JPH06209786A - ヒトパルボウイルス構造タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記のＡ、Ｂ及びＣの３工程のうち少なくと
も２工程を含む（但し、ＡとＢの組合せを除く）ことを
特徴とするヒトパルボウイルス構造タンパク質の精製方
法。Ａ工程：等電点電気泳動工程、Ｂ工程：陰イオン交
換工程、Ｃ工程：疎水クロマト工程。 【効果】 本発明の精製方法により、ヒトパルボウイル
ス構造タンパク質を生産した大腸菌から高純度のヒトパ
ルボウイルス構造タンパク質を取得することが可能とな
った。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパルボウイルス構
造タンパク質の遺伝子を遺伝子組換え法によって導入さ
れた宿主細胞が生産したヒトパルボウイルス構造タンパ
ク質の精製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】ヒトパルボウイルスは、1975
年に輸血用血液中に偶然発見された〔Lancet,i:72-73(1
975) 〕が、病原性は不明であった。その後、鎌状赤血
球貧血に生じた急性赤芽球ろうがヒトパルボウイルスに
よるものであることが報告された〔Lancet,i:664-665(1
981)〕。また、小児に流行する伝染性紅斑症の病因ウイ
ルスであることが確認され〔Lancet,i:1378(1983) 〕、
それが感染源となり成人にも感染が及び、関節炎を主症
状とする病気が起こることが分かった。さらに伝染性紅
斑流行後に胎児水腫で流産した症例が報告され〔Lance
t,ii:1033-1034(1984) 〕、妊婦のヒトパルボウイルス
感染が死産や胎児水腫の原因となることが証明され、わ
が国においてもヒトパルボウイルス感染による胎児死亡
例が報告された〔日本産婦人科学会誌,40:99-100(198
8)〕。そして、健常成人においても、不定の発疹症、出
血熱様疾患、関節炎の原因となるところが知られ〔医学
の歩み,142:530-532(1987)〕、最近ではリウマチとの関
係も推測されている〔Arch.Intern.Med.148:2587-2589
(1988) 〕。以上のように、ヒトパルボウイルスは、臨
床的にきわめて興味深いウイルスであり、人の生命に影
響を与えることもありうることから、治療や予防対策の
必要性が明確となってきている。ヒトパルボウイルス感
染の証明は、血清中に抗ヒトパルボウイルス抗体を検出
することによって行われている。この抗体検出に必要な
ウイルス抗原の取得方法は、細胞培養でウイルスを増殖
させる方法、もしくは、遺伝子組換え法、たとえばウイ
ルス遺伝子をクローニングして、抗原タンパク質や非感
染性のウイルス粒子を大量に発現させる方法に大別され
る。

【０００３】しかしヒトパルボウイルスの細胞培養系を
用いた方法で、ヒトパルボウイルス抗原を有用かつ大量
に取得することは非常に困難である〔臨床と微生物,16:
177-186(1989) 〕。このため遺伝子組換え法の研究が進
められている。遺伝子組換え法では目的のタンパク質の
遺伝子を含むＤＮＡ分子を導入した宿主細胞を培養し、
その宿主細胞内に目的のタンパク質を発現させるという
手法がよく用いられる。これまでにもＢ型肝炎ウイルス
など様々なウイルスの抗原タンパク質を発現させること
に成功している。これら抗原タンパク質はウイルス感染
の証明やワクチンの作製に用いられており、ヒトパルボ
ウイルスの場合にも同様な用途が期待できる。しかし遺
伝子組換え法で生産した抗原タンパク質は宿主細胞由来
のタンパク質が夾雑しているためそのままでは使用でき
ない。夾雑しているタンパク質の中にはプロテアーゼが
含まれており抗原タンパク質が分解されてしまう恐れが
あるからである。さらに夾雑しているタンパク質が多い
ほど抗原タンパク質に対する抗ウイルス抗体の特異性は
低くなってしまい、ウイルス感染の検査キットを作製し
た場合、その性能を低下させてしまう恐れがある。以上
のことから宿主細胞由来のタンパク質を取り除き高純度
の抗原タンパク質を取得することが望まれている。

【０００４】現在までに米国でクローン化されたヒトパ
ルボウイルス遺伝子の塩基配列〔J.Virol.,58:921-936
(1986) 〕の解析から、ウイルス構造タンパク質として
ウイルス粒子を構成するのは、ＶＰ−１（分子量約84KD
a ）及びＶＰ−２（分子量約58KDa ）の２種類のタンパ
ク質のみであり、ヒトパルボウイルスに感染した宿主が
これらＶＰ−１及びＶＰ−２を標的として抗原抗体反応
を惹起することが確かめられている〔J.Virol.,61:2627
(1987)〕。そして、このヒトパルボウイルス構造タンパ
ク質であるＶＰ−１あるいはＶＰ−２の遺伝子の全部あ
るいは一部からヒトパルボウイルス構造タンパク質の全
部あるいは一部を大腸菌を宿主細胞として発現させた報
告例がいくつかある〔Bio/Technology,5:1077-1081(198
7), Med.Microbiol.Immunol.,179:169-175(1990),J.Ge
n.Viol.,71:2665-2672(1990), J.Clin. Microbiol.,30:
305-311(1992), 特願平4-281017号〕。これらの発現物
は一部を除き非常に疎水性が高く可溶化が困難であり、
特にＶＰ−１を発現させた場合においては高濃度のＳＤ
Ｓ存在下で可溶化された例が報告されているにすぎない
〔Bio/Technology,5:1077-1081(1987), J.Gen.Viol.,7
1: 2665-2672(1990) 〕。ところが高濃度のＳＤＳ存在
下ではタンパク質の存在状態が異なるものになってしま
うため、このような形のままウイルス抗体検出のキット
等に利用するのは望ましくない。また大腸菌に発現させ
た後、単離精製した例もあるが、いずれもＶＰ−１ある
いはＶＰ−２の一部のみである。例えばβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合タンパク質として発現させた後、アフィ
ニティークロマトグラフィーを用いた例〔Med.Microbio
l.Immunol.,179:169-175(1990)〕や同じくβ−ガラクト
シダーゼとの融合タンパク質として発現させた後、アガ
ロースゲル上で電気泳動を行なった後、当該分子量の部
分のバンドを切り出す方法（ProSieveアカ゛ロース ：FMC Bio
Products, Rockland,ME ）を用いた例〔J.Clin. Micro
biol.,30:305-311(1992) 〕があるが、あくまでＶＰ−
１あるいはＶＰ−２の可溶性のある一部を精製した例に
過ぎない。しかしＶＰ−１あるいはＶＰ−２の一部を用
いウイルス感染の検査キットを作製した例では伝染性紅
斑患者血清より精製したパルボウイルス粒子を用いた例
よりウイルス抗体の検出率が低くなってしまうという結
果が報告されており〔J.Clin. Microbiol.,30:305- 31
1(1992) 〕、産業上の使用には問題がある。ＶＰ−１あ
るいはＶＰ−２の全部を精製した例では上記のProSieve
アガロース法を用いた報告があるが〔特願平4-281017
号〕、この方法はスケールアップが困難であり大量の精
製は不可能である。したがって産業上の利用が可能なＶ
Ｐ−１あるいはＶＰ−２の精製法は未だ報告されていな
い。本発明者らは、従来困難であったヒトパルボウイル
ス構造タンパク質ＶＰ−１及びＶＰ−２の精製を可能に
すべく、タンパク質の精製に用いられている手法を種々
検討した結果、この目的を達成する方法を見いだした。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】すなわち、本発明は、 （１）下記のＡ、Ｂ、及びＣの３工程のうち少なくとも
２工程を含む（但し、ＡとＢの組合せを除く）ことを特
徴とするヒトパルボウイルス構造タンパク質の精製方
法。 Ａ工程：ヒトパルボウイルス構造タンパク質を含む溶液
を等電点電気泳動し、ｐＨ６〜８の分画を回収する工
程。 Ｂ工程：ヒトパルボウイルス構造タンパク質を陰イオン
交換体に吸着させ、無機塩濃度０．０５Ｍ〜０．６Ｍの
溶液で溶出させる工程。 Ｃ工程：ヒトパルボウイルス構造タンパク質を疎水クロ
マト担体に吸着させ、無機塩濃度０．３Ｍ以下の溶液又
は５（ｖ／ｖ）％〜７０（ｖ／ｖ）％の有機溶媒を含ん
だ溶液で溶出させる工程、 （２）陰イオン交換体の官能基がトリメチルアミノエチ
ル基、ジエチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル
基、第４級アミノエチル基及びアミノエチル基の群から
選択された一種であり、疎水クロマト担体の官能基がフ
ェニル基及び炭素数Ｃ₁ 〜Ｃ₈ の疎水性官能基の群から
選択された一種であることを特徴とする（１）記載の方
法である。

【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明は
ＶＰ−１及びＶＰ−２を精製するための方法として、以
下に述べる三つの工程のうち等電点電気泳動工程（Ａ工
程）と疎水クロマト工程（Ｃ工程）の組合せまたは陰イ
オン交換工程（Ｂ工程）と疎水クロマト工程（Ｃ工程）
または等電点電気泳動工程（Ａ工程）と陰イオン交換工
程（Ｂ工程）と疎水クロマト工程（Ｃ工程）の組合せか
ら成るが、各々の組合せにおいて実施の順番はどれを先
におこなっても効果に違いはなく最終純度で９５％以上
の精製品を得ることができる。しかし、試料のロス及び
大量試料の処理を考慮すると、陰イオン交換工程（Ｂ工
程）と疎水クロマト工程（Ｃ工程）の組合せが特に好ま
しい。本発明に用いる精製原料としては例えば特願平４
−２８１０１７号記載の様な方法で培養した組換え大腸
菌を用いることができるが、組換え体のＶＰ−１または
ＶＰ−２であればどのような方法で取得したものでも本
精製法を利用できる。

【０００７】Ａ工程：等電点電気泳動工程 等電点電気泳動では非イオン性あるいは両性イオン界面
活性剤や変性剤が使用可能である。例えば、非イオン性
界面活性剤ではジギトニンやオクチルグルコシドやＴｗ
ｅｅｎ ２０なら３（Ｗ／Ｖ）％程度、両性イオン界面
活性剤ではＣＨＡＰＳやＣＨＡＰＳＯなら３（Ｗ／Ｖ）
％程度、変性剤では尿素なら８Ｍ程度まで使用可能であ
る。等電点電気泳動用の装置は、例えばロトフォア
（（株）ハ゛イオラット゛社製）が市販されており利用可能であ
る。以下、このロトフォアを用いた場合について説明す
るが本発明はこの装置の使用のみに限定されるものでは
ない。原料溶液としては培養した組換え大腸菌を公知の
方法、例えばリゾチームと非イオン性界面活性剤を用い
た方法で取得したＶＰ−１またはＶＰ−２を含む封入体
を３〜８Ｍの尿素で溶解した溶液を用いる。サンプル溶
液の液量は３０〜６０ｍｌとする。タンパク質量は１〜
１００ｍｇ程度とする。このサンプル溶液の中に両性担
体を０〜８（Ｗ／Ｖ）％程度添加する。両性担体は例え
ばＢｉｏ−Ｌｙｔｅ（（株）ハ゛イオラット゛社製）やファルマ
ライト（（株）ファルマシア社製）など多くの種類のものが市
販されており形成されるｐＨ勾配も２．５〜５、３〜１
０、６〜９、８〜１０．５など様々なものがあるが、使
用にあたってｐＨレンジが６〜８を含むものであれば特
に種類に限定はない。泳動条件は８〜２０Ｗ定電力で１
〜１０時間程度行なうが例えば１２Ｗで３時間行えば良
好な結果が得られる。さらに泳動中は泳動チャンバー内
の温度を１０〜２５℃、好ましくは１６〜２０℃程度に
保つ。電気泳動中に両性担体により泳動チャンバー内に
ｐＨ勾配が形成され、タンパク質は表面に持っている電
荷の和が０になるｐＨごとに分離する。泳動終了後、サ
ンプルをいくつかの画分に分取しｐＨを測定する。この
うちｐＨが６〜８の画分をこの工程での精製画分とする
が、ＶＰ−１の場合はｐＨ６．８〜７．６、ＶＰ−２の
場合はｐＨ６．０〜７．０の画分を選択するとより精製
度が向上する。疎水クロマト工程あるいは陰イオン交換
工程を先に行なった場合にはその精製画分を必要に応じ
て濃縮、希釈、透析し両性担体を添加したものを原料溶
液とする。

【０００８】Ｂ工程：陰イオン交換工程 陰イオンクロマトグラフィー用のクロマト材として種々
ものが市販されているがＶＰ−１及びＶＰ−２の精製に
あたってはそのうちトリメチルアミノエチル基、ジエチ
ルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基、第４級ア
ミノエチル基、アミノエチル基を結合させたものが好ま
しい。原料溶液としては培養した組換え大腸菌を公知の
方法、例えばリゾチームと非イオン性界面活性剤を用い
た方法で取得したＶＰ−１またはＶＰ−２を含む封入体
を下記の条件の緩衝液中に溶解した溶液を用いる。緩衝
液の条件は０〜８Ｍの尿素を含みｐＨ７．５〜１０．０
の範囲のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液
等が例示されるが、その他緩衝作用を持つ成分について
は通常のカラムクロマトグラフィーに用いられているも
のを適宜使用できる。また濃度は緩衝作用のある範囲で
よい。陰イオン交換担体をカラムに充填し、原料溶液と
同じ緩衝液で予め平衡化しておく。原料溶液をカラムに
添加した後、平衡化緩衝液で洗浄する。その後、塩化ナ
トリウムなどの無機塩類を添加した緩衝液をカラムに送
液し、ゲル担体に結合している陰イオン交換基との間の
静電相互作用の差を利用しタンパク質を分離する。無機
塩類が塩化ナトリウムの場合、０．０５Ｍ〜０．６Ｍの
間で溶出されるが、０．１〜０．３Ｍでの溶出画分を選
択すると精製度が向上する。またカラム温度は、通常４
℃〜室温程度であれば分離に影響しない。疎水クロマト
工程あるいは等電店電気泳動工程を先に行った場合には
その精製画分を原料溶液として用いるが、下記の条件の
緩衝液となるように透析、必要な成分の添加等の操作を
行う。緩衝液の条件は０〜８Ｍの尿素を含みｐＨの範囲
が７．５〜１０．０のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、Ｃ
ＡＰＳ緩衝液等が例示されるが、その他緩衝作用を持つ
成分については通常のカラムクロマトグラフィーに用い
られているものを適宜使用できる。また濃度は緩衝作用
のある範囲でよい。

【０００９】Ｃ工程：疎水クロマト工程 疎水クロマトグラフィー用のクロマト材としてゲル担体
に種々の疎水性基を結合させたものが現在市販されてい
るが、ＶＰ−１及びＶＰ−２の精製にあたってはそのう
ちフェニル基や炭素数Ｃ₁ 〜Ｃ₈ の疎水性基を結合させ
たものが好ましい。原料溶液は培養した組換え大腸菌を
公知の方法、例えばリゾチームと非イオン性界面活性剤
を用いた方法で取得したＶＰ−１またはＶＰ−２を含む
封入体を下記の条件の緩衝液に溶解した溶液を用いる。
緩衝液の条件は０〜８Ｍの尿素を含んだ酢酸緩衝液、ト
リス緩衝液、リン酸緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液等が例示さ
れるが、その他、緩衝作用をもつ成分については通常の
カラムクロマトグラフィーに用いられるものを適宜使用
できる。また濃度は緩衝作用のある範囲であればよい。
この溶液に硫安などの無機塩類をタンパク質が沈澱しな
い範囲で添加する。

【００１０】疎水クロマト担体をカラムに充填し、原料
溶液と同じ組成の緩衝液で予め平衡化しておく。サンプ
ルをカラムに添加した後、さらに平衡化緩衝液で洗浄す
る。その後、無機塩類の濃度を落とした緩衝液をカラム
に送液し、ゲル担体に結合している疎水性基との間の疎
水結合の強さの差を利用してタンパク質を分離する。無
機塩類が硫安の場合、濃度を０．３Ｍ以下にするとＶＰ
−１あるいはＶＰ−２は溶出されてくるが、０．１Ｍ以
下での溶出が有効であり、さらにメタノール、エタノー
ル、プロパノール、アセトニトリルといった有機溶媒を
含む溶液による溶出はより効果的である。例えばエタノ
ールの場合、７０（Ｖ／Ｖ）％までの溶液が使用可能で
あり望ましくは１０〜５０（Ｖ／Ｖ）％である。またカ
ラム温度は、通常４℃〜室温程度であれば分離に影響し
ない。但し、等電点電気泳動工程及び陰イオン交換工程
を先に行った場合にはその精製画分にタンパク質が沈澱
しない範囲で硫安などの無機塩類を添加したものを原料
溶液として用いるが、カラムの平衡化緩衝液には原料溶
液と同じ濃度の無機塩類及び０〜８Ｍの尿素を含んだ酢
酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝
液等が例示されるが、その他、緩衝作用をもつ成分につ
いては通常のカラムクロマトグラフィーに用いられるも
のを適宜使用できる。また、濃度は緩衝作用のある範囲
でよい。また、陰イオン交換工程と疎水クロマト工程の
組合せにおいて陰イオン交換工程を先に行った場合に
は、その精製画分にタンパク質が沈澱しない範囲で硫安
などの無機塩類を添加したものを原料溶液として用い
る。またカラムの平衡化緩衝液には原料溶液の組成と同
じものを用いる。

【００１１】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 ［実施例１］等電点電気泳動工程の後に疎水クロマト工
程を行なったＶＰ−１の精製例 Ａ工程：等電点電気泳動工程 特願平４−２８１０１７号記載の方法、すなわち以下の
方法でＶＰ−１を含む封入体を取得した。大腸菌Ｎ４８
３０−１［ｐＶＰ１００］を５０μｇ／ｍｌＡｍｐｉｃ
ｉｌｉｎを含むＬＢ培地２ｍｌで３０℃、７時間培養し
た。次に２Ｌ発酵槽を用いて１ＬのＪＡＲ培地（0.7% N
a₂HPO₄, 0.3% KH₂PO₄, 0.5% (NH₄)₂SO ₄, 0.1% クエン 酸ナト
リウム, 0.02% MgSO₄・7H₂O, 2.5% ク゛ルコース, 0.4% 酵母抽出
物, 0.4% カサ゛ミノ 酸, 0.4% ヒスチシ゛ン, 0.4% イソロイシン, 0.4%
ハ゛リン, 50 μg/ml アンヒ゜シリン ）で３０℃、約１６時間培養
した。さらに７０Ｌ発酵槽を用いてＪＡＲ培地（４０
Ｌ）で３５℃で培養した。Ｏ．Ｄ．550 ＝５に達した
時、カザミノ酸を終濃度２％、ヒスチジン、イソロイシ
ン及びバリンをそれぞれ終濃度０．４％になるように添
加した後、４２℃、３時間培養した。培養液は限外ろ過
装置で濃縮後、菌体を５Ｌの破砕ｂｕｆｆｅｒ（50mM T
ris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,30mM NaCl）に懸濁した。Ｍ
ａｎｔｏｎ・Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーを用いて菌体
を破砕した（7,500PSI× 3回）。次に５，５００ｇで３
０分間遠心分離し沈澱を集めた。この沈澱を２．５Ｌの
Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（50mM Tris-HCl(pH
8.0), 50mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% Triton X-100 ）に
懸濁、４℃、３０分間撹拌の後、５，５００ｇで１５分
間遠心分離し沈澱を集めた。このＤｅｔｅｒｇｅｎｔ
ｂｕｆｆｅｒによる懸濁−遠心分離操作を３回行い沈澱
（封入体）を取得した。上記の方法で得られた封入体の
うち湿重量１００ｍｇを８Ｍ尿素５０ｍｌ中に溶解し
た。この溶液のタンパク質量は２３ｍｇであった。この
溶液中に両性担体としてＢｉｏ−Ｌｙｔｅ３／１０
（（株）ハ゛イオラット゛社）を１ｍｌ添加した。調製用液体等
電点電気泳動装置ロトフォア（（株）ハ゛イオラット゛社）を予
め組み立て、４℃の水を循環させ冷却した。次に上記サ
ンプル溶液をチャンバー内に注入し３０分程度放置しサ
ンプルを冷却した後、定電力１２Ｗで泳動を開始した。
電圧がほぼ７００Ｖで平衡に達した時点（泳動開始後約
３時間）で泳動を終了した。４℃の水による冷却は泳動
終了まで継続した。サンプルを２０に分画して回収し
た。これら画分をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動し
て観察したところ、主としてｐＨ６．８〜７．６の画分
にＶＰ−１の分子量に相当するバンドを認めたのでこれ
を等電点電気泳動工程における精製サンプルとした。こ
のサンプルのタンパク質量は６．８ｍｇであった。

【００１２】Ｃ工程：疎水クロマト工程 等電点電気泳動工程の精製サンプルに０．５Ｍの硫安を
添加した後、８Ｍ尿素及び０．５Ｍ硫安を含む２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチル
トヨパール（（株）東ソー社製）を充填したカラム
（１．６ｃｍ×５．０ｃｍ）に添加した。平衡化で用い
た緩衝液１００ｍｌでカラムを洗浄し、さらに８Ｍ尿素
及び０．３Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１００ｍｌ、０．３Ｍ硫安を含む２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄
後、ＶＰ−１を３０％エタノールで溶出した。添加、洗
浄、溶出とも５０ｍｌ／ｈｒの流速で行なった。実験は
室温下で行なった。溶出画分中のタンパク質量は１．２
ｍｇであり、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による
観察では分子量８０〜９０ｋＤａにほぼ単一のバンドと
して見いだされた。さらにこの精製品の純度は９５．８
％であった。最終的にＮ末端のアミノ酸配列分析により
精製したタンパク質がＶＰ−１であることを確認した。

【００１３】［実施例２］疎水クロマト工程の後に等電
点電気泳動工程を行なったＶＰ−２の精製例 Ｃ工程：疎水クロマト工程 特願平４−２８１０１７号記載の大腸菌Ｎ４８３０−１
［ｐＶＰ２００］を実施例１記載の方法と同様の方法で
培養し、ＶＰ−２を含む封入体を取得した。この封入体
のうち湿重量１００ｍｇを８Ｍ尿素５０ｍｌ中に溶解し
た。溶液中のタンパク質量は３０ｍｇであった。０．５
Ｍ硫安を添加した後、この溶液を８Ｍ尿素及び０．５Ｍ
硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したフェニルセルロファイン（（株）生化学工
業社製）を充填したカラム（１．６ｃｍ×５．０ｃｍ）
に添加した。平衡化で用いた緩衝液１００ｍｌでカラム
を洗浄し、さらに８Ｍ尿素及び０．３Ｍ硫安を含む２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌ、
０．３Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１００ｍｌで洗浄後、ＶＰ−２を３０％エタノ
ールで溶出した。添加、洗浄、溶出とも５０ｍｌ／ｈｒ
の流速で行なった。実験は室温下で行なった。溶出画分
中のタンパク質量は５．２ｍｇであった。

【００１４】Ａ工程：等電点電気泳動工程 疎水クロマト工程の精製サンプルを１００倍容量の８Ｍ
尿素中に透析した後、８Ｍ尿素を加え容量を５０ｍｌと
した。この溶液中に両性担体としてＢｉｏ−Ｌｙｔｅ３
／１０（（株）ハ゛イオラット゛社）を１ｍｌ添加した。調製用
液体等電点電気泳動装置ロトフォア（（株）ハ゛イオラット゛
社）を予め組み立て、４℃の水を循環させ冷却した。次
に上記サンプル溶液をチャンバー内に注入し３０分程度
放置しサンプルを冷却した後、定電力１２Ｗで泳動を開
始した。電圧がほぼ７００Ｖで平衡に達した時点（泳動
開始後約３時間）で泳動を終了した。４℃の水による冷
却は泳動終了まで継続した。サンプルを２０に分画して
回収した。これら画分をＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動して観察したところ、主としてｐＨ６．０〜７．０
の画分にＶＰ−２の分子量５０〜６０ＫＤａに相当する
ほぼ単一のバンドを認めたのでこの画分を最終精製品と
して回収した。回収画分中のタンパク質量は２．０ｍｇ
であった。さらにこの精製品の純度は９６．４％であっ
た。最終的にＮ末端のアミノ酸配列分析により精製した
タンパク質がＶＰ−２であることを確認した。

【００１５】［実施例３］陰イオン交換工程の後に疎水
クロマト工程を行ったＶＰ−２の精製 Ｂ工程：陰イオン交換工程 実施例２記載の方法で取得した封入体のうち湿重量１０
０ｍｇを８Ｍ尿素５ｍｌ中に溶解した。この溶液のタン
パク質量は３０ｍｇであった。この溶液を３Ｍ尿素を含
む２０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．０）２０ｍｌで
希釈した後、同じ緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑカラ
ム（（株）ファルマシア社製：０．５ｃｍ×５．０ｃ
ｍ）に添加した。平衡化で用いた緩衝液２０ｍｌ、次に
平衡化緩衝液に０．１Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝
液２０ｍｌでカラムを洗浄後、ＶＰ−２を平衡化緩衝液
に０．３Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液で溶出し
た。添加、洗浄、溶出とも２０ｍｌ／ｈｒの流速で行な
った。実験は室温下で行なった。溶出画分中のタンパク
質量は４．４ｍｇであった。

【００１６】Ｃ工程：疎水クロマト工程 陰イオン交換工程の精製サンプルに０．５Ｍの硫安を添
加した後、８Ｍ尿素及び０．５Ｍ硫安を含む２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチルト
ヨパール（（株）東ソー社製）を充填したカラム（１．
６ｃｍ×５．０ｃｍ）に添加した。平衡化で用いた緩衝
液１００ｍｌでカラムを洗浄し、さらに８Ｍ尿素及び
０．３Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１００ｍｌ、０．３Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄後、Ｖ
Ｐ−２を３０％エタノールで溶出した。添加、洗浄、溶
出とも５０ｍｌ／ｈｒの流速で行なった。実験は室温下
で行なった。溶出画分中のタンパク質量は１．４ ｍｇ
であり、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による観察
では分子量５０〜６０ｋＤａにほぼ単一のバンドとして
見いだされた。さらにこの精製品の純度は９５．２％で
あった。最終的にＮ末端のアミノ酸配列分析により精製
したタンパク質がＶＰ−２であることを確認した。

【００１７】［実施例４］疎水クロマト工程の後に陰イ
オン交換工程を行なったＶＰ−１精製の例 Ｃ工程：疎水クロマト工程 実施例１に記載の方法で取得した封入体のうち湿重量１
ｇを８Ｍ尿素５００ｍｌ中に溶解した。この溶液のタン
パク質量を測定すると２３６ｍｇであった。０．５Ｍ硫
安を添加した後、この溶液を８Ｍ尿素及び０．５Ｍ硫安
を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したフェニルセルロファイン（（株）生化学工業社
製）を充填したカラム（５．０ｃｍ×１０．０ｃｍ）に
添加した。平衡化で用いた緩衝液１Ｌでカラムを洗浄
し、さらに８Ｍ尿素及び０．３Ｍ硫安を含む２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌ、０．３Ｍ硫安を
含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌで
洗浄後、ＶＰ−１を３０％エタノールで溶出した。添
加、洗浄、溶出とも５００ｍｌ／ｈｒの流速で行なっ
た。また実験は室温下で行なった。溶出画分中のタンパ
ク質量は４８．３ｍｇであった。

【００１８】Ｂ工程：陰イオン交換工程 疎水クロマト工程の精製サンプルを５０倍容量の３Ｍ尿
素を含む２０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で透
析した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲル ＥＭ
Ｄ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）（（株）メルク社製）を充
填したカラム（５．０ｃｍ×１０．０ｃｍ）に添加し
た。平衡化で用いた緩衝液１Ｌでカラムを洗浄後、ＶＰ
−１を平衡化緩衝液に０．１Ｍ塩化ナトリウムを添加し
た緩衝液で溶出した。添加、洗浄、溶出とも１Ｌ／ｈｒ
の流速で行なった。実験は室温下で行なった。溶出画分
中のタンパク質量は１４．５ｍｇであり、ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動による観察では分子量８０〜９０
ｋＤａにほぼ単一のバンドとして見いだされた。さらに
この精製品の純度は９５．４％であった。最終的にＮ末
端のアミノ酸配列分析により精製したタンパク質がＶＰ
−１であることを確認した。

【００１９】［実施例５］陰イオン交換工程の後に等電
点電気泳動工程を行い、さらに疎水クロマト工程を行っ
たＶＰ−１の精製 Ｂ工程：陰イオン交換工程 実施例１記載の方法で取得した封入体のうち湿重量１０
０ｍｇを８Ｍ尿素５ｍｌ中に溶解した。この溶液のタン
パク質量は２６ｍｇであった。この溶液を３Ｍ尿素を含
む２０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．０）２０ｍｌで
希釈した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲル Ｅ
ＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）（（株）メルク社製）を
充填したカラム（１．６ｃｍ×５．０ｃｍ）に添加し
た。平衡化で用いた緩衝液１００ｍｌでカラムを洗浄
後、ＶＰ−１を平衡化緩衝液に０．１Ｍ塩化ナトリウム
を添加した緩衝液で溶出した。添加、洗浄、溶出とも５
０ｍｌ／ｈｒの流速で行なった。実験は室温下で行なっ
た。溶出画分中のタンパク質量は３．４ｍｇであった。

【００２０】Ａ工程：等電点電気泳動工程 陰イオン交換工程の精製サンプルに８Ｍ尿素を加え容量
を５０ｍｌとした。この溶液中に両性担体としてＢｉｏ
−Ｌｙｔｅ３／１０（（株）ハ゛イオラット゛社）を１ｍｌ添加
した。調製用液体等電点電気泳動装置ロトフォア
（（株）ハ゛イオラット゛社）を予め組み立て、４℃の水を循環
させ冷却した。次に上記サンプル溶液をチャンバー内に
注入し３０分程度放置しサンプルを冷却した後、定電力
１２Ｗで泳動を開始した。電圧がほぼ７００Ｖで平衡に
達した時点（泳動開始後約３時間）で泳動を終了した。
４℃の水による冷却は泳動終了まで継続した。サンプル
を２０に分画して回収した。これら画分をＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動して観察したところ、主としてｐ
Ｈ６．８〜７．６の画分にＶＰ−１の分子量８０〜９０
ＫＤａに相当するバンドを認めたのでこれを精製画分と
して回収した。回収画分中のタンパク質量は２．１ｍｇ
であった。

【００２１】Ｃ工程：疎水クロマト工程 等電点電気泳動工程の精製サンプルに０．５Ｍの硫安を
添加した後、８Ｍ尿素及び０．５Ｍ硫安を含む２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチル
トヨパール（（株）東ソー社製）を充填したカラム
（１．６ｃｍ×５．０ｃｍ）に添加した。平衡化で用い
た緩衝液１００ｍｌでカラムを洗浄し、さらに８Ｍ尿素
及び０．３Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１００ｍｌ、０．３Ｍ硫安を含む２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄
後、ＶＰ−１を３０％エタノールで溶出した。添加、洗
浄、溶出とも５０ｍｌ／ｈｒの流速で行なった。実験は
室温下で行なった。溶出画分中のタンパク質量は０．８
ｍｇであり、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による
観察では分子量８０〜９０ｋＤａにほぼ単一のバンドと
して見いだされた。さらにこの精製品の純度は９６．９
％であった。最終的にＮ末端のアミノ酸配列分析により
精製したタンパク質がＶＰ−１であることを確認した。

【００２２】なお、実施例１〜５におけるタンパク質量
の測定、純度の検定、およびＶＰ−１、ＶＰ−２の同定
は下記の方法により行なった。 １．タンパク質量の測定：ＢＩＯ−ＲＡＤ ＰＲＯＴＥ
ＩＮ ＡＳＳＡＹ キット（（株）ハ゛イオラット゛社製）を用
いた。 ２．純度の検定：ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を
行い、クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色
後、デンシトメータＣＳ−９１０型（（株）島津製作所
製）にて行なった。 ３．ＶＰ−１、ＶＰ−２の同定：アミノ酸配列分析装置
４７７Ａ型（（株）アプライドバイオシステムズ社製）
により精製品のアミノ酸配列を分析し同定した。

【００２３】

【発明の効果】本発明の精製方法により、ヒトパルボウ
イルス構造タンパク質を生産した大腸菌から高純度のヒ
トパルボウイルス構造タンパク質を取得することが可能
となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 鈴木 弘康 東京都町田市３丁目５番１号 電気化学工 業株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のＡ、Ｂ、及びＣの３工程のうち少
   なくとも２工程を含む（但し、ＡとＢの組合せを除く）
   ことを特徴とするヒトパルボウイルス構造タンパク質の
   精製方法。 Ａ工程：ヒトパルボウイルス構造タンパク質を含む溶液
   を等電点電気泳動し、ｐＨ６〜８の分画を回収する工
   程。 Ｂ工程：ヒトパルボウイルス構造タンパク質を陰イオン
   交換体に吸着させ、無機塩濃度０．０５Ｍ〜０．６Ｍの
   溶液で溶出させる工程。 Ｃ工程：ヒトパルボウイルス構造タンパク質を疎水クロ
   マト担体に吸着させ、無機塩濃度０．３Ｍ以下の溶液又
   は５（ｖ／ｖ）％〜７０（ｖ／ｖ）％の有機溶媒を含ん
   だ溶液で溶出させる工程。
2. 【請求項２】 陰イオン交換体の官能基がトリメチルア
   ミノエチル基、ジエチルアミノエチル基、ジメチルアミ
   ノエチル基、第４級アミノエチル基及びアミノエチル基
   の群から選択された一種であり、疎水クロマト担体の官
   能基がフェニル基及び炭素数Ｃ₁ 〜Ｃ₈ の疎水性官能基
   の群から選択された一種であることを特徴とする請求項
   １記載の方法。