CN115768882A - 改善腺相关病毒的纯化以更有效地去除污染dna - Google Patents

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Abstract

一种降低含有AAV衣壳和污染DNA的制剂中污染DNA含量的方法，包括以下步骤：a)用在其表面带有正电荷的固相对DNA进行提取，在pH值为7.0±1.0和10mM至200mM的盐浓度下，将所述固相与制剂接触，得到第一组分，b)通过第一切向流过滤对所述第一组分进行渗滤以获得第二组分，c)用DNA酶处理第二组分，d)通过第二切向流对通过步骤c)获得的DNA酶处理的第二组分进行渗滤，e)过滤至缓冲液，其pH为7.0±1.0且盐浓度为10mM至20mM，以产生第三组分，并且任选地f)在进行补充层析之前，通过切向流过滤浓缩第三组分。

Description

改善腺相关病毒的纯化以更有效地去除污染DNA
本发明公开了一种降低含有AAV衣壳和污染DNA的制剂中污染DNA含量的方法。
背景
腺相关病毒(AAV)已成为人类基因治疗领域中治疗性DNA的常见递送载体。该病毒是通过细胞培养方法产生的，最常见的是使用哺乳动物或昆虫宿主细胞。操控细胞培养，以使所需的治疗性DNA质粒位于AAV衣壳内。收集细胞培养物，并使用标准色谱方法(例如亲和色谱法，离子交换色谱法，疏水交互色谱法等)纯化含DNA的AAV衣壳。
与所有人类可注射治疗剂一样，为保证安全，需要将污染的DNA降低到非常低的水平。事实证明，这比预期的更具挑战性。最近开发的分析技术表明，困难可能部分来自于结合在AAV衣壳外部的残留DNA。这也许不足为奇，因为众所周知AAV衣壳与阳离子交换剂紧密结合。与阳离子交换剂的强结合表明AAV衣壳外部具有强正电荷。DNA是负电性的，并与带正电的表面紧密结合。无论是何种机制，这些发现都凸显了去除DNA的困难。
目前，通过简单地添加DNA酶来处理AAV收获物是业界的普遍做法。不幸的是，通过这种方法减少的DNA是有限的，并且不能解决将污染DNA减少到非常低的水平的问题。它提供了一个次要的好处，即把收获物的可过滤性从无望提高到可能，但是过滤器堵塞仍然是一个常规问题，需要过多的过滤介质，并会导致AAV衣壳的损失。它还可以防止像切向流过滤这样的处理方法能够在很大程度上浓缩收获物。浓度因子高达2有时是可能的，但仅此而已。
WO02/12455A1公开了在没有传染性腺病毒存在下产生的重组AAV(rAAV)病毒的大规模纯化方法。优选地，所述rAAV是通过使用辅助功能载体、AAV载体和AAV辅助载体的三重转染在宿主细胞系中产生的。所述方法包括从宿主细胞系制备裂解物，并将该裂解物通过离子交换色谱介质和/或亲和色谱介质的各种组合。亲和色谱介质是AAV受体或对AAV具有结合亲和力的抗体，例如硫酸肝素。考虑了各种阳离子交换和阴离子交换介质。在某些实施方案中，可包括任选的纯化步骤，例如通过一个或多个过滤器过滤裂解物，或用核酸酶处理裂解物。
WO 2010/148143 A1公开了纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，所述载体可用于基因转移，特别是用于基因治疗或疫苗接种。重组AAV载体基本上不含过程中的杂质，包括生产成分，例如细胞核酸、细胞蛋白、辅助病毒和培养基成分。
WO 03/097797A2公开了一种纯化病毒颗粒，特别是重组腺病毒载体颗粒的方法。该方法依赖于细胞裂解，从病毒中脱离的基于去污剂的宿主细胞污染物沉淀，深度过滤或离心，超滤，核酸酶消化和色谱法的各种组合，可靠且经济地生产高度纯化的产品。此方法导致污染的DNA水平始终低于可检测水平。
WO 2019/006390 A1公开了包括至少2个柱色谱步骤的重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的纯化、生产和制造方法。柱层析步骤包括例如阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法和/或AAV亲和色谱法，单独或组合和以任何顺序进行。
本文引用的所有参考文献均通过引用而并入，其并入程度为与本文的明确教导不矛盾。
发明概要
已开发一种新颖的方法，所述方法为AAV的纯化提供了令人惊讶的改进，尤其是在减少DNA污染方面。将细胞培养物或裂解物暴露于带正电荷的一个表面或多个表面，以结合与AAV颗粒无关的DNA。用带正电的表面处理可实现DNA的初始减少，并促进切向流过滤(TFF)，使浓缩因子达到10-20或更高的程度。鉴于细胞收获物或裂解物的DNA酶处理无法在可过滤性方面实现这种改善，令人惊讶地是，具有带正电表面的固相萃取能够做到这一点。
本发明的简要说明
根据本发明的方法，在含有AAV衣壳和污染DNA的制剂中，降低污染DNA含量，所述方法包括以下步骤:
a)用在其表面带有正电荷的固相对DNA进行提取，在pH值为7.0±1.0和10mM至200mM的盐浓度下，将所述固相与制剂接触，得到第一组分，
b)通过第一切向流渗滤对所述第一组分进行渗滤以获得第二组分，
c)用DNA酶处理第二组分，
d)通过第二切向流过滤，将步骤c)获得的经DNA酶处理的第二组分进行渗滤至pH值为7.0±1.0且盐浓度为10mM至20mM的缓冲液，以得到第三组分，并且任选地
e)在进行补充层析之前，通过切向流过滤浓缩第三组分。
在本发明方法的一个实施方式中，所述的固相可以是松散的散装颗粒或流通装置的形式。
在本发明方法的另一个实施方式中，所述切向流过滤可以用选自下组的膜进行：中空纤维膜，包括单根中空纤维膜或成束的膜；或平膜，包括单层膜或者堆叠或卷成圆柱体的膜。
在本发明方法的另一个实施方式中，所述第一过滤可在缓冲液中进行，所述缓冲液被配制为促进DNA被DNA酶消化。
在本发明方法的又一个实施方式中，所述切向流过滤膜具有孔隙率，所述的孔隙率的截留分子量范围为10kDa至300kDa、或30kDa至300kDa、或60kDa至300kDa、或100kDa至300kDa、或200kDa至300kDa、或250kDa至300kDa，优选地，截留分子量为100kDa或以上。
在本发明方法的另一个实施方式中，所述含有AAV衣壳和污染DNA的制剂可以含有选自下组的AAV颗粒：AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或其他血清型，包括具有一种以上血清型特征的重组血清型。
在本发明方法的另一个实施方式中，在步骤d)或步骤e)之后可获得的组分可以按照以下选项(i)至(iii)进一步处理：
选项(i)阳离子交换层析，
选项(ii)亲和层析，或
选项(iii)一种阴离子交换层析。
在本发明方法的第二方面的另一个实施方式中，在纯化步骤(i)中，将步骤d)或e)的组分加载到pH值为4至6，特别是pH值约为5的阳离子交换层析材料上，然后：
-将阳离子交换层析材料重新平衡至pH值约为3.5±0.5，
-用盐梯度进行洗脱，
-然后用阴离子交换层析进行处理。此过程产生例如临床质量的AAV。
在本发明方法的另一个实施方式中，在纯化步骤(ii)中，将步骤d)或e)的组分加载到亲和层析材料上，并在洗脱后进行阴离子交换色谱处理。此过程产生例如纯化的AAV。
在本发明方法的另一个实施方式中，在纯化步骤(iii)中，将步骤d)或e)的组分进行阴离子交换色谱柱。此过程产生例如研究级的AAV。
附图简要说明
图1显示了本发明方法的概述。
图2显示了阳离子交换色谱图，展示了本发明方法的应用。
图3显示了将标准条件与本发明方法的条件进行比较的分析还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
图4显示了亲和层析，从细胞裂解物中捕获AAV。
图5显示了如图4中所示的亲和色谱图所示的组分的分析还原SDS-PAGE。
具体实施方式
现以AAV作为待纯化的实体为例，更详细地描述本发明的各个方面。同样，其他实体可以用类似的方式纯化，这对于阅读和理解本发明公开内容的本领域技术人员来说是很容易认识到。
本领域的一些经验人员将认识到，可以通过添加带正电荷的可溶性聚合物代替带正电荷的固相材料将DNA从处理溶液中除去。从临床安全性的角度来看，这可能是不稳定的，并且可能会改变纯化的衣壳在体外的生物学行为，从而导致对结果的误解，并可能造成不代表AAV但由带正电荷的聚合物引起的结果。它们还可能具有保护某些DNA免受DNA酶裂解的作用。众所周知，DNA会积极地与AAV衣壳的外部结合。如果将带正电的聚合物添加到包含此类AAV衣壳的制剂中，则带正电的聚合物可能会在衣壳外部相关的DNA上形成涂层。已知DNA和带正电的蛋白质之间的紧密结合会干扰DNA酶的作用。带正电的聚合物可以在更大程度上做到这一点。其程度为在纯化后，带正电荷的聚合物仍与AAV衣壳结合，它们可以随后浸出到体外样品中或逐渐释放到包括实验动物或人类在内的活体中。带正电的聚合物都是引起炎症的化学刺激物。鉴于纯化的AAV衣壳最终将被施用于已经生病的人，无意中给他们服用已知类别的炎症剂带来不必要的潜在的严重风险。这突出了本发明的创造性，因为它提供了一种用固相材料提取DNA的方法，所述固相材料可以在处理后从AAV衣壳制剂中完全除去。
配制用于浓缩TFF步骤的缓冲液，以促进在随后的处理步骤中通过选定DNA酶进行的DNA消化。添加所选的DNA酶并使其孵育合适的时长，与常规的DNA裂解方法有两个显著差异。1)由于TFF浓度的实现，体积较小，所需的酶较少。2)去除抑制剂并将缓冲液交换到选定的DNA酶的最佳裂解条件中，与简单地将其添加到原始细胞培养物或裂解物中的标准做法相比，实现了更有效的减少。
TFF膜的孔隙率得益于最大可能仍保留衣壳的孔隙率。孔隙率等级根据制造商和膜材料而有所不同，但一般而言，具有250kDa至300kDa截留分子量的膜是理想的。较低的MWCO值支持较低的污染物清除效果，但仍显著降低了所处理的制剂的污染物含量。总的来说，可以使用具有下列MWCO等级的TFF膜：10kDa至300kDa、30kDa至300kDa、60kDa至300kDa、100kDa至300kDa、200kDa至300kDa或250kDa至300kDa，但优选高于100kDa。
可在商业上获得各种物理形式和尺寸的TFF膜，以适应研发，扩大规模和制造的各种需求。它们包括单个或成堆或成卷的平膜；和单根或成束的中空纤维。
切向流过滤(TFF)技术通常以三种原理模式中的任何一种或任何组合进行，如在本发明的方法中。这些模式中的第一种是浓缩，其目的是去除多余的流体，以使后续的处理操作更有效。第二种模式是渗滤。在渗滤过程中，过滤掉原始流体、盐、糖和缓冲液成分，引入不含这些成分的新流体。这具有"缓冲交换"样品所在液体的效果，目的是使样品为后续处理做好准备。术语渗滤是“透析”和“过滤”两个词的组合。第三种模式是基于尺寸的纯化。浓缩和渗滤可以使用任何孔隙率的切向流过滤膜进行，以保留想要的产品，包括截留分子量为10kDa或更小的膜。使用TFF作为纯化工具代表了一种扩展，其中专门使用大孔膜来消除小于目标产品的生物分子污染物。条件是孔隙率必须足够小，以保留目标产品，具有满足该要求的最大孔隙的膜提供了去除最广泛尺寸范围的污染生物分子的益处。在当前情况下，由于AAV衣壳在生物产品的规模上相当大，因此孔非常大的孔膜，例如截留分子量高达300kDa的，可以消除大多数蛋白质和其他生物分子。那些污染的生物分子越小，就越能有效地被消除。这使得该技术特别适合在DNA裂解后去除DNA酶，以及用于去除通过裂解先前与之相关的DNA而从宿主细胞DNA中释放的组蛋白。
许多DNA酶可以在商业上购得，每种酶都需要自己独特的条件才能获得最佳效果。初步实验数据表明，所谓的耐盐DNA酶可能提供更好的结果。某些DNA酶也裂解RNA，这在RNA稳定大的DNA异源聚集体的程度上可能是有用的。如果DNA酶缺乏这种能力，则可以将RNA酶添加到DNA酶中。然而，所述裂解制剂消化RNA的能力对于本发明的方法不是必须的。
裂解后，再次通过TFF处理样品以去除裂解酶，去除DNA片段，并去除通过裂解宿主DNA释放的宿主组蛋白。
一个特别出乎意料的实验发现是，即使完全优化了裂解条件，DNA的裂解也不足以完全解决问题。实验数据表明，残留的组蛋白会干扰层析，从而损害其去除包括DNA在内的污染物的能力。在层析之前去除组蛋白可增强所有污染物类别的去除，并进一步增强对污染DNA的去除。
第二个TFF步骤采用大致代表生理条件的缓冲液，例如pH值在6.5和7.5之间，氯化钠浓度为25-200mM。维持大致的生理条件被认为是本发明方法提供的增强的有价值的贡献因素。
TFF制备的样品通常使用接近以下层析结合条件的缓冲液。大致生理条件适合于通过亲和色谱捕获AAV，但是本发明的方法将总污染物负荷降到很低的程度，以至于诸如通过阳离子交换色谱或阴离子交换色谱捕获的替代方法可以产生高纯度的AAV而无需依赖亲和色谱。这很重要，因为市售的亲和色谱介质需要低流速，这增加了处理时间，并且它们不能耐受用1.0M的NaOH清洗。用离子交换剂捕获可以使用色谱介质，该介质支持高流速、产品结合能力更高，以及使用1.0M的NaOH清洁消毒时间更长。
在一个实施方式中，之前的方法步骤用于制备用于加载到亲和色谱柱的样品。
在另一个实施方式中，使用前述方法步骤来制备样品，以便将其装入带正电的色谱柱，如阴离子交换剂。在这种情况下，样品将在第二个TFF步骤之后稀释，以使其电导率足够低，以确保AAV与色谱柱的高容量结合。它的pH值也可以调整到更高的值，以便更好地区分空的衣壳和完整的衣壳。可以添加镁盐和/或钙盐以改变空-完整分离的选择性。这种方法可能适用于生产研究级完整衣壳。
在另一个实施方式中，使用前述方法步骤来制备用于加载到阳离子交换剂上的样品。准备与阳离子交换剂结合的样品的通常准备工作包括将样品的pH值滴定到pH为3.5。这会改变衣壳蛋白表面氨基酸残基的滴定状态，导致衣壳表面变为净正电。它们的正表面电荷使它们与阳离子交换剂的带负电的表面结合在一起。然而，它也有不利的影响。通过使衣壳表面带正电，它会引起DNA的强结合，或者如果DNA已经与衣壳外部结合，则低pH会稳定这种结合。无论哪种方式，低结合pH都会促进DNA与衣壳外部结合。
这个问题的另一个方面使它更成问题。如果DNA与衣壳外部结合，则体系中多余的组蛋白很大概率与衣壳外部相关的DNA结合。这突出了第二个TFF步骤的价值，不仅可以去除DNA片段，还可以去除组蛋白。在这种情况下，需要强调的是，极低的pH(如pH 3.5)也会放大组蛋白以及其他DNA结合蛋白(如转录因子，甚至泛素)上的正电荷。
本发明的方法包括解决这些电位的另一个特征，该电位也产生令人惊讶的效果。在与阳离子交换剂结合的制备中，将样品平衡到更温和的pH值5.0±0.25，而不是pH值3.5。将阳离子交换剂平衡至相同条件，并加载样品。在样品结合后，将柱重新平衡至pH值为3.5，并用增加的盐梯度洗脱AAV。实验数据表明，这种方法大大降低了从阳离子交换剂上洗脱的AAV组分的污染。特别地，它去除了DNA结合蛋白大小范围内的小污染物。这表明，在经过本发明方法的先前步骤之后，在将样品施加到柱上时，仍在样品中的组蛋白和其他DNA结合蛋白与阳离子交换剂结合，并且在AAV被洗脱时它们仍然结合在那里。这与组蛋白的已知行为一致，组蛋白不会从NaCl中的阳离子交换剂中洗脱下来，而是需要用胍或NaOH进行洗脱。无论采用何种机制，都可以大大提高洗脱的AAV的质量。
在初始阳离子交换色谱步骤之后，将AAV应用于带正电的色谱装置(例如阴离子交换剂)上，以进一步提取DNA并从完整的衣壳中分离出空的衣壳，指的是含有所需治疗性DNA质粒的衣壳。在初始亲和色谱步骤之后，可以对AAV衣壳进行类似的处理。
阳离子交换色谱介质在市场上广泛销售，有各种不同的配体和不同的物理形式。阳离子交换剂的关键定义特征是它们带负电。具有足够正电荷的生物物种与它们结合，然后可以洗脱，最常见的是通过增加盐的浓度。但是，所有阳离子交换剂都是多模式的，这意味着静电相互作用仅代表有助于结合生物分子的化学机制之一。两种最常见的阳离子交换配体是羧基烷烃基团，例如羧甲基，羧乙基和羧丙基；和磺基烷烃基团，例如磺基甲基，磺基乙基和磺丙基。羧基烷烃阳离子交换基团包含一个具有两个自由孤对电子的羰基氧原子和一个具有三个自由孤对电子的羧基氧原子。这些孤对电子是氢受体，赋予这些配体参与氢键的潜力。磺基-烷烃阳离子交换基团包含三个氧原子，其中两个不带电，但携带两个孤对自由电子。第三个带有负电荷，具有三个孤对电子，使配体成为氢供体，并使其具有参与氢键的能力。阳离子交换剂有时使用烷烃-磷脂酸残基。根据pH值，它们具有两个带负电荷的氧原子，每个具有三个孤对电子和一个不带电荷的氧原子具有两个孤对电子，或者它们具有一个带负电荷的氧原子具有三个孤对电子和两个不带电荷的氧原子各自具有两个孤对。此外，基于磷脂酸的阳离子交换剂具有参与金属配位键合的能力。二羧基、三羧基和多羧基阳离子交换配体也具有结合金属的能力。所有上述配体还具有不同程度的疏水特性，这取决于结合的烷烃是否含有一个、两个、三个或更多个碳残基。一些阳离子交换配体还包括疏水环。因此，出于本发明的目的，阳离子交换剂被定义为带有负电荷的色谱固相，而不管它们可能体现的任何其他化学反应性。阳离子交换剂可从全球多家供应商处商购。
同样的一般逻辑也适用于阴离子交换色谱介质。为了本发明的目的，它们被定义为带有正电荷的色谱固相，尽管它们可以体现任何额外的化学反应性。弱阴离子交换剂的带电氮原子具有一对单独的自由电子，使其成为氢受体。直接与氮基团键合的氢原子可以充当氢供体。强阴离子交换剂的带电氮原子缺乏孤对自由电子。在强阴离子交换剂和大多数弱阴离子交换剂上与氮原子相关的烷烃基团赋予疏水性。有些采用其他疏水结构。一些阴离子交换剂使用基于聚合物的配体，这些配体产生其他化学反应性的组合。所有阴离子交换剂都是多模式的。阴离子交换剂可从全球多家供应商商购。
用于亲和色谱的配体由肽和蛋白质组成，通常代表抗体或抗体的亚结构，例如F(ab)'2区或Fab区，或单链轻链衍生物(scFV)或其他重组结构，所有这些都模仿抗体的特异性。与离子交换剂一样，全球不同的供应商可以提供许多商业变体。
当含AAV的细胞培养收获物或裂解物在大致生理条件下与带正电的表面接触时，固相DNA提取过程就开始了。将样品与带正电的表面接触约1分钟至4小时。
在一个实施方式中，在正电荷表面是颗粒形式的情况下，颗粒与样品的体积比例可以0.1％到10％、1％到5％、2％到5％或更高、更低或中间比例。
在一个实施方式中，在正电荷表面是颗粒形式的情况下，接触时间可以是10分钟至240分钟、或20分钟至120分钟、或30分钟至60分钟，或更长、更短或中间的时间。
在一个或多个实施例中，在正电荷表面是流通装置的情况下，接触时间可以是1分钟至60分钟，或2分钟至30分钟，或5分钟至15分钟，或更长、更短或中间时间。
在某些情况下，所述的带正电的颗粒可能与其他化学性质的颗粒混合。实验数据表明，带负电的颗粒与带正电的颗粒的混合物比单独带正电的颗粒能去除更多的污染物。
DNA酶处理可以进行15分钟至24小时，或30分钟至16小时，或1小时至8小时，或更长、更短或中间的时间。由于实现尽可能高的DNA裂解程度是一个特定的目标，因此优选较长的间隔(例如16小时至24小时)。
DNA酶处理优选在用于浓缩和平衡DNA酶处理的缓冲液的相同TFF单元内进行。跨膜压力设置为零，并在加入DNA酶后，将样品在系统中再循环，以确保彻底混合。在消化过程完成后，将TFF缓冲液换成pH约为5且盐浓度为20mM至100mM的缓冲液。跨膜压力设置为正值，并重新启动TFF。大多数酶与DNA片段一起被消除，尤其是组蛋白。
术语pH约5，应理解为pH值在4.0至6.0、或4.5至5.5、或4.75至5.25的范围内。本领域的经验人员将理解，pH值越低，样品中可能存在的盐的浓度越高，并且AAV仍然能被阳离子交换剂捕获。为了提高阳离子交换剂的结合能力，也可以在此时稀释样品。一般而言，平衡后的样品的视觉清晰度将是条件适用性的一个指标。出现浑浊或白色的丝状物或颗粒，表明pH值过低。
在将AAV颗粒加载到阳离子交换剂上的情况下，阳离子交换剂被重新平衡至pH值为约3.5±0.5，例如用含有甲酸、或乙酸、或甘氨酸、或这些物质的一些组合的缓冲液，浓度为20mM至50mM。该缓冲液可含有20mM至200mM NaCl，以防止被比AAV衣壳更弱阳性的污染物结合。重新平衡后，用盐梯度洗脱柱至1.0M NaCl或更高。洗脱后，用1.0M NaOH(任选地包括1-3M NaCl)和20mM至50mM EDTA清洗柱。
许多商业化的DNA酶可用于实践本发明的方法。实例包括核酸内切酶(Protean)、脱氧核糖核酸酶(Worthington)、Salton酶(Blirt)，San-HQ和M-San HQ(ArcticZymes)、全能核酸酶(“DENARASE”，C-Lecta)、Turbo核酸酶(Accelagen)，Kaneka核酸内切酶(Kaneka)、DNA酶(新英格兰生物实验室)，和Kryptonase(BIA分离)。这些酶中的每一种都有其独特的条件，以提供最有效的DNA消化。有些酶比其他酶更耐盐。有些在更低温下比其他有效。有些酶能够裂解RNA和DNA。如果需要，可以将RNA酶添加到缺乏这种能力的酶中。
正电性颗粒可以多种形式从多个供应商商购。基于颗粒的阴离子交换色谱介质提供了大多数候选介质，其中正电荷可能来自颗粒表面上的各种形式和组合的胺衍生物。这种形式和组合包括伯胺基团，单个残基和聚合物，例如聚烯丙胺和壳聚糖；仲胺基团，单个残基和聚合物；叔胺基团，单个残基和聚合物，例如DEAE和DEAE葡聚糖；季胺基团，单个残基和聚合物，例如Q，QA，和Q或QA葡聚糖，或消胆胺；含有伯、仲和叔胺基团的单独的配体和聚合物。包含此类组合的单个配体包括固定化的乙二胺，其包含伯胺基团和仲胺基团，以及三(2-氨基乙基)胺，其固定化形式包含伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团。混合氨基形式的聚合物包括聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺含有不同比例的伯胺，仲胺和叔胺，具体取决于聚合物内的支化程度。所述颗粒的物理基质可以是聚合物、二氧化硅基、金属氧化物基，或其组合。所述颗粒可以是任何尺寸，例如从0.1μm至200μm。所述颗粒可以是无孔的或具有范围为0.1nm-10μm的孔隙率。所述颗粒可以是球形的、椭球状的、非球状的、不规则的、丝状的、或具有混合特征。
所述的正电颗粒可以与其他具有其他化学反应性的颗粒混合。初步实验数据表明，在某些情况下(电负性颗粒本身)，电正性(乙二胺)颗粒与电负性(SO3)颗粒的组合去除了更多的蛋白质污染物。如上所述，电正性颗粒也可以是多模式的，其中特定种类的正电性颗粒能够与污染物相互作用，不仅是通过静电相互作用，还可能通过额外的反应性，如氢键、疏水性或金属亲和性。
正电性流通装置在市场上广泛销售。一种越来越流行的形式包括所谓的深度过滤器。其他潜在地包括简单的膜形式，也称为膜吸附单元。其他包括所谓的水凝胶、填充颗粒柱、填充纤维柱以及包含多种物理形式的带正电荷表面的装置。此类流通装置的表面化学可包括针对颗粒描述的任何表面化学。
实施例
实施例1
使用本发明的方法纯化AAV
以300mL含有AAV血清型8的细胞裂解液为起始，加入5mL带正电的颗粒。所述颗粒为非球面的聚甲基丙烯酸酯颗粒，尺寸范围为20μm至40μm，平均孔径为2μm，其表面带有乙二胺。固定在固相表面上的乙二胺由于每个残基都带有伯胺和仲胺而带正电。将制剂混合30分钟。通过在10,000×g下离心10分钟并通过0.45μm PES膜过滤除去颗粒。
使用截止分子量为300kDa的膜，通过切向流过滤将无颗粒上清液浓缩14倍。与浓度一致，将其缓冲液交换为50mM Tris，0.5M NaCl，5mM氯化镁，1％蔗糖，0.1％泊洛沙姆，pH8.0。
添加耐盐DNA酶至终浓度为50单位/mL，并将混合物在室温下孵育16小时。重新进行切向流过滤，仍然在具有相同原始膜的相同机械单元中加入20mM HEPES，30mM氯化钠，1％蔗糖，0.1％泊洛沙姆，pH 7.0。
通过逐渐加入2M乙酸将含AAV的光学透明上清液滴定至pH 5.25。将强阳离子交换剂(SO3)平衡至20mM MES，30mM氯化钠，1％蔗糖，0.1％泊洛沙姆，pH 5.25。将平衡后的样品加载到平衡后的柱上，然后用平衡缓冲液洗涤以清除未结合的污染物。
然后将阳离子交换柱重新平衡至50mM甲酸，30mM氯化钠，1％蔗糖，0.1％泊洛沙姆，pH 3.5。重新平衡后，用线性梯度增加的氯化钠洗脱色谱柱，然后用1M氢氧化钠，2M氯化钠清洗。色谱图如图2所示。通过SDS-PAGE评估AAV峰(图3)。
实施例2
使用本发明方法的一些步骤纯化AAV
通过第二个TFF步骤相同地处理实施例1中所述的相同材料的样品。然后通过逐渐加入2M甲酸将其滴定至pH为3.5。
将相同的阳离子交换剂平衡至50mM甲酸，0.2M氯化钠，1％蔗糖，0.1％泊洛沙姆，pH 3.5。加载样品，用平衡缓冲液洗涤柱，然后用与实施例1中所述相同的线性梯度配置洗脱。用1M NaOH，2M氯化钠清洗色谱柱。
图3比较了在两个实施例中分别实现的纯化程度。第一组的3个样品通道说明了来自实施例2的结果，其中阳离子交换步骤在pH为3.5下进行。第二组的3个样品通道说明了来自实施例1的结果，其中阳离子交换剂和样品最初平衡至pH为5.25，然后在该pH下加载样品并洗涤之后，将柱重新平衡至pH为3.5并在该pH下洗脱。结果表明，平衡的样品在pH为5.25下含有较少的污染物，使得阳离子交换剂能够获得更清洁的AAV组分。平衡至pH为3.5的样品含有较高的污染物负荷，阳离子交换产生了更不纯的组分。
实施例3
运行使用亲和色谱的实验对照，以证明将本发明的方法用于其他AAV捕获方法的潜在好处。用50mM磷酸盐，100mM NaCl，pH 7.2平衡AAV亲和柱。将样品平衡至相同的pH，过滤，然后加载到色谱柱上。用平衡缓冲液洗涤该柱，然后经过梯度洗脱至50mM甘氨酸，pH为3.0。洗脱后，用25mM氢氧化钠清洗色谱柱。
色谱图如图4所示。图2中的色谱图与图4中的色谱图的比较表明，亲和层析具有与阳离子交换层析类似的问题，即过量污染物结合的问题。
SDS-PAGE分析的结果如图5所示。图3中的PAGE凝胶与图5中的色谱图的比较表明，相比与未受益于本发明方法的亲和层析，具有阳离子交换层析的本发明的方法提供了更好的纯化。
通常认为亲和层析可提供所有层析中的最佳捕获纯化。本发明的方法能够使一般的纯化方法如阳离子交换层析获得明显更优越的纯化的能力，这一点凸显了本发明的方法提高纯化潜力的能力。它还指出，它将显著改善作为捕获方法的亲和色谱的纯化性能，并且在一些情况下，它将能够通过遵循如实施例2中所述的方法的初始步骤，利用阴离子交换色谱纯化来纯化至少研究级AAV。
实施例4
该方法对亲和层析初始捕获的适应性
执行本发明的步骤到第二个TFF步骤，但不执行随后的降低pH值和将样品施加到阳离子交换器的步骤。相反，将样品直接施加到亲和色谱柱上。然后就当做没有本发明的改善措施一样，洗涤和洗脱所述柱。
实施例5
该方法对阴离子交换层析初始捕获的适应性。
执行本发明的步骤到第二个TFF步骤，但不执行随后的降低pH值和将样品施加到阳离子交换器的步骤。相反，将样品稀释至足够低的电导率(盐浓度)，以使AAV与平衡至同样条件的阴离子交换剂结合。然后就当做没有本发明的改善措施一样，洗涤和洗脱所述柱。
实施例6
用带正电的流通装置的内表面代替带正电的颗粒。
可以通过用带正电的大表面代替带正电的颗粒来实践上述任何实施例。许多商业过滤介质中都有这样的表面，如深度过滤器。

Claims (10)

1.一种降低含有AAV衣壳和污染DNA的制剂中污染DNA含量的方法，包括以下步骤：
a)用在其表面带有正电荷的固相对DNA进行提取，在pH值为7.0±1.0和10mM至200mM的盐浓度下，将所述固相与制剂接触，得到第一组分，
b)通过第一切向流过滤对所述第一组分进行渗滤以获得第二组分，
c)用DNA酶处理第二组分，
d)通过第二切向流过滤，将步骤c)获得的经DNA酶处理的第二组分进行渗滤至pH值为7.0±1.0且盐浓度为10mM至20mM的缓冲液中，以得到第三组分，并且任选地
e)在进行补充层析之前，通过切向流过滤浓缩第三组分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相为松散的散装颗粒或流通装置的形式。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述切向流过滤用选自下组的膜进行：中空纤维膜，包括单根中空纤维膜或成束的膜；或平膜，包括单层膜或者堆叠或卷成圆柱体的膜。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一过滤在缓冲液中进行，所述缓冲液被配制为促进DNA被DNA酶消化。
5.如权利要求3或4中任一项所述的方法，其特征在于，所述切向流过滤膜具有孔隙率，所述的孔隙率的截留分子量范围为10kDa至300kDa、或30kDa至300kDa、或60kDa至300kDa、或100kDa至300kDa、或200kDa至300kDa、或250kDa至300kDa，优选地，所述截留分子量为100kDa或以上。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述含有AAV衣壳和污染DNA的制剂含有选自下组的AAV颗粒：AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或其他血清型，包括具有一种以上血清型特征的重组血清型。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)或步骤e)之后，采用以下纯化步骤中的至少一个：
(i)阳离子交换层析步骤或，
(ii)亲和层析步骤或，
(iii)阴离子交换层析步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在纯化步骤(i)中，将步骤d)或e)的组分上样至pH值为4至6，特别是pH值约为5的阳离子交换层析材料上，然后：
-将阳离子交换层析材料重新平衡至pH值约为3.5±0.5，
-用盐梯度进行洗脱，和
-然后进行阴离子交换层析处理。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在纯化步骤(ii)中，将步骤d)或e)的组分上样至亲和层析材料上，并且在洗脱后进行阴离子交换层析处理。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在纯化步骤(iii)中，对步骤d)或e)的组分进行阴离子交换层析。
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