CN103562383A - 低pH蛋白质纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在含有杂质的溶液中回收和纯化胆盐刺激脂酶（BSSL）的方法，所述方法包括以下步骤：（i）施加BSSL到疏水作用层析（HIC）树脂；（ii）通过用具有pH范围从4到5的洗涤制品洗涤所述HIC树脂去除杂质；以及（iii）从所述HIC树脂回收BSSL。

Description

低pH蛋白质纯化方法
技术领域
本发明涉及用于纯化胆盐刺激脂酶（BSSL）的方法，所述方法包括在低pH下使用疏水作用层析以及，任选的，在低pH下使用阴离子交换层析。
背景技术
人类哺乳期乳腺和胰腺生产脂解酶，胆盐刺激脂酶（BSSL），也被称作胆盐激活脂肪酶（BAL）或者羧酸酯脂肪酶（CEL）。BSSL是胰液的主要成分并且负责胆固醇酯以及其他各种饮食中的酯类的水解。该酶在十二指肠液中发挥它的功能，当酶与胆盐混合时被激活，酶还在新生儿的消化乳脂中起到重要作用（综述，参见例如Wang&Hartsuck(1993)Biochim.Biophys Acta1166:1-19）。
来自人乳和人的胰腺的BSSL已经被纯化和表征，如由Wang(1980;Anal.Biochem.105:398-402)；
Figure BDA0000412771520000011
&Hernell(1981;Eur J Biochem,116:221-225)；Wang&Johnson(1983;Anal.Biochem.133:457-461)；Wang(1988;Biochem.Biophys.Res.Comm.164:1302-1309)报导。人的BSSL的cDNA序列被Nilsson(1990;Eur J Biochem,192:543-550)鉴定并且在WO91/15234和WO91/18923中被公开。
然而，以前还未公开BSSL能够通过包括疏水作用层析和/或阴离子交换层析的方法纯化，其中在低pH下洗涤层析树脂。需要用于BSSL的纯化的改进的方法，该方法能够有效地去除杂质例如宿主细胞蛋白（HCP）和DNA，而在同时给予高的产品收率。
附图简要说明
图1显示分别通过纯化方法A、B和C在阴离子交换层析（DEAE）之后获得的产物中宿主细胞蛋白的量（ng/mg）。在图1-6中，误差棒显示置信区间（95%置信水平）。
图2显示DEAE之后获得的产物中的DNA的量（pg/mg）。
图3显示疏水作用层析（HIC）之后BSSL的收率（%）。
图4显示HIC之后获得的产物中的宿主细胞蛋白的量（ng/mg）。
图5显示HIC之后获得的产物中的DNA的量（pg/mg）。
图6显示DEAE和HIC组合之后BSSL的收率（%）。
图7显示DEAE和HIC组合之后获得的产物中宿主细胞蛋白的对数减少。
图8显示DEAE和HIC组合之后获得的产物中DNA的对数减少。
发明公开内容
意外地发现，胆盐刺激脂酶（BSSL）能够通过疏水作用层析（HIC）甚至在低pH下被有利地纯化。杂质，例如宿主细胞蛋白（HCP）和DNA，用这种方法被有效地去除并且获得更纯的产物，同时维持产品收率。尤其，本发明提供了一种以下被称作“方法A”的方法，该方法用于纯化BSSL是有用的。方法A包括以下（a）和（b）的组合：（a）阴离子交换层析，其包括在低pH下洗涤柱和在低pH下洗脱BSSL；（b）疏水作用层析，其包括在低pH下洗涤柱。
因此，在本发明的第一方面提供了一种在含有杂质的溶液中回收和纯化胆盐刺激脂酶（BSSL）的方法，所述方法包括以下步骤：
（i）施加BSSL到疏水作用层析（HIC）树脂；
（ii）通过用具有pH范围从3.5到5，优选从3.5到4.5，以及更优选约pH为4的洗涤制品洗涤所述HIC树脂去除杂质；以及
（iii）从所述HIC树脂回收BSSL。
术语“疏水作用层析（HIC）”是本领域众所周知的并且指的是使用疏水性的性能以分离蛋白质彼此的分离技术。在这种分离中，最初施加具有高离子强度的缓冲液到柱和样品。缓冲液中的盐引起蛋白质一致性变化（protein conformance change）和被吸附到介质的疏水区的暴露。洗脱蛋白质，盐浓度降低。
术语“杂质”特指来自用于目标蛋白质的生产的细胞并且将存在于培养基中的宿主细胞蛋白和DNA。
所述BSSL优选为人的BSSL，更优选为重组的人的BSSL。重组的人的BSSL能够通过现有技术中的已知方法生产，例如通过在重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中表达，如下面实验部分的描述。可选地，重组BSSL能够在其他已知的表达系统中生产，所述其他已知的表达系统例如大肠杆菌（E.coli），如由通过Hansson等人.(1993)J.Biol.Chem.268:26692-26698描述的；或者巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），如在WO96/37622中公开的。
在本发明的优选形式中，BSSL的纯化方法包括阴离子交换层析步骤，其中在低pH下例如pH4-5下洗涤和洗脱BSSL。因此，本发明提供如上所述的方法（包括HIC）并且还包括以下步骤：
（i）施加BSSL到阴离子交换树脂；
（ii）通过用具有pH范围从4到5，优选从约4.4到约4.6，例如pH4.4或4.5的洗涤制品洗涤所述阴离子交换树脂去除杂质；以及
（iii）通过用洗脱剂洗脱所述阴离子交换树脂回收BSSL。优选地，所述洗脱剂具有从4到5，优选从约4.4到约4.6，例如pH4.4或4.5的pH范围。
术语“阴离子交换层析”（AIEX）是本领域众所周知的并且指的是包括将带负电的氨基酸结合到固定的阳离子表面的分离技术。通常，通过改变缓冲液的组成，例如用氯化钠增加离子强度，使得生物分子从阴离子交换器释放。特别优选阴离子交换步骤在HIC步骤之前进行，即，在BSSL被施加于HIC树脂之前从阴离子交换树脂中回收BSSL。
在本发明的特别优选形式中，BSSL纯化方法是在实施例中被称作“方法A”的方法并且该方法包括以下步骤：
（i）施加BSSL到阴离子交换树脂；
（ii）通过用具有pH范围从4到5，优选从约4.4到约4.6，例如pH4.4或4.5的洗涤制品洗涤所述阴离子交换树脂去除杂质；
（iii）通过用洗脱剂洗脱所述阴离子交换树脂回收BSSL，优选所述洗脱剂具有pH范围从4到5，以及更优选从约4.4到约4.6，例如pH4.4或4.5；
（iv）施加在步骤（iii）中获得的BSSL到疏水作用层析（HIC）树脂；
（v）通过用具有pH范围从3.5到5，优选从3.5到4.5，以及更优选约pH4的洗涤制品洗涤所述HIC树脂去除杂质；以及
（vi）从所述HIC树脂回收BSSL。
本领域技术人员将理解，根据本发明的纯化方法中能够包括另外的步骤。例如，一个或多个另外的步骤能够被包括在“方法A”中在AIEX之前、在AIEX和HIC之间，或者在HIC之后。这种另外步骤的例子包括病毒减少步骤、超滤和透析过滤（UF/DF），等等。
实施例
1.重组BSSL的表达
人的BSSL能够根据标准程序通过从含有包括编码人的BSSL的核苷酸序列的核酸表达系统的重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达来制备。简单地说，包括前导序列的编码全长hBSSL的2.3Kb cDNA序列（如Nilsson等人,1990;Eur J Biochem,192:543-550描述的）从pS146（Hansson等人,1993;J Biol Chem,268:26692-26698）获得并且被克隆到表达载体pAD-CMV1（Boehringer Ingelheim）-包括用于基因表达的CMV启动子/SV40多聚腺苷酸（polyA）信号和用于筛选/扩增的dhfr基因的基于pBR的质粒-以形成pAD-CMV-BSSL。
然后pAD-CMV-BSSL用于DHFR-阴性CHOss细胞（BoehringerIngelheim）的转染-连同编码新霉素抗性以筛选遗传霉素（G418）抗性的质粒pBR3127SV/NeopA共转染-以产生DHFR阳性的产生BSSL的CHO细胞。在条件下培养所得CHO细胞并放大规模以表达大量的rhBSSL。例如，将来自主细胞库（master cell bank，MCB）的细胞解冻，使用没有谷氨酰胺和葡萄糖的Ex-Cell302培养基（SAFC）在摇瓶中扩增，稍后补充谷氨酰胺和葡萄糖，接着在15和100L的生物反应器中生长，之后接种700L生产生物反应器，在那里BSSL被组成型地表达和以分批补料工艺产生。来自细胞培养的收获材料能够通过使用深度和绝对过滤器的组合或者通过离心分离澄清。
2.BSSL的纯化（方法A）
阴离子交换层析
用Tris缓冲液（10mM，pH7）稀释（约1:1.2，从17到9mS/cm）来自表达BSSL的CHO细胞培养物的澄清的收获物。将稀释后的收获物负载到DEAE琼脂糖FFTM阴离子交换柱（GE Healthcare）。在用Tris缓冲液（25mM，pH7.2）初次洗涤（“第一次洗涤”）之后，用含有25mM乙酸钠（pH4.5）和50mM氯化钠的缓冲液洗涤（“第二次洗涤”）柱。逐步从具有含有25mM乙酸钠（pH4.5）和350mM NaCl的缓冲液的柱中洗脱BSSL。
病毒灭活
对于根据已知方法进行低pH病毒灭活，通过添加甘氨酸-HCl,pH2.5将DEAE池中的pH降到3.5。培养60分钟后，通过添加0.5M磷酸氢二钠,pH9将pH增加到6.3。
疏水作用层析
病毒灭活之后，通过添加4M氯化钠/25mM磷酸钠（pH6）使BSSL处于约140mS/cm的导电率的条件下。最终氯化钠的浓度为约1.75M。将样品负载到苯基琼脂糖FFTM高取代柱（GE Healthcare）。用含有25mM磷酸钠（pH6）和1.75M氯化钠的缓冲液洗涤（“第一次洗涤”）柱。然后用25mM乙酸钠,pH4和1.75M氯化钠洗涤（“第二次洗涤”）柱。最后用与“第一次洗涤”中相同的缓冲液（25mM磷酸钠,pH6，和1.75M氯化钠）洗涤（“第三次洗涤”）柱。然后通过降低电导率（10mM磷酸钠，pH6）洗脱BSSL。
3.BSSL的纯化（用于比较的方法B）
通过与上述方法A一样的“方法B”纯化BSSL，除了在阴离子交换步骤和在HIC步骤中都不包括“第二次洗涤”。另外，在阴离子交换层析期间，使用Tris缓冲液在pH7.2洗脱BSSL。
4.BSSL的纯化（用于比较的方法C）
通过与上述方法A一样的“方法C”纯化BSSL，除了下述步骤：
（i）在阴离子交换层析期间，使用Tris缓冲液在pH7.2进行“第二次洗涤”和洗脱步骤；以及
（ii）在HIC期间，使用磷酸钠缓冲液在pH6进行“第二次洗涤”。
下面表I和II分别总结了在阴离子交换层析和HIC期间方法A、B和C之间的区别。
表I
BSSL的阴离子交换层析
（CV=柱体积）
Figure BDA0000412771520000061
表II
BSSL的疏水作用层析
（CV=柱体积）
Figure BDA0000412771520000071
5.来自方法A-C的结果
阴离子交换层析
表III显示来自通过阴离子交换层析，包括低pH病毒灭活的BSSL的纯化的结果。如“收率”栏显示的，用不包括“第二次洗涤”的方法B回收了大部分产物，如预期的。然而，表III也显示了用方法A（在pH4.5下“第二次洗涤”）回收的产物多于用方法C（在pH7.2下“第二次洗涤”）。
表III
来自阴离子交换层析的结果
Figure BDA0000412771520000072
表III和图1显示从阴离子交换层析获得的材料中的宿主细胞蛋白（HCP）的含量。从这些数据，方法A-C对于HCP去除表现为具有相似的效果。然而，SDS-PAGE分析（没有显示）显示，代表不同于BSSL的尺寸和电荷的蛋白质的条带，在方法B和C的样品中更强，表明方法A提供的材料具有更少的HCP。
表III和图2显示从阴离子交换层析获得的材料中的DNA的含量。意外地，证明方法A清除更多的DNA并维持处理产物的效率，导致方法A用于清除获得的产品中的DNA时比方法B和C更显著有效。
在表III中还显示，根据已知方法通过SE-HPLC（尺寸排阻-高效液相层析）分析表明，用方法A比方法B或C获得更纯的产物（“主峰”，对应全长BSSL）。
疏水作用层析
如表IV（“收率”）和图3显示，用全部三种方法的产品收率相似。然而，方法A与方法B和C相比意外地取得了稍微高的产品收率。
表IV
来自疏水作用层析的结果
Figure BDA0000412771520000081
表IV和图4显示从疏水作用层析获得的材料中的宿主细胞蛋白（HCP）的含量。数据显示，关于HCP的去除方法A优于方法B和C。用SDS-PAGE（没有显示）获得了相同的结果。
表IV和图5显示从疏水作用层析获得的材料中的DNA的含量。再次，在从产物池中去除DNA的方面方法A显示出优于方法B和C。用方法B和C，单位产物量的残留DNA的量是用方法A对应量的超过6倍高。另外，表IV显示根据SE-HPLC分析，用方法A获得单体BSSL的最高量，以及低分子量（LMW）材料的最少量。
结论
当组合来自阴离子交换和HIC的结果时，显示用方法A、B和C获得的产品收率之间没有显著差异（图6）。然而，关于污染物HCP（图7）和DNA（图8）的对数减少值（LRV），与方法B和C相比，用方法A是优胜的。对数减少值是在负载到步骤的杂质的总量和步骤之后的杂质的总量（在中间产物池中）之间的比值的对数（log10）。
总之，用于BSSL的纯化的“方法A”包括（a）阴离子交换层析和（b）疏水作用层析的组合，其中（a）阴离子交换层析包括在低pH下洗涤柱和在低pH下洗脱BSSL；（b）疏水作用层析包括在低pH下洗涤柱。意外地发现，用“方法A”有效地去除杂质例如宿主细胞蛋白（HCP）和DNA，并且获得更纯的产物，同时维持产品收率。

Claims (14)

1.一种在含有杂质的溶液中回收和纯化胆盐刺激脂酶（BSSL）的方法，所述方法包括以下步骤：
（i）施加BSSL到疏水作用层析（HIC）树脂；
（ii）通过用具有pH范围从3.5到5的洗涤制品洗涤所述HIC树脂去除杂质；以及
（iii）从所述HIC树脂回收BSSL。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述BSSL为人的BSSL。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述BSSL为重组的人的BSSL。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组的人的BSSL是通过从重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达而制备的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述洗涤制品的pH为从3.5到4.5。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述洗涤制品的pH为4。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
（i）施加BSSL到阴离子交换树脂；
（ii）通过用具有pH范围从4到5的洗涤制品洗涤所述阴离子交换树脂去除杂质；以及
（iii）回收BSSL。
8.根据权利要求7所述的方法，其中BSSL是通过用具有pH范围从4到5的洗脱剂洗脱所述阴离子交换树脂回收的。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中在BSSL被施加到所述HIC树脂之前从所述阴离子交换树脂回收BSSL。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括以下步骤：
（i）施加BSSL到阴离子交换树脂；
（ii）通过用具有pH范围从4到5的洗涤制品洗涤所述阴离子交换树脂去除杂质；以及
（iii）通过用具有pH范围从4到5的洗脱剂洗脱所述阴离子交换树脂回收BSSL；
（iv）施加在步骤（iii）中获得的BSSL到疏水作用层析（HIC）树脂；
（v）通过用具有pH范围从3.5到5的洗涤制品洗涤所述HIC树脂去除杂质；以及
（vi）从所述HIC树脂回收BSSL。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤（ii）中的所述洗涤制品具有从4.4到4.6的pH范围。
12.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤（iii）中的所述洗脱剂具有从4.4到4.6的pH范围。
13.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤（v）中的所述洗涤制品的pH为从3.5到4.5。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤（v）中的所述洗涤制品的pH为4。
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