TW202030200A - 使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法 - Google Patents

使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202030200A
TW202030200A TW108146543A TW108146543A TW202030200A TW 202030200 A TW202030200 A TW 202030200A TW 108146543 A TW108146543 A TW 108146543A TW 108146543 A TW108146543 A TW 108146543A TW 202030200 A TW202030200 A TW 202030200A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
vaccine
vaccine virus
solution
purifying
virus
Prior art date
Application number
TW108146543A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI803725B (zh
Inventor
柳在林
鄭恩朱
蔡珍娥
李東億
Original Assignee
南韓商Ｃｊ醫藥健康股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 南韓商Ｃｊ醫藥健康股份有限公司 filed Critical 南韓商Ｃｊ醫藥健康股份有限公司
Publication of TW202030200A publication Critical patent/TW202030200A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI803725B publication Critical patent/TWI803725B/zh

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B01D15/203—Equilibration or regeneration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B01D15/426—Specific type of solvent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明是有關使用親和層析法之用於疫苗病毒的分離及純化方法，且更具體而言，有關使用包含一疫苗病毒親和樹脂之親和層析法，而能夠在高純度及高產量下獲得疫苗病毒的病毒純化方法。

Description

使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法
本發明是有關使用親和層析法之用於疫苗病毒的分離及純化方法，且更具體而言，有關使用包含一疫苗病毒親和樹脂之親和層析法，而能夠在高純度及高產量下獲得疫苗病毒的病毒分離及純化方法。
在使用自人類以外之物種所衍生之細胞作為宿主細胞而培養的疫苗病毒中，必須移除由宿主所衍生之材料。為了移除由宿主衍生之材料，在相關技術領域中，已使用糖密度梯度離心法(sugar density gradient centrifugation method)、粒徑排阻層析法(size-exclusion chromatography)，或離子交換層析法(ion-exchange chromatography)。作為頻繁用於病毒純化的方法，由於這些方法無論對於何種病毒的種類為可以輕易應用的，這些方法較親和層析法(affinity chromatography)更常被使用。
糖密度梯度離心法是利用使用糖而形成密度差異以純化病毒的方法，且作為最傳統及古老的方法，由於其不需要獨立的過程研究(process studies)，其是最常用於研究的初始階段的方法。為了將該方法應用至工業生產階段，額外需要昂貴的設備，且需要加入諸如透析法或粒徑排阻層析法之用於移除糖的方法，而因此具有總處理時間過長的缺點。在一 項研究中亦被報導的是，糖的黏度及高滲透壓影響病毒之感染蛋白(infective proteins)而降低該方法的整體病毒產率(Peng HH et al.(2006)Anal Biochem,354(1)：140-147)。
粒徑排阻層析法是不受到蛋白修飾(protein modification)或滲透壓之影響的方法，且在現有技術中(CN101695570B、CN101780278B)，已揭露使用粒徑排阻層析法製備用於手足口症(hand-foot-and-mouth disease)的未活化疫苗。然而，由於過量的濃縮過程涉及於粒徑排阻層析法中作為預處理過程，存在有病毒結構由於濃縮過程而被破壞，或是由於增加之過程而降低產率的缺點。再者，由於規模擴增(scale-up)受限，粒徑排阻層析法的應用在研究階段是較簡單的，但在工業量產的規模下其應用受限。
已使用無論病毒樣品之容量為何都能被使用之離子交換層析法進行研究(CN101695570B、Ashok Raj Kattur Venkatachalam et al.(2014)Virology Journal,11：99)。大部分的研究是藉由將病毒吸附至諸如DEAE(二乙氨基乙基)的具有電荷的樹脂，並接著以具有高鹽濃度之緩衝劑溶析(eluting)該經吸附之病毒之方法進行。然而，為了使用離子交換層析法，需要使用透析過程(dialysis process)以降低樣品的鹽濃度，且存在有由於額外過程而降低產率的缺點。另外，由於病毒是由各種種類之蛋白質所組成而非僅由單一蛋白質組成，病毒具有各種電荷，且因此需要用以維持病毒之溶析條件的過程研究。另外，存在有具有與病毒相似電荷之雜質可能被一同溶析的缺點。
基於此技術背景，本發明之發明人已盡相當努力以找尋在高純度及高產率下純化疫苗病毒的方法，結果，他們研發出當使用親和層析法得以在高純度及高產量下獲得疫苗病毒的純化方法，藉此完成本發明。
本發明的一個態樣提供一種用於疫苗病毒之純化方法，其包含：(a)將包含一疫苗病毒之一樣品裝載於包含一病毒親和樹脂之一親和層析管柱；(b)以一洗滌溶液洗滌該親和層析管柱；以及(c)使用一溶析溶液自該親和層析管柱回收一所欲之疫苗病毒。
本發明的另一態樣提供根據該純化方法而純化的疫苗病毒。
根據本發明之純化方法，除了所欲之疫苗病毒外大多數的雜質被移除，該疫苗病毒可在適用於量產之高純度及高產率下被純化。
圖1顯示進行本發明之純化方法的程序。
圖2及圖3顯示使用包含硫酸葡聚醣之CaptoTM DeVirS樹脂純化疫苗病毒的結果。
圖4及圖5顯示使用包含肝素之HiTrap肝素樹脂純化疫苗病毒的結果。
圖6及圖7顯示使用一Fractogel DEAE樹脂純化疫苗病毒的結果。
圖8及圖9顯示使用一Fractogel TMAE樹脂純化疫苗病毒的結果。
圖10及圖11顯示使用一CIM DEAE樹脂純化疫苗病毒的結果。
此後將詳細敘述本發明。
同時，揭示於本發明中的各敘述及實施例亦可被各自應用至其他敘述及實施例。亦即，揭示於本發明中之各種組件的所有組合屬於本發明的範圍。另外，本發明的範圍不可由下列具體敘述限制。
再者，所屬技術領域具有通常知識者可以藉由僅使用一般實驗而認知或決定在本發明中敘述的具體實施例的多個均等實施例。另外，這些均等實施例意欲被包括於本發明中。
圖1顯示進行本發明之純化方法的程序之一實例。
參考圖1，本發明之一態樣提供用於疫苗病毒的純化方法，其包含：(a)將包含一疫苗病毒之一樣品裝載於包含一病毒親和樹脂之親和層析管柱；(b)以一洗滌溶液洗滌該親和層析管柱；以及(c)使用一溶析溶液自該親和層析管柱回收一所欲之疫苗病毒。
以下將各別詳細敘述用於疫苗病毒之純化方法的各步驟。首先，步驟(a)為將包含一疫苗病毒之一樣品裝載於包含一病毒親和樹脂之親 和層析管柱。
只要包含該疫苗病毒之該樣品包含一疫苗病毒，對於材料及製造方法沒有限制。具體而言，包含該疫苗病毒之該樣品可包括一腸病毒(enterovirus)，但不限於此。該樣品可由人類衍生之細胞(human-derived cells)之外的宿主細胞製備，但不限於此。
用於本發明之該「親和層析法(affinity chromatography)」代表使用以親和力而連結至特定蛋白質之材料的一層析方法。以親和力而連結至特定蛋白質之材料為其中之功能性基團共軛於聚合性材料的材料，且其連結至溶解於一極性或非極性溶劑中且具有親和力的材料。
為了本發明的目的，該親和層析法可為包含一疫苗病毒親和樹脂(vaccine virus-affinity resin)的親和層析法。具體而言，該層析法可使用能夠特別連結至該疫苗病毒蛋白質的樹脂而進行。舉例而言，該疫苗病毒親和樹脂可包括選自於由硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、肝素(Heparin)及其等之混合物所組成之群組的至少一者。例如，該疫苗病毒親和樹脂包含CaptoTM DeVirS(GE Healthcare)及HiTrap Heparin(GE Healthcare)，但不限於此，且任何能夠特別連結(specifically binding)至該疫苗病毒蛋白的樹脂皆可。
舉例而言，該CaptoTM DeVirS樹脂包含硫酸葡聚醣，該HiTrap Heparin樹脂包含肝素，而該樹脂可特別連結至該疫苗病毒蛋白。
於一實施例中，在步驟(a)中裝載包含該疫苗病毒之該樣品之前，一管柱可由pH 7.5至pH 8.0的一平衡溶液平衡(equilibrated)。具體而言，該平衡溶液可包括選自於由下列所組成之群組的至少一鹽類：磷酸鈉、 氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)、3-嗎啉丙烷-1-磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid，MOPS)、哌嗪N,N’-雙(2-乙磺酸)(Piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES)、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES)，但不限於此。
於一實施例中，該方法可在步驟(a)之前進一步包括離子交換層析、濃縮，及/或透析。此步驟是用以藉由移除包含該疫苗病毒之該樣品中的主要雜質(primary impurities)而增加該樣品的純度。具體而言，在步驟(a)之前，包含該疫苗病毒之該樣品被濃縮及透析，且在藉由離子交換層析法預先進行純化後，包含該疫苗病毒之該樣品可被裝載於使用該親和樹脂之該親和層析管柱。用以移除未連結至該親和樹脂之主要雜質及增進該樣品之純度的任何操作可被應用而不被限制。
於一實施例中，使用親和層析法之用於疫苗病毒的該純化方法的特徵可在於在該親和層析法之前未進行另外的濃縮或透析過程。在此情形中，雖然該過程是簡單的，卻能夠獲得具有高產率及高純度的結果。
在用於該疫苗病毒的純化方法中，步驟(b)是將洗滌溶液施用(applying)於裝載有該樣品之該層析管柱的步驟，作為以該洗滌溶液洗滌該樣品的步驟。
該洗滌溶液可具有pH 7.5至pH 8.0之範圍。具體而言，該洗滌溶液可包括選自於由下列所組成之群組的至少一鹽類：磷酸鈉、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉丙烷-1-磺酸(MOPS)、哌嗪N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，但不限於此。
為了本發明的目的，在步驟(b)中，非特別(non-specifically)連結至該疫苗病毒親和樹脂之雜質可藉由該洗滌溶液而移除。
於一實施例中，該純化方法可進一步包括在步驟(a)或(b)後，以該平衡溶液排放(discharging)對該樹脂不具有親和性的雜質的步驟。該步驟可被特別進行至少一次，但一般而言，其可不被限制地進行直到達成平衡。
於一實施例中，該純化方法可進一步包括在步驟(a)或(b)後以一再平衡溶液(re-equilibrium solution)進行再平衡(re-equilibration)的步驟。該再平衡溶液不與該洗滌步驟及該溶析(eluting)步驟之間的任何物質反應、在所欲之疫苗病毒未被溶析之步驟(a)中該平衡溶液之相同條件下流通，且接著於該溶析溶液流動之前再次流通以作為該洗滌溶液及該溶析溶液之間的橋樑。
具體而言，該再平衡溶液可具有pH 7.5至pH 8.0之範圍。具體而言，該再平衡溶液可包括選自於由下列所組成之群組的至少一鹽類：磷酸鈉、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸 (MES)、3-嗎啉丙烷-1-磺酸(MOPS)、哌嗪N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，但不限於此。
在該病毒的純化方法中，步驟(c)是使用該溶析溶液自該親和層析管柱回收該所欲之疫苗病毒的步驟。
該溶析溶液可具有pH 7.5至pH 8.0的範圍。具體而言，該溶析溶液可包括選自於由下列所組成之群組的至少一鹽類：磷酸鈉、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉丙烷-1-磺酸(MOPS)、哌嗪N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，但不限於此。
另外，該溶析溶液可包含0.1M至0.5M之氯化鈉，但可自該親和層析管柱分離該所欲之疫苗病毒的鹽類可以在不限濃度之下被使用。
使用本發明之純化方法而被分離之該所欲之疫苗病毒可具有88%或更高之純度，且具體而言90%或更高、91%或更高、92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高，或98%或更高的純度，但不限於此。該用語「純度(purity)」表示被移除雜質之一純的(pure)疫苗病毒，且作為一實例，若純度為92%，則剩下的8%代表雜質。另外，純度可單純代表自該經溶析之溶液分離的材料之純度，但最終純度%可根據所裝載之樣品的純度百分比而改變。
該用語「雜質(impurity)」為該所欲之疫苗病毒之外的任何 其他材料，且例如，可包括一自宿主衍生之DNA(host-derived DNA)、一自宿主衍生之蛋白質、一內毒素(endotoxin)等，但並未限制於此。
再者，該疫苗病毒之純度可藉由特別被提供用以自該溶析溶液之總蛋白質量而量測衍生自宿主之雜質的一酵素結合免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA))法加以分析，但並未限制於此，且當然地，該疫苗病毒之純度可使用陽離子交換高效液相層析法(CEX-HPLC)、粒徑排阻高效液相層析法(SEC-HPLC)等加以分析。
在本發明中，該病毒較佳為腸病毒(enterovirus)，但未限制於此。
再者，藉由本發明之純化方法所純化之疫苗病毒可被用作疫苗或免疫性組成物(immunogenic composition)，但並未限制於此。
本發明的另一態樣提供根據該純化方法所純化的一疫苗病毒。該疫苗病毒可被用作疫苗或免疫性組成物，但並未限制於此。
發明模式(Mode for Invention)
此後，較佳的實例被提出以輔助了解本發明。然而，下列實例僅是為了使本發明能被更輕易地理解而提供，且本發明的內容並不受實例限制。
實例1. 使用包含硫酸葡聚醣之Capto TM DeVirS樹脂之純化
於實例1中，對於疫苗病毒之純化產率(purification yield)及雜質移除率(impurity removal rate)是使用包含一硫酸葡聚醣配位基之CaptoTM DeVirS樹脂加以確認。
一20mM磷酸鈉pH 7.5緩衝劑被用作一平衡溶液及一洗滌溶液(0M氯化鈉)，而一溶析溶液被製備並使用一pH 7.5緩衝劑，其中在平衡溶液中氯化鈉會達到2M之濃度。
首先，包含一腸病毒之含疫苗病毒之樣品被裝載於一管柱，然後，藉由流通該洗滌溶液進行洗滌。接著，0M至2M氯化鈉之溶析溶液以線性濃度梯度(linear concentration gradient)被流通，該經溶析之溶液被收集，且接著該疫苗病毒含量以TCID50量測，且該雜質含量被量測。
圖2及3顯示使用包含硫酸葡聚醣之CaptoTM DeVirS樹脂之純化疫苗病毒的結果。
參考圖2及3，已確認的是將該經裝載之樣品的雜質量(impurity amount)與流經(flowthrough)(F/T)者相比，大量的雜質已自該經裝載之樣品移除。再者，已確認的是當將包括於該經裝載之樣品中之該病毒含量與流經(F/T)者相比，大部分的疫苗病毒被純化而未遭受疫苗病毒的損失。
同時，該溶析溶液之氯化鈉濃度被自0M增加至2M以取得各別的餾分(fractions)。結果，當該餾分是在0.1M至0.9M，較佳0.1M至0.5M的鹽濃度下取得時，已確認的是大量的雜質被移除，且同時，大多的疫苗病毒在未遭受疫苗病毒之損失下被純化。
作為一實例，當餾分3及4在0.1M至0.5M之鹽濃度內取得， 已確認的是約81.1%之該疫苗病毒被回收，且此時，雜質之移除率是約97.7%，且因此雜質之含量與其他餾分相比為非常低的。
實例2. 使用包含肝素之HiTrap Heparin樹脂之純化
於實例2中，對於疫苗病毒之純化產率及雜質移除率使用包含肝素配位基之HiTrap Heparin樹脂加以確認。
50mM Tris-HCl pH 8.0緩衝劑被用作平衡溶液及洗滌溶液，且一溶析溶液被製備並使用，俾使氯化鈉得於該平衡溶液中會達到2M。
首先，包含一腸病毒之含疫苗病毒之樣品被裝載於一管柱，且接著藉由流通該洗滌溶液進行洗滌。接下來，0M至2M氯化鈉之溶析溶液以線性濃度梯度被流通、該經溶析之溶液被收集，且接著該疫苗病毒含量以TCID50量測，且該雜質含量被量測。
圖4及5顯示使用包含肝素之HiTrap Heprarin樹脂而純化一疫苗病毒的結果。
參考圖4及圖5，已確認的是將該經裝載之樣品的雜質量與流經(flowthrough)(F/T)者相比，大量的雜質已自該經裝載之樣品移除。再者，已確認的是當將包括於該經裝載之樣品中之該病毒含量與流經(F/T)者相比，大部分的疫苗病毒被純化而未遭受疫苗病毒之損失。
同時，該溶析溶液之氯化鈉濃度被自0M增加至2M以取得各別的餾分(fractions)。結果，當該餾分是在0.1M至0.9M，較佳0.1M至0.5M且最佳0.1M至0.3M的鹽濃度下取得時，已確認的是大量的雜質被移除，且同時，大多的疫苗病毒在未遭受疫苗病毒之損失下被純化。
作為一實例，當餾分4至7在0.1M至0.5M的鹽濃度內取得，已確認的是約85.4%之該疫苗病毒被回收，且此時，雜質之移除率是約92.0%。
比較例1. 使用Fractogel DEAE樹脂之純化
於比較例1中，對於疫苗病毒之純化率及雜質移除率使用包含二乙氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)之Fractogel DEAE樹脂加以確認。
50mM之Tris-HCl pH 8.0緩衝劑被用作平衡溶液及洗滌溶液，而溶析溶液被製備並使用，俾使氯化鈉在該平衡溶液中能達到2M。
首先，包含腸病毒之含疫苗病毒的樣品被裝載於一管柱，且接著藉由流通該洗滌溶液進行洗滌。接下來，該溶析溶液以線性濃度梯度被流通、該經溶析之溶液被收集，且接著該疫苗病毒含量以TCID50量測，且該雜質含量被量測。
圖6及圖7顯示使用一Fractogel DEAE樹脂之純化疫苗病毒的結果。
參考圖6及7，當鹽濃度被增加且各別的餾分被取得時，在餾分11中於特定的鹽濃度下，約25.7%之該疫苗病毒被回收，且此時，雜質移除率為51.3%。亦即，已確認的是，在與其他餾分相比，其中疫苗病毒之回收率為較高的餾分中，其雜質含量是非常高的。
比較例2. 使用Fractogel TMAE樹脂之純化
在比較例2中，對於疫苗病毒之純化率及雜質移除率是使用 包含三甲基銨甲基(TMAE)之Fractogel TMAE樹脂加以確認。
一50mM Tris-HCl pH 8.0緩衝劑被用作平衡溶液及洗滌溶液，而溶析溶液被製備並使用，俾使氯化鈉在該平衡溶液中能達到2M。
首先，包含一腸病毒之含疫苗病毒之樣品被裝載於一管柱，且接著藉由流通該洗滌溶液進行洗滌。接下來，該溶析溶液以線性濃度梯度被流通，該經溶析之溶液被收集，且接著該疫苗病毒含量以TCID50量測，且該雜質含量被量測。
圖8及9顯示使用一Fractogel TMAE樹脂純化疫苗病毒的結果。
參考圖8及9，當鹽濃度被增加且各別的餾分被溶析，已確認的是在一特定的餾分(餾分5)中，約20.5%的該疫苗病毒被回收，且在此時，雜質移除率為89.2%。
比較例3. 使用CIM DEAE樹脂之純化
於比較例3中，對於疫苗病毒之純化產率及雜質移除率使用由DEAE組成之碟型單體(disk-shaped single body)加以確認。
一50mM Tris-HCl pH 8.0緩衝劑被用作平衡溶液及洗滌溶液，而溶析溶液被製備並使用，俾使氯化鈉在該平衡溶液中能達到2M。
首先，包含一腸病毒之含疫苗病毒之樣品被裝載於管柱，且接著藉由流通該洗滌溶液進行洗滌。該平衡溶液及該溶析溶液以預定比例混合以通過一濃度梯度流動，使得氯化鈉的濃度為100mM、140mM、200mM、400mM及600mM，該經溶析之溶液被收集，且接著該疫苗病毒含量 以TCID50量測。
圖10及圖11顯示使用CIM DEAE樹脂純化疫苗病毒的結果。
參考圖10及圖11，當鹽濃度被增加且各別的餾分被溶析，已確認的是在140mM的鹽濃度下，約34.2%的該疫苗病毒被回收，且已確認的是由於該過程中過高的壓力(overly high pressure)，而難以應用於實際的過程中。
實例1及2以及比較例1至3之方法及結果被總結於下表1中。
Figure 108146543-A0202-12-0014-1
Figure 108146543-A0202-12-0015-2
這些結果指出，相較於使用離子交換層析法之傳統純化方法，本發明之使用親和層析法的用於疫苗病毒之純化方法中，所欲之疫苗病毒可以高雜質移除率及高產率而被分離。
可由所屬技術領域具有通常知識者了解的是，以上敘述之本發明可以其他具體的形式實施而不自本發明之技術精神或必要特徵偏離。因此，應被了解的是上述實施例完全意欲為顯示性的而非限制性的。舉例而言，上述實例1及2中，該疫苗病毒之純化產率及雜質移除率是使用包含硫酸葡聚醣之樹脂及包含肝素之樹脂加以確認，但根據實例，硫酸葡聚醣及肝素以預定比例被混合之樹脂亦可被使用。
本發明之範圍是藉由以下敘述之申請專利範圍而不是詳細說明所表示，且申請專利範圍之意義及範圍及衍生自其等之均等意義及範圍的所有改變或修飾應被解讀為落於本發明之範圍內。

Claims (13)

  1. 一種用於疫苗病毒的純化方法，其包含下列步驟：
    (a)將包含一腸病毒之一樣品裝載於包含一病毒親和樹脂之親和層析管柱；
    (b)以一洗滌溶液洗滌該親和層析管柱；以及
    (c)使用一溶析溶液自該親和層析管柱回收一所欲之腸病毒。
  2. 如請求項1所述之用於疫苗病毒的純化方法，其中該病毒親和樹脂被提供以特別連結於該腸病毒。
  3. 如請求項1所述之用於疫苗病毒的純化方法，其中該病毒親和樹脂包含硫酸葡聚醣。
  4. 如請求項1所述之用於疫苗病毒的純化方法，其中該病毒親和樹脂包含肝素。
  5. 如請求項1所述之用於疫苗病毒的純化方法，其中步驟(c)中之溶析溶液包含氯化鈉。
  6. 如請求項1所述之用於疫苗病毒的純化方法，其中步驟(c)包含在0.1M至0.9M之鹽濃度下使用該溶析溶液自該親和層析管柱回收一所欲之疫苗病毒。
  7. 如請求項1所述之疫苗病毒的純化方法，其中步驟(c)包含在0.1M至0.5M之鹽濃度下使用該溶析溶液自該親和層析管柱回收一所欲之疫苗病毒。
  8. 如請求項1所述之疫苗病毒的純化方法，其中步驟(b)中之該洗滌溶液包含選自於由下列所組成之群組的至少一鹽類：磷酸鈉、氯化鈉、三 羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉丙烷-1-磺酸(MOPS)、哌嗪N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
  9. 如請求項1所述之疫苗病毒的純化方法，進一步包含：
    在步驟(a)之前以一平衡溶液平衡該親和層析管柱。
  10. 如請求項9所述之疫苗病毒的純化方法，其中該平衡溶液包含選自於由下列所組成之群組的至少一鹽類：磷酸鈉、氯化鈉、羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉丙烷-1-磺酸(MOPS)、哌嗪N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
  11. 如請求項1至7之任一項所述之疫苗病毒的純化方法，進一步包含：在步驟(a)及(b)之至少一者後以一平衡溶液平衡該親和層析管柱。
  12. 如請求項1所述之疫苗病毒的純化方法，進一步包含：在步驟(a)及(b)之至少一者後以一再平衡溶液對該親和層析管柱進行再平衡。
  13. 如請求項1所述之疫苗病毒的純化方法，其中該樣品是從人類衍生之細胞之外的宿主細胞所製備。
TW108146543A 2018-12-20 2019-12-19 使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法 TWI803725B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0166428 2018-12-20
KR1020180166428A KR102209790B1 (ko) 2018-12-20 2018-12-20 친화성 크로마토그래피를 이용한 백신용 바이러스 정제방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202030200A true TW202030200A (zh) 2020-08-16
TWI803725B TWI803725B (zh) 2023-06-01

Family

ID=71102603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108146543A TWI803725B (zh) 2018-12-20 2019-12-19 使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210355452A1 (zh)
EP (1) EP3898954A4 (zh)
JP (1) JP7282178B2 (zh)
KR (1) KR102209790B1 (zh)
CN (1) CN113166732A (zh)
AU (1) AU2019401729B2 (zh)
PH (1) PH12021551008A1 (zh)
SG (1) SG11202104592WA (zh)
TW (1) TWI803725B (zh)
WO (1) WO2020130672A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115948351B (zh) * 2022-12-01 2023-11-14 杭州养生堂生物医药有限公司 一种分离纯化cvb1的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5529869B2 (ja) * 2008-08-14 2014-06-25 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション プロテインａアフィニティークロマトグラフィーを用いる抗体の精製方法
WO2014031480A1 (en) * 2012-08-24 2014-02-27 Xcellerex, Inc. Virus purification and formulation process
PL3116891T3 (pl) * 2014-03-10 2020-07-27 Richter Gedeon Nyrt. Oczyszczanie immunoglobuliny z zastosowaniem etapów wstępnego oczyszczania
WO2018190677A2 (en) * 2017-04-14 2018-10-18 Cj Healthcare Corporation Method for purifying analogous antibody using cation-exchange chromatography
KR102087823B1 (ko) * 2017-05-16 2020-03-13 에이치케이이노엔 주식회사 친화성 크로마토그래피를 이용한 항체 또는 항체절편 정제 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200077675A (ko) 2020-07-01
WO2020130672A1 (en) 2020-06-25
EP3898954A1 (en) 2021-10-27
CN113166732A (zh) 2021-07-23
KR102209790B1 (ko) 2021-02-01
US20210355452A1 (en) 2021-11-18
TWI803725B (zh) 2023-06-01
JP2022512377A (ja) 2022-02-03
JP7282178B2 (ja) 2023-05-26
SG11202104592WA (en) 2021-06-29
AU2019401729B2 (en) 2023-06-15
AU2019401729A1 (en) 2021-07-29
EP3898954A4 (en) 2022-09-07
PH12021551008A1 (en) 2021-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002512361A (ja) アデノウイルスの効率的精製
JP7540667B2 (ja) アデノウイルス精製の方法
Tseng et al. A fast and efficient purification platform for cell-based influenza viruses by flow-through chromatography
WO2019178495A1 (en) Methods for purifying recombinant adeno-associated viruses
JP2017086090A5 (zh)
JPH01311028A (ja) 肝炎蛋白質の精製
Sviben et al. Recovery of infective virus particles in ion-exchange and hydrophobic interaction monolith chromatography is influenced by particle charge and total-to-infective particle ratio
JP2018516229A5 (zh)
US20220056421A1 (en) A method for depletion or removal of endotoxin from an endotoxin-containing source or potentially endotoxin-containing source
Gagnon Chromatographic purification of virus particles
TWI803725B (zh) 使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法
Reiter et al. Separation of influenza virus‐like particles from baculovirus by polymer‐grafted anion exchanger
US20230227791A1 (en) Enhanced purification of adeno-associated virus to more effectively remove contaminating dna
JPS6034916A (ja) 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製
WO2023023541A1 (en) Anion-exchange chromatography methods for purification of recombinant adeno-associated viruses
McCann et al. Evaluation of expanded bed adsorption chromatography for extraction of prothrombin complex from Cohn Supernatant I
Cedervall et al. Rapid and facile purification of apolipoprotein AI from human plasma using thermoresponsive nanoparticles
TW201900257A (zh) 使用親和力層析術純化抗體或其抗體片段的方法
Lin et al. Separation of bio-particles by ion-exchange chromatography
JP2024004020A (ja) Ａ型肝炎ウイルスのクロマトグラフィー精製方法
Mayer et al. Highly pure measles virus generated by combination of salt-active nuclease treatment and heparin affinity chromatography
Alves Production, concentration and purification strategies for Bluetongue virus
CN114307988A (zh) 一种用于纯化mRNA的微球的制备方法及应用
CZ20003829A3 (cs) Účinné čištění adenoviru
JPS59164727A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法