JPH01311028A - 肝炎蛋白質の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ビチア・バストリス（Ｐｉｃｂｉａ　ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ）酵母菌体からのＢ型肝炎表面抗原の精製方
法ｌこ関る、。

（従来の技術） Ｂ型肝炎ウィルスはＢ型肝炎として知られている感染症
を引き起こす。このウィルスによる慢性感染は肝硬変及
び肝臓癌を引き起こす可能性がある。

現在、Ｂ型肝炎ウィルスに感染した個体の治療法はない
。従って、現在の医学的処置法はワクチンＩこよる予防
が中心となっていつる。

ワクチンの活性成分は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原とし
て知られているポリペプチドである。このポリペプチド
は天然のＢ型肝炎ウィルスの表面に存在している。

このペプチドを生産る、一つの方法としては、Ｂ型肝炎
ウィルスに感染した個体の血液からそれを単離る、方法
がある。しかし、現在ではＡＩＤＳのような血液製品か
らの感染る、病気に対る、恐怖のためＩこ、この方法は
用いられなくなってきｔこ　。

別法として遺伝子工学によってＢ型肝炎表面抗原を生産
る、方法がある。Ｂ型肝炎表面抗原の遺伝子を、例えば
酵母、細菌、もしくはホ乳類細胞のいずれにもクローニ
ングる、ことができる。

遺伝的に改変された細胞は、Ｂ型肝炎表面抗原ポリペプ
チドが発現されそして粒子に組み立てられることができ
るような方法によって増殖させることができる。

Ｂ型肝炎表面抗原ポリペプチドは組み換え体細胞によっ
て十分に生産る、ことができるけれども、細胞からのポ
リペプチドの回収及びその精製に利用されている現在の
方法にはまだ問題が存在している。

例えば、最も一般的に用いられているＢ型肝炎表面抗原
の精製方法は、密度勾配遠心分離法である。しかし、こ
の方法は、多量の塩化セシウム及びスクロースの使用の
みならず超遠心分離器及びその精製の程度や量に応じて
種々のローターの使用を必要としており、そして、それ
ゆえこの方法は生産コストが高いという観点から適当で
あるとは言えない。

１９８７年７月２８日発行の米国特許第４，６８３．２
９３号明細書には、遺伝的に改造されたピチア・パスト
リス株により生産されるＢ型肝炎表面抗原のような親油
性蛋白質はカオトロピック塩を含む細胞溶解緩衝液の使
用によって選択的に回収できることが開示されている。

そのような方法は親油性蛋白質の精製において大きな利
点があると考えられるが、ワクチンの調製における使用
に適した形態のＢ型肝炎表面抗原としてそのような蛋白
質の回収を可能とる、全体的方法についてはまだ改善の
必要かある。

従って、酵母菌体からのＢ型肝炎表面抗原粒子を、ワク
チンに直接入れることのできるぐらい十分に精製された
状態で回収る、ための工業的規模での実施か可能となる
ような全体的方法を開発る、ことは当分野に価値ある寄
与をる、と考えられる。

（発明が解決しようとる、課題） 本発明の目的は、ワクチンに直接入れることのできるぐ
らいに十分な純度のＢ型肝炎表面抗原粒子を回収る、た
めの方法であって、且つ工業的規模での実施を可能とる
、ような方法を提供る、ことである。。

本発明の他の観点は以下の記載により明らかにされるで
あろう。

（課題を解決る、ための手段） 本発明は； ａ）カオトロピック化合物の存在下で酵母細胞を溶解る
、こと及びＢ型肝炎表面抗原を含む上澄液を溶解した細
胞ペレットから分離る、こと；ｂ）工程（ａ）で得られ
たＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液を、脂質及び夾
雑蛋白質を前記Ｂ全肝炎表面抗原上澄液から沈澱させる
ための適当な条件にる、こと、及び沈澱した残渣を前記
Ｂ全肝炎表面抗原上澄液から除去る、こと；Ｃ）工程（
ｂ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む上澄液を濃縮及
び限外濾過（ｄｉｚｆｉｌｔｒｚ目ｏｎ）る、こと； ｄ）工程（ｃ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る残留物（レテンテート）をシリカと接触させること： ｅ）非−Ｂ型肝炎表面抗原蛋白質を、６〜８の範囲のＩ
）Ｈを有る、適当な緩衝液で前記シリカから洗い流すこ
と； 【）前記Ｂ型肝炎表面抗原をシリカから９．５〜１１．
０の範囲のｐＨを有し及び尿素を０．５〜８モル濃度で
含んでいる適当な緩衝液で溶出る、こと； ｇ）工程（ｒ＞で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る画分を、Ｂ型肝炎表面抗原粒子を夾雑物から分離る、
のに適当な分子量除去限界を有る、ゲル濾過にかけるこ
と； ｈ）工程（ｇ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る画分を陰イオン交換樹脂に接触させること；及び ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原粒子を陰イオン交換樹脂から６〜
９の範囲のｐＨを有る、適当な緩衝液で溶出る、こと； からなる方法によって酵母細胞からＢ型肝炎表面抗原粒
子を回収、精製る、ことができることを発見して完成さ
れた。

本発明の方法はＢ型肝炎表面抗原を発現る、ことのでき
る如何なる形質転換酵母においても使用できる。適当な
形質転換酵母の代表的な例は、カンヂダ（Ｃａｏｄｉｄ
ａ）、コロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｃｒａ）、サッス（Ｔ
ｏｒｕｌｏｐｉｓ）、ビチア（Ｐｉｃｈｉｊ）及びタル
イベａマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属
る、酵母からなる群から選択る、ことができる。特に好
ましい酵母はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐｓ
ｓｔｏｒｉｓ）である。

典型的には、酵母は、この分野ではよく知られているよ
うな資化性窒素源、無機塩、適当なｐＨをともなう分子
状酸素及び他の制御因子を用いる好気的液体発酵条件下
で、適当な炭素エネルギー源で増殖させることにより培
養される。酵母を増殖させる正確な方法は本発明の実施
において重要な意味はない。

当業者には明らかなように、Ｂ型肝炎ウィルスゲノムは
３種類の異なったＢ型肝炎表面抗原ポリペプチドを生産
る、ことが知られている。これらの変種は一般にＳ−型
、プレＳ１〜型及びプレＳ２−型と呼ばれている。本方
法はポリペプチドのこれらの型のいずれからなる粒子で
あっても回収、精製が可能であり、例えば、粒子がＢ型
肝炎表面抗原ポリペプチドの混合物からなっていてもよ
い。

本明細書で用いられているＢ型肝炎表面抗原という用語
はＳ−型、プレＳヨー型及びプレＳ２−型の粒子並びに
それらの混合物を意味している。

本発明の第１工程はカオトロピック塩（米国特許第４，
６８３，２９３号）の存在下で酵母細胞を溶解る、こと
である。典型的には、細胞はビーズミル中でのホモゲナ
イゼーションにより溶解される。

本明細書で用いられている“カオトロピック化合物”と
いう用語は尿素及びその陰イオンが水に無極性基の移動
を与える塩のような化合物を意味している。そのような
塩には、チオシアネート陰イオン、ヨウ化物及び臭化物
のような／Ｘロゲン化物陰イオン、過塩素酸塩のような
ハイポハライド陰イオン、並びに例えばリチウム、カル
シウム及びバリウムのような陽イオンが含まれる。

適当なカオトロピック化合物の代表的な例は、チオシア
ン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ヨウ化ナトリ
ウム、ヨウ化カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、塩化リ
チウム、臭化リチウム、塩酸グアニジン、グアニジニウ
ムチオシアネート、尿素、及びそれらの類似物である。

この中ではチオシアン酸カリウムが好ましい。

カオトロピック化合物は約１〜約８モル濃度で存在る、
ことが好ましい。

更に、カオトロピック化合物は約６〜約８の範囲のｐＨ
を維持る、ために緩衝されていることが好ましい。当業
者には明らかなように、６〜８の範囲内にｐＨを維持で
きる緩衝系は数多く存在している。選択された塩と相溶
性であるそれらの緩衝系の如何なるものでも本発明に使
用る、ことができる。現時点では好ましい緩衝剤はリン
酸ナトリウムである。

もし必要ならば、プロテアーゼ阻害剤をカオトロピック
化合物媒体中に存在させることができる。

適当なプロテアーゼ阻害剤の代表的な例は、フッ化フェ
ニルメチルスルホニル、及びジイソプロピルフルオロホ
スフェートからなる群から選択る、ことができる。

典型的にはカオトロピック化合物による細胞溶解は、蛋
白質分解を最小にる、ために０〜ｌＯ℃の温度範囲で行
われる。

酵母細胞を溶解した後、Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄液
を更に精製る、前に溶解した細胞ペレットから分離る、
ことが好ましい。この分離は遠心分離又は他の慣用的方
法によって行うことができる。

カオトロピック化合物による抽出によって得られた溶解
された細胞ベレットは、細胞ベレット中に残っている残
留Ｂ型肝炎表面抗原を取り除くために６〜８の範囲のｐ
Ｈを有る、緩衝液で更に洗浄る、ことが好ましい。

もし必要ならば、緩衝されたカオトロピック化合物をそ
の細胞ペレットを洗浄る、ために使用る、ことができる
。

溶解された細胞ペレットを洗浄した後、溶解された細胞
ペレットと結合していた細胞破砕物から分離して得られ
た上澄液を更に精製る、ために先に得られた上澄液と一
緒にる、ことが好ましい。

精製の次の工程は、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄
液を、脂質及び夾雑蛋白質をＢ型肝炎表面抗原を含んで
いる上澄液から沈澱させるために適当な条件にる、こと
である。この沈澱を引き起こす一つの適当な方法は上澄
液を４５〜５５℃、好ましくは４７〜５．０℃の温度範
囲で１０〜３０分間の間加熱る、ことである。

上澄液から脂質及び夾雑蛋白質を沈澱させるための他の
適当な方法は酸の存在下で上澄液を加熱る、方法である
。

Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄液のｐＨを約５゜０〜約６
．０の範囲内のｐＨまで下げるのに十分な酸を渥加しな
ければならない。

本工程で使用できる酸は無！！！酸又は有機酸のどちら
でもよい。適当な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蓚
酸、硝酸、過塩素酸、又は蟻酸からなる群より選択る、
ことができる。

酸性化処理は好ましくは３０℃よりも高くない温度、更
に好ましくは２０℃を越えない温度で行い、即ち４〜３
０℃の範囲、更に好ましくは４〜２０℃の範囲である。

沈澱工程の後、沈澱した細胞成分をＢ型肝炎表面抗原を
含む上澄液から分離る、ことが好ましい。

これは遠心分離やデカンテーションのような如何なる慣
用的分離技術によっても行うことができる。

もし酸性化が沈澱工程で行われるならば、更に精製る、
前にＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液を十分な塩基
で処理して約６〜８の範囲、好ましくは約６．５のｐＨ
に戻すことが好ましい。

ｐＨを約６〜８に戻すのに使用される特定の塩基は本発
明の実施において特に意味はない。適当な塩基の代表的
な例は水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アン
モニウムからなる群から選択る、ことができる。

精製の次の工程は、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄
液を濃縮、限外濾過る、ことである。濃縮及び限外濾過
は、Ｂ型肝炎表面抗原を膜通過させないが、夾雑ペプチ
ド及び電解質は通過させるのに十分な分子量排除限界を
有る、膜を用いて行われる。

５０００〜ｓｏｏ、ｏｏｏ、好ましくは７５，０００〜
１００，０００の範囲内の分子量排除限界を有る、如何
なる市販の濃縮膜でもこの工程に使用る、ことができる
。

濃縮膜はカオトロピック化合物の除去にも使用る、こと
が好ましい。これは６〜８の範囲内のｐＨを有る、カオ
トロピックを含まない緩衝溶液１〜２倍体積を最初の濃
縮の後のＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液に添加し
、再び濃縮工程を繰り返すことによって行うことができ
る。

同体積の緩衝液の各々の添加はＢ型肝炎表面抗原を含ん
でいる溶液中のカオトロピック化合物の濃度を約５０％
の率で希釈している。従って、これらの添加はカオトロ
ピック塩をＢ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液から段階
的に除去している。

精製の次の工程は、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄
液をシリカによる吸着クロマトグラフィーにかけること
である。

吸着クロマトグラフィーはカラム法又はバッチ法によっ
て行うことができる。本方法ではバッチ法が好ましい。

本発明の方法に使用できる適当なシリカは有効表面積が
１００　ｍ＋ｓ”／ｇ厘〜５００　ｍｃｍ”／（ｍの範
囲内である粒子状シリカ水和物またはシリカ無水物のど
ちらでもよい。適当な粒子状シリカは商標名アエロジル
（Ａｅｒｏｓｉｌ）３８０としてニコージャージー（Ｎ
ｅｗ　Ｊｓｔｓｅｙ）のデグッサ・コープ（ｊ）ｅＧｕ
ｓｓａ　Ｃｏｔｐ）から販売されている。

バッチ法において、粒子状シリカは十分な水中に分散し
て、４０〜６０重量％のシリカを含むシリカスラリーを
調製る、。

そして、そのシリカスラリーをＢ型肝炎表面抗原を含ん
でいる上澄液と接触させる。

使用されるシリカは以下に示す量でなければならない。

即ち、最初の粒子濃度が溶解された細胞の抽出物からの
全抽出蛋白質の１％以上であるとき、上澄液中に存在る
、Ｂ型肝炎表面抗原活性１ｍｇ毎について５０　＝　ｌ
　ＯＯｍ　ｇのシリカを上澄液に添加る、。好ましくは
、最初の粒子濃度が１％以上であるときは存在る、ＡＵ
ＳＲＩ　Ａ活性１ｍｇ毎について約６０ｍｇのシリカを
添加る、。

溶解された細胞抽出物中の粒子濃度が１％未満であると
き、シリカの量は減少した粒子濃度に比例して増加させ
なければならない。

ＡＵＳＲＩＡＩ［分析キットはシカゴ（Ｃｈｉｃｌｇｏ
。

ＩＬ）のアボット・ラボラトリーズ（ＡｂｂｏＬＬ　Ｌ
！ｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）から販売されている。

Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液をシリカ溶液と接
触させた後、生成した混合物を１５分〜４時間の間−緒
に撹拌る、ことが好ましい。

Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液を適当な時間シリカ
と接触させた後、その上澄液をシリカと結合したＢ型肝
炎表面抗原と分離る、ことが好ましい。これは遠心分離
やデカンテーションのような慣用的技術により行うこと
ができる。

精製の次の工程はシリカから夾雑蛋白質を除去る、こと
である。これは６〜８の範囲、好ましくは約７．２のｐ
Ｈを有る、緩衝溶液でシリカを洗浄る、ことによって行
うことができる。当業者には明らかなようＩこ、ｐＨを
６〜８の範囲Ｉこ維持る、ための数多くの緩衝系が存在
している。これらの緩衝系のいずれであっても本発明に
おいて使用できる。本発明において好ましい緩衝系はリ
ン酸ナトリウム−塩化ナトリウム緩衝系である。

そのシリカを数回、１回につき５〜１５＠の体積の緩衝
液で洗浄して、夾雑蛋白質の除去を確実にる、ことが好
ましい。夾雑蛋白質の除去を監視る、一つの方法は各洗
浄液の２８０ｎｍでの吸光を測定る、ことである。吸光
か変化せず最小値となったとき、洗浄工程は終了る、。

夾雑蛋白質をシリカから除去した後、Ｂ型肝炎表面抗原
はシリカを０．５〜３モル濃度の尿素を含む適当な緩衝
液と接触させることによって溶出る、ことができる。

適当な緩衝液は９．５〜１１の範囲のｐｉ（を有してい
る。当業者には明らかなように、ｐＨを９゜５〜１１の
範囲に維持できる数多くの緩衝系が存在している。これ
らの緩衝系のいずれであっても本発明において使用でき
る。本発明において好ましくは、緩衝系は炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液である。

もしバッチ法が用いられているならば、尿素を含む８〜
１２倍体積の緩衝液を１〜４時間、好ましくは約２時間
の間シリカと接触させることが好ましい。接触時間経過
後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液をシリカから
分離し、次の精製工程に用いる。

シリカを尿素を含む８〜１２＠体積の緩衝液で更に溶出
る、ことが好ましい。得られた追加のＢ型肝炎表面抗原
を含んでいる画分を先のＢ型肝炎表面抗原を含んでいる
画分と一緒にして、次の精製工程に用いる。

もしカラム法が用いられているならば、クロマトグラフ
ィーカラムを粒子状シリカで充填して、Ｂ型肝炎表面抗
原を含んでいる上澄液をカラムと接触させる。夾雑蛋白
質は上記のバッチ法で述べた６〜８の範囲のｐＨを存る
、Ｈ＃液でシリカから洗浄した。Ｂ型肝炎表面抗原は上
記のバッチ法で述べたように９．５〜１１の範囲のｐＨ
を有る、尿素緩衝液で溶出る、ことができる。

そして、好ましくは、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画
分は尿素を除去る、ために更に限外濾過される。限外濾
過システムにはＢ型肝炎表面抗原が通過できないような
分子量排除限を有している膜を用いなければならない。

適当な膜はｓ、ｏｏｏ〜ｓｏｏ、ｏｏｏの範囲内の分子
量排除限界を有しているものである。

尿素は、６〜８の範囲のｐ）Ｉを有る、尿素を含まない
追加の緩衝液をＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分に限
外濾過の間に添加して、画分を繰り返し限外濾過る、こ
とによってＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分から除去
される。これらの追加の緩衝液を伴う繰り返し限外濾過
は尿素を溶液から段階的に希釈している。

精製の次の工程はＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分を
ゲル濾過る、ことである。

ゲル濾過は、アガロースゲルが充填されたクロマトグラ
フィーカラムで行うことが好ましい。カラムの充填に使
用できる他の適当な極性マトリンクスは、限定はされな
いがデキストランゲル及びポリアクリルアミドゲルから
なる群から選択る、ことができる。

ゲル濾過の充填剤として使用される極性マトリックスは
少なくとも１００万の分子量排除限界を有しなければな
らない。

Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分をクロマトグラフィ
ーカラムに接触させる前に、カラムは適当な緩衝液で平
衡化して、Ｂ型肝炎表面抗原が充填剤に吸着る、ことを
防がなければならない。適当な緩衝液は、６〜９のｐＨ
範囲を有している。

当業者には明らかなように、ｐＨを６〜９の範囲に維持
る、ための数多くの緩衝液が存在している。

これらの緩衝系のいずれであっても本発明において使用
できる。本発明において好ましい緩衝液はトリス（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩ　Ｓ）クロリド
緩衝液である。

カラムを平衡化後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分
をカラム中の充填剤と接触させなければならない。

カラムの平衡化に使用した緩衝液は、夾雑蛋白質及びＢ
型肝炎表面抗原の両方をカラムから洗浄る、のにも使用
る、。

当業者には明らかなように、大きな分子量を有る、分子
はカラムを最初に通過し、小さな分子か続いて出る。カ
ラムは、Ｂ型肝炎表面抗原が溶出る、まで、適当な緩衝
液で連続的に洗浄しなければならない。

溶出液中のＢ型肝炎表面抗原の存在はＢ型肝炎表面抗原
に対して感度のある如何なる市販されている分析キット
又はゲル電気泳動によっても検出る、ことができる。そ
のような適当なキットの−一つはアボット・ラボラトリ
ーズから市販されているＡＵＳＲＩ　Ａｎである。

Ｂ型肝炎表面抗原を有していることについて陽性の画分
を一緒にプールして、必要に応じて濃縮される。濃縮の
適当な手段の一つは限外濾過である。

次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分はイオン交換
クロマトグラフィーによる更なる精製が行われる。精製
は陰イオン交換リガンドで行うことが好ましい。本方法
においては陰イオン交換リガンドがジエチルアミンエチ
ル陽イオンであることが好ましい。

当業者には明らかなように、陰イオン交換リガンドはポ
リアクリルアミドゲル樹脂又はセルロースやデキストラ
ンのような炭水化物ポリマー樹脂に導入され、クロマト
グラフィーカラムはこの充填剤で充填される。カラム配
置は、限定はされないが慣用的な垂直流れ又は半径方向
流れのどちらであってもよい。セルロースが好ましい樹
脂である。

Ｂ型肝炎表面抗原を陰イオン交換樹脂に接触させる前に
、樹脂は６〜９範囲のｐＨを有している適当な緩衝液で
平衡化しなければならない。

数多くの緩衝液がこの範囲のｐＨを維持できる。

これらの緩衝液のいずれであっても本発明において使用
できる。本発明において好ましくはトリス−塩酸緩衝液
である。

平衡化後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分を陰イオ
ン交換樹脂と接触させなければならない。

Ｂ型肝炎表面抗原は直線勾配溶出によって陰イオン交換
樹脂から溶出る、ことが好ましい。これはイオン強度の
直線的変化又はｐａｌの直線的変化によって行うことが
できる。最初、カラムは平衡化工程で使用されたと同一
の緩衝系で洗浄した。

溶媒組成は緩衝系に電解質を導入る、ことによりゆっく
りと変化し、そして電解質の濃度が約０゜３モル濃度ま
でゆっくりと上昇る、。

本発明においては電解質は塩化ナトリウムが好ましいが
、他の電解質でも同様に使用できる。

勾配溶出の結果えられた種々の画分についてＢ型肝炎表
面抗原の含量を測定る、ことが好ましい。

これはゲル濾過の流出液を測定したのと同じようにして
行うことができる。

Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいるこれらの画分は一緒にプ
ールされる。もし必要ならば、得られたプールされたＢ
型肝炎表面抗原を含んでいる画分は限外濾過で濃縮して
もよい。

以上に概説された精製方法により得られるＢ型肝炎表面
抗原は、少なくともワクチンに直接食ませることができ
る程度の純度である。

以下に述べる実施例は本発明の利点を更に説明る、ため
に示されている。しかし、本発明を決して限定る、もの
と解釈してはならない。

実施例１ 本実施例は形質転換されたピチア・パストリス（Ｐｉｃ
ｈｉｘ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）により生産されるＢ型肝炎
表面抗原の精製における本発明のユティリティーを示し
ている。

ピチア・パストリス（ＧＳＩ　１５　；ＮＲＲＬＹ−１
５８５１）細胞のカルチャーをベクターｐＢＳＡＧＩ５
Ｉ（イリノイ、ペオリアにある米国農務省の／−ザンー
レギオナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　
Ｒｓ（ｉｏａｘｌ　Ｒｅ５ｅｘｔｃｈ　Ｃｅ＋＋ｔｅｒ
）に寄託番号ＮＲＲＬＢ−１８０２１で寄託されている
大腸菌宿主から得られる）で形質転換した。

ピチア・パストリスの培養は慣用的な方法によって細胞
濃度２６４ｇ／Ｌ湿重量まで培養した。

１９００ｍ１の培養液を培養槽から分離した。

この培養液を８５０Ｏｒｐｍ　（ＲＣＦ、ｒ、ｗ、＝７
７００）で約１０分間遠心分離し、その上澄液を捨てた
。

３Ｍの濃度のチオシアン酸カリウム及びｌｏｍＭのリン
酸ナトリウムを含むカオトロピック緩衝液を抽出工程の
ために調製した。プロテアーゼ阻害剤、７ソ化フエニル
メチルスルホニルも１ｍＭの濃度で添加した。得られた
緩衝液のｐＨは７゜５である。

溶解工程は、ビーズミル中で５００ｍ１の０゜５ｍｍガ
ラスビーズ存在下でペッレトからの５００ｇの細胞を１
５００ｍｌのカオトロピック緩衝液中で撹拌る、ことに
より行った。

細胞−ビーズの混合物を１５分間、１２．５０Ｏｒｐｍ
　（ｒ、、、＝１６，０００．ＲＣＦ）で遠心分離した
。上澄液を細胞−ビーズ混合物からデカンテーションに
より分離して、次の精製に用いた。

細胞−ビーズ混合物は１，０００ｍ１のカオトロピック
緩衝液で追加の洗浄を行った。得られた上澄液は細胞−
ビーズ混合物から分離し、次の精製に用いた。

カオトロピック化合物による抽出は４℃の温度で行った
。他の全ての工程も特に述べない限りは４℃で行った。

これは蛋白質分解を最少にる、ためである。

上澄液を一緒にして、その上澄液を室温まで湯浴中で暖
めることにより沈澱を起こさせた。上澄液が室温に一旦
達したならば、ｌ規定のリン酸を上澄液の９１１を７．
５から５に下げるために上澄液に添加した。次に、その
溶液を室温で約３０分間放置した。この時間の間に、夾
雑蛋白質及び脂質はＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄
液から沈澱させられる。

上澄液を４℃に冷却し、１２．５０Ｏｒｐｍで１０分間
遠心分離した。その上澄液を沈澱した破砕物から分離る
、ためにデカントした。

上澄液のｐＨをｌ規定の水酸化ナトリウムを添加る、こ
とにより６．５まで上げた。

この時点で、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は３
，１２０ｍ１であった。ＡＵＳＲＩＡＩ［アッセイを行
った。このアッセイは上澄液中に２３６ｍｇのＢ型肝炎
表面抗原があることを示した。

これは８０．５％の回収率である。

次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液を分子量排除
限界１００，０００を何る、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）
のホローファイバー限外濾過システムで＃縮、限外濾過
を行った。

最初に約０．５リツターまで濃縮して後、ｐＨ７，５の
リン酸ナトリウム緩衝液ｌリッターをＢ型肝炎表面抗原
を含んでいる上澄液に添加して、得られた混合物を更に
濃縮した。これはチオシアン酸カリウムが溶液から希釈
されるまで２回繰り返した。

チオシアン酸カリウムがＢ型肝炎表面抗原を含んでいる
上澄液から限外濾過により除去されて後、再度Ａ　ＬＪ
　Ｓ　ＲＩ　Ａ　Ｉ！アッセイを４０５ｍ１の残留物に
ついて行った。このアッセイによれは、２３１ｍｇのＢ
型肝炎表面抗原が含まれ、７８．８％の回収率であるこ
とが示された。

次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は有効表面
積３８０ｍ”／ｇを有る、シリカにバッチ結合させた。

これは以下の方法により行った。最初に、乾燥シリカを
蒸留水で５０％スラリー（乾燥重量／体積）として調製
した。これによりスラリーｍｌ光たり５０ｍｇのシリカ
を含む混合物を調製した。

シリカスラリー２７５ｍ１をＢ型肝炎表面抗原を含んで
いる上澄液に添加し、そしてその混合物を室温で２時間
ゆっくりと撹拌した。

次に、肝炎−シリカ混合物を４℃に冷却し、５．００Ｏ
ｒｐｍ　（ｒ、、、＝２５００でＲＣＦ）で１０分間遠
心分離した。その上澄液は捨てた。

次に、シリカは、Ｏ，１５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７のリ
ン酸緩衝液５００ｍ１で洗浄した。洗浄液は捨てた。リ
ン酸緩衝液による洗浄工程は、上澄液の２８０ｎｍでの
吸光が変化しない最小値になるまで続けた。

次に、Ｂ型肝炎表面抗原は２５ｍＭ炭酸ナトリウム、２
５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、及び１モル尿素を含む緩衝
液でシリカから溶出した。緩衝液の最終的ｐＨは１０で
ある。

肝炎−シリカ混合物を５００ｍ１の尿素緩衝液中に入れ
て、室温で２時間撹拌した。

シリカ／肝炎を含んでいる緩衝された尿素溶液を４℃に
冷却し、５．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した。上
澄液をデカントして、次の精製工程に用いた。

シリカは第１回目と同じように緩衝された尿素溶液５０
０ｍ１で第２回目の溶出を行った。得られた上澄液は最
初の上澄液と一緒にして、尿素を除去る、ために濃縮及
び限外濾過工程に付した。

この時点では、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は
分子量排除限界１００，０００の膜を仔る、アミコンホ
ローフィルターダイアフィルトレ−ンヨンシステムにお
いて濃縮された。

最初に約１００　ｍ　ｌに濃縮して後、ｐＨ７，５の１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液２００ｍ１をＢ型肝炎表
面抗原を含んでいる上澄液に添加して、更に濃縮を行っ
た。この工程は尿素を除去る、効果がある。この手順を
、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分から尿素の８９％
を除去できるように２回繰り返した。

限外濾過の後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分を１
６．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した。

この時点でＡＵＳＲＩ　Ａｌｌアッセイを行った。

アッセイは肝炎２３４ｍｇか存在し、６４．５％の回収
率であることを示した。

次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液をゲル濾過
にかけた。

市販されているセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｃ
Ｌ４Ｂサイズ排除カラムを使用した。このカラムは２リ
ツターの体積仔しており、分子量排除限界２０ＸＩＯ’
を有る、アガロースゲルが充填されている。

そして、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分をこのカラ
ムと接触させた。肝炎はｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸
でカラムから溶出した。

カラムから溶出した画分を集めて、Ｂ型肝炎表面抗原含
量Ｊ二ついてアッセイした。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析に基づくＢ型肝炎表面抗原活性を有る、画分
をプールして、後の精製に用いた。使用したアッセイは
アボットラボラトリーズから市販されているＡＵＳＲＩ
ＡＩＩアッセイ試験である。

プールした画分は全体で１７０ｍｇのＢ型肝炎表面抗原
活性があり、これは６３．１％の回収率に相当る、。

そして、このＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分はアミ
コンＹＭ３０フィルターを用いて濃縮しｔ；。

次に、濃縮されたＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分は
イオン交換クロマトグラフィーにかけた。

イオン交換クロマトグラフィーはセルロース支持体マト
リックスに結合されているジエチルアミノエチルカチオ
ンを用いるカラムにおいて行った。

このカラムはｐＨ８のトリス−クロリド緩衝液で平衡化
した。

樹脂を平衡化した後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画
分のプールをイオン交換クロマトグラフィー樹脂に接触
させた。

そして、Ｂ型肝炎表面抗原は、濃度がＯから３Ｍまで変
化る、塩化ナトリウムを有る、ｐＨ８のトリス−クロリ
ド緩衝液を使用して直線勾配溶出により溶出した。

クロマトグラフィーカラムから溶出した画分を集めて、
前記のようにＢ型肝炎表面抗原についてアッセイした。

Ｂ型肝炎表面抗原活性を示す画分のサンプルを銀染色し
、得られたゲルをＢ型肝炎表面抗原の存在と純度を確認
る、ために分析した。

Ｂ型肝炎表面抗原を保持している画分を一緒にプールし
た。更に、ＡＵＳＲＩＡ■アッセイを′行ったところ、
Ｂ型肝炎表面抗ｗ、６３　ｍ　ｇが含まれ、回収率４２
％であることが確認された。生成物の純度は約９５％で
あった。

Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液を０．２ミクロンフ
ィルターで濾過し、−７０℃で保存した。

この実施例は、Ｂ型肝炎表面抗原蛋白質が酵母細胞から
本発明により回収できることを示している。

この実施例は単に本発明の詳細な説明る、ために提示さ
れたものであり、本発明の範囲及び特許請求の範囲を限
定る、ものとして理解してはならない。

本発明の思想及び構成から遊離る、ことのない種々の変
更や改変は特許による保護が求められている範囲に入る
ものと思われる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ピチア・パストリス（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｔｏ
   ｒｉｓ￥）細胞からＢ型肝炎表面抗原を生産する方法で
   あって； ａ）緩衝されたカオトロピック化合物の存在下で前記酵
   母細胞を溶解すること及びＢ型肝炎表面抗原を含んでい
   る上澄液を前記溶解細胞から分離すること； ｂ）工程（ａ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
   る上澄液を、脂質及び夾雑蛋白質を前記上澄液から沈澱
   させるための適当な条件にすること； ｃ）工程（ｂ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
   る上澄液を限外濾過すること； ｄ）工程（ｃ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
   る残留物（レテンテート）をシリカと接触させること； ｅ）夾雑蛋白質を、６〜８の範囲内のｐＨを有する緩衝
   液でＢ型肝炎表面抗原を吸着している前記シリカから洗
   い流すこと； ｆ）Ｂ型肝炎表面抗原を、０．５から８モル濃度までの
   尿素を含み９．５〜１１．０の範囲内のｐＨを有してい
   る緩衝された溶出液でシリカから溶出すること； ｇ）工程（ｆ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
   る画分を、Ｂ型肝炎表面抗原を夾雑蛋白質から分離する
   のに適当なゲル濾過にかけること；及び ｈ）工程（ｇ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
   る画分を、Ｂ型肝炎表面抗原を夾雑蛋白質から分離する
   ために適当な陰イオン交換クロマトグラフィー工程にか
   けること；からなる前記方法。 ２、前記酵母細胞がガラスビーズ破砕によって溶解され
   る、請求項１記載の方法。 ３、前記カオトロピック化合物がチオシアン酸ナトリウ
   ム、チオシアン酸カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化
   カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、塩化リチウム、臭化
   リチウム、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジウム
   、及び尿素からなる群から選択される、請求項１又は２
   記載の方法。 ４、前記カオトロピック化合物が約１モル濃度〜約８モ
   ル濃度で存在している、請求項３記載の方法。 ５、前記カオトロピック塩が約６〜約８の範囲内のｐＨ
   を有する緩衝系によって緩衝されている、請求項４記載
   の方法。 ６、脂質及び夾雑蛋白質の前記沈澱が、前記Ｂ型肝炎表
   面抗原を含んでいる上澄液を４５〜５５℃の範囲の温度
   で１０分ないし３０分間加熱することによってなされる
   、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 ７、脂質及び夾雑蛋白質の前記沈澱が、前記Ｂ型肝炎表
   面抗原を含んでいる上澄液を４〜３０℃の範囲の温度に
   加熱し、且つ前記上澄液のｐＨを４．５〜５．５の範囲
   に下げるのに十分な量の酸を添加することによってなさ
   れる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 ８、前記酸が塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蓚酸、硝酸、
   過塩素酸及び蟻酸からなる群から選択される、請求項７
   記載の方法。 ９、前記沈澱の後、前記Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる
   上澄液のｐＨを６〜８の範囲まで上げるのに十分な塩基
   を添加する、請求項７又は８記載の方法。 １０、前記限外濾過が５，０００〜５００，０００の範
   囲内の分子量排除限界を有する膜で行われる、請求項１
   〜９のいずれか１項記載の方法。 １１、前記シリカが１００ｍ＾２／ｇｍ〜５００ｍ＾２
   ／ｇｍの範囲内の有効表面積を有している、請求項１〜
   １０のいずれか１項記載の方法。 １２、最初の粒子濃度が溶解細胞抽出物からの全抽出蛋
   白質の１％以上である場合、前記Ｂ型肝炎表面抗原を含
   んでいる上澄液中に存在するＢ型肝炎表面抗原活性１ｍ
   ｇ毎について、５０〜１００ｍｇのシリカが使用される
   、請求項１１記載の方法。 １３、最初の粒子濃度が溶解細胞抽出物からの全抽出蛋
   白質の１％未満である場合、前記Ｂ型肝炎表面抗原を含
   んでいる上澄液中に存在するＢ型肝炎表面抗原活性１ｍ
   ｇ毎について、１％当たり５０〜１００ｍｇのシリカの
   基本量から比例的に増加させた相当のシリカを使用する
   、請求項１１記載の方法。 １４、前記シリカが、４０〜６０重量％のシリカを含む
   シリカスラリーとして存在している、請求項１１、１２
   又は１３記載の方法。 １５、前記Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分を、アガ
   ロースゲル、デキストランゲル、及びポリアクリルアミ
   ドゲルからなる群から選択される極性マトリックス上で
   ゲル濾過を行う、請求項１〜１４のいずれか１項記載の
   方法。 １６、前記極性マトリックスが少なくとも１００万の分
   子量排除限界を有している、請求項１５記載の方法。 １７、前記Ｂ型肝炎表面抗原が６〜９の範囲内のｐＨを
   有する緩衝液によって前記極性マトリックスから溶出さ
   れる、請求項１６記載の方法。 １８、前記イオン交換クロマトグラフィーがジエチルア
   ミノエチルカチオンを用いる陰イオン交換樹脂によって
   行われる、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。 １９、前記Ｂ型肝炎表面抗原が６〜９の範囲内のｐＨを
   有する緩衝液及び０モル濃度から０．３モル濃度までの
   範囲の電解質を使用することによって陰イオン交換樹脂
   から溶出される、請求項１８記載の方法。 ２０、（ａ）前記酵母細胞が約３モル濃度のチオシアン
   酸カリウム及び約７．５のｐＨを有するリン酸緩衝液の
   存在下で溶解され； （ｂ）前記沈澱がｐＨを５．０まで下げるのに十分な濃
   度を有するリン酸の存在下で約２０℃の温度で行われ； （ｃ）前記沈澱の後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶
   液のｐＨを約６．５まで上げるのに十分な水酸化ナトリ
   ウムが添加され； （ｄ）前記Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は、約
   ７．５のｐＨを有するリン酸緩衝液の存在下で１００，
   ０００の分子量排除限界を有する膜上で限外濾過され； （ｅ）前記Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は、前
   記上澄液中に存在するＢ型肝炎表面抗原活性１ｍｇ毎に
   ついてシリカ６０ｍｇが使用されることとなるように約
   ５０重量％シリカスラリーの十分量と接触させられ； （ｆ）前記夾雑蛋白質は０．１５ＭＮａＣｌを含みｐＨ
   約７のリン酸で緩衝された食塩緩衝系で前記シリカから
   洗い流され； （ｇ）前記Ｂ型肝炎表面抗原は約１モル濃度の尿素及び
   約１０．１のｐＨを有する炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液に
   よって前記シリカから溶出され； （ｈ）工程（ｇ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んで
   いる画分は、約８のｐＨを有するトリス−クロリド緩衝
   液の存在下で１００，０００の分子量排除限界を有する
   膜で限外濾過され： （ｉ）前記ゲル濾過は２０×１０＾５の分子量排除限界
   を有するアガロースゲルで行われ、前記Ｂ型肝炎表面抗
   原は約８のｐＨを有するトリス−クロリド緩衝液で前記
   アガロースゲルから溶出され；及び （ｊ）前記イオン交換クロマトグラフィーはジエチルア
   ミノエチルカチオンで行われ、前記Ｂ型肝炎表面抗原は
   ０モルから０．３モルまでの範囲の濃度の塩化ナトリウ
   ムを有するトリス−クロリド緩衝液で前記カチオンから
   溶出される； 請求項１記載の方法。 ２１、前記酵母細胞がｐＢＳＡＧＩ５Ｉ（ＮＲＲＬＢ−
   １８０２１）で形質転換されたピチア・パストリス（￥
   Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）ＧＳ１１５（Ｎ
   ＲＲＬＹ−１５８５１）である、請求項１〜２０のいず
   れか１項記載の方法。