JP2023529187A - 混入ｄｎａをより効果的に除去するための、アデノ随伴ウイルスの精製の強化 - Google Patents

Abstract

以下のステップを含む、ＡＡＶカプシド及び混入ＤＮＡを含む調製物の混入ＤＮＡ含量を低減する方法：（ａ）表面の正電荷を担持する固相を用いてＤＮＡの抽出を行って、第１の画分を得ることであって、ここで、固相は、ｐＨ７．０±１．０、塩濃度１０ｍＭ～２００ｍＭで調製物と接触しており；（ｂ）第１の画分を、第１のタンジェンシャルフローフィルトレーションによりダイアフィルトレーションし、第２の画分を得ること；（ｃ）第２の画分をＤＮＡｓｅで処理すること；（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた、ＤＮＡｓｅ処理された第２の画分を第２のタンジェンシャルフローによりダイアフィルトレーションすること；（ｅ）緩衝液に対してｐＨ７．０±１．０、塩濃度１０ｍＭ～２０ｍＭでフィルトレーションして第３の画分を得ること；及び任意選択として、（ｇ）補足的なクロマトグラフィの前に、第３の画分をタンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮すること。【選択図】なし。

Description

本発明は、ＡＡＶカプシド及び混入ＤＮＡ（contaminating DNA）を含む調製物の混入ＤＮＡ含量を低減するための方法を開示する。

アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus）（ＡＡＶ）は、ヒトの遺伝子治療の分野において、治療用ＤＮＡの送達ビヒクルとして広く用いられている。このウイルスは、最も一般的には哺乳類又は昆虫の宿主細胞を用いて、細胞培養法により製造される。細胞培養は、所望の治療用ＤＮＡプラスミドがＡＡＶカプシドの内部に存在するように操作される。細胞培養物を採取し、ＤＮＡ含有ＡＡＶカプシドを、アフィニティークロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、及び疎水性相互作用クロマトグラフィ等の標準的なクロマトグラフィ法により精製する。

ヒトに投与可能な治療薬の場合と同様に、安全性を確保するためには、混入ＤＮＡを非常に低いレベルにまで減らす必要がある。これは予想以上に困難なことであることが分かっている。最近開発された分析技術によれば、この困難さは、ＡＡＶカプシドの外側に結合している残留ＤＮＡに起因している可能性がある。ＡＡＶカプシドは陽イオン交換体に強く結合することが知られているので、これはおそらく当然といえば当然である。陽イオン交換体への強い結合は、ＡＡＶカプシドの外装が強い正電荷を帯びていることを示す。ＤＮＡは電気陰性であり、正に帯電した表面と強く結合する。どのようなメカニズムであれ、これらの知見はＤＮＡを除去することの難しさを浮き彫りにしている。

現在、ＡＡＶハーベストには、単にＤＮａｓｅ酵素を添加することが業界の常識となっている。この方法によるＤＮＡ低減は残念ながらわずかであり、混入ＤＮＡを非常に低いレベルまで低減させるという課題を解決することはできない。これは、ハーベストのろ過性（filterability）を絶望的から可能なものへと改善するという副次的な利点があるが、フィルターの目詰まりは未だに日常的な問題であり、過剰なろ過媒体（filtration media）を必要とし、ＡＡＶカプシドの損失を引き起こしている。また、タンジェンシャルフローフィルトレーション（tangential flow filtration）のような処理方法では、ハーベストをかなりの程度まで濃縮することができない。濃縮倍率は２倍まで可能な場合があるが、それ以上はほとんど可能ではない。

国際公開公報ＷＯ０２／１２４５５ Ａ１には、感染性アデノウイルスの非存在下で産生された組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの大規模精製のための方法が開示されている。好ましくは、ｒＡＡＶは、宿主細胞株において、アクセサリ機能ベクター、ＡＡＶベクター、及びＡＡＶヘルパーベクターとのトリプルトランスフェクションを介して産生される。この方法は、宿主細胞株からライセートを調製し、そのライセートをイオン交換クロマトグラフィ媒体及び／又はアフィニティークロマトグラフィ媒体の様々な組み合わせにかけることを含む。アフィニティークロマトグラフィ媒体は、ＡＡＶ受容体又はＡＡＶに対する結合親和性を有する抗体、例えば、ヘパリン硫酸である。様々な陽イオン交換及び陰イオン交換媒体が企図される。特定の実施形態では、ライセートを1つ以上のフィルターでろ過する、又はライセートをヌクレアーゼで処理する等、任意の精製工程が含まれてもよい。

国際公開公報ＷＯ２０１０／１４８１４３ Ａ１には、遺伝子導入に、特に遺伝子治療又はワクチン接種に使用できる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの精製方法が開示されている。組換えＡＡＶベクターは、細胞核酸、細胞タンパク質、ヘルパーウイルス、及び培地成分等の生産成分を含む、プロセス内不純物（in-process impurities）を実質的に含まない。

国際公開公報ＷＯ０３／０９７７９７ Ａ２には、ウイルス粒子、特に再組み換えアデノウイルスベクター粒子を精製するためのプロセスが開示されている。このプロセスは、細胞溶解、ウイルスから離れた宿主細胞の汚染物質の洗剤ベースの沈殿、深層ろ過又は遠心分離、限外ろ過、ヌクレアーゼ消化及びクロマトグラフィの様々な組み合わせに依存して、強固かつ経済的に高純度製品を製造している。このプロセスにより、混入ＤＮＡのレベルは一貫して検出不可能なレベル以下となる。

国際公開公報ＷＯ２０１９／００６３９０ Ａ１には、少なくとも２つのカラムクロマトグラフィステップを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の精製、生成及び製造方法が開示されている。カラムクロマトグラフィステップは、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography）、及び／又はＡＡＶアフィニティークロマトグラフィを単独で又は組み合わせで、任意の順序で含む。

本明細書で引用された全ての文献は、本明細書において提示された教示と矛盾しない範囲で、参照により組み込まれる。

ＡＡＶの精製、特にＤＮＡ混入の低減について、驚くほど強化された新規の方法を開発した。細胞培養のハーベスト又はライセートを、正に帯電した表面（単数又は複数）にさらして、ＡＡＶ粒子と結合していないＤＮＡと結合させる。正に帯電した表面（単数又は複数）で処理することにより、ＤＮＡの初期低減が達成され、１０～２０以上の濃縮因子を可能とする程度までタンジェンシャルフローフィルトレーション（tangential flow filtration）（ＴＦＦ）が促進される。細胞ハーベスト又はライセートのＤＮａｓｅ処理ではこのようなろ過性の向上は望めないことを考えると、正に帯電した表面による固相抽出が可能であることは驚くべきことである。

本発明の方法によれば、ＡＡＶカプシド及び混入ＤＮＡを含む調製物（preparation）における混入ＤＮＡ含量が低減され、当該方法は以下のステップを含む：
（ａ）表面に正電荷を担持する固相を用いてＤＮＡの抽出を行って、第１の画分を得ることであって、ここで、上記固相は、ｐＨ７．０±１．０、塩濃度１０ｍＭ～２００ｍＭで調製物と接触させられ；
（ｂ）上記第１の画分を、第１のタンジェンシャルフローフィルトレーション（tangential flow filtration）によりダイアフィルトレーションして（diafiltering）第２の画分を得ること；
（ｃ）上記第２の画分をＤＮＡｓｅで処理すること；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた、ＤＮＡｓｅ処理された第２の画分を、ｐＨ７．０±１．０及び塩濃度１０ｍＭ～２０ｍＭを有する緩衝液に、第２のタンジェンシャルフローフィルトレーションによりダイアフィルトレーションして第３の画分を得ること；及び
任意に（optionally）、
（ｅ）補足的なクロマトグラフィの前に、第３の画分をタンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮すること。

本発明の方法の一実施形態において、固相は、ばらの嵩高粒子（loose bulk particles）又はフロースルーデバイス（flow-through device）の形態であり得る。

本発明の方法の別の実施形態において、タンジェンシャルフローフィルトレーションは、単一中空糸の膜若しくは束状の膜などの中空糸膜（hollow-fiber membranes）、又は、単一の膜若しくは積層した若しくは筒状に巻いた膜などの平坦膜からなる群から選択される膜を用いて行われてよい。

本発明の方法のさらに別の実施形態において、第１のフィルトレーションは、ＤＮａｓｅによるＤＮＡ消化を促進するよう調合された緩衝液中で行われ得る。

本発明の方法のさらに別の実施形態において、タンジェンシャルフローフィルトレーション膜の多孔率は、１０ｋＤａ～３００ｋＤａ、３０ｋＤａ～３００ｋＤａ、６０ｋＤａ～３００ｋＤａ、１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、２００ｋＤａ～３００ｋＤａ、又は２５０ｋＤａ～３００ｋＤａの範囲であり、好ましくは分画分子量で１００ｋＤａ以上の分画分子量（molecular weight cutoff）を有し得る。

本発明の方法の更なる実施形態において、ＡＡＶカプシド及び混入ＤＮＡを含む調製物は、ＡＡＶセロタイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は、２つ以上のセロタイプの特徴を有する組み換えセロタイプなど、他のセロタイプからなる群から選択されるＡＡＶ粒子を含んでいてよい。

本発明の方法のさらに別の実施形態において、ステップ（ｄ）又はステップ（ｅ）の後に得られ得る分画は、以下のオプション（ｉ）から（ｉｉｉ）に沿ってさらに進められ得る：
オプション（ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィ、
オプション（ｉｉ）アフィニティークロマトグラフィ、又は、
オプション（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィ。

本発明の方法の第２の態様のさらに別の実施形態において、精製ステップ（ｉ）において、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の画分は、ｐＨ４～６（特に約ｐＨ５）で、陽イオン交換クロマトグラフィ材料上にロードされた後に、
陽イオン交換クロマトグラフィ材料を約ｐＨ３．５±０．５へ再平衡化すること、
塩勾配を用いた溶出を行うこと、及び
その後、陰イオン交換クロマトグラフィ処理を行うこと、
が行われる。このプロセスにより、例えば、臨床品質のＡＡＶが得られる。

本発明の方法の別の実施形態において、精製ステップ（ｉｉ）において、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の画分は、アフィニティークロマトグラフィ材料上にロードされ、溶出後に、陰イオン交換クロマトグラフィ処理が行われる。このプロセスにより、例えば、精製ＡＡＶが得られる。

本発明の方法のさらに別の実施形態において、精製ステップ（ｉｉｉ）において、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の画分は、陰イオン交換クロマトグラフィカラムに供される。このプロセスにより、例えば、研究用グレードのＡＡＶが得られる。

図１は、本発明の方法の概要を示す図である。 図２は、本発明の方法の適用を示す陽イオン交換クロマトグラフィを示す図である。 図３は、標準条件と本発明の方法の条件とを比較した分析用還元型ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す図である。 図４は、細胞ライセートからのＡＡＶのアフィニティークロマトグラフィによる捕捉を示す図である。 図５は、図４に示したアフィニティクロマトグラムから示される画分の分析用還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。

本発明の態様を、精製対象物（entity to be purified）としてＡＡＶを使用する例によって、より詳細に説明する。同様に、本発明の開示を読み、理解した当業者によって容易に認識される類似の方法で、他の物体（entities）を精製してもよい。

正に帯電した固相材料の代わりに、正に帯電した可溶性ポリマーを添加することによって、プロセス溶液からＤＮＡを代替的に除去し得るということは、当業者であれば認識するであろう。これは臨床上の安全性の観点から非常に不安定であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける精製カプシドの生物学的挙動を変え、結果の誤解を招き、ＡＡＶを代表するものではなく、正に帯電したポリマーによって引き起こされる結果を引き起こす可能性がある。また、ＤＮａｓｅ酵素による溶解から一部のＤＮＡを保護する効果もあるかもしれない。ＤＮＡはＡＡＶカプシドの外面に積極的に結合することが知られている。正に帯電したポリマーがこのようなＡＡＶカプシドを含む調製物に加えられた場合、正に帯電したポリマーは、カプシド外面に結合したＤＮＡ（capsid-exterior-associated DNA）上に被膜を作り得る。ＤＮＡと正に帯電したタンパク質との間の強い結合は、ＤＮａｓｅ酵素に干渉することが知られている。正に荷電したポリマーは、より大きくそれを行う可能性がある。精製後に正電荷ポリマーがＡＡＶカプシドと結合したままであれば、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料中に溶出するか、又は、実験動物若しくはヒトなどの生きた対象中に徐々に放出され得る。正電荷ポリマーはすべて化学的刺激物であり、炎症を引き起こす。精製ＡＡＶカプシドは、最終的にはすでに病気の人に投与されることを考慮すると、既知の炎症性物質を不用意に投与することは、不必要かつ潜在的に重大なリスクとなる。本発明は、プロセス後にＡＡＶカプシド調製物から完全に除去可能である固相材料を用いてＤＮＡを抽出する方法を提供するため、本技術革新の発明的性質を強調するものである。

濃縮ＴＦＦステップ用の緩衝液は、後続のプロセスステップにおける選択されたＤＮａｓｅ酵素によるＤＮＡ消化を促進するように調合されている。選択されたＤＮａｓｅ酵素を添加し、適切な時間インキュベートするが、日常的に実施されるＤＮＡ溶解とは２つの顕著な違いがある：（１）ＴＦＦ濃縮が可能であることにより、より少ない体積なのでより少量の酵素で済む；（２）インヒビタの除去、及び選択したＤＮａｓｅ酵素に最適な溶解条件に緩衝液交換することで、生の細胞ハーベスト又はライセートに単に添加する標準的な方法よりもはるかに効果的な低減を達成し得る。

ＴＦＦ膜の多孔率（porosity）は、カプシドを保持したまま可能な限り大きくすることが有効である。多孔率は製造者及び膜素材によって多少異なるが、一般的には、分画分子量（molecular weight cutoff）が２５０ｋＤａ～３００ｋＤａである膜が理想的である。ＭＷＣＯ値が低いと、混入物の除去効果は低くなるが、それでも処理した調製物の混入物含量は実質的に低減される。全体として、ＴＦＦ膜は、１０ｋＤａ～３００ｋＤａ、３０ｋＤａ～３００ｋＤａ、６０ｋＤａ～３００ｋＤａ、１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、２００ｋＤａ～３００ｋＤａ、又は２５０ｋＤａ～３００ｋＤａのＭＷＣＯ値で使用され得るが、１００ｋＤａより大きいことが好ましい。

ＴＦＦ膜は、研究開発（Ｒ＆Ｄ）、スケールアップ、及び製造の様々なニーズに対応するため、様々な物理的形状及びサイズで市販されている。ＴＦＦ膜には、単一又は積層状若しくはロール状の平坦膜；及び、単一又は束状の中空糸がある。

タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）の技術は、一般的に、本発明の方法におけるように、３つの原理モードのいずれか1つ又は任意の組み合わせで実行される。それらのモードのうちの１つ目は濃縮であり、その目的は、後続の処理操作をより効率的にするために余分な流体を除去することである。第２のモードは、ダイアフィルトレーション（diafiltration）である。ダイアフィルトレーション中、元の液体、塩類、糖類、及び緩衝液成分はろ過され、それらの成分を含まない新しい流体が導入される。これは、試料が存在する流体を「緩衝液交換（buffer exchanging）」し、その後の処理に備えるという効果がある。ダイアフィルトレーションという用語は、透析（dialysis）とろ過（filtration）という２つの単語の組み合わせである。第３のモードは、サイズに基づく精製（size-based purification）である。濃縮及びダイアフィルトレーションは、分画分子量が１０ｋＤａ以下の膜などの、目的物質を保持する任意の多孔率を有するタンジェンシャルフローフィルトレーション膜を使用して行うことができる。精製ツールとしてＴＦＦを使用することで、大孔径膜を使用して、特に、目的物質よりも小さい生体分子混入物を除去することを可能とする拡張を意味する。多孔率は目的物質を保持するのに十分小さくなければならないことを考えると、この条件を満たす最大の孔を有する膜は、最も広いサイズ範囲の混入生体分子を除去できるという利点がある。本願の場合、ＡＡＶカプシドは生物学的産物の規模からするとかなり大きいので、分画分子量が最大３００ｋＤａまでなどの、非常に大きな孔の膜を使えば、大部分のタンパク質及びその他の生体分子を除去することができる。混入生体分子が小さければ小さいほど、より効果的に除去することができる。このため、ＤＮＡ溶解後のＤＮａｓｅ酵素の除去、及びそれまで結合していたＤＮＡの溶解により宿主細胞ＤＮＡから遊離したヒストンタンパク質の除去に特に適している。

多くのＤＮａｓｅ酵素が市販されているが、最良の結果を得るためには、それぞれ独自の条件を必要とする。予備的な実験データによると、いわゆる塩耐性ＤＮａｓｅ酵素は優れた結果をもたらす可能性がある。ＤＮａｓｅ酵素の中にはＲＮＡも溶解するものもあり、ＲＮＡが大きなＤＮＡヘテロ凝集体を安定化させる程度には有用であると思われる。ＤＮａｓｅ酵素がこの能力を欠いている場合、ＲＮａｓｅ酵素をＤＮａｓｅ酵素に加えてもよい。しかし、溶解調合物（lysis formulation）がＲＮＡを消化する能力を有することは、本発明の方法を実施するために必須ではない。

溶解後、試料を再度ＴＦＦで処理して、溶解酵素を除去し、ＤＮＡフラグメントを除去し、宿主ＤＮＡの溶解により遊離した宿主ヒストンタンパク質を除去する。

特に予想外だった実験結果は、溶解条件を完全に最適化した場合であっても、ＤＮＡの溶解だけでは問題を完全に解決するのには十分ではないことである。実験データからは、残留ヒストンがクロマトグラフィ法に干渉して、ＤＮＡなどの混入物を除去する能力を低下させることが示唆されている。クロマトグラフィに先立ってヒストンを除去することで、全てのクラスの混入物の除去が強化され、混入ＤＮＡの除去もさらに強化される。

第２のＴＦＦステップでは、ｐＨ６．５～７．５及び塩化ナトリウム濃度２５～２００ｍＭなどの、ほぼ生理学的な条件を示す緩衝液を使用する。ほぼ生理学的な条件を維持することは、本発明の方法によって得られる強化に寄与する貴重な要素であると考えられる。

ＴＦＦによる試料調製には、多くの場合、以下のクロマトグラフィ法の結合条件に近い緩衝液を用いる。アフィニティークロマトグラフィによるＡＡＶの捕捉には、ほぼ生理学的な条件が適しているが、本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィに頼らずに陽イオン交換クロマトグラフィ又は陰イオン交換クロマトグラフィによる捕捉などの代替法が高純度のＡＡＶを生成できる程度に、全体の混入物量（overall contaminant load）を低減する。市販のアフィニティークロマトグラフィ用媒体は低流量であるため処理時間が長く、かつ１．０Ｍ ＮａＯＨでの洗浄に耐えられないことを考えると、これは重要なポイントである。イオン交換体による捕捉は、高流量、高結合能、１．０Ｍ ＮａＯＨによる長時間の洗浄消毒に対応するクロマトグラフィ媒体を使用することを可能とする。

一実施形態において、上述の方法ステップは、アフィニティクロマトグラフィカラムへロードするための試料の調製に使用される。

別の実施形態において、上述の方法ステップは、アニオン交換体などの正電荷クロマトグラフィカラムにロードするための試料の調製に使用される。この場合、試料は、カラムに対するＡＡＶの高性能結合を確実にするために導電率が十分に低くなるように、第２のＴＦＦステップの後に希釈される。また、空及び完全なカプシドをより良く区別しやすくするために、試料のｐＨをより高い値に調整してもよい。マグネシウム塩及び／又はカルシウム塩を添加して、空－完全分離の選択性を改変し得る。この方法は、研究用グレードの完全カプシドの生成に適し得る。

別の実施形態において、上述の方法ステップは、陽イオン交換体にロードするための試料の調製に使用される。陽イオン交換体に結合させるための試料を調製するための通常の準備は、試料のｐＨをｐＨ３．５に下がるまで滴定することを含む。これにより、カプシドタンパク質表面のアミノ酸残基の滴定状態が変化し、カプシド表面が純水に電気陽性（net electropositive）になる。その表面の正電荷によって、陽イオン交換体の負に帯電した表面に結合するようになる。しかし、これには不利な効果もある。カプシド表面を電気陽性にすると、ＤＮＡの強い結合が引き起こされ、もしＤＮＡがすでにカプシド外面に結合している場合には、低いｐＨによりその結合が安定化されてしまう。いずれにせよ、結合ｐＨが低いと、カプシド外面へのＤＮＡ結合が促進されることとなる。

この論点のもう一つの態様は、さらに問題を大きくしている。ＤＮＡがカプシド外面に結合している場合、システム内の過剰なヒストンタンパク質は、そのカプシド外面と結合したＤＮＡ（capsid exterior-associated DNA）と非常に高い確率で結合する。このことは、ＤＮＡフラグメントだけでなくヒストンタンパク質も除去するという、第２のＴＦＦステップの価値を際立たせている。この文脈では、ｐＨ３．５などの極端に低いｐＨは、ヒストンタンパク質だけでなく、転写因子及びユビキチンなどの他のＤＮＡ結合タンパク質上の正電荷も増幅することを強調することが重要である。

本発明の方法は、これらの可能性に対処するための別の特徴を含んでおり、それはまた驚くべき効果をもたらすものである。試料をｐＨ３．５に平衡化する代わりに、陽イオン交換体に結合させるための準備において試料をｐＨ５．０±０．２５の、より穏やかなｐＨに平衡化する。陽イオン交換体も同じ条件で平衡化し、試料を結合させる。試料の結合後、カラムをｐＨ３．５に再平衡化し、増加していく塩勾配でＡＡＶを溶出させる。実験データによると、このアプローチは、陽イオン交換体から溶出するＡＡＶ画分の混入を実質的に低減させることが示されている。このアプローチは、特に、ＤＮＡ結合タンパク質のサイズ範囲にある小さな混入物を除去する。このことは、本発明の方法のそれ以前のステップの後、試料中に未だ残っているヒストン及び他のＤＮＡ結合タンパク質が、試料がカラムに付与された際に陽イオン交換体に結合し、ＡＡＶが溶出される間、そこに結合したままであることを示唆し得る。これは、ヒストンタンパク質は、ＮａＣｌ中の陽イオン交換体から溶出しない代わりに、溶出のためにはグアニジン又はＮａＯＨを必要とする、という既知の挙動と一致する。どのようなメカニズムであれ、溶出されたＡＡＶの品質を実質的に向上させるものである。

最初の陽イオン交換クロマトグラフィステップの後、ＡＡＶを、陰イオン交換体などの正電荷クロマトグラフィ装置に付与してＤＮＡをさらに抽出し、空のカプシドと完全カプシド（所望の治療用ＤＮＡプラスミドを含むカプシドを指す）とを分離させる。ＡＡＶカプシドを、最初のアフィニティークロマトグラフィステップの後、同様に処理してもよい。

陽イオン交換クロマトグラフィ媒体は、様々なリガンド及び様々な物理的形態で、広く市販されている。陽イオン交換体の主な区別特徴は、負に帯電していることである。十分に正電荷を有する生物種は陽イオン交換体に結合し、その後、最も一般的には塩の濃度を上げることにより、溶出させることが可能である。しかし、全ての陽イオン交換体はマルチモーダルであり、静電相互作用は生体分子との結合に寄与する化学的メカニズムの1つでしかないことを意味する。最も一般的な陽イオン交換リガンドは、カルボキシメチル、カルボキシエチル、及びカルボキシプロピル等のカボキシアルカン基、並びに、スルホメチル、スルホエチル、及びスルホプロピル等のスルホアルカン基の２つである。カルボキシアルカン陽イオン交換基は、２つの自由な孤立電子対を有するカルボニル酸素原子と、３つの自由な孤立電子対を有するカルボキシル酸素原子を含んでいる。これらの孤立電子対は水素受容体であり、これらのリガンドに水素結合を形成する可能性を与えている。スルホアルカン陽イオン交換基は３つの酸素原子を含み、そのうちの２つは電荷を有しないが、自由電子の孤立対を２つの有する。３つ目は負電荷を帯びており、リガンドを水素供与体として、水素結合に寄与する能力を与える、孤立電子類を３つ有する。陽イオン交換体には、アルカン－ホスファチジン酸残基が用いられる場合がある。ｐＨに応じて、上記残基は、それぞれ孤立電子対を３つ有する負電荷の酸素原子２つと、孤立電子対を２つ有する非電荷の酸素原子１つと、を有するか、又は、孤立電子対を３つ有る負電荷の酸素原子１つと、それぞれ孤立電子対を２つ有する非電荷の酸素原子を２つと、を有する。また、ホスファチジン酸系陽イオン交換体は、金属の配位結合に寄与する能力を有する。ジ－カルボキシ、トリ－カルボキシ、及びポリカルボキシ陽イオン交換リガンドもまた、金属を結合する能力を有する。また、上記のリガンドは全て、関連するアルカンが１、２、３、又はそれ以上の炭素残基を含むかどうかに応じて、様々なレベルの疎水性を有する。また、いくつかの陽イオン交換リガンドは疎水性環（hydrophobic rings）も含む。したがって、本発明の目的のために、陽イオン交換体は、具現化され得る他のいかなる化学反応性とは関係なく、負電荷を有するクロマトグラフィ固相として定義される。陽イオン交換体は、世界中の複数のサプライヤーから商業的に入手可能である。

陰イオン交換クロマトグラフィ媒体にも同じ一般的論理が適用される。本発明の目的のために、陰イオン交換クロマトグラフィ媒体は、具現化され得る追加の化学反応性とは関係なく、正電荷を有するクロマトグラフィ固相として定義される。弱い陰イオン交換体の帯電した窒素原子は、自由な孤立電子対を１つ有し、水素受容体となる。窒素原子に直接結合している水素原子は、水素供与体として作用し得る。強い陰イオン交換体の帯電した窒素原子は、自由な孤立電子対を有しない。強い陰イオン交換体上及び最も弱い陰イオン交換体上の窒素原子と結合しているアルカン基は、疎水性をもたらす。また、他の疎水性構造を有するものもある。いくつかの陰イオン交換体は、化学的に反応性の特性の他の組み合わせをもたらす、ポリマーベースのリガンドを利用している。全ての陰イオン交換体はマルチモーダルである。陰イオン交換体は、世界中の複数のサプライヤーから商業的に入手可能である。

アフィニティークロマトグラフィ用のリガンドは、ペプチド及びタンパク質から成り、抗体又は抗体の部分構造、例えばＦ（ａｂ）’_２領域若しくはＦａｂ領域、単鎖軽鎖誘導体（ｓｃＦＶ）、若しくは抗体の特異性を模倣する組み換え体構造であることが多い。イオン交換体と同様に、多くの市販品バリエーションが世界中のサプライヤーから入手可能である。

固相ＤＮＡ抽出のプロセスは、ＡＡＶを含む細胞培養ハーベスト又はライセートを、おおよそ生理学的な条件下で正に帯電した表面（単数又は複数）と接触させたときに開始される。試料は、約１分～４時間の間、正に帯電した表面（単数又は複数）と接触させられる。

正に帯電した表面（単数又は複数）が粒子の形態である一実施形態において、試料に対する粒子の体積比率は、０．１％～１０％、１％～５％、２％～５％、又は、それよりも高いか、低いか、若しくは中間の比率であってよい。

正に帯電した表面（単数又は複数）が粒子の形態である一実施形態において、接触時間は、１０分～２４０分、又は２０分～１２０分、又は３０分～６０分、又は、それよりも長いか、短いか、若しくは中間の時間量であってよい。

正に帯電した表面（単数又は複数）がフロースルーデバイス（flow-through device）の形態である１以上の実施形態において、接触時間は、１分～６０分、又は２分～３０分、又は５分～１５分、又は、それよりも長いか、短いか、若しくは中間の時間量であってよい。

場合によっては、正に帯電した粒子を、他の化学的性質を有する粒子と混合してもよい。実験データによると、正電荷粒子と負電荷粒子との混合物は、正電荷粒子単独よりも多くの混入物を除去することが示されている。

ＤＮａｓｅ処理は、１５分～２４時間、又は３０分～１６時間、又は１時間～８時間、又は、それよりも長いか、短いか、若しくは中間の時間量で行ってよい。ＤＮＡの溶解程度を可能な限り高くすることが特に目的であるため、１６時間～２４時間などの長い間隔が好ましい場合がある。

ＤＮａｓｅ処理は、ＤＮａｓｅ処理用の緩衝液の濃縮及び平衡化に使用したのと同じＴＦＦユニット内で行うことが好ましい。膜間圧力（transmembrane pressure）をゼロに設定し、ＤＮａｓｅ添加後に試料をシステム内で再循環させて、十分に混合する。消化プロセス完了後、ＴＦＦ緩衝液を、ｐＨ約５、塩濃度２０ｍＭ～１００ｍＭの緩衝液に変更する。膜間圧力を正の値に設定し、ＴＦＦを再開する。酵素の大部分は、ＤＮＡフラグメント及び最も特にはヒストンタンパク質とともに排除される。

ｐＨ約５という用語は、４．０～６．０、又は４．５～５．５、又は４．７５～５．２５の範囲内のｐＨ値を意味すると理解される。ｐＨ値が低いほど、試料中に存在し得る塩の濃度が高くなるが、それでもＡＡＶを陽イオン交換体によって捕捉することが可能であるということが、当業者には理解されるであろう。陽イオン交換体の結合能力を高める目的で、この時点で試料を希釈してもよい。一般的に、平衡化された試料の視覚的な透明度（visual clarity）は、条件の適合性の指標となり得る。濁り又は白っぽいフィラメント若しくは粒子の出現は、ｐＨが過度に低くなっていることを示すものである。

ＡＡＶ粒子が陽イオン交換体にロードされた状態で、陽イオン交換体は、例えば、２０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の、ギ酸、又は酢酸、又はグリシン、又はそれらの種のいくつかの組み合わせを含む緩衝液を用いて、ｐＨ約３．５±０．５に再平衡化される。この緩衝液は、ＡＡＶカプシドよりも弱陽性である混入物による結合を防ぐために、２０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌを含んでいてもよい。再平衡化後、カラムは１．０Ｍ以上のＮａＣｌの塩勾配で溶出される。溶出後、カラムは１．０Ｍ ＮａＯＨ、任意で（optionally）１～３Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ～５０ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄する。

本発明の方法を実施するためのＤＮａｓｅ酵素には、多くの市販の選択肢がある。例としては、エンドヌクレアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｎ）、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｓａｌｔｏｎａｓｅ（Ｂｌｉｒｔ）、Ｓａｎ－ＨＱ及びＭ－Ｓａｎ ＨＱ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ）、Ｄｅｎａｒａｓｅ（Ｃ－Ｌｅｃｔａ）、ＴｕｒｂｏＮｕｃｌｅａｓｅ（Ａｃｃｅｌａｇｅｎ）、カネカエンドヌクレアーゼ（カネカ）、ＤＮａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びクリプトナーゼ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が挙げられる。これらのエンザイムはそれぞれ、ＤＮＡを最も効率的に消化するための特徴的な条件を有している。いくつかは塩分に対して他のものより耐性がある。いくつかは、他のものよりも低温で効果的である。いくつかは、ＤＮＡだけではなく、ＲＮＡも溶解可能である。このような能力を持たないものに、必要に応じてＲＮａｓｅ酵素を追加することができる。

陽性電荷粒子は、多くのサプライヤーから多くの形態で市販的に入手可能である。粒子ベースの陰イオン交換クロマトグラフィ媒体は候補の大部分であり、正電荷が粒子表面上のアミン誘導体の様々な形態及び組み合わせに由来し得る。そのような形態及び組み合わせには、ポリアリルアミン及びキトサンなどの、１級アミン基、個々の残基及びポリマー；２級アミン基、個々の残基及びポリマー；ＤＥＡＥ及びＤＥＡＥデキストランなどの、３級アミン基、個々の残基及びポリマー；Ｑ、ＱＡ及びＱ若しくはＱＡデキストラン、又はコレスチラミンなどの、４級アミン基、個々の残基及びポリマー；１級、２級及び３級アミン基を含む、個々のリガンド及びポリマーが挙げられる。そのような組み合わせを含む個々のリガンドには、1級及び２級アミン基を含む固定化エチレンジアミン、並びに固定化形態が１級、２級、及び３級アミン基を含むトリス（２－アミノエチル）アミンが挙げられる。混合アミノ形態のポリマーには、ポリエチレンイミンが上げられ、これは、ポリマー内の分岐程度に応じて、１級、２級及び３級アミンの割合が異なっている。粒子の物理的マトリックスは、ポリマー系、シリカ系、金属酸化物系、又はその複合体であり得る。粒子は、０．１μｍ～２００μｍの範囲などの、任意のサイズであり得る。粒子は、非多孔質であっても、０．１ｎｍ～１０μｍの範囲の多孔質であってもよい。粒子は、球状、スフェロイド状、非球状、不規則状、フィラメント状、又はそれらの混合物状であってもよい。

電気陽性粒子は、他の化学反応性を有する他の粒子とブレンドしてもよい。予備的な実験データによれば、電気陽性（エチレンジアミン）粒子と電気陰性（ＳＯ３）粒子との組み合わせでは、電気陰性粒子単独よりも多くのタンパク質混入物が除去される場合がある。電気陽性粒子は、上述のようにマルチモーダルであってもよく、電気陽性粒子の所定の種は、静電相互作用を介してだけではなく、水素結合、疎水性、又は金属親和性などの追加の反応性を介して、混入物と相互作用可能である。

電気陽性フロースルーデバイスも広く市販で入手可能である。いわゆるデプスフィルター（depth filter）などの形式がますます普及している。その他に、膜吸着ユニットとして知られている、単純な膜形式も含まれ得る。その他、いわゆるハイドロゲル、充填粒子のカラム、充填繊維のカラム、及び複数の物理的形態で正に帯電した表面を含むデバイスが挙げられる。このようなフロースルーデバイスの表面化学は、粒子について説明した表面化学のいずれかを含んでもよい。

＜実施例１：本発明の方法を用いたＡＡＶの精製＞
最初に、ＡＡＶセロタイプ８を含む細胞ライセート３００ｍＬに、５ｍＬの正電荷粒子を添加した。この粒子は、表面にエチレンジアミンが固定化された、サイズ範囲が２０μｍ～４０μｍであり、平均孔径が２μｍの非球面ポリメタクリレート粒子であった。固相表面に固定化されたエチレンジアミンは、各残基が１級アミン及び２級アミンを有することにより、正に帯電している。この調製物を３０分間攪拌した。１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、０．４５μｍＰＥＳ膜でろ過することにより、粒子を除去した。

粒子を含まない上清を、分画分子量３００ｋＤａの膜を用いたタンジェンシャルフローろ過により、１４倍に濃縮した。濃縮と同時に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１％ スクロース、０．１％ ポロキサマー（poloxamer）、ｐＨ８．０に緩衝液交換を行った。

耐塩性ＤＮａｓｅを最終濃度が１ｍＬ当たり５０単位となるように添加して、混合物を室温で１６時間インキュベートした。タンジェンシャルフローろ過を再開して、同じ機械ユニットで、同じ元の膜を用いて、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％ スクロース、０．１％ ポロキサマー、ｐＨ７．０にした。

光学的に透明なＡＡＶ含有上清を、２Ｍ 酢酸を徐々に加えてｐＨ５．２５に滴定した。強陽イオン交換体（ＳＯ３）を、２０ｍＭ ＭＥＳ、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％ スクロース、０．１％ ポロキサマー、ｐＨ５．２５に平衡化した。平衡化した試料をこの平衡化カラムにロードし、平衡化緩衝液で洗浄して、未結合の混入物を排除した。

次いで、陽イオン交換カラムを、５０ｍＭ ギ酸、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、１％ スクロース、０．１％ ポロキサマー、ｐＨ３．５に再平衡化した。再平衡化後、カラムを、塩化ナトリウムの増加する直線勾配を用いて溶出し、１Ｍ 水酸化ナトリウム、２Ｍ 塩化ナトリウムで洗浄した。クロマトグラムを図２に示す。ＡＡＶのピークをＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図３）。

＜実施例２：本発明の方法のステップのうちのいくつかを用いたＡＡＶの精製＞
実施例１に記載されたものと同じ材料の試料を、第２のＴＦＦステップを通して同様に処理した。次に、２Ｍ ギ酸を徐々に添加することにより、ｐＨ３．５に滴定した。

同一の陽イオン交換体を５０ｍＭ ギ酸、０．２Ｍ 塩化ナトリウム、１％ サッカロース、０．１％ ポロキサマー、ｐＨ ３．５に平衡化した。試料をロードし、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、実施例１に記載したのと同じ直線勾配構成で溶出した。カラムを１Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ 塩化ナトリウムで洗浄した。

図３は、２つの実施例でそれぞれ得られた精製度を比較したものである。最初の３つの試料レーンは、陽イオン交換ステップをｐＨ３．５で実施した実施例２の結果を示している。次の３つの試料レーンは、陽イオン交換体及び試料をｐＨ５．２５に初期平衡化し、そのｐＨで試料をロードし洗浄した後に、カラムをｐＨ３．５に再平衡化し、そのｐＨで溶出を行った実施例１の結果を示している。その結果、ｐＨ５．２５で平衡化した試料は、含まれる混入物が少なく、陽イオン交換体はよりクリーンなＡＡＶ画分を得ることができることが示されている。ｐＨ３．５に平衡化した試料は、混入物量が多く、陽イオン交換によって、より不純物の多い画分が生成された。

＜実施例３＞
アフィニティークロマトグラフィを用いた実験対照を実行して、他のＡＡＶ捕捉方法に対する本発明の方法を用いることの潜在的利点を実証した。ＡＡＶアフィニティーカラムを５０ｍＭ リン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化した。試料を、同じｐＨに平行化し、ろ過した後、カラムにロードした。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭ グリシン、ｐＨ３．０へのステップで溶出させた。溶出後、カラムを２５ｍＭ 水酸化ナトリウムで洗浄した。

クロマトグラムを図４に示す。図２のクロマトグラムと図４のクロマトグラムとを比較すると、アフィニティークロマトグラフィには、陽イオン交換クロマトグラフィと同様に、過剰な混入物の結合について問題があることが示されている。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を図５に示す。図３のＰＡＧＥゲルと図５のクロマトグラムとを比較すると、陽イオン交換クロマトグラフィを用いる本発明のその方法は、本発明の方法の利点を有しないアフィニティークロマトグラフィよりも良好な精製をもたらすことが示されている。

アフィニティークロマトグラフィは、一般的に、全てのクロマトグラフィ法の中で最も優れた捕捉精製をもたらすと考えられている。陽イオン交換クロマトグラフィなどの一般的な精製方法が明らかに優れた精製を得ることを可能にするという本発明の方法の性能は、本発明の方法の性能が精製能力を強化するということを強調している。また、これは、捕捉方法としてのアフィニティークロマトグラフィの精製性能を大幅に向上させるものであると言え、場合によっては、実施例２に記載したように、本方法の初期ステップ後に、陰イオン交換クロマトグラフィによる精製を行うことにより、少なくとも研究用グレードのＡＡＶの精製を可能にするであろう。

＜実施例４：アフィニティークロマトグラフィにより初期捕捉に対する本方法の適用＞
第２のＴＦＦステップまでの本発明のステップは行うが、その後のｐＨを下げるステップ及び陽イオン交換体に試料を付与するステップは行わない。その代わりに、試料をアフィニティークロマトグラフィカラムに直接付与する。その後、カラムを洗浄し、本発明の強化を用いない場合と同様に溶出する。

＜実施例５：陰イオン交換クロマトグラフィによる初期捕捉に対する本発明の適用＞
第２のＴＦＦステップまでの本発明のステップは行うが、その後のｐＨを下げるステップ及び陽イオン交換体に試料を付与するステップは行わない。その代わりに、試料を、ＡＡＶが同じ条件に平衡化された陰イオン交換体に結合するように、十分に低い伝導度（塩濃度）に希釈される。その後、カラムを洗浄し、本発明の強化を用いない場合と同様に溶出する。

＜実施例６：正に帯電した粒子のフロースルーデバイスの正に帯電した内表面との置換＞
上述の実施例のいずれも、正に帯電した粒子を、大きな正に帯電した表面に置換することによって実施することができる。このような表面は、デプスフィルタなどの、多くの市販のろ過媒体に見られる。

Claims (10)

1. 以下のステップを含む、ＡＡＶカプシド及び混入ＤＮＡを含む調製物の混入ＤＮＡ含量を低減する方法：
   （ａ）表面に正電荷を担持する固相を用いてＤＮＡの抽出を行って、第１の画分を得ることであって、ここで、前記固相は、ｐＨ７．０±１．０、塩濃度１０ｍＭ～２００ｍＭで調製物と接触させられ；
   （ｂ）前記第１の画分を、第１のタンジェンシャルフローフィルトレーション（tangential flow filtration）によりダイアフィルトレーションして（diafiltering）第２の画分を得ること；
   （ｃ）前記第２の画分をＤＮＡｓｅで処理すること；
   （ｄ）ステップ（ｃ）で得られた、ＤＮＡｓｅ処理された第２の画分を、ｐＨ７．０±１．０及び塩濃度１０ｍＭ～２０ｍＭを有する緩衝液に、第２のタンジェンシャルフローフィルトレーションによりダイアフィルトレーションして第３の画分を得ること；及び
   任意に（optionally）、
   （ｅ）補足的なクロマトグラフィの前に、第３の画分をタンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮すること。
2. 前記固相が、ばらの嵩高粒子（loose bulk particles）又はフロースルーデバイス（flow-through device）の形態である、請求項１に記載の方法。
3. 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、単一中空糸の膜若しくは束状の膜などの中空糸膜（hollow-fiber membranes）、又は、単一の膜若しくは積層した若しくは筒状に巻いた膜などの平坦膜からなる群から選択される膜を用いて行われる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記第１のフィルトレーションが、ＤＮＡｓｅによるＤＮＡ消化を促進するよう調合された緩衝液中で行われる、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. タンジェンシャルフローフィルトレーション膜の多孔率が、１０ｋＤａ～３００ｋＤａ、３０ｋＤａ～３００ｋＤａ、６０ｋＤａ～３００ｋＤａ、１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、２００ｋＤａ～３００ｋＤａ、又は２５０ｋＤａ～３００ｋＤａの範囲であり、好ましくは分画分子量で１００ｋＤａ以上の分画分子量（molecular weight cutoff）を有する、請求項３又は請求項４に記載の方法。
6. ＡＡＶカプシド及び混入ＤＮＡを含む調製物が、ＡＡＶセロタイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は、２つ以上のセロタイプの特徴を有する組み換えセロタイプなど、他のセロタイプからなる群から選択されるＡＡＶ粒子を含む、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップ（ｄ）又はステップ（ｅ）の後に、以下の精製ステップの少なくとも１つが用いられる、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法：
   （ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィステップ、又は、
   （ｉｉ）アフィニティクロマトグラフィステップ、又は、
   （ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィステップ。
8. 精製ステップ（ｉ）において、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の画分が、ｐＨ４～６（特に約ｐＨ５）で、陽イオン交換クロマトグラフィ材料上にロードされた後に、
   陽イオン交換クロマトグラフィ材料を約ｐＨ３．５±０．５へ再平衡化すること、
   塩勾配を用いた溶出を行うこと、及び
   その後、陰イオン交換クロマトグラフィ処理を行うこと、
   が行われる、請求項７に記載の方法。
9. 精製ステップ（ｉｉ）において、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の画分が、アフィニティクロマトグラフィ材料上にロードされ、溶出後に、陰イオン交換クロマトグラフィ処理が行われる、請求項７に記載の方法。
10. 精製ステップ（ｉｉｉ）において、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の画分が、陰イオン交換クロマトグラフィにかけられる、請求項７に記載の方法。
    

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