 1-34 aminoácidos é mostrado na Raia 1. Estes fragmentos foram adicio- 25 nalmente digeridos para 281 pares de base com Ncol/Sall (Raia 2) e 141 pares de base com Sall/Xhol (Raia 3). Raia 4: vetor pET19b após digestão com Ncol/Xhol e purificação com gel para uso na clonagem. Raia 5: marca- dor de DNA de 100 pares de base (promega).

A figura 2 mostra o DNA Miniprep digerido com Ncol/Xhol mos- trando a presença de clones positivos com a inserção de nosso fragmento de β-galactosidase-hPTH (1-34)(LacZ). As raias 2-12 e 14: mostram 342 pa- res de base do Fragmento 4) da faixa de inserção de β-galactosidase-hPTH (1-34) (mostrada por uma seta). 5.643 pares de base do fragmento de vetor pETI19b são mostrados na parte superior (mostrados pela cabeça da seta). Raia 13: confirmando o tamanho do fragmento de vetor digerido Ncol/Xhol que mostra ausência de 342 pares de base da faixa de inserção.

A figura 3 mostra o mapa da inserção de ρΕΤ-β-galactosidase-

hPTH(1-34) no vetor pET-19b.

A figura 4 mostra a análise RE com Ncol/Xhol nos transforman- tes BL21(DE) dos clones positivos, mostrando a presença de fragmento di- gerido, 342 pares de base (mostrados pela seta). Raia 1: mistura em régua escalonada de gene, Raias 2-13: clones números 48 e 49. O mesmo foi rea- lizado com outros clones positivos, mencionados na figura 3.

A figura 5 mostra análise RE com Ncol/Xhol nos transformantes BL21(DE3) dos clones positivos, mostrando a presença de fragmento digeri- do, 342 pares de base (mostrados pela seta). Raia I: mistura em régua esca- Ionada de gene, Raias 2-13: clones números 48 e 49. O mesmo foi realizado com outros clones positivos, mencionados na figura 4.

A figura 6 mostra perfil de alimentação e fermentação do clone de rhPTH (1-34).

A figura 7 mostra análise de expressão de fermentação de rhP- TH (1-34) quimérico. Raia 1: Marcador, Raia 2: não induzida, Raia 3: induzi- da com lactose.

A figura 8 mostra cromatograma de EBA com Sefarose de que- lação de linha de circulação livre de um líquido.

A figura 9 mostra perfil de SDS-PAGE colorido com Coomasie de rhPTH (1-34) quimérico usando Sefarose de quelação de linha de circula- ção livre de um líquido em EBA. Raia 1: material de partida, Raia 2: não li- gada (fluxo através), Raia 3: lavagem, Raia 4: eluição.

A figura 10 mostra análise de SDS-PAGE colorida com Cooma- sie de digestão de EK de rhPTH (1-34) quimérico. Raia 1: não digerido, Raia 2: amostra digerida com EK.

A figura 11 mostra cromatograma de troca de íon usando coluna

de SP-XL. A figura 12 mostra análise de frações cromatográficas de troca de íon por eletroforese de gel. Raia 1: amostra carregada em IEX1 Raia 2: FT1 Raia 3: eluição com IEX.

A figura 13 mostra cromatograma de purificação de rhPT (1-34)

por HIC.

A figura 14 mostra análise de RP-HPLC da fração 1 de HIC.

A figura 15 mostra perfil cromatográfico de fase inversa de rhP- TH (1-34).

A figura 16 mostra análise de pureza de rhPTH (1-34) por RP-

HPLC.

Descrição Detalhada da Invenção

Uma concretização da presente invenção é dirigida a um pro- cesso para síntese de rhPTH (1-34), o dito processo compreendendo:

i. isolamento do RNA total da fonte de tecido,

ii. construção de um nucleotídeo ORF quimérico codificando

cDNA como um fragmento Ncol/Xhol conforme estabelecido na SEQ. ID N0:1 por ampliação do cDNA por RT-PCR empregando iniciadores específi- cos de gene selecionados dentre SEQ. ID N°:3, SEQ. ID N°:4, SEQ. ID N°:5, SEQ. ID N°:6, SEQ. ID N°:7 e SEQ. ID N°:8 codificando proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) conforme estabelecida na SEQ. ID N°:2,

iii. transformação do Escherichia coli com um vetor de expressão contendo nucleotídeo quimérico como um fragmento Ncol/Xhol conforme estabelecido na SEQ. ID N0:1 codificando proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) conforme estabelecida na SEQ. ID N°:2 em que a proteína de

fusão quimérica consiste em uma alça de afinidade, um parceiro de fusão, um sítio de clivagem de endonuclease e peptídeo rhPTH (1-34),

iv. cultivo do Escherichia coli transformado da etapa iii. para ex- pressão da proteína de fusão quimérica na presença de um indutor,

v. isolamento da proteína de fusão quimérica da cultura na forma de corpos de oclusão,

vi. captura da proteína de fusão quimérica de rhHTH (1-34) da

etapa v., vii. digestão da proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) da

etapa vi.,

viii. purificação do rhPTH (1-34) obtido na etapa vii. por um pro- cesso ortogonal.

Outra concretização da presente invenção é direcionada ao uso

de indução de Iactose em taxa de alimentação baixa para a expressão da proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34), onde a indução da Iactose es- tá na faixa de cerca de 10% a 30% da proteína total.

Outra concretização da presente invenção é dirigida a um pro- cesso ortogonal para purificação de rhPTH (1-34), o processo compreen- dendo:

i. captura da proteína de fusão quimérica solubilizada conforme estabelecida na SEQ. ID N°:2 usando cromatografia por leito expandido,

ii. digestão da proteína de fusão quimérica eluída da etapa i por endopeptidase para render a proteína-alvo,

iii. purificação da proteína-alvo por cromatografia de troca de ânion para uma pureza igual ou superior a 98%,

iv. polimento opcional da proteína-alvo por HIC ou RP-HPLC pa- ra uma pureza igual ou superior a 99%.

Ainda outra concretização da presente invenção é direcionada a

um processo ortogonal para purificação de rhPTH (1-34) em que a proteína de fusão quimérica solubilizada é capturada na coluna de Sefarose de que- lação de linha de circulação livre de um líquido sob condição desnaturante, a proteína de fusão quimérica capturada é digerida por enterocinase em con- centração de ureia em uma faixa de 500 mM a 4.000 mM por um período de

4 a 6 horas, a proteína-alvo digerida sendo purificada a uma pureza igual ou superior a 98% na coluna de troca de cátion SP-XL e a proteína-alvo eluída é opcionalmente polida por HIC em fenil Sefarose a uma pureza igual ou superior a 99%.

Ainda outra concretização da presente invenção é direcionada

ao rhPTH (1-34) na forma líquida onde rhPTH (1-34) não está na forma cris- talina nem na forma amorfa. O termo "cDNA" ou DNA complementar conforme usado no pre- sente documento se refere ao DNA sintético inverso transcrito de um RNA específico através da ação da enzima de transcriptase inversa.

O termo "ORF" ou Quadro Aberto de Leitura conforme usado no presente documento se refere a uma porção do genoma do organismo que contém uma seqüência de bases codificando potencialmente a proteína.

O termo "β-galactosidase" e "LacZ" são usados no presente do- cumento como termos sinônimos.

"Iniciadores específicos de gene" significa iniciadores suficien- temente complementares para hibridizar com um polinucleotídeo-alvo para a síntese do produto de extensão do iniciador que é complementar ao polinu- cleotídeo-alvo.

HIC fornece lesão estrutural mínima às biomoléculas e sua ativi- dade biológica é mantida devido a uma interação mais fraca em relação à 15 afinidade, troca de íon ou cromatografia de fase inversa (RPC) (Fausnaugh e outros, 1984;Regnier, 1987). HIC é um modo alternativa de explosão das pro- priedades hidrófobas das proteínas, trabalhando em um ambiente mais polar e menos desnaturante em relação a RPC, uma vez que esta técnica requer o uso de solventes não polares para a eluição da proteína devido à ligação 20 forte ao absorvente (El Rassi, 1996).

PTH é um peptídeo de 84 aminoácidos de cadeia simples no qual os requisitos estruturais para atividade biológica são satisfeitos pelos primeiros 34 aminoácidos de término NH3. A detecção de alguns aminoáci- dos tanto do término NH3 quanto COOH do fragmento ativo PTH (1-34) re- 25 sulta em um declínio progressivo na atividade biológica, tal que a região de seqüência contínua 2-26 foi designada a seqüência mínima necessária para atividade biológica, conforme determinado pela ativação de adenilato ciclase renal. Rossenblatt, M e outros ensinam explicitamente que o amido (Nle-8, Nle-18, Tyr-34)bPTH-(3-34) análogo, sintético, que incorpora modificações 30 mostradas com bPTH (1-34) para ambas melhora da atividade biológica e conferência de resistência à oxidação, inibirá atividade de bPTH (1-34) quando presente com o hormônio nativo em quantidades equimolares. As ações biológicas conhecidas de PTH são expressas em um fragmento que contém apenas os primeiros trinta e quatro aminoácidos (Tregear,G.W., Ri- etschoten, J.V., Greene. E., Keutmann1 H.T., NiaII1H.D., Reit1 B., Parsons1 J.A., e Potts1JT., Jr.(1973) Endocrinology 93, 1349-1353)), e a função dos 5 50 resíduos de término carbóxi não é conhecida. A interação de 1-34 PTH com seus receptores é alterada por oxidação do resíduo de metionina nas posições 8 e 18 (Tashjian, A.H., Ontjec, D.A., and Munson, P.L.(1964) Bio- chemistry 3,1175-1182; Frelinger, A.L.JII, e Zull, J.E. (1984) J. Biol. Chem. 259, 5507-5513; Frelinger, A.L.JII, and Zull, J.E. (1986) Arch. Biochem. Bio- 10 phys. 244,641-649) e por apagamento dos aminoácidos na extremidade de término amino do hormônio (Martin,K.J., Bellorin-Font, E., Freitag, J., Ro- senblatt, M., and Slatopolsky, E. (1981) Endocrinology 109, 956-959; Mckee, R.L., Goldman, M.E., Caulfield, M.P., deHaven, P.A., Lave, J.J., Nutt, R.F., and Rosenblatt, M. (1988) Endoerinology 122,3008-3010; Goldman, M.E., 15 McKee, R.L., Caulfield, M.P., Reagen, J.E., Levy, J.J., Gay, C.T., DeHaven, P.A., Rosenblatt, M., and Chorev1M. (1988) Endocrinology 123,2597-2599)). Os peptídeos oxidados são agonistas plenos com afinidade reduzida (Frelin- ger, A.L.JII, and Zull, J.E. (1984) J. Biol. Chem. 259, 5507-5513; Frelinger, A.L.JII, and Zull, J.E. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 244,641-649), porém 20 os peptídeos apagados no terminal amino são agonistas parciais ou antago- nistas com afinidade reduzida (Martin,K.J.,Bellorin-Font, E., Freitag, J., Ro- senblatt, M., and Slatopolsky, E. (1981) Endocrinology 109, 956-959; Mckee, R.L., Goldman, M.E., Caulfield, M.P., deHaven, P.A., Lave, J. J., Nutt, R.F., and Rosenblatt, M. (1988) Endocrinology 122,3008-3010). A oxidação do 25 resíduo 8 apresenta o maior impacto na afinidade do hormônio, e o apaga- mento dos resíduos 1 e 2 produz os efeitos mais dramáticos na atividade biológica. Assim, 3-34 PTH é um agonista muito fraco, e o fragmento 7-34 é um antagonista. Parece que cada um dos resíduos alterados está diretamen- te envolvido na ligação de receptor ou que a oxidação ou apagamento induz 30 mudanças estruturais secundárias ou terciárias no peptídeo, de modo que a ligação do receptor e/ou ativação é defeituosa. Consequentemente, um pro- cesso ortogonal sensível único para síntese de rhPTH (1-34) de comprimen- to pleno, intacto de término NeC que exibe bioatividade é um aspecto es- sencial da invenção, em que a separação de rhPTH (1-34) de outras impure- zas é obtida rendendo uma pureza superior a 99% com bom rendimento do processo. As impurezas oxidadas são frequentemente geradas durante puri- ficação aquosa em rhPTH (1-34) por exposição do peptídeo ao ar. Conse- quentemente, a literatura reporta o uso de RP-HPLC como a etapa de poli- mento final, em que os solventes orgânicos usados para eluição impedem oxidação aérea. Em vista das vantagens oferecidas pela HIC, em termos de custo-benefício evitando o uso de solventes orgânicos de classificação H- φ 10 PLC e o custo adicional incorrido na remoção de traços de solventes orgâni- cos aos limites desejáveis e descarte além, principalmente, do manuseio de solventes voláteis em grande escala, tudo isso motivou os inventores a de- senvolverem um processo ortogonal otimizado de custo-benefício e não a- gressivo ao meio ambiente de acoplamento da cromatografia de troca de cátion à HIC para obter uma pureza > 99% para rhPT(1-34). A presente in- venção assim evita a geração de quaisquer impurezas oxidadas e outras impurezas relacionadas, como peptídeos desamidados, por emprego de um ambiente aquoso para eluição e rendendo um rhPTH(1-34) intacto nos tér- minos N e C. Na presente invenção, a etapa de purificação intermediária da cromatografia de troca de cátion empregando coluna SP-XL rendeu rhPTH φ (1-34) com uma pureza £98% com um rendimento aumentado na faixa de

300-400 mg/L. O foco da presente invenção é assim a síntese de rhPTH (1- 34) estável altamente purificado na forma líquida.

Uma ampla variedade de proteínas comercialmente importantes 25 vêm sendo produzidas em Escherichia coli. Assim, esforços consideráveis foram realizados para otimizar o rendimento volumétrico das proteínas re- combinantes, a fim de diminuir os custos de produção (Lee, 1996). Uma ca- racterística importante dos promotores usados nestes sistemas é sua capa- cidade de indução de modo simples e de custo-benefício. O uso da Iactose 30 como um indutor para expressão de batelada alimentada e otimizada da pro- teína de fusão é também um aspecto essencial da presente invenção.

Na presente invenção nós descrevemos um método para clonar PTH (1-34), por ampliação do cDNA codificando 1-84 aminoácidos de PTH humano usando RT-PCR. O cDNA foi clonado em um vetor de clonagem com base em pUC-18 que foi usado como o gabarito para a clonagem da região codificando 1-34 aminoácidos de hPTH. A construção-alvo foi desig- 5 nada de um modo onde os 41 aminoácidos novos de β-galactosidase (LacZ) (aminoácido 124 ao aminoácido 164) fossem tomados como um peptídeo de fusão para aumentar o nível de expressão de PTH no frasco de agitação, bem como na fermentação escalonada. O peptídeo adiciona uma vantagem de p1 para proteína recombinante intacta e foi escolhido com base na estru- 10 tura secundária do peptídeo e energia livre de ribonucleotídeo. Um tamanho de corte de protease, por exemplo, enterocinase foi incorporado à extremi- dade de fusão IacZ para remoção eficaz do parceiro de fusão da proteína de interesse. ORF plena está sob controle do promotor T7 induzível com ampi- cilina como um marcador de seleção.

A microesfera celular do caldo de fermentação foi suspensa em

um tampão, pressão interrompida para Iise da célula por sujeição da sus- pensão celular aos ciclos repetidos de homogeneização em pressão alta. A esta suspensão de célula Iisada são adicionados cristais de ureia a uma concentração final de 4-8M e agitados por 8-12 horas para solubilizar as pro- 20 teínas celulares. A solução foi então centrifugada ou microfiltrada para re- mover fragmentos de células.

A proteína de fusão de interesse foi então purificada a partir da proteína total solúvel por quelação de Sefarose de linha de circulação livre de um líquido. A eluição da coluna de quelação de linha de circulação livre 25 de um líquido contendo a proteína de fusão foi então tanto dessalinizada usando G-25 quanto diretamente diluída para abaixar a concentração de sal final. A esta solução foi adicionada Enterocinase recombinante a uma con- centração de 1-10 unidades a 20-100 pg de proteína e mantida por 4-12 ho- ras com concentração de ureia a 1M. Foram realizadas simultaneamente 30 dessalinização e preparação da etapa enzimática.

O pH da solução desta amostra digerida foi ajustado para pH 5-7 e ligado em um trocador de íon preferivelmente um trocador de cátion. O trocador de cátion seria tanto uma microesfera polimérica quanto microes- fera com base em Sefarose contendo grupo sulfopropila, metilsulfonato ou carboximetila anexado à mesma. Após carregamento da amostra, a coluna foi lavada com tampão acetato de concentração baixa de cerca de 20-50 mM 5 de concentração e proteína ligada eluída com um grande do tampão B con- tendo NaCI a 0,5 1M. A absorvência em 254 nm quanto 280 nm foi monito- rada para verificar o perfil de eluição. A máxima principal contém PHT (1-34) que foi absorvido para purificação adicional.

A purificação final foi realizada usando tanto HIC quanto RPC. Para HIC, sulfato de amônio ou NaCI foi adicionado a eluição de IEX a uma concentração final de 1-2M e então a amostra foi carregada em uma coluna HIC. A coluna de HIC poderia ser grupo fenila, butila, isopropila ou éter ane- xado tanto à microesfera polimérica quanto microesfera à base de sefaro- se/agarose. Na presente invenção ambas a fonte de fenila e fenil sefarose foram empregadas. Uma eluição gradiente da proteína ligada a partir de alto teor de sal para baixo teor de sal tanto em AGU quanto tampão de aceta- to/citrato de 20-50 mM forneceu >99% de PTH(1-34) puro. O modo não a- quoso alternativo seria a etapa RPC com ambas as colunas de sílica C4 bem com de fase inversa polimérica. Na fase móvel A, água contendo 0,01 %-0,1 % de TFA ou tampão de acetato de sódio, de pH 4,0 podem ser empregados e a fase móvel B seria tanto acetonitrila quanto mistura de ace- tonitrila, metanol. Uma eluição gradiente com fase móvel B separaria de mo- do robusto as impurezas relacionadas e seriam obtidas frações de >99% de PTH (1-34) puro. Seria entendido que os exemplos que se seguem descritos no presente documento são para fins ilustrativos, apenas, e que várias modi- ficações ou alterações serão sugeridas ao versado na técnica e estarão in- cluídas no espírito e reivindicações apensas do presente pedido. EXEMPLOS:

Exemplo 1:isolamento total de RNA e síntese do primeiro fila- mento do cDNA:

RNA total foi isolado por "RNAgents For Total RNA Isolation Sys- tems" (Promega, Cat N0 Z5110). Cerca de 2 g de tecido foram processados. Uma estratégia foi realizada quando cDNA de PTH de comprimento pleno foi isolado das várias fontes de RNA total de tecido, por exemplo, fígado, rins, cérebro e placenta. A microesfera de RNA total foi ressuspensa em 1 ml_ de água isenta de nuclease e armazenada a -70°C. A concentração de RNA 5 total foi de cerca de 4 ng/mL. RNA poliadenilado foi agrupado com a ajuda de microesferas Oligo (dT)8+12 do RNA total conforme descrito acima. 10 ng de RNA total foram empregados para cada reação. RNA poliadenilado foi transcrito por reversão no DNA complementar de filamento simples (gabarito de cDNA de primeiro filamento) usando AMV de transcriptase inversa em 10 43°C por uma hora. Cerca de 20 ng/μί. do cDNA de primeiro filamento foram obtidos. A qualidade do primeiro filamento foi verificada por ampliação dos pares de iniciador de beta-actina.

Exemplo 2: ampliação de PCR de cDNA de PTH contendo 1-84 aminoácidos putativos das fontes de tecido:

com base no par iniciador específico para gene de 1-84 aminoá-

cidos de comprimento pleno foi sintetizado para geração do primeiro filamen- to por método RT-PCR. Todas as fontes de tecido mencionadas acima foram usadas para ampliação e foi verificado serem positivas para PTH. Finalmen- te, o fígado foi selecionado para clonagem do domínio de 1-34 aminoácidos 20 de PTH em um sistema de vetor de expressão T7 E.coli. cDNA de 476 pares de base codificando 1-84 aminoácidos foi clonado e era o gabarito para am- pliação adicional do domínio de 1-34 aminoácidos. RT-PCR foi realizada no grupo de RNAm usando par iniciador específico para gene (SEQ. ID. NO. 3 e 4)que foi desenvolvido na seqüência cDNA de PTH. Este par foi usado 25 para ampliar seqüência de cDNA de comprimento pleno de PTH de 476 pa- res de base (fragmento 1).

Exemplo 3: ligação e Transformação

A mistura de ligação contendo DNA de 20 ng-50 ng do Fragmen- to 1 (476 pares de base) foi ligada separadamente ao vetor de clonagem de TA com base em pUC18 e vetor pET-19b em JM109 e BL21 (DE3), respecti- vamente. De modo a aumentar o número de transformantes, as placas foram incubadas por toda noite a 4°C. Análise de enzima de restrição e análise de seqüência nos clones positivos foram realizadas para confirmar os mesmos. Foram obtidos vários clones positivos para PTH (1-84).

Exemplo 4: clonagem dos 1-34 aminoácidos de PTH por amplia- ção da PCR:

na próxima etapa, a ampliação da PCR foi realizada conforme

mencionado a seguir para ampliar do domínio de PTH 1-34 usando 1-84 a- minoácidos de PTH contendo a construção de DNA mencionada acima. A construção-alvo foi designada em uma maneira onde uma porção de β- galactosidase (LacZ) foi tomada como um peptídeo de fusão. Um sítio de 10 corte de protease, por exemplo, enterocinase foi inserido por métodos da PCR na extremidade de IacZ para remoção enzimática do mesmo de 1-34 AA matura, a proteína de interesse.

A seqüência conforme mencionada a seguir: VDNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWGRWVGYGQDSRLP é a sequên- cia de aminoácido da β-galactosidase quimérica para rhPTH(1-34) com sítio de corte EK, DDDDK.

Um par de iniciador (SEQ. ID N0: 5 e 6) foi então usado para ampliar a extremidade 5’ da quimera de fusão, IacZ com o sítio de corte His- tag e EK na extremidade 3’. Este produto da PCR de 241 pares de base 20 (Fragmento 2) possui dois sítios RE, Neol e Sall, o que foi útil durante a clo- nagem com 1-34 aminoácidos em conjunto no vetor pET-19b. A extremidade 3’ de rhPTH(1-34) foi ampliada usando conjunto de par de iniciador (SEQ ID NO. 7 e 8) que foi usado no cDNA de PTH(1-84) de comprimento pleno para ampliar um fragmento de 141 pares de base com os sítios RE Sall e Xhol 25 para clonagem imediatamente após sítio de corte EK.

Exemplo 5: fabricação da construção final de pET-lacZ- rhPTH(1-34):

a construção final conforme mostrada na figura 3 contém o sítio de partida a 5 a montante com o sítio Ncol juntamente com a seqüência IacZ, sítio de clivagem EK e o sítio de partida imediata da seqüência rhPTH

(1-34) arrastado após sítio de corte EK e antes de TCT GTG.....TAA TAA

com dois códons de parada sítio Xhol CTC GAG. Estas estruturas de clone então desenvolveram por toda noite a 37°C e foram armazenadas a -70°C. ORF plena que é traduzida até os códons de parada na extremidade 3’ ime- diatamente após 108 pares de base (codifica 34 aminoácidos de rhPTH (1- 34). O cDNA maduro codifica 34 aminoácidos incluindo dois códons de pa- 5 rada sendo mencionados (figura 1b).

Este ORF foi então clonado no vetor de expressão de E.coli, pET-19b no sítio Ncol/Xhol. As etapas seqüenciais são mostradas a seguir. Para clonagem final (figura 2) e ampliação por PCR de rhPTH (1-34)um marcador de fusão (IacZ) foi anexado à extremidade 5’. A quimera completa 10 no vetor de clonagem contém 6 x His-lacZ-EK-(1-34) sem qualquer peptídeo de sinal.

Purificação dos fragmentos-alvo 2 e 3:

cDNAs de PTH purificados com gel foram listados com o vetor pET-19b nos sítios RE Ncol/Xhol. Na raia 2, produto da PCR de 281 pares de base (fragmento 2, figura 1) mostra a extremidade 5’ da porção IacZ com sítios Ncol e Sall nos quais reside a porção do sítio 6 X His-/acZ-EK. Na raia

3, o produto da PCR mostra o início da ORF Madura de PTH putativo após o peptídeo de sinal-34 aminoácidos (rhPTH(1-34)) com dois códons de para- da. Estes 141 pares de base (fragmento 3, figura 1) contêm sítios Sall e Xhol 20 para ligação a IacZ a montante e sítio EK. A ligação dos Fragmentos 2 e 3 digeridos ao sítio Sall favorece o surgimento do fragmento de inserção, IacZ- rhPTH(1-34) de 342 pares de base (fragmento 4, figura 1) que foi ligado ao vetor no sítio Ncol na extremidade 5’ e sítio Xhol na extremidade 3'. A liga- ção para fornecer a construção final (figura 3) e procedimentos de transfor- 25 mação foram seguidos de acordo com o Exemplo 3 e classificados para os transformantes positivos por digestão de DNA extraído em minipreparação com Ncol/Xhol de modo a obter o fragmento ligado.

Exemplo 6: confirmação do Mapa de Restrição:

a análise RE foi realizada usando Ncol/Xhol e digestão dupla Bglll/Xhol foi empregada para confirmar estes clones positivos adicionalmen- te após transformação de BL21(DE3) com os clones positivos identificados anteriormente usando 50-100 ng de DNA. Análise de RE foi também realiza- da usando Sall que possuía dois sítios na construção pET-lacZ-rhPTH(1-34). 141 pares de base (fragmento 3) foi também visível com a análise da ensina (dados não mostrados). Vários clones positivos que obteve-se na base da cepa BL21(DE3) foram analisados por emprego de digestão dupla com 5 combinação de Ncol/Xhol. Os resultados mostraram o tamanho correto, fragmento de inserção de 342 pares de base (fragmento 4). Por emprego de Bglll/Xhol e várias outras combinações de enzimas de restrição, por exem- plo, BamHI/Sall, Sall estes clones foram então verificados antes da análise dos mesmos por análise de seqüência (figuras 4 e 5).

Exemplo 7:

DNA de minipreparação de clones positivos foi então isolado para purificar a precipitação de PEG que se segue por análise de seqüência (figura 2). A seqüência foi confirmada por emprego dos respectivos iniciado- res a frente e reverso. Após confirmação da seqüência, estes clones foram 15 então desenvolvidos por toda a noite a 37°C e armazenados a -70°C. Cerca de 10 clones foram confirmados como positivos por análise de seqüência. O sequenciamento foi realizado por emprego de Prisma ABI. Dentre 10 clones, com base na confirmação do nível de expressão, o clone final foi escolhido para cultura em 1L de fermentador para desenvolvimento do processamento 20 a jusante.

Exemplo 8: preparação da cultura em semente Cepa BL21 de Escherichia coli transformada para expressar rhPTH (1-34) foi purificada e mantida em solução mestra de glicerol. Uma alíquota da solução mestra de glicerol foi raiada em placa 2,5% YE, (2,5% de extrato de levedura, 0,5% de cloreto de sódio, pH 7,4, com Ágar 1,5%) contendo ampicilina a 50 pL/mL e incubada a 37°C por 24 horas para obter colônias isoladas. Uma colônia simples foi inoculada em 10 mL de meio lí- quido de 2,5% YE (2,5% de extrato de levedura, 0,5% de cloreto de sódio, pH 7,4) com ampicilina 50 microlitros/mL em tubos falcon e incubada a 37°C por 8 a 16 horas. 5 mL da cultura do tubo foram inoculados em frascos côni- cos de 500 mL contendo 100 mL de meio basal. O frasco foi incubado a 37°C em um agitador giratório a 200 rpm por 8 horas. 10

15

20

Exemplo 9: fermentação de batelada alimentada A cultura em frasco mencionada acima foi usada para inocular 2 litros de fermentador em jarra contendo 600 mL do meio basal. A fermenta- ção foi realizada a 37°C e o pH mantido em 7 usando 12,5% de solução de amônia. A agitação foi realizada a 1.200 rpm com fornecimento de ar de 10 LPM sendo mantido através de toda fermentação. O meio de alimentação foi bombeado para o fermentador seguindo-se a estratégia de alimentação con- forme estabelecida na figura 6. Foi realizada indução em 18 horas a partir do início da fermentação com solução a 20% de Iactose alimentada a uma taxa de 0,25 mL/minuto. Uma solução antiespuma à base de silicone foi empre- gada para controlar espuma em excesso. A fermentação foi realizada por 24 horas durante o que as amostras foram retiradas para medição da densida- de óptica e produção de rhPTH (1-34). Os rendimentos em diferentes pontos de tempo foram medidos por escaneamento de géis SDS-PAGE coloridos em azul Coomassie (Tabela 1). A análise das amostras colhidas do caldo de fermentação mostrou que o rendimento médio da proteína de fusão de inte- resse é de aproximadamente 3 gms/litro após a primeira purificação de afini- dade. A tabela 2 fornece a taxa de alimentação usada na fermentação des- crita na figura 7.

Idade da cultura no fer¬ Densidade óptica Porcentagem do rendimento de mentador (em horas) em 600 nm rhPTH (1-34) na proteína total 0 0,36 0 16 128,8 Indução com alimentação constante com Iactose a 20%, Iactose a 10% 18 141,0 10,5 125,0 10,69 22 102,8 15,69 24 108,0 13,38 Tabela 2: taxa de alimentação usada na fermentação:

Tempo % de Alimentação 0 0 2 2 3,32 3 4,45 4 5,49 5 6,92 7 8,03 9 9,11 11 16,0 16 24 16 Exemplo 10: composição do Meio Basal

O meio basal usado para o processo de fermentação continha soluções BS1, BS2, solução mestra de MgSO4, Solução de elemento de tra- ço (TES) e solução Mestra de Antibiótico.

BS1 foi preparada por dissolução de 2,5 - 15 g de fonte de car- bono, tal como glicose ou glierol e 2,5 - 15 g de fonte de nitrogênio, tal co- mo, extrato de levedura ou peptona de soja em 400-600 mL de água RO.

BS2 foi preparada por dissolução de 0,5 4 g de sulfato de amô- nio, 0,8 - 3,2 g de Na2HPO4^H2O e 0,45 - 1,8 g de cloreto de sódio em 50 - 200 mL de água RO.

A solução mestra de MgSO4 foi preparada por dissolução de 61,7 g - 246,5 g de MgS04.2H20 em 1.000 mL de água RO e autoclavada.

TES (Solução de elemento de traço) foi reparada por dissolução de 0,13 - 1,24 g de H3BO3, 0,88 - 0,322 g de CoCI2.6H20, 0,025 - 0,1 g de NaMoO4. 2H2O, 0,088 - 0,352 g de CaCI2.2H20, 0,125 - 0,5 g de Mn- S04.2H20, 2,1 - 8,35 g de FeCI3 e 0,0125 - 0,05 g de CuS04.5H20 e 0.05-

0,2 g de ZnS04.7H20 em 500 mL de água RO. A solução foi esterilizada em filtro. A solução mestra de antibiótico consiste em solução de estoque de ampicilina esterilizada em filtro (50 mg/mL). O meio basal foi preparado como se segue:

400 - 600 mL de BS1 foram misturados com 100-1.000 microli- tros de solução de antiespumante (antiespumante Dow Corning 1510), antes da autoclavagem. A esta solução foi adicionada uma mistura de 50 - 200 mL 5 de BS2, 1-5 mL de solução mestra de MgSO4, 1-5 mL de TES e 1-1,5 mL de solução mestra de antibiótico para formar o meio basal. A concentração da fonte de carbono e da fonte de nitrogênio no meio basal estava entre 0,25-

1,5 peso/volume e 0,25-1,5 peso/volume, respectivamente.

Exemplo 11: composição de Meios de Alimentação O meio de alimentação usado para o processo de fermentação

continha as soluções FS1, FS2, FS3 e TES. FS1 foi preparado por dissolução de 100 - 200 g de fonte de carbono, tal como glicose ou glicerol em 200 - 300 mL de água RO. FS2 foi preparado por dissolução de 100 - 200 g de fonte de nitrogênio, tal como, extrato de levedura ou peptona de soja em 250-350 mL 15 de água RO. FS3 foi preparado por dissolução de 8-10 g de KH2PO4, 6-9 g de Na2HP04.2H20 e 6 -9 g de K2HPO4 em 25-75 mL de água RO. Todas as soluções acima foram esterilizadas por autoclavagem. O meio de alimentação foi preparado por mistura de 200-300 mL de FS1, 250-350 mL de FS2, 25-75 mL de FS3 e 18-25 mL de TES. A concentração da fonte de carbono, fonte 20 de nitrogênio e fosfatos inorgânicos no meio de alimentação foi de 10-30% peso/volume, 10 - 30% peso/volume e 2,5 - 4,25% peso/volume, respectiva- mente. As células obtidas após fermentação (realizada conforme o Exemplo 9) foram peletizadas e retiradas para purificação adicional.

Exemplo 12: clarificação, Iise e solubilização da célula:

Caldo de fermentação foi centrifugado para se obter microesfera

de célula que foi suspensa no tampão de Iise (Tris a 50 mM, pH 8,0, NaCI a 150 mM) e homogeneizada. Após resfriamento da solução homogeneizada para ~10 graus as células foram Iisadas por interrupção da pressão em 85 mPa (850 bar) e três ciclos. A isso foram adicionados 8M de ureia e agitados 30 para solubilizar as proteínas. Após solubilização da amostra (figura 7) foi filtrada através de membrana de 0,45 pm o que ajudou a evitar a formação de canal na cromatografia de EBA inicial. Exemplo 13: captura inicial da proteína de interesse:

A solução de proteína solubilizada e filtrada foi carregada no leito expandido da coluna de linha de circulação livre de um líquido de quelação de sefarose após equilibrar a coluna com tampão A, Tris a 20 mM, pH 8,0, 5 NaCI a 150 mm, 8M de ureia e Tampão B, Tris a 20 mM, pH 8,0, NaCI a 150 mm, 8M de ureia e 250 mM de imidazol. Após carregamento da amostra a coluna foi lavada com tampão A e então a proteína ligada foi eluída com Tampão B. O cromatograma e análise SDS-PAGE são mostrados nas figuras 8 e 9, respectivamente.

Exemplo 14: digestão da proteína de fusão por enterocinase

A eluição EBA foi diluída com Tris a 20 mM, pH 8,0 oito vezes para obtenção de uma concentração final de ureia de ~ 1M e enterocinase foi adicionada a uma razão de 1:100 (enzima:substrato), mantida em agita- ção a temperatura ambiente por uma hora. A amostra digerida foi verificada em um gel de Tris-Tricina mostrado (figura 10).

Exemplo 15: cromatografia de troca de cátion da amostra digerida: após uma hora de digestão de ΕΚ, o pH da amostra foi ajustado para 7,0 com HCI e então carregada em uma coluna de troca de cátion (SP- XL) que foi equilibrada com tampão A antes da carga da amostra. Após car- regamento da amostra, a coluna foi lavada com tampão A, acetato de sódio a 20 mM, pH 5,5 e a proteína ligada foi eluída com um gradiente de NaCI no tampão B: solução de acetato a 20 mM, NaCI a 1M. O pH da amostra foi a- justado para 7,0 antes do carregamento na coluna, uma vez que a carga de PTH marcado em fusão (não digerido) e marcador de fusão é calculada co- mo sendo negativa e PTH é possivelmente carregado e consequentemente, foi esperado que apenas PTH se ligasse no trocador de cátion e resultados semelhantes foram obtidos.

Cromatograma de troca de cátion e análise das frações por Tris- Tricina são fornecidos (figura 11).

Exemplo 16a: cromatografia de interação hidrófoba para purifi-

cação final:

sulfato de amônio foi adicionado à eluição IX acima a uma con- centração final de 1,75M. Após mistura completa a amostra foi carregada na coluna de Fenil Sefarose com tampão A, acetato de sódio a 20 mM, pH 5,5, sulfato de amônio a 1,75M antes do carregamento da amostra. Após carre- gamento da amostra a coluna foi lavada com tampão A e então uma eluição de gradiente foi realizada com o tampão B, acetato de sódio a 20 mM, pH

5,5 para purificação final. A máxima principal (vide figura 12) contém >99% de PTH (1-34) puro conforme analisado por RP-HPLC. As impurezas são eluídas imediatamente após a máxima principal conforme marcado no cro- matograma ‘fr.1’. Análise de fr-1 por RP-HPLC é fornecida abaixo (figura 14).

Exemplo 16b: cromatografia de fase inversa para purificação final:

alternativamente a purificação final da eluição IEX foi tentada usando coluna de sílica de fase inversa C4. Neste método, a eluição 1EX foi carregada na coluna C4 que foi equilibrada com tampão A (0,01% TFA em água). Um gradiente de até 30% do tampão B (0,1% de TFA em 90% aceto- nitrila) em 5 Volumes de Coluna (CV) seguido por um isocrático a 30% B para 5 CV e então uma elevação substancial para 100% B em 5 CV forneceu um bom rendimento de >99% de PTH (1-34) puro. Afigura 15 mostra perfil de purificação cromatográfico de fase de rhPT (1-34). Análise do PTH (1-34) purificado final foi realizada por RP-HPLC usando Bachem PTH (1-34) ou Forteo como referência e pureza confirmada para ser consistentemente >99% (figura 16).

PTH (1-34) purificado pelo método acima foi analisado pelos mé- todos que se seguem:

- uma massa de 4117 Da foi obtida por MALDI-TOF.

- os primeiros cinco aminoácidos dos dados de sequenciamento de término N são Ser, Vai, Ser, Glu, Iso.

- o bioensaio usando ensaio AMPc com linhagem de célula UMR106 forneceu nosso PTH (1-34) como sendo bioativo.

Claims (14)

1. Processo para síntese de rhPTH (1-34), caracterizado pelo fato de que compreende: i. construção de um ORF de nucleotídeo quimérico codificando cDNA conforme estabelecido na SEQ. ID N0:1 por ampliação do cDNA por RT-PCR empregando iniciadores específicos de gene selecionados dentre SEQ. ID N°:3, SEQ. ID N°:4, SEQ. ID N°:5, SEQ. ID N°:6, SEQ. ID N°:7 e SEQ. ID N°:8 codificando proteína de fusão quimérica de rhPTH (1-34) con- forme estabelecida na SEQ. ID N°:2, ii. expressão da proteína de fusão quimérica na presença de Iac- tose como indutora na faixa de cerca de 10-30% da proteína total, iii. purificação de rhPTH (1-34) obtido por um processo ortogo- nal, em que a purificação é realizada por cromatografia de troca de cátion para uma pureza >98% opcionalmente seguida por cromatografia de intera- ção hidrófoba (HIC) ou RP-HPLC a uma pureza >99%.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão contendo ORF de nucleotídeo conforme estabelecido na SEQ. ID N°:1 é selecionado do grupo consistindo em pLMab, pRA, pET 19b, em que o vetor é pET 19b.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a síntese de ORF de nucleotídeo quimérico conforme estabele- cido na SEQ. ID N°:1 está sob controle de um promoter induzível seleciona- do de um grupo consistindo em arasad, trp, T7, lac, Pho and trc, em que o promotor é T7.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parceiro de fusão quimérica consiste essencialmente em 41 aminoácidos de peptídeo de β-galactosidase de Escherichia coli (LacZ).

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão quimérica conforme estabelecida na SEQ. ID. N°:2 consiste em uma alça de afinidade selecionada do grupo consistindo em marcador de poli-histidina, marcador de GST, proteína de ligação a maltose e proteína estafilocócica, em que a alça de afinidade é marcador de poli-histidina.

6. Processo ortogonal para purificação de rhPTH (1-34), carac- terizado pelo fato de que consiste essencialmente no acoplamento por cro- matografia de troca de cátion rendendo uma pureza >98% para HIC renden- do uma pureza de >99% em que o aperfeiçoamento compreende evitar a geração de impurezas oxidadas e peptídeos desaminados usando um ambi- ente aquoso para eluição e rendendo rhPT (1-34) de terminais NeC intac- tos.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca de cátion é realizada em uma coluna selecionada de um grupo consistindo em SP-XL, SP-FF, Source-30S e Source-15S, em que a coluna é SP-XL.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que rhPTH (1-34) é ligada á coluna de troca de cátion e a coluna é lavada empregando tampão de lavagem possuindo uma faixa de pH de 3,5 a 5,5 e condutividade na faixa de 1 mS/cm a 3 mS/cm.

9. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que rhPTH (1-34) elui a partir da coluna de cromatografia de troca de cátion em um pH na faixa de 4,0 a 5,5 e uma faixa de condutividade de 15 mS/cm a 35 mS/cm.

10. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa HIC emprega uma coluna consistindo em microes- feras de agarose reticulada com Iigantes selecionados do grupo consistindo em etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terciária butila, pentila, isospenti- la, hexila, fenila, isopropanol, isobutanol, éter C4-C6, preferivelmente Sefa- rose consistindo em Iigante fenila.

11. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a coluna de HIC é lavada com solução tampão de lavagem compreendendo tampão de acetato a 20 mM e 1.000 a 2.000 mM de sulfato de amônio com um pH de 5,5.

12. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a coluna de HIC é eluída com um tampão de eluição com- preendendo 10 a 50 mM de tampão acetato com um pH de 5,5 em um gra- diente ou modo isocrático ou combinatório.

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a coluna RP-HPLC é selecionada do grupo consistindo C4, C8 e C18, em que a coluna é C4.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que rhPTH (1-34) possui massa em 4117 Da.