KR960004707B1 - B형 간염 표면 항원의 정제 방법 - Google Patents

B형 간염 표면 항원의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 표면 항원의 정제 방법
본 발명은 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris) 효모 세포로부터 B형 간염 표면 항원의 정제하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스는 B형 간염으로 알려진 전염병을 일으킨다. 바이러스에 의한 만성 감염은 간경변증 및 간암을 일으킬 수도 있다.
현재, B형 간염 바이러스에 감염된 사람들을 치료하는 방법은 없다. 그리하여 최근의 의약 치료는 백신 주사를 통한 예방에 중점을 두고 있다.
백신의 활성 성분은 B형 간염 표면 항원으로 알려진 폴리펩티드이다. 이 폴리펩티드는 B형 간염 바이러스의 표면에서 자연적으로 생겨난다.
이 펩티드를 생산하는 한가지 방법은 B형 간염 바이러스에 감염된 사람들의 혈액으로부터 그것을 단리시키는 것이다. 혈액 생산물을 통한 AIDS와 같은 감염 질환에 대해 통상적으로 두려움을 갖고 있기 때문에 이 방법은 선호되지 못하고 있다.
또 다른 방법은 유전 공학을 통해 B형 간염 표면 항원을 생산하는 것이다. B형 간염 표면 항원 폴리펩티드에 대한 유전자는 예를 들어 효모, 세균이나 포유 동물 세포내로 클로닝될 수 있다.
그후에, 일반적으로 변경된 세포를 B형 간염 표면 항원 폴리펩티드가 형질 표현되고 입자로 회합될 수 있는 방법으로 성장시킬 수 있다.
B형 간염 표면 항원 폴리펩티드가 재조합 세포내에서 성공적으로 생산될 수 있지만, 세포로부터 폴리펩티드를 회수하고 그것을 정제하는데 사용되는 통상적인 방법에는 여전히 문제점들이 존재한다.
예를 들어, B형 간염 표면 항원을 정제하는데 사용되는 가장 통상적인 방법은 미로 구배 원심 분리법이다. 그러나, 이 방법에는 다량의 세슘 염화물과 슈크로우즈의 사용 뿐만 아니라 초 원심 분리기의 사용은 물론 정제와 그 규모에 따른 다양한 로우터가 필요하므로, 높은 가격 때문에 적절하지 못하다.
1987년 7월 28일 특허로 미합중국 특허 제4,683,293호는 피치아 파스토리스의 유전적으로 변형된 균주에 의해 생산된 B형 간염 표면 항원과 같은 호지성 단백질을 카오트로픽(chaotropic) 염을 함유하는 용해 완충 용액을 사용하여 선택적으로 회수할 수 있음을 개시하고 있다. 그러한 공정이 호지성 단백질을 정제하는데 상당한 진보를 가져온 것으로 여겨지지만 백신 제조에 사용하기에 적합한 형태로 B형 간염 표면 항원과 같은 단백질을 회수하도록 하는데 전체 공정을 실시할 것을 여전히 요구하고 있다.
그리하여, 백신에 직접적으로 함입되기에 충분한 순도로 효모 세포로부터 B형 간염 항원 입자를 회수하는데 산업적인 규모로 수행될 수 는 전체 공정을 개발하는 것은 본 분야에 값진 공헌이 될 것이다.
본 발명의 목적은 산업적인 규모로 수행될 수 있는 방식으로, 백신에 직접 함입되기에 충분한 순도로 B형 간염 표면 항원 입자를 회수하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양상 및 목적은 이후에 명백해질 것이다.
본 발명에 따라, 하기 (a)-(i) 단계로 구성된, 효모 세포로부터 B형 간염 항원 입자를 회수하고 정제하는 방법이 발견되었다 : a) 카오트로픽 화합물의 존재하에 상기 효모 세포를 용해시키고 용해된 세포 펠릿으로부터 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 분리시키는 단계; b) a) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원 함유 상등액을 상기 상등액에서 지방 및 오염 단백질을 침전시키기에 적당한 조건하에 놓고, 상기 상등액으로부터 침전된 잔사를 제거하는 단계; c) b) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원 함유 상등액을 농축시키고 다이아 여과(diafiltration)시키는 단계; d) c) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원 함유 보유액을 실리카와 접촉시키는 단계; e) 상기 실리카로부터 비-B형 간염 항원 단백질을 pH 6-8의 적절한 완충 용액을 사용하여 세척하는 단계; f) 실리카로부터 상기 B형 간염 표면 항원을 0.5-8몰 농도(molarity)로 요소를 함유하는 pH 9.5-11.0의 적절한 완충 용액으로 용출시키는 단계; g) f) 단계에서 B형 간염 표면 항원 함유 분류물을 오염물로부터 B형 간염 표면 항원 입자를 분리시키기에 적절한 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과시키는 단계; h) g) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원 함유 분류물을 음이온 교환 수지와 접촉시키는 단계; 및 i) B형 간염 표면 항원 입자를 음이온 교환 수지로부터 pH 6-9의 적절한 완충 용액을 사용해 용출시키는 단계.
본 발명의 공정은 B형 간염 표면 항원을 발현할 수 있는 임의의 형질 전환된 효모에서 유용하다. 적절한 형질 전환된 대표적인 효모로는 캔디다(candida), 클로에케라(Kloeckera), 사카로 마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로 마이세스(Schizosaccharomyces), 로도토률라(Rhodotorula), 한세눌라(Hansenula), 토룰로피스(Torulopis), 피치아(Pichia) 및 클뤼베로 마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 효모들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 효모는 피치아 파스토리스이다.
전형적으로, 본 분야에서 공지된 바와 같이 등화성 질소원, 무기염, 적절한 pH의 분자 산소 및 기타 조절 상태들을 사용하여 호기성 수성 발효 조건하, 적절한 탄소 에너지원 상에서 효모들을 자라게 함으로써 배양한다. 효모를 자라게 하는 정확한 방식은 본 분야를 실행하는데 중요하지 않다.
본 분야의 숙련인들에게 공지된 바와 같이, B형 간염 바이러스 게놈은 B형 간염 표면 항원 폴리펩티드의 세가지 변형물을 생산하는 것으로 알려져 있다. 이러한 변형물들은 S-형, 전 S1-형 및 전 S2-형으로 보통 언급된다. 통상의 공정은 이러한 형의 폴리펩티드 중 임의의 것으로 이루어진 입자들(예를 들어 입자들은 B형 간염 표면 항원 폴리펩티드의 혼합물로 이루어질 수 있다)을 회수하고 정제하는데 적합할 수 있다.
이 출원에서 사용된 대로, 용어 B형 간염 표면 항원은 S-형, 전 S1-형 및 전 S2-형과 그들의 혼합물을 일컫는다.
본 발명의 제1단계는 카오트로픽 염의 존재하에 효모 세포를 용해하는 것이다(미합중국 특허 제4,683,293호). 전형적으로 세포는 비이드 밀내에서 균질화에 의해 용해될 것이다.
이 기술에서 사용된 용어 ＂카오트로픽 화합물＂은 음이온이 비극 성기를 물로 이동시키도록 하는 염 및 요소와 같은 화합물을 말한다. 그러한 염에는 티오시안산, 음이온, 요오드화 이온 및 브롬화 이온과 같은 할로겐화 음이온 및 과염소산과 같은 차아할로겐산 음이온 및 리튬, 칼슘 및 바륨과 같은 양이온을 함유하는 화합물이 있다.
적절한 카오트로픽 화합물로 대표적인 것으로는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 있다. 티오시안산 나트륨, 티오시안산 칼륨, 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, 차아염소산 나트륨, 염화 리튬, 브롬화 리튬, 염산 구아니디늄, 티오시안산 구아니디늄, 요소 등.
현재 티오시안산 나트륨이 바람직하다.
카오트로픽 화합물이 약 1-약 8몰 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
또한 카오트로픽 화합물이 약 6-약 8의 pH를 유지하도록 완충화시키는 것이 바람직하다. 본 분야의 숙련인들에게 공지된 대로, 6-8로 pH를 유지할 수 있는 수많은 완충 시스템이 있다. 선택된 염과 상용성인 임의의 완충 시스템이 본 발명에 사용하기에 적절하다.
현재 바람직한 완충 용액은 인산 나트륨이다.
원한다면, 카오트로픽 화합물 배지내에 프로테아제 저해제가 존재할 수 있다. 적절한 프로테아제 저해제로 대표적인 것으로는 페닐메틸 설포닐 불화물 및 디이소프로필 플루오포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
통상적인 카오트로픽 화합물을 사용한 세포 용해는 단백질 분해 변성을 더 최소화 하기 위해 0-10℃의 온도에서 수행될 것이다.
효모 세포가 용해된 후에, B형 간염 표면 항원 함유 상등액을 더 정제하기 전에 용해된 세포 펠릿으로부터 분리하는 것이 바람직하다. 이 분리는 원심 분리나 기타 임의의 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
세포 펠릿 내에 남아 있는 임의의 잔류 간염 표면 항원을 제거시키기 위해 카오트로픽 화합물로 추출하여 얻어진 용해된 세포 펠릿을 즉시 6-8의 pH를 갖는 완충액으로 더 세척하는 것이 바람직하다.
원한다면 완충화된 카오트로픽 화합물을 세포 펠릿을 세척하는데 사용할 수 있다.
용해된 세포 펠릿을 세척한 후, 결과 상등액을 용해된 세포 펠릿과 관련되고 더 정제하기 위해 이미-얻어진 상등액과 조합된 세포 부스러기로부터 분리하는 것이 바람직하다.
정제의 다음 단계는 B형 간염 표면-항원 함유 상등액을 B형 간염 표면 항원-함유 상등액으로부터 오염 단백질 및 지방을 침전시키기에 적당한 조건에 수반시키는 것이다. 이러한 침전을 일으키는 한가지 적당한 방법은 10 내지 30분의 시간동안 45-55℃, 바람직하게는 47-50℃까지 상등액을 가열하는 것이다.
상등액으로부터 지방 및 오염 단백질을 침전시키기 위해 적당한 또다른 방법은 산 존재하에 상등액을 가열시키는 것이다.
B형 간염 표면 항원-함유 상등액의 pH를 약 5.0 내지 6.0 이하의 pH로 낮추기 위해 충분한 산을 첨가해야만 한다.
이 공정에 사용되는 산은 무기산 또는 유기산일 수 있다. 적당한 산은 염산, 황산, 인산, 아세트산, 옥살산, 질산, 과염산 또는 포름산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
산성화 처리는 바람직하게는 30℃보다 높지 않은 온도, 더욱 바람직하게는 20℃ 보다 높지 않은 온도, 즉 4℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되며 더 바람직하게는 4℃ 내지 20℃에서 수행된다.
정제 단계후, 침전된 세포 성분들을 B형 간염 표면 항원-함유 상등액으로부터 분리하는 것이 바람직하다. 이것은 원심 분이 또는 기울여 따르기와 같은 임의의 통상적인 분리 기술에 의해 수행될 수 있다.
산성화가 침전 단계에 사용된다면 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 더 정제하기 전에 약 6 내지 8, 바람직하게는 6.5의 pH로 돌아가도록 하기에 충분한 염기로 처리하는 것이 바람직하다.
약 6-8의 pH로 되돌리는데 사용되는 특별한 염기는 본 발명의 실행에서 중요하지 않다. 적당한 염기의 대표적인 예는 수산화 칼륨, 수산화 나트륨 및 수산화 암모늄으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
정제의 다음 단계는 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 농축 및 다이아 여과시키는 것이다. 농축 및 다이아 여과는 막을 통하여 B형 간염 표면 항원의 통과는 막지만 오염 펩티드 및 전해질의 통과는 허용할 수 있기에 충분한 분자량 배제 제한을 갖는 막으로 수행될 수 있다.
5000-500,000; 바람직하게는 75,000-100,000의 분자량 배제 제한을 갖는 상업적으로 구입할 수 있는 농축 막이 본 공정에 사용하기에 적당하다.
또한 농축 막은 카오트로픽 화합물을 제거시키기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 이것은 초기 농축후 B형 간염 표면 항원-함유 상등액에 6-8의 pH를 갖는 카오트로픽-유리 완충 용액 1 내지 2 부피를 첨가하고 농축 순서를 반복함으로써 수행될 수 있다.
완충 용액의 각각 부가적인 동일한 부피는 약 50%의 인자까지 B형 간염 표면 항원-함유 용액내의 카오트로픽 화합물의 농도를 희석시킬 것이다. 그래서, 이들 첨가적 부피는 B형 간염 표면 항원-함유 용액으로 부터 카오트로픽 염을 점차적으로 제거할 것이다.
정제화 도식에 있어서 다음 단계는, B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 실리카로 흡착 크로마토그래피시키는 것이다.
흡착 크로마토그래피를 컬럼법 및 배치법에 의해 달성할 수 있다. 배치법이 바람직하다. 본 발명의 방법과 함께 사용되기 위해 적당한 실리카는 100mm2/gm-500mm2/gm 내의 허용 가능한 표면적을 갖는 미립수화 실리카 또는 무수 실리카를 포함한다. 적당한 미립실리카는 뉴우 저어지의 데구싸 사로부터 상표명 에어로실(Aerosil) 380하에 구입 가능하다.
배치법에 있어서, 미립 실리카는 충분한 물에서 분산되어, 실리카 46-60중량%를 함유하는 실리카 슬러리를 생성한다.
이후에 슬리카 슬러리를 B형 간염 표면 항원-함유 상등액과 접촉시킨다.
이용되는 실리카 슬러리의 양은 초기 입자 농도가, 용해 세포 추출물로부터의 전체 추출성 단백질의 1%이상일 때, 상등액내 존재하는 B형 간염 표면 항원 활성 매 1mg에 대해,실리카 50-100mg을 상등액에 첨가하는 그런 양이어야 한다. 바람직하게는 초기 입자 농도가 1% 이상일 때, 아우스리아(AUSRIA) 활성의 매 1mg에 대해 실리카 약 60mg을 첨가하는 것이 바람직하다.
용해 세포 추출물내 입자 농도가 1% 이하일 때, 실리카 양은 감소된 입자 농도에 비례하여 증가되어야 한다.
아우스리아 II 분석 키트는 일리노이주, 시카고시의 아보트 레보로토리스로부터 상업적으로 구입 가능하다.
B형 간염 표면 항원-함유 상등액이 실리카 용액과 접속된 후, 결과 형성된 혼합물을 15분-4시간의 주기동안 함께 휘저어 섞는 것이 바람직하다.
B형 간염 표면 항원-함유 용액을 적합한 시간동안 실리카와 접촉하도록 한 후, 상동액을 실리카-결합 B형 간염 표면 항원으로부터 분리하는 것이 바람직하다. 이것은 원심 분리 및 기울여 따르는 분리 또는 통상적으로 사용되는 임의의 다른 기술에 의해 달성될 수 있다.
정제에 있어서, 다음 단계는 실리카로부터 오염 단백질을 제거하는 것이다. 이것은 6-8, 바람직하게는 약 7.2의 pH를 갖는 완충 용액으로 실리카를 세척하여 달성할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이 6-8내의 pH를 유지하기 위해 구입 가능한 수많은 완충 시스템이 있다. 임의의 이러한 완충 시스템은 본 발명과 함께 사용되기에 적당하다. 주로 바람직한 완충 시스템은 인산 나트륨-염화 나트륨 완충 시스템이다.
오염 단백질을 확실히 제거하기 위해 매번 완충 용액의 5-15의 부피로 실리카를 여러회 세척하는 것이 주로 바람직하다.
오염 단백질의 제거를 감지하기 위한 한가지 방법은 280nm에서 각 세척의 흡광도를 측정하는 것이다. 흡광도가 동일한 비변화 최소 값일때, 세척 과정이 완결된다.
오염 단백질이 실리카로부터 제거된 후, 0.5-3몰 농도(molarify)로 존재하는 요소를 함유하는 적당한 완충 용액과 실리카를 접촉시킴으로써,B형 간염 표면 항원을 실리카로부터 용출시킬 수 있다.
적당한 완충 용액은 9.5-11의 pH를 가질것이다.
당업자에게 공지된 바와 같이 9.5-11내에서 pH를 유지할 수 있는 수많은 완충 시스템이 있다. 임의의 이들 완충 시스템이 본 발명과 함께 사용하기에 적당하다. 주로, 탄산 나트륨-중탄산 나트륨 완충 용액이 바람직하다.
이후에, 배치법이 사용될 경우, 요소-함유 완충 용액의 8-12 부피를 1-4시간,바람직하게 약 2시간 주기동안 실리카에 접촉되도록 하는 것이 바람직하다. 이 시간의 주기후에, B형 간염 표면 항원을 함유하는 상등액을 실리카로부터 분리하고 더 이상의 정제를 위해 남겨둔다.
완충된 요소의 8-12 부피로 실리카를 부가적으로 용출시키는 것이 주로 바람직하다. 분류물을 함유하는 첨가적인 B형 간염 표면 항원을 보다 초기의 B형 간염 표면 항원-함유 분류물과 조합하고 더 정제한다.
이후에, 컬럼법이 사용될 경우, 크로마토그래피 컬럼을 미립 실리카로 채우고, B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 컴럼과 접촉시킨다. 오염 단백질을 실리카로부터, 배치법에 대해 상기 기술된 바와 같이, 6-8의 pH를 갖는 완충 용액으로 세척한다.
B형 간염 표면 항원을 배치법에 대해 상기 기술된 바와 같이 9.5-11내의 pH를 갖는 요소 완충 용액으로 용출시킬 수 있다.
바람직하게는, 이후에, B형 간염 표면 항원 함유 분류물을, 요소를 제거하기 위해 부가적인 다이아 여과 단계에 적용시킨다.
B형 간염 표면 항원이 통과되지 않을 그러한 분자량 제한을 갖는 막을 갖는 다이아 여과 시스템을 이용해야 한다.
적당한막은 5,000-500,000내의 분자량 제한을 갖는 것들이다.
6-8의 pH를 갖는 비요소-함유 완충 용액의 부가적인 부피를 B형 간염 표면 항원-함유 분류물에 첨가하는 도중에 분류물을 반복되는 다이아 여과에 적용시킴으로써 우레아를 B형간염 표면 항원-함유 분류물로부터 제거한다. 부가적인 완충 용액으로의 이들 반복되는 다이아 여과는, 용액으로부터 요소를 점차적으로 희석시킬 것이다.
정제에 있어서, 다음 단계는 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 겔 여과시키는 것이다.
아가로스겔로 채워진 크로마토그래 컬럼 상에서 겔 여과를 수행하는 것이 주로 바람직하다. 칼럼을 채우기 위해 사용될 수 있는 다른 적당한 극성 매트릭스를 덱스트란 겔 및 폴리아크릴아미드 겔로 구성되는 군으로부터 선택할 수 있으나, 이로써 제한되지 않는다.
겔 여과를 위한 충전 물질로서 사용되는 극성 매트릭스는 적어도 백만의 분자량 배제 제한을 가져야 한다.
B형 간염 표면 항원-함유 분류물과 크로마토그래피 컬럼을 접촉시키기 전에, 충전 물질에 B형 간염 표면 항원이 흡수되는 것을 방지하기 위해, 컬럼을 적합한 완충 용액으로 평형화하여야 한다. 적당한 완충 용액은 6-9의 pH를 가질 것이다. 당업자에게 공지된 바와같이, 6-9의 pH를 유지할 수 있는 수많은 완충용액이 있다. 임의의 이들 완충 용액은 본 발명과 함께 이용되기 위해 적합하다.
주로 바람직한 것은 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(TRIS) 염화물 완충 용액이다.
컬럼이 평화한 된 후, B형 간염 표면 항원-함유 분류물은 컬럼내에서 충전 물질과 접촉되어야 한다.
컬럼의 평형화에서 사용되는 완충 용액은, 또한 컬럼을 통한 B형 간염 표면 항원 및 오염 단백질 모두를 세척하는데 사용될 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 가장 큰 분자량을 갖는 그런 분자들은 첫번째로 컬럼을 통과할 것이며, 보다 작은 것이 뒤따른다. B형 간염 표면 항원이 용출될 때까지, 컬럼을 적합한 완충 용액으로 연속 세척시켜야 한다.
용출제내 B형 간염 표면 항원의 존재를, B형 간염 표면 항원에 대해 민감한 상업적으로 구입 가능한 임의의 분석 키트 또는 겔 전기 영동에 의해 감지할 수 있다.한가지 이러한 키트는 아보트 레보로토리스로부터 구입 가능한 아우스리아 II이다.
B형 간염 표면 항원을 갖는 것에 대해 양성으로 시험된 이들 분류물을 함께 한데 모으고 임의로 농축시킨다. 한가지 적당한 농축 수단은 한외 여과이다.
이후에, B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제시킨다. 정제를 음이온 교환 리간드와 함께 수행하는 것이 주로 바람직하다. 음이온 교환 리간드는 디에틸 아미노에틸 양이온인 것이 주로 바람직하다.
당업자에게 공지된 바와같이, 음이온 교환 리간드는 폴리아크릴아미드 겔 수지 또는 탄수화물 중합체 수지, 예를 들어 셀룰로오스 또는 덱스트란으로 도입될 것이며,크로마토그래피 컬럼을 이 물질로 채울 것이다. 컬럼 배치는 통상적인 수직 흐름 또는 방사상 흐름일 수 있으나, 이로써 제한되지 않는다. 주로 셀룰로오스가 바람직한 수지이다.
B형 간염 표면 항원과 음이온 교환 수지를 접촉시키기 전에, 6-9의 pH를 갖는 적합한 완충 용액으로 수지를 평형화 해야 한다.
다수의 완충 용액이 이 pH 범위를 유지시킬 수 있다. 임의의 이들 완충 용액이 본 발명과 함께 사용하기 위해 바람직하다. 주로 바람직한 것은 TRIS-염화물 완충 용액이다.
평형화 한 후에, B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 음이온 교환 수지와 접촉시켜야 한다.
B형 간염 표면 항원을 선형 구배 용출에 의해 음이온 교환 수지로부터 용출시키는 것이 주로 바람직하다. 이것은 이온 강도의 선형 변화 또는 pH의 선형 변화에 의해 달성될 수 있다. 초기에, 컬럼을, 평형화 단계에서 사용한 것과 동일한 완충 시스템으로 세척한다. 점차적으로, 용매 조성물은, 전해질을 완충 시스템에 도입시킴으로써, 및 약 0.3몰 농도 이하로 전해질의 농도를 점차로 증가시킴으로써 변화된다.
다른 전해질이 똑같이 효험이 있지만, 전해질은 염화나트륨이 주로 바람직하다.
구배 용출의 결과로서 얻어진 다양한 분류물을 B형 간염 표면 항원 함량에 대해 시험하는 것이 주로 바람직하다. 이것은 겔 여과로부터의 용출제를 시험하는 그런 수단으로 수행할 수 있다.
B형 간염 표면 항원을 함유하는 이들 분류물은 함께 한데 모은다. 원한다면, 결과 형성된 한데 모아진 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 한외 여과에 의해 농축시킬 수 있다.
이제, 상기 개략적으로 설명된 정제를 통하여 얻어진 B형 간염 표면 항원은 적어도 백신에 직접 항입시킬 수 있는 순도 수준이다.
하기 실시예들은 본 발명의 잇점을 더 설명하기 위해 존재한다. 그렇지만, 이것은 어느 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
[실시예 I]
이 실시예는 형질 전환된 피치아 파스토리스 배양액으로 제조한 B형 간염 표면 항원을 정제시킴에 있어서 본 발명의 유용성을 설명한다.
피치아파스토리스(GS 115; NRRL Y-15851) 세포 배양액을 벡터 PBSAGI5I(수탁 번호 NRRLB-18021, 일리노이주, 페오리아시, 미농무성 북부 지역 조사 센타로부터 E. 콜리 숙주로 구입 가능)로 형질 전환시킨다.
통상적인 기술에 의해 이들 피치아 파스토리스 배양액을 264g/L 습윤 중량 이하의 세포 밀도로 발효시킨다.
1900ml의 발효 육즙을 발효 용기로부터 분리시킨다. 이 발효 육즙을 약 10분 동안 8500rpm(속도 평균=7700에서의 RCF)에서 원심 분리시키고 결과 생성된 상등액을 버린다.
추출 단계를 위해 3M 농도의 티오시안산 칼륨 및 10mM 농도의 인산나트륨을 함유하는 카오트로픽 완충용액을 제조한다. 프로테아제 저해제인 페닐메틸 설포닐 불화물도 1mM의 농도까지 첨가한다. 결과 형성된 완충 용액의 pH는 7.5이다.
500ml의 0.5mm 유리 비이드가 존재하는 가운데 비이드 밀 내에서 펠릿으로부터의 세포 500g을 1500ml의 카오트로픽 완충 용액에 진탕시킴으로써 용해 단계를 수행한다.
세포-비이드 혼합물을 15분 동안 12,500rpm(속도 평균=16,000에서의 RCF)에서 원심 분리시킨다. 상등액을 기울여 따름으로써 세포-비이드 혼합물로부터 분리시키고 후정제를 위해 남겨둔다.
세포-비이드 혼합물을 1,000ml의 카오트로픽 완충 용액으로 부가적으로 세척한다. 결과 형성된 상등액을 세포-비이드 혼합물로부터 분리시키고 더 정제하기 위해 남겨둔다.
4℃에서 카오트로픽 화합물로 추출을 수행한다. 다른 언급이 없는 한 다른 모든 정제 단계도 4℃에서 진행시킨다. 단백질 분해를 최소화 하기 위해 이를 수행한다.
상등액을 합하고, 수욕 내에서 상등액을 실온까지 데움으로써 침전시킨다. 일단 상등액이 실온에 도달하면, 상등액의 pH가 7.5에서 5까지 낮아질 정도의 양만큼 1노르말 인산을 상등액에 첨가한다. 그 다음 실온에서 약 30분 동안 용액을 정치시킨다. 이 시간 동안에, 오염 단백질 및 지방을 간염 표면 항원-함유 상등액으로부터 침전시킨다.
상등액을 4℃까지 냉각시키고 12,500rpm에서 15분 동안 원심 분리시킨다. 상등액을 기울여 따라 침전된 부스러기로부터 분리시킨다.
그 다음 1N 수산화나트륨을 첨가하여 상등액의 pH를 6.5까지 올린다.
이때, 3,120ml의 B형 간염 표면 항원-함유 상등액이 있다. AUSRIA II 분석을 진행시킨다. 이 분석으로 상등액 내에 236mg의 B형 간염 표면 항원이 있음을 알 수 있다.
이는 80.5%의 회수를 나타낸다.
B형 간염 표면 항원-함유 용액을 농축시킨 다음 분자량 배제 제한 100,000을 갖는 아미콘 중공 여과기한외 여과 시스템 상에서 다이아 여과시킨다.
초기에 약 0.5리터까지 농축시킨 다음, pH 7.5를 갖는 인산나트륨 완충 용액 1리터를 B형 간염 표면 항원-함유 상등액에 첨가하고, 결과형성된 혼합물을 부가적으로 농축시킨다. 티오시안산 칼륨이 용액으로부터 희석될 때까지 이들 두번 반복한다.
티오시안산 칼륨을 B형 간염 표면 항원-함유 상등액으로부터 다이아 여과에 의해 제거한 다음, 405ml의 보유액에 대해 다른 AUSRIA II 분석을 진행시킨다. 이 분석으로, 78.8%의 회수를 나타내는 231mg의 B형 간염 표면 항원이 있음을 알 수 있다.
B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 380m2/g의 접근 가능 표면을 갖는 실리카에 배치 결합시킨다.
이를 하기 방법으로 수행한다. 먼저, 건조 실리카를 증류수와 함께 50% 슬러리(건조 중량/부피)로서 제조한다. 이는 50mg의 실리카/슬러리 ml를 갖는 혼합물을 제조한다.
275ml의 실리카 슬러리를 B형 간염 표면 항원-함유 상등액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 혼합물을 천천히 휘저어 섞는다.
그 다음 간염-실리카 혼합물을 4℃까지 냉각시키고 5,000rpm(속도 평균=2500에서의 RCF)에서 15분 동안 원심 분리시킨다. 결과 형성된 상등액을 버린다.
그 다음 0.15M NaCl을 함유하고 pH 7을 갖는 인산염 완충 용액 500ml으로 실리카를 세척하고, 헹굼액을 버린다. 상등액으로부터 280nm에서의 흡광도가 최소 불변가에 도달할 때까지 인산염 완충 용액으로 세척 단계를 계속한다.
그 다음에 B형 간염 표면 항원을 25mM의 탄산나트륨, 25mM의 중탄산나트륨, 및1몰의 요소를 함유하는 완충 용액으로 실리카로부터 용출시킨다. 완충 용액의 최종 pH는 10이다.
간염-실리카 혼합물을 500ml의 요소 완충 용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 휘저어 섞는다.
실리카/간염을 함유하는 완충화된 요소 용액을 4℃까지 냉각시키고 5,000rpm에서 15분 동안 원심 분리시킨다.
상등액을 기울여 따르고 더 정제하기 위해 남겨둔다.
첫번째와 같은 방법으로 완충화된 500ml 부피의 두번째 용소로 실리카를 요출시킨다. 결과 형성된 상등액을 첫번째 상등액과 합하고 농축 및 다이아 여과시켜 요소를 제거한다.
이때, 분자량 배제 제한 100,000을 가진 막을 갖는 아미콘 중공 여과기 다이아 여과 시스템 상에서 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 농축시킨다.
초기에 약 100ml가 되게 농축시킨 후, pH 7.5를 갖는 10mM 인산나트륨 완충 용액 200ml를 B형 간염 표면 항원-함유 상등액에 첨가하고 부가적으로 농축시킨다.
이 단계는 요소를 희석시키는 효과를 갖는다. 이 절차를 두번 반복하여 B형 간염 표면 항원-함유 분류물로부터 89%의 요소를 제거하는 효과를 얻는다.
다이아 여과시킨 후, B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 16,000rpm에서 15분 동안 원심 분리시킨다.
이때, AUSRIA II 분석을 수행한다. 이 분석으로 64.5%의 회수를 나타내는 234mg의 간염이 존재함을 알 수 있다.
B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 겔 여과시킨다.
상업적으로 구입 가능한 세파로스 CL4B 크기 배제 컬럼을 이용한다. 이 컬럼은 2리터의 부피를 가지며 분자량 배제 제한 20×106을 갖는 아가로스 겔로 채운다.
B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 이 컬럼과 접촉시킨다. pH 8을 갖는 25mm의 트리스-염화물을 사용하여 컬럼으로부터 간염을 용출시킨다.
컬럼으로부터 용출시킨 분류물들을 모으고 B형 간염 표면 항 함유물을 분석한다.폴리아크릴아미드 겔전기 영동 분석을 기준으로, B형 간염 표면 항원 활성을 갖는 분류물들을 한데 모으고 후정제를 위해 남겨둔다. 사용된 분석은 AUSRIA II 분석 시험으로서 아보트 연구소로부터 상업적으로 구입 가능하다.
한데 모은 분류물들은 총 170mg의 B형 간염 표면 항원 활성을 가지며, 이는 63.1%의 회수를 나타낸다.
이러한 B형 간염 표면 항원-함유 분류물들을 한데 모은 것을 아미콘 YM30 여과기를 사용하여 농축시킨다.
농축된 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 이온 교환 크로마토그래피시킨다.
셀룰로오스 지지 매트릭스에 결합된 디에틸 아미노에틸 양이온을 이용하여 컬럼 상에서 이온 교환 크로마토그래피를 진행시킨다.
이 컬럼을 pH 8을 갖는 트리스-염화물 완충 용액으로 평형시킨다.
수지를 평형시킨 후, B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 한데 모은 것을 이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시킨다.
그 다음에, 염화나트륨 농도 0-0.3M 및 pH8을 갖는 트리스-염화물 완충 용액을 이용하여, 선형 기울기 용출에 의해 B형 간염 표면 항원을 수지로부터 용출시킨다.
크로마토그래피 컬럼으로부터 용출시킨 분류물을 모으고 상기한 바와 같이 B형 간염 표면 항원에 대해 분석한다.
B형 간염 표면 항원 활성을 보여주는 분류물들의 샘플을 은 염색시키고 결과 형성된 겔을 분석하여 B형 간염 표면 항원의 순도 및 존재를 확인한다.
B형 간염 표면 항원을 함유하는 유분들을 함께 한데 모은다. AUSRIA II 분석을 수행하여 42%의 회수를 나타내는 63mg의 B형 간염 표면 항원이 존재함을 알 수 있다. 생성물의 순도는 약95%이다.
B형 간염 표면 항원-함유 용액을 0.2미크론 여과기를 통해 여과한 다음-70℃에서 저장한다.
따라서, 이 실시예는 본 발명에 의해 B형 간염 표면 항원 단백질이 효모 세포로부터 회수될 수 있음을 설명한다.
이 실시예는 본 발명의 실행을 설명하기 위해서만 제공되며 어떠한 방법으로든 첨부된 청구 범위나 본 발명의 범주를 제한하도록 해석되어서는 안된다.
본 발명의 참뜻과 본질을 벗어나지 안흔 적당한 변화 및 변경이 원하는 추구하는 특히 보호의 범주 내에서 고려된다.

Claims (22)

  1. a) 완충시킨 카오트로픽(chaotropic) 염의 존재하에 피치아 파스토리스(pichia pastoris) 효모 세포를 용해시키고 상기 용해된 세포로부터 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 분리시키고; b) a) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을, 상기 상등액에서 지방 및 오염 단백질을 침전시키기에 적합한 조건하에 놓고; c) b) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 다이아 여과(diafiltration)시키고; d) c) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원-함유 보유액을 실리카와 접촉시키고; e) 결과 생성된 실리카-흡착된 B형 간염 표면 항으로부터의 오염 단백질을 pH 6-8의 완충 용액을 사용하여 세척하고; f) 실리카로부터의 B형 간염 표면 항원을 0.5-8몰 농도의 요소를 함유하는 pH 9.5-11.0의 완충 용출액으로 용출시키고; g) f) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 오염 단백질로부터 B형 간염 표면 항원을 분리시키기에 적합한 겔 여과 단계에 놓고; h) g) 단계에서 얻어진 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 오염 단백질로부터 상기 B형 간염 표면 항원을 분리시키기에 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 거치게 하는 것을 포함하는, 피치아 파스토리스 세로포부터 B형 간염 표면 항원을 회수하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포가 유기 비이드(beads) 분쇄에 의해 용해되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 티오시안산 나트륨, 티오시안산 칼륨, 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, 차아염소산 나트륨, 염화 리튬, 브롬화 리튬, 염산 구아니디늄, 티오시안산 구아니디늄, 및 요소로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 약 1-약 8몰 농도로 존재하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 약 6-약8의 pH를 갖는 완충 시스템에 의해 완충되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 지방 및 오염 단백질의 침전이, 10-30분 동안 45-55℃의 온도 범위로 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 가열시킴으로써 수행되는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 지방 및 오염 단백질의 침전이 상기 B형 간염 표면 항원-함유 용액을 4-30℃의 온도 범위로 가열시키고 상기 상등액의 pH를 4.5-5.5 범위로 낮추기 위해 충분한 양의 산을 첨가시킴으로써 수행되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 산이 염산, 황산, 인산, 아세트산, 옥살산, 질산, 과염소산 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 침전후에, B형 간염 표면 항원-함유 상등액의 pH를 6-8의 범위로 올리기 위해 충분한 염기가 첨가되는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 다이아 여과가 5,000-500,000의 분자량 배제 제한(exclusion limit)을 갖는 막을 사용하여 수행되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 실리카가 100m2/gm-5002/gm 범위의 허용 가능한 표면적을 갖는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 초기 입자 농도가 용해된 세포 추출물로부터의 총 추출 가능한 단백질의 1% 이상인 경우, 상기 B형 간염 표면 항원-함유 상등액에 존재하는 매 1mg의 B형 간염 표면 항원의 활성에 대해 50-100mg 의 실리카가 사용되는 방법.
  13. 제11항에 있어서,초기 입자 농도가 용해된 세포 추출물로부터의 총 추출 가능한 단백질의 1% 보다 작은 경우, 상기 B형 간염 표면 항원-함유 상등액 안에 존재하는 매 1mg의 B형 간염 표면 항원 활성에 대해, 1% 당 50-100mg의 실리카로부터 상응하는 비율로 증가하는 양의 실리카가 사용되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 실라카가 40-60중량%의 실리카를 함유하는 실리카 슬러리로서 존재하는 방법.
  15. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 아가로스 겔, 덱스트란 겔, 및 폴리아크릴아미드 겔로이루어진 군으로부터 선택된 극성 매트릭스 상에서 겔 여과시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 극성 매트릭스가 적어도 1백만의 분자량 배제를 갖는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 6-9의 pH를 갖는 완충 용액을 사용하여 상기 극성 매트릭스를 통해 상기 B형 간염 표면 항원이 용출되는 방법.
  18. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 디에틸 아미노 에틸 양이온을 사용하는 음이온-교환 수지로 수행되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 6-9 범위의 pH 및 0-0.3몰 농도의 전해질 농도를 갖는 완충 용액을 사용하여 B형 간염 표면 항원을 상기 음이온 교환 수지로부터 용출시키는 방법.
  20. 제1항에 있어서, (a) 약 7.5의 pH를 갖는 인산염 완충 용액 및 약 3몰 농도의 티오시안산 칼륨 농도의 존재하에 상기 효모 세포를 용해시키고; (b) pH를 5.0으로 낮추는데 충분한 농도를 갖는 인산의 존재하에 약 20℃의 온도에서 상기 침전을 수행하고; (c)는 상기 침전후에, 상기 B형 간염 표면 항원-함유 용액의 pH를 약 6.5로 올리기 위해 충분한 수산화 나트륨을 첨가시키고; (d) 약7.5의 pH를 갖는 인산염 완충 용액의 존재하에 100,000의 분자량 배제 제한을 갖는 막에서 상기 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 다이아 여과시키고; (e)상기 B형 간염 표면 항원-함유 상등액을 충분한 양의 약 50중량%의 실리카 슬러리와 접촉시켜 상기 상등액에 존재하는 매 1mg의 B형 간염 표면 항원 활성에 대해 60mg의 실리카를 사용하고, (f) 약 7의 pH를 갖고, 0.15M NaCl을 함유하는 인산염으로 완충시킨 염수 완충 시스템을 사용하여 상기 실리카로부터 상기 오염 단백질을 세척하고, (g) 약 10.1의 pH 및 약 1몰 농도의 요소 농도를 갖는 탄산염-중탄산염 완충 용액으로 상기 실리카로부터 상기 B형 간염 표면 항원을 용출시키고,(h) 약 8의 pH를 갖는 트리스(TRIS)-염화물 완충 용액의 존재하에, 100,000의 분자량 배제 제한을 갖는 막에서 단계(g)에서 얻어진 상기 B형 간염 표면 항원-함유 분류물을 여과시키고, (i) 20×106의 분자량 배제를 갖는 아가로스 겔 위에서 상기 겔 여과를 수행하고 약 8의 pH를 갖는 트리스-염화물 완충 용액으로 상기 B형 간염 표면 항원을 상기 아가로스 겔을 통해 용출시키고, (j) 상기 이온 교환 크로마토그래피를 디에틸 아미노 에틸 양이온을 사용하여 수행하고 상기 B형 간염 표면 항원을 0-0.3몰 농도 범위의 염화나트륨 농도를 갖는 트리스-염화물 완충 용액을 사용하여 상기 양이온으로부터 용출시키는 방법.
  21. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 효모 세포가 pBSAGI5I(NRRL B-18021)로 형질 전환된 피치아 파스토리스 GS115(NRRL Y-15851)인 방법.
  22. 제1항의 방법에 의해 제조된 정제시킨 B형 간염 표면 항원 입자.
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