NO176439B - Fremgangsmåte for rensing av hepatittproteiner - Google Patents
Fremgangsmåte for rensing av hepatittproteiner Download PDFInfo
- Publication number
- NO176439B NO176439B NO891532A NO891532A NO176439B NO 176439 B NO176439 B NO 176439B NO 891532 A NO891532 A NO 891532A NO 891532 A NO891532 A NO 891532A NO 176439 B NO176439 B NO 176439B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hepatitis
- surface antigen
- supernatant
- silica
- buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 23
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 130
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 129
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 129
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 128
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 86
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 59
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 6
- -1 diethylaminoethyl cation Chemical class 0.000 claims description 6
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 20
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 abstract description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical group [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229910002019 Aerosil® 380 Inorganic materials 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LRCFXGAMWKDGLA-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;hydrate Chemical compound O.O=[Si]=O LRCFXGAMWKDGLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012540 ion exchange chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Physical Water Treatments (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til rensing av hepatitt-B-overflateantigener fra Pichia pastoris-gjærceller.
Hepatitt-B-viruset induserer en infeksjon kjent som hepatitt B. Kronisk infeksjon med viruset kan føre til skrumplever og leverkreft.
For øyeblikket kan man ikke helbrede individer som er infisert med hepatitt-B-viruset. Følgelig konsentrerer medisinsk behandling seg om forebyggelse via vaksinasjon.
Vaksinens aktive bestanddel er et polypeptid kjent som hepatitt-B-overf lateantigenet. Dette polypeptid opptrer naturlig på overflaten av hepatitt-B-viruset.
En fremgangsmåte til fremstilling av dette peptid er å isolere det fra blodet hos individer som er infisert med hepatitt-B-viruset. På grunn av den frykt som for tiden hersker med hensyn til spredning av sykdommer såsom AIDS via blodprodukter, er denne fremgangsmåte blitt mindre populær.
En alternativ fremgangsmåte er å fremstille hepatitt-B-overflateantigenet via genteknikk. Genet for hepatitt-B-overflateantigenpolypeptidet kan klones inn i f.eks. enten en gjær-, bakterie- eller pattedyrcelle.
Den genetisk endrede celle kan deretter dyrkes på en slik
måte at hepatitt-B-overflateantigenpolypeptidet vil uttrykkes og samles i partikler.
Skjønt hepatitt-B-overflateantigenpolypeptidet med hell kan fremstilles i rekombinante celler, eksisterer der likevel problemer med de fremgangsmåter som for tiden anvendes til utvinning av polypeptidet fra cellen og rensing av dette.
Den mest vanlige fremgangsmåte til rensing av hepatitt-B-overf lateantigen er f.eks. en densitetsgradientsentrifugering. Denne fremgangsmåte krever imidlertid anvendelse av en stor mengde cesiumklorid og sakkarose samt bruken av en ultrasentri-fugeringsmaskin og også forskjellige rotorer i henhold til graden av rensing og dens målestokk, og følgelig er fremgangsmåten ikke egnet på grunn av dens høye omkostninger.
I US-PS 4 683 293 er der angitt at lipofile proteiner såsom hepatitt-B-overflateantigen fremstilt ved genetisk modifiserte stammer av Pichia pastoris kan utvinnes selektivt ved bruk av en lysebuffer som inneholder kaotropiske salter. Skjønt en slik fremgangsmåte anses å representere et betydelig frem-skritt i rensingen av lipofile proteiner, er der fortsatt behov for en samlet fremgangsmåte som tillater utvinningen av slike proteiner som hepatitt-B-overflateantigenet i en form som er egnet til bruk i fremstillingen av en vaksine.
Det vil således være et verdifullt bidrag til faget å utvikle en samlet fremgangsmåte som lar seg utføre i industriell målestokk for utvinning av hepatitt-B-overflateantigenpartikkelen fra gjærceller i en renhetstilstand som er tilstrekkelig for direkte innlemmelse i en vaksine.
Det er en hensikt med den foreliggende oppfinnelse å skaffe
en fremgangsmåte til utvinning av hepatitt-B-overflateantigenpartikkelen i en tilstand av renhet som er tilstrekkelig til at den kan innlemmes direkte i en vaksine og på en måte som er forenlig med utførelse i industriell målestokk.
Denne hensikt er oppnådd ved foreliggende oppfinnelse kjenne-tegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det funnet at hepatitt-B-overflateantigenpartikkelen kan utvinnes og renses fra en gjærcelle ved en fremgangsmåte som omfatter at: a. de nevnte gjærceller underkastes lyse i nærvær av et kaotropisk salt og den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant separeres fra den lyserte cellepellet; b. den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant som fås i trinn (a), underkastes betingelser som er egnet til å utfelle lipider og forurensende proteiner fra den nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant og nevnte utfelling utføres ved en temperatur på tilnærmet 200°C i nærvær av fosforsyre som har en konsentrasjon tilstrekkelig til å senke pH-verdien til 5; c. etter nevnte utfelling tilsettes tilstrekkelig natriumhydroksid til å heve pH-verdien av nevnte hepatitt-B-overf lateantigenholdige oppløsning til tilnærmet 6,5; d. nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige oppløsning oppnådd i trinn (c) underkastes diafiltrering på en membran som har en molekylvekteksklusjonsgrense på 100
000 og i nærvær av en fosfatbuffer som har en pH-verdi
på tilnærmet 7,5;
e. nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige retentat som fås i trinn (d) bringes i kontakt med en tilstrekkelig mengde av en tilnærmet 50 vekt% silikaslurry slik at for hvert 1 mg av hepatitt-B-overflateantigenaktivitet
tilstede i nevnte supernatant benyttes det 60 mg silika;
f. nevnte forurensende proteiner vaskes fra nevnte silika med et fosfatbufret salinebuffersystem som har en pH-verdi i området 6-8 og inneholder 0,15 M NaCl;
g. nevnte hepatitt-B-overflateantigen elueres fra silikaet med en karbonat-bikarbonat buffer som har en pH-verdi i området 9,5-11,0 og en ureakonsentrasjon i området 0,5-8 M;
h. nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon oppnådd
1 trinn (g) underkastes diafiltrering på en membran som
har en molekylvekteksklusjonsgrense på 100 000 i nærvær av en TRIS-kloridbuffer som har en pH-verdi på tilnærmet
8;
i. nevnte gelfiltrering utføres på en agarosegel som har en molekylvekteksklusjonsgrense på 20*IO<6> og nevnte hepatitt-B-overf lateantigen elueres gjennom nevnte agarosegel
med en TRIS-kloridbuffer som har en pH-verdi på tilnærmet 8; og
j. den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon som fås
i trinn (i) underkastes ionevekslingskromatografi under anvendelse av et dietylaminoetylkation og nevnte hepatitt-B-overf lateantigen elueres fra nevnte kation med TRIS-kloridbuf f er som har en natriumkloridkonsentrasjon i området fra 0 til 0,3 M.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er nyttig for en hvilken som helst transformert gjær som kan uttrykke et hepatitt-B-overf lateantigen. Representative eksempler på egnede transfor-merte gjærsorter kan velges fra gruppen bestående av de gjærsorter som tilhører slektene Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis, Pichia og Kluyveromyces. En særlig foretrukket gjær er Pichia pastoris.
Typisk blir gjærsorter dyrket ved at de får vokse på en egnet karbonenergikilde under aerobe, vandige gjæringsbetingelser ved anvendelse av en assimilerbar nitrogenkilde, mineralsalter, fritt oksygen med egnet pH-verdi og andre styringsmekanismer, slik det er kjent i faget. Den nøyaktige måte som gjæren dyrkes på, er ikke kritisk for utførelse av den foreliggende oppfinnelse.
Som kjent for fagfolk er hepatitt-B-virusgenomer kjent for å produsere tre variasjoner av hepatitt-B-overflateantigenpolypeptidet. Disse variasjoner er alminnelig betegnet som S-formen, pre-S]_-formen og pre-S2_formen. Den foreliggende fremgangsmåte er anvendelig for utvinning og rensing av partikler som består av hvilke som helst av disse former av polypeptidet, f.eks. kan partiklene bestå av en blanding av hepatitt-B-overflateantigenpolypeptider.
Uttrykket hepatitt-B-overflateantigen, slik det anvendes i
den foreliggende søknad, betegner partikler med S-formen, pre-S^-formen og pre-S2-formen og blandinger derav.
Det første trinn i den foreliggende oppfinnelse er å lysere gjærcellene i nærvær av et kaotropisk salt (US-PS 4 683 293). Typisk vil cellene bli lysert ved homogenisering i en perle-mølle.
Uttrykket "kaotropisk salt", slik det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betegner salter hvis anioner begunstiger overføringen av apolare grupper til vann. Slike salter innbefatter forbindelser som inneholder tiocyanatanionet, halogenid-anioner såsom jodid og bromid, og hypo-NaCl-anioner (hypohalite anions) såsom perklorat, såvel som kationer som f.eks. litium, kalsium og barium.
Representative eksempler på egnede kaotropiske salter kan velges fra gruppen bestående av natriumtiocyanat, kaliumtiocyanat, natriumjodid, kaliumjodid, natriumhypokloritt, litium-klorid, litiumbromid, guanidinhydroklorid, guanidintiocyanat, urea og lignende. For tiden foretrekkes kaliumtiocyanat.
Det foretrekkes for tiden at det kaotropiske salt foreligger
i en molar konsentrasjon på 1-8.
Det foretrekkes også at det kaotropiske salt buffres for opprettholdelse av en pH-verdi i området 6-8. Som fagfolk vet, er der en rekke forskjellige buffersystemer som kan opprettholde en pH-verdi i området 6-8. Hvilke som helst av disse buffersystemer som er forenlige med det valgte salt, er egnet til bruk ved den foreliggende oppfinnelse. Den for tiden foretrukne buffer er natriumfosfat.
Om ønskelig kan proteaseinhibitorer foreligge i det kaotropiske saltmedium. Representative eksempler på egnede proteaseinhibitorer kan velges fra gruppen bestående av fenylmetylsulfonylfluorid og diisopropylfluorfosfat.
Typisk vil cellelysen med det kaotropiske salt utføres ved
en temperatur i området 0-10"C for ytterligere å redusere proteolytisk nedbrytning.
Etter at gjærcellene er blitt lysert, foretrekk.es det for tiden at den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant separeres fra den lyserte cellepellet før ytterligere rensing. Denne separasjon kan oppnås ved sentrifugering eller en hvilken som helst annen vanlig fremgangsmåte.
Det foretrekkes for tiden at den lyserte cellepellet som fås ved ekstraksjonen med det kaotropiske salt, underkastes en ytterligere vasking med en buffer som har en pH-verdi i området 6-8 for å fjerne eventuelle resterende hepatitt-B-overflateantigener som er tilbake i cellepelleten.
Om ønskelig kan det buffrede kaotropiske salt anvendes til å vaske cellepelleten.
Etter at den lyserte cellepellet er blitt vasket, foretrekkes det at den resulterende supernatant separeres fra celleavfallet som er forbundet med den lyserte cellepellet og kombineres med den supernatant som ble oppnådd tidligere for ytterligere rensing.
Det neste trinn i rensingen er å underkaste den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant betingelser som er egnet til å utfelle lipider og forurensende proteiner fra den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant. En egnet fremgangsmåte til å bevirke denne utfelling, er å varme supernatanten til en temperatur i området 45-55°C, fortrinnsvis 47-5CPC i et tidsrom på 10-30 min.
En annen egnet fremgangsmåte til utfelling av lipidene og
de forurensende proteiner fra supernatanten, er å varme supernatanten i nærvær av en syre.
Tilstrekkelig mengde syre bør tilsettes til at pH-verdien av den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant reduseres til 5,0-6,0.
Den syre som anvendes i fremgangsmåten, kan være enten en uorganisk syre eller en organisk syre. Egnede syrer kan velges fra gruppen bestående av saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, oksalsyre, salpetersyre, perklorsyre eller maursyre.
Syrningsbehandlingen utføres fortrinnsvis ved en temperatur ikke høyere enn 30°C, helst ikke høyere enn 20°C, dvs. i et området på 4-30'C, helst 4-20°C.
Etter utfellingstrinnet foretrekkes det at de utfelte celle-komponenter separeres fra den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant. Dette kan utføres ved en hvilken som helst vanlig separasjonsteknikk såsom sentrifugering eller dekantering.
Dersom syrning anvendes i utfellingstrinnet, foretrekkes det at den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant behandles med tilstrekkelig mengde base til å returnere pH-verdien til et område på 6-8, fortrinnsvis ca. 6,5, før ytterligere rensing.
Den spesielle base som anvendes for å returnere pH-verdien
til 6-8, er ikke kritisk for utførelse av den foreliggende oppfinnelse. Representative eksempler på egnede baser kan velges fra gruppen bestående av kaliumhydroksid, natriumhydroksid og ammoniumhydroksid.
Det neste trinn i rensingen-.- er å underkaste den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant konsentrering og diafiltrering. Konsentrering og diafiltreringen bør utføres med en membran som har en molekylvekteksklusjonsgrense som er tilstrekkelig til å hindre passasjen av hepatitt-B-overflateantigenet gjennom membranen, men likevel er i stand til å tillate passasjen av forurensende peptider og elektrolytter.
En hvilken som helst i handelen tilgjengelig konsentrasjons-membran som har en molekylvekteksklusjonsgrense i området 5000-500 000, fortrinnsvis 75 000-100 000, er egnet til bruk i den foreliggende fremgangsmåte.
Det foretrekkes også at konsentrasjonsmembranen benyttes til
å fjerne det kaotropiske salt. Dette kan oppnås ved tilsetning av 1-2 volumer av en kaotropisk-fri buffret oppløsning med en pH-verdi i området 6-8 til den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant etter den opprinnelige konsentrering og gjentagelse av konsentreringsrekkefølgen.
Ethvert etterfølgende like stort volum buffer vil fortynne konsentrasjonen av det kaotropiske salt i den hepatitt-B-overf lateantigenholdige oppløsning med en faktor på ca. 5 0%. Således vil disse ytterligere volumer gradvis fjerne det kaotropiske salt fra den hepatitt-B-overflateantigenholdige oppløsning.
Det neste trinn i renseprosessen er å utsette den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant for adsorpsjonskromato-grafi med silika.
Adsorpsjonskromatografien kan utføres ved en kolonnemetode eller ved en satsvis metode. Den satsvise metode foretrekkes for tiden. Silika som er egnet til bruk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, innbefatter enten partikkelformet silika-hydrat eller silikaanhydrat med et tilgjengelig overflateareal i området 100-500 mm<2>/g. Et egnet partikkelformet silika er tilgjengelig under handelsnavnet "Aerosil 380" fra DeGussa Corp., New Jersey.
I den satsvise fremgangsmåte blir det partikkelformede silika dispergert i tilstrekkelig mengde vann til å gi en silikaoppslemming som inneholder 40-60 vektprosent silika.
Silikaoppslemmingen blir deretter bragt i berøring med den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant.
Den mengde silikaoppslemming som benyttes, bør være slik at når den opprinnelige partikkelkonsentrasjon er £ 1% av det samlede ekstraherbare protein fra det lyserte celleekstrakt, så tilsettes for hvert mg hepatitt-B-overflateantigenaktivitet som foreligger i supernatanten, 50-100 mg silika til supernatanten. Fortrinnsvis tilsettes ca. 60 mg silika for hvert mg AUSRIA-aktivitet som foreligger når den opprinnelige partikkelkonsentrasjon er > 1%. Når partikkelkonsentrasjonen i det lyserte celleekstrakt er < 1%, så bør mengden av silika økes proporsjonalt med den reduserte partikkelkonsentrasjon.
AUSRIA II Analysis Kit er tilgjengelig i handelen fra Abbott Laboratories, Chicago, IL.
Etter at den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant er blitt bragt i berøring med silikaoppslemmingen, foretrekkes det at den resulterende blanding omrøres sammen i en periode fra 15 min til 4 h.
Etter at den hepatitt-B-overflateantigenholdige oppløsning
er blitt tillatt å komme i berøring med silika i et egnet tidsrom, foretrekkes det at supernatanten separeres fra de silikabundne hepatitt-B-overflateantigener. Dette kan oppnås ved sentrifugering og dekantering eller ved en hvilken som helst teknikk som det er vanlig å anvende.
Det neste trinn i rensingen er å fjerne de forurensende proteiner fra silikaet. Dette kan oppnås ved vasking av silikaet med en buffret oppløsning som har en pH-verdi i området 6-8, fortrinnsvis ca. 7,2. Som det er kjent for fagfolk, er der en rekke forskjellige buffersystemer tilgjengelige for opprettholdelse av en pH-verdi i området 6-8. Hvilke som helst av disse buffersystemer er egnet til bruk i den foreliggende oppfinnelse. Det for tiden foretrukne buffersystem er et natriumfosfat/natriumklorid-buffersystem.
Det foretrekkes for tiden at silikaet vaskes flere ganger med 5-15 volumer av bufferen hver gang for å sikre fjerning av de forurensende proteiner. En måte å overvåke fjerningen av forurensende proteiner på, er å måle absorbansen av hver vasking ved 280 nm. Når absorbansen når den samme uendrede minimumsverdi, er vaskeprosessen fullstendig.
Etter at de forurensende proteiner er blitt fjernet fra silikaet, kan hepatitt-B-overflateantigenet elueres fra silikaet ved at silikaet bringes i berøring med en egnet buffer som inneholder urea, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,5-3 molaritet.
Egnede buffere vil ha en pH-verdi i området 9,5-11. Som det er kjent for fagfolk, er der en rekke forskjellige buffersystemer som kan opprettholde en pH-verdi innen området 9,5-11. Hvilke som helst av disse buffersystemer er egnet til bruk med den foreliggende oppfinnelse. For tiden foretrekkes en natriumkarbonat/natriumbikarbonat-buffer.
Dersom den satsvise metode er blitt anvendt, foretrekkes det at 8-12 volumer av den ureaholdige buffer tillates å kontakte silikaet i en periode på 1-4 h, fortrinnsvis ca. 2 h. Etter dett tidsrom blir supernatanten som inneholder hepatitt-B-over: ^eantigenet separert fra silikaet og tatt vare på for ytterligere rensing.
Det foretrekkes for tiden at silikaet underkastes en ytterligere eluering med 8-12 volumer av den buffrede urea. De ytterligere hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjoner som fremstilles, kombineres med den tidligere hepatitt-B-overf lateantigenholdige fraksjon og underkastes ytterligere rensing.
Dersom kolonnemetoden anvendes, blir en kromatografikolonne pakket med det partikkelformede silika og den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant bringes i berøring med kolonnen. De forurensende proteiner vaskes fra silikaet med en buffer som har en pH-verdi i området 6-8, som beskrevet ovenfor for den satsvise metode. Hepatitt-B-overflateantigenet kan elueres med en ureabuffer som har en pH-verdi i området 9,5-11, som beskrevet ovenfor for den satsvise metode.
Fortrinnsvis blir den hepatitt- overflateantigenholdige fraksjon deretter underkastet ytterligere diafiltreringstrinn for å fjerne ureaet. Et diafiltreringssystem bør anvendes som har en membran med en molekylvektbegrensning slik at hepatitt-B-overflateantigenet ikke vil passere gjennom den.
Egnede membraner er de som har en molekylvektbegrensning innen området 5 000-500 000.
Ureaet fjernes fra den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon ved at fraksjonen underkastes gjentatte diafiltreringer i løpet av hvilke et ytterligere volum av en ikke-urea-holdig buffer som har en pH-verdi i området 6-8, settes til den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon. Disse gjentatte diafiltreringer med ytterligere buffer vil gradvis fortynne ureaet fra oppløsningen.
Det neste trinn i rensingen er å underkaste den hepatitt-B-overf lateantigenholdige fraksjon gelfiltrering.
Det foretrekkes for tiden at gelfiltreringen utføres på en kromatografikolonne som er blitt pakket med en agarosegel. Andre egnede polare grunnmasser som kan anvendes til å pakke kolonnen, kan velges fra, men er ikke begrenset til, gruppen bestående av dekstrangeler og polyakrylamidgeler.
Den polare grunnmasse som benyttes som pakkingsmateriale for gelfiltreringen, bør ha en molekylvekteksklusjonsgrense på minst en million.
Før den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon bringes
i berøring med kromatografikolonnen, bør kolonnen ekvilibreres med en egnet buffer for å hindre at hepatitt-B-overflateantigenet adsorberes på pakkingsmat°rialet. Egnede buffere vil ha en pH-verdi i området 6-9. i det er kjent for fagfolk,
er der en rekke forskjellige buffere som kan opprettholde en pH-verdi i området 6-9. Hvilke som helst av disse buffere er egnet til bruk med den foreliggende oppfinnelse. For tiden foretrekkes en tris(hydroksymeti_,/aminometan(TRIS)-kloridbuffer.
Etter at kolonnen er blitt ekvilibrert, bør den hepatitt-B-overf lateantigenholdige fraksjon bringes i berøring med pak-kingsmaterialet i kolonnen.
Den buffer som anvendes i ekvilibreringen av kolonnen, anvendes også til vasking av både der forurensende proteiner og hepatitt-B-overf lateantigenene gjennom kolonnen.
Søm kjent for fagfolk, vil de molekyler som har den største molekylvekt, passere gjennom kolonnen først og de mindre molekyler følge etter. Kolonnen bør vaskes kontinuerlig med en egnet buffer inntil hepatitt-B-overflateantigenene er blitt eluert.
Nærværet av hepatitt-B-overflateantigen i elueringsmiddelet kan påvises ved gelelektroforese eller ved hvilke som helst av de i handelen tilgjengelige analysepakker som er følsomme for hepatitt-B-overflateantigen. En slik egnet pakke er AUSRIA II, som er tilgjengelig fra Abbott Laboratories.
De fraksjoner som har testet positivt for besittelse av hepatitt-B-overflateantigener, slås sammen og blir valgfritt underkastet konsentrering. En egnet konsentreringsmetode er ultrafiltrering.
De hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjoner blir deretter underkastet ytterligere rensing ved ionevekslingskromatografi. Det foretrekkes for tiden at rensingen utføres med en anionvekslingsligand. Den for tiden foretrukne anionvekslingsligand er et dietylaminoetylkation.
Som kjent for fagfolk, kan anionvekslingsliganden innføres i en polyakrylamidgelharpiks eller en karbohydratpolymerharpiks såsom cellulose eller dekstran, og kromatografikolonnen .vil være pakket med dette materiale. Kolonnekonfigurasjonen kan være, men er ikke begrenset til, enten vanlig vertikal strøm-ning eller radial strømning. Cellulose er for tiden den foretrukne harpiks.
Før hepatitt-B-overflateantigenene bringes i berøring med anionvekslingsharpiksen, bør harpiksene ekvilibreres med en passende buffer som har en pH-verdi i området 6-9.
En rekke buffere kan opprettholde dette pH-område. Hvilke
som helst av disse buffere er egnet til bruk med den foreliggende oppfinnelse. For tiden foretrekkes en TRIS-klorid-buf fer .
Etter ekvilibrering bør de hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjoner bringes i berøring med anionvekslingsharpiksen.
Det foretrekkes for tiden at hepatitt-B-overflateantigenene elueres fra ionevekslingsharpiksen ved lineærgradienteluering. Dette kan oppnås ved en lineær forandring i ionestyrke eller en lineær forandring i pH-verdi. Opprinnelig blir kolonnen vasket med et buffersystem som er det samme som det som benyttes i ekvilibreringstrinnet. Gradvis blir oppløsnings-middelsammensetningen forandret ved innføring av en elektrolytt i buffersystemet og gradvis økning av konsentrasjonen av elektrolytten opp til en molaritet på ca. 0,3 molar.
Det foretrekkes for tiden at elektrolytten er natriumklorid, skjønt andre elektrolytter er like virkningsfulle.
For tiden foretrekkes det at de forskjellige fraksjoner som oppnås som et resultat av gradientelueringen, testes for hepatitt-B-overflateantigeninnhold. Det kan gjøres på samme-måte som utløpsstrømmen fra gelfiltreringen ble testet.
De fraksjoner som inneholder hepatitt-B-overflateantigen, slås sammen. Om ønskelig, kan de resulterende sammenslåtte hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjoner konsentreres ved ultrafiltrering.
Det hepatitt-B-overflateantigen som oppnås via den rensing som er angitt ovenfor, har nå i det minste et renhetsnivå hvor det kan anvendes direkte i en vaksine.
Det følgende eksempel er gitt for ytterligere å belyse for-delene ved oppfinnelsen.
Eksempel I
Dette eksempel viser nytten av den foreliggende oppfinnelse ved rensing av hepatitt-B-overflateantigener som er blitt produsert i transformert Pichia pastoris-kulturer.
En kultur av Pichia pastoris-celler (GS115; NRRL Y-15851)
ble transformert med en vektor pBSAGI5I (tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center ved
De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois, med aksesjonsnr. NRRLB-18021).
Disse kulturer av Pichia pastoris ble gjæret ved vanlige teknikker inntil en celletetthet på 264 g/l våtvekt.
1900 ml av gjæringsvæsken ble separert fra gjæringsbeholderen. Denne gjæringsvæske ble sentrifugert ved 850 0 omdr. pr. min (RCF ved rave=7700) i ca. 10 min, og den resulterende supernatant ble kassert.
En kaotropisk buffer ble fremstilt for ekstraksjonstrinnet, hvilken inneholdt kaliumtiocyanat i en konsentrasjon på 3M
og natriumfosfat i en konsentrasjon på 10 mM. Proteaseinhibi-toren, fenylmetylsulfonylfluorid, ble også satt til inntil en konsentrasjon på 1 mM. Den resulterende buffer hadde en pH-verdi på 7,5.
Lysetrinnet ble utført ved at der i en perlemølle ble agitert 500 g celler fra pelleten i 1500 ml av den kaotropiske buffer i nærvær av 500 ml 0,5 mm glassperler.
Celle/perle-blandingen ble sentrifugert i 15 min ved 12 500 omdr. pr. min (RCF ved rave = 16 000). Supernatanten ble separert fra celle/perle-blandingen ved dekantring og bevart for senere rensing.
Celle/perle-blandingen ble deretter underkastet en ytterligere vasking med 1000 ml av den kaotropiske buffer. Den resulterende supernatant ble deretter separert fra celle/perle-blandingen og bevart for ytterligere rensing.
Ekstraksjonen med et kaotropisk salt ble utført ved en temperatur på 4°C. Alle andre rensetrinn ble også utført ved 4°C med mindre noe annet er angitt. Dette ble gjort for å redusere proteolytisk nedbrytning.
Supernatantene ble kombinert og underkastet utfelling ved oppvarming av supernatanten til værelsetemperatur i et vannbad. Straks supernatanten hadde oppnådd værelsetemperatur, ble
IN fosforsyre tilsatt supernatanten i en mengde som reduserte pH-verdien av supernatanten fra 7,5 til 5. Oppløsningen ble deretter tillatt å stå ved værelsetemperatur i ca. 30 min.
I løpet av dette tidsrom ble forurensende proteiner og lipider utfelt fra den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant.
Supernatanten ble avkjølt til 4°C og sentrifugert i 15 min
ved 12 500 omdr. pr. min. Supernatanten ble dekantert for å separere den fra de utfelte avfallsstoffer.
pH-verdien av supernatanten ble deretter øket til 6,5 ved tilsetning av IN natriumhydroksid.
På dette punkt var der 3 120 ml hepatitt-B-overflateantigen-holdig supernatant. En AUSRIA Il-analyse ble utført. Denne analyse viste at der var 236 mg hepatitt-B-overflateantigen i supernatanten. Dette representerte en utvinning på 80,5%.
Den hepatitt-B-overflateantigenholdige oppløsning ble deretter underkastet konsentrering og diafiltrering på et Amicon-hul-fiber ultrafiltreringssystem med en molekylvekteksklusjonsgrense på 100 000.
Etter den opprinnelige konsentrering til ca. 0,5 1 ble 1 1 natriumfosfatbuffer med en pH-verdi på 7,5 satt til den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant og den resulterende blanding ble underkastet ytterligere konsentrering. Dette ble gjentatt to ganger inntil kaliumtiocyanatet ble fortynnet fra oppløsningen.
Etter at kaliumtiocyanatet var blitt fjernet fra den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant ved diafiltrering, ble nok en AUSRIA II-analyse utført på det 40 5 mis retentat. Denne analyse viste at der var 231 mg hepatitt-B-overflateantigen, hvilken representerte en utvinning på 7 8,8%.
Den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant ble deretter satsvis bundet til silika som hadde en tilgjengelig overflate på 380 m2/g.
Dette ble utført på følgende måte:
Først ble tørt silika fremstilt som en 50% oppslemming (tørr-vekt/volum) med destillert vann. Dette gav en blanding med 50 mg silika pr. ml oppslemming. 27 5 ml av silikaoppslemmingen ble satt til den hepatitt-B-overf lateantigenholdige supernatant og blandingen ble omrørt langsomt ved værelsetemperatur i 2 h.
Hepatitt/silika-blandingen ble deretter avkjølt til 4°C og sentrifugert i 15 min ved 5000 omdr. pr. min (RCF ved rave = 2500). Den resulterende supernatant ble kassert.
Silikaet ble deretter vasket med 500 ml av en fosfatbuffer med en pH-vedi på 7 og inneholdende 0,15 M NaCl. Renseopp-løsningen ble kassert. Vasketrinnene med fosfatbuffer ble fortsatt inntil absorbansen ved 280 nm fra supernatant nådde en minste uendret verdi.
Hepatitt-B-overflateantigenet ble deretter eluert fra silikaet med en buffer inneholdende 25 mM natriumkarbonat, 25 mM natri-umbikarbonat og 1 molar urea. Den endelige pH-verdi av bufferen var 10.
Hepatitt/silika-blandingen ble plassert i 500 ml av urea-bufferen og omrørt ved værelsetemperatur i 2 h.
Den buffrede ureaoppløsning inneholdende silika/hepatitt ble avkjølt til 4°C og sentrifugesrt i 15 min ved 5000 omdr. pr. min. Supernatanten ble dekantert og bevart for ytterligere rensing.
Silikaet ble deretter eluert med et andre volum på 500 ml urea, buffret på samme måte-som det første. Den resulterende supernatant ble kombinert med den første supernatant og underkastet et konsentrerings- og diafiltreringstrinn for å fjerne ureaet.
På dette punkt ble den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant underkastet konsentrering på et Amicon-hulfilter diafiltreringssystem som hadde en membran med en molekylvekteksklusjonsgrense på 100 000.
Etter denne opprinnelige konsentrering til ca. 100 ml ble
200 ml av en 10 mM natriumfosfatbuffer med en pH-verdi på
7,5 satt til den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant og underkastet en ytterligere konsentrering. Dette trinn hadde den virkning at det fortynnet ut ureaet. Fremgangsmåten ble gjentatt to ganger, hvilket hadde den virkning at 89% av
ureaet ble fjernet fra den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon.
Etter diafiltrering ble den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon sentrifugert i 15 min ved 16 000 omdr. pr. min.
En AUSRIA Il-analyse ble utført på dette punkt. Analysen viste at der var 234 mg hepatitt-B-overflateantigen til stede, hvilket representerte en 64,5% utvinning.
Den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant ble deretter underkastet gelfiltrering.
En i handelen tilgjengelig Sepharose CL4B størrelseseksklu-sjonskolonne ble benyttet. Denne kolonne hadde et volum på 2 1 og var pakket med en agarosegel som hadde en molekylvekteksklusjonsgrense på 20 x 10^.
Den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon ble deretter bragt i berøring me denne kolonne. Hepatitt-B-overflateantigenet ble eluert fra kolonnen med 25 mm TRIS-klorid med en pH-verdi på 8.
Fraksjonene ble samlet opp etter hvert som de ble eluert fra kolonnen og analysert for hepatitt-B-overflateantigeninnhold. Disse fraksjoner med hepatitt-B-overflateantigenaktivitet, basert på en polyakrylamidgelelektroforese-analyse, ble slått sammen og bevart for senere rensing. Den analyse som ble anvendt, var den AUSRIA II-analysetest som er tilgjengelig i handelen fra Abott Laboratories.
De sammenslåtte fraksjoner hadde samlet 17 0 mg hepatitt-B-overf lateantigenaktivitet , som representerer 63,1% utvinning.
Denne hepatitt-B-overflateantigenholdige sammenslåtte fraksjon ble deretter konsentrert ved bruk av et Amicon YM 30-filter. Den konsentrerte hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon ble deretter underkastet ionevekslingskromatografi.
Ionevekslingskromatografiet ble utført på en kolonne ved anvendelse av et dietylaminoetylkation som var blitt bundet til en cellulose-bærergrunnmasse. Denne kolonne ble ekvilibrert med en TRIS-kloridbuffer med en pH-verdi på 8.
Etter ekvilibrering av harpiksen ble den hepatitt-B-overflateantigenholdige sammenslåtte fraksjon bragt i berøring med ionevekslingskromatografiharpiksen.
Hepatitt-B-overflateantigenet ble deretter eluert fra harpiksen ved lineær gradienteluering ved anvendelse av en TRIS-klorid-buf fer med en pH-verdi på 8 og en natriumkloridkonsentrasjon som varierte fra 0 til 0,3 M.
Fraksjonene ble samlet opp etter hvert som de ble eluert fra kromatografikolonnen og ble analysert for hepatitt-B-overflateantigener som beskrevet tidligere. Prøver av de fraksjoner som viste oppviste hepatitt-B-overflateantigenaktivitet ble deretter underkastet sølvflekking (silver staining) og de resulterende geler ble analysert for å bekrefte nærværet og renheten av hepatitt-B-overflateantigen.
De fraksjoner som inneholdt'hepatitt-B-overflateantigen, ble slått sammen. En ytterligere AUSRIA II-analyse ble utført og viste at der var 63 mg hepatitt-B-overflateantigen til stede, hvilket representerte en utvinning på 42%. Produktet var tilnærmet 95% rent.
Den hepatitt-B-overflateantigenholdige oppløsning ble deretter filtrert gjennom et 0,2 mikrometer filter og lagret ved -70°C.
Dette eksempel viser således at hepatitt-B-overflateantigen-proteiner kan utvinnes fra gjærceller i henhold til den foreliggende oppfinnelse.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte til utvinning av hepatitt-B-overflateantigen med opptil 95% renhet dyrket fra Pichia pastoris-celler transformert med et gen som koder for hepatitt-B-overflateantigen-peptid,
karakterisert ved at (a) nevnte dyrkede gjærceller lyseres i nærvær av en fosfatbuffer som har en pH-verdi på tilnærmet 7,5 og en kaliumtiocyanat-konsentrasjon på tilnærmet 3 molar og den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant separeres fra de lysert celler; (b) den hepatitt-B-overflateantigenholdige supernatant oppnådd i trinn (a) underkastes betingelser egnet til å utfelle lipider og forurensende proteiner fra nevnte supernatant og nevnte utfelling utføres ved en temperatur på tilnærmet 20<*>C i nærvær av fosforsyre som har en konsentrasjon tilstrekkelig til å senke pH-verdien til 5,0; (c) etter nevnte utfelling tilsettes tilstrekkelig natriumhydroksid til å heve pH-verdien av nevnte hepatitt-B-overf lateantigenholdige oppløsning til tilnærmet 6,5; (d) nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige oppløsning oppnådd i trinn (c) underkastes diafiltrering på en membran som har en molekylvekteksklusjonsgrense på 100 000 og i nærvær av en fosfatbuffer som har en pH-verdi på tilnærmet 7,5; (e) nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige retentat som fås i trinn (d) bringes i kontakt med en tilstrekkelig mengde av en tilnærmet 50 vekt% silikaslurry slik at for hvert 1 mg av hepatitt-B-overflateantigenaktivitet tilstede i nevnte supernatant benyttes det 60 mg silika; (f) nevnte forurensende proteiner vaskes fra nevnte silika med et fosfatbufret salinebuffersystem som har en pH-verdi i området 6-8 og inneholder 0,15 M NaCl; (g) nevnte hepatitt-B-overflateantigen elueres fra silikaet med en karbonat-bikarbonat buffer som har en pH-verdi i området 9,5-11,0 og en ureakonsentrasjon i området 0,5-8 M; (h) nevnte hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon oppnådd
i trinn (g) underkastes diafiltrering på en membran som har en molekylvekteksklusjonsgrense på 100 000 i nærvær av en TRIS-kloridbuf f er som har en pH-verdi på tilnærmet 8; (i) nevnte gelfiltrering utføres på en agarosegel som har en molekylvekteksklusjonsgrense på 20-10^ og nevnte hepatitt-B-overf lateantigen elueres gjennom nevnte agarosegel med en TRIS-kloridbuf fer som har en pH-verdi på tilnærmet 8; og (j) den hepatitt-B-overflateantigenholdige fraksjon som fås i trinn (i) underkastes ionevekslingskromatografi under anvendelse av et dietylaminoetylkation og nevnte hepatitt-B-overflateantigen elueres fra nevnte kation med TRIS-kloridbuffer som har en natriumkloridkonsentrasjon i området fra 0 til 0,3 M.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at gjærcellene blir lysert ved glassperleknusing.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte gjærceller utgjør Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) transformert med pBSAG151 (NRRLB-18021).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/181,934 US5004688A (en) | 1988-04-15 | 1988-04-15 | Purification of hepatitis proteins |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO891532D0 NO891532D0 (no) | 1989-04-13 |
| NO891532L NO891532L (no) | 1989-10-16 |
| NO176439B true NO176439B (no) | 1994-12-27 |
| NO176439C NO176439C (no) | 1995-04-05 |
Family
ID=22666418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO891532A NO176439C (no) | 1988-04-15 | 1989-04-13 | Fremgangsmåte for rensing av hepatittproteiner |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5004688A (no) |
| EP (1) | EP0337492B1 (no) |
| JP (1) | JP2721699B2 (no) |
| KR (1) | KR960004707B1 (no) |
| AT (1) | ATE124088T1 (no) |
| AU (1) | AU608706B2 (no) |
| CA (1) | CA1339792C (no) |
| DE (1) | DE68923115T2 (no) |
| DK (1) | DK181589A (no) |
| ES (1) | ES2075006T3 (no) |
| IE (1) | IE68408B1 (no) |
| IL (1) | IL89924A0 (no) |
| MX (1) | MX166707B (no) |
| NO (1) | NO176439C (no) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69013471T2 (de) * | 1989-12-05 | 1995-03-30 | Merck & Co Inc | Methode zur Stabilisierung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Hefe. |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
| IT1248075B (it) * | 1991-06-18 | 1995-01-05 | Sclavo Spa | Processo per la purificazione del virus dell'epatite a (hav), virus cosi` purificato e composizioni vaccinali che lo contengono. |
| RU2128707C1 (ru) * | 1992-01-17 | 1999-04-10 | Сентро Де Инженьериа Генетика И Биотекнологиа | Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в (hbs ag), моноклональные антитела св-hepi, поверхностный антиген вируса гепатита в (hbs ag) и способ получения гибридного клона 48/1/574, продуцирующего моноклональные антитела св-hepi |
| US6362003B1 (en) | 1992-02-24 | 2002-03-26 | Coulter Corporation | Hematological reference control composition containing leukocyte analogs, methods of making, and uses thereof |
| US5494801A (en) * | 1993-12-03 | 1996-02-27 | Biostar, Inc. | Microorganism antigen extraction methods |
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
| HRP950097A2 (en) | 1994-03-08 | 1997-06-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis a virus culture process |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| NZ296648A (en) * | 1994-10-18 | 2001-05-25 | Corvas Int Inc | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| KR960023066A (ko) * | 1994-12-10 | 1996-07-18 | 성재갑 | 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법 |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| KR100251015B1 (ko) * | 1997-06-05 | 2000-05-01 | 성재갑 | B형간염표면항원의정제방법 |
| DE19918619A1 (de) * | 1999-04-23 | 2000-10-26 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAg |
| US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
| WO2002000879A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Glycofi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
| US7449308B2 (en) * | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
| US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| JP4798833B2 (ja) * | 2000-10-24 | 2011-10-19 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 |
| KR100405174B1 (ko) * | 2001-02-02 | 2003-11-12 | 씨제이 주식회사 | 재조합 β형 간염바이러스 표면항원의 정제방법 |
| KR100436655B1 (ko) * | 2001-07-25 | 2004-06-22 | (주)엘피스바이오텍 | 광범위한 단백질에 적용할 수 있는 단백질의 농축 및정제 방법 |
| US7118901B2 (en) * | 2002-12-18 | 2006-10-10 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity |
| DE60319333D1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-04-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten |
| US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1460425A1 (en) | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| DE602004025192D1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung |
| CA2548378A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Bharat Biotech International Limited | A process for the preparation and purification of recombinant proteins |
| CA2621344C (en) * | 2005-09-14 | 2014-12-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin |
| AU2013330344B2 (en) | 2012-09-17 | 2018-07-05 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Chromatography media and devices |
| WO2015080943A1 (en) | 2013-11-26 | 2015-06-04 | Yale University | Novel cell-penetrating compositions and methods using same |
| JP6914189B2 (ja) | 2014-05-02 | 2021-08-04 | ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ | 官能化担体材料並びに官能化担体材料を作製及び使用する方法 |
| EP3302784B1 (en) | 2015-06-05 | 2021-10-06 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbent bioprocessing clarification agents and methods of making and using the same |
| CN108047316B (zh) * | 2018-01-04 | 2021-06-15 | 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 | 重组乙肝核心抗原的分离纯化方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4515714A (en) * | 1983-03-09 | 1985-05-07 | Juridicial Foundation, The Chemo-Semo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for purification of hepatitis B virus surface antigen |
| US4533596A (en) * | 1983-06-28 | 1985-08-06 | Ncr Corporation | Thermal magnetic transfer ribbon |
| JPS6078999A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| JPS60197629A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| US4624918A (en) * | 1984-07-09 | 1986-11-25 | Genentech, Inc. | Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof |
| CA1268437A (en) * | 1984-12-21 | 1990-05-01 | Haruo Fujita | Method for purification of hbc antigen and method for measurement of hbc antibody by using said purified hbc antigen |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
-
1988
- 1988-04-15 US US07/181,934 patent/US5004688A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-12 IL IL89924A patent/IL89924A0/xx unknown
- 1989-04-13 AU AU32779/89A patent/AU608706B2/en not_active Ceased
- 1989-04-13 MX MX026712A patent/MX166707B/es unknown
- 1989-04-13 NO NO891532A patent/NO176439C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-04-14 ES ES89106753T patent/ES2075006T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-14 EP EP89106753A patent/EP0337492B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-14 DK DK181589A patent/DK181589A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-04-14 CA CA000596774A patent/CA1339792C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-14 JP JP1095079A patent/JP2721699B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-14 IE IE120689A patent/IE68408B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-04-14 KR KR1019890005065A patent/KR960004707B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-04-14 DE DE68923115T patent/DE68923115T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-14 AT AT89106753T patent/ATE124088T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE68408B1 (en) | 1996-06-12 |
| ATE124088T1 (de) | 1995-07-15 |
| EP0337492B1 (en) | 1995-06-21 |
| DK181589A (da) | 1989-10-16 |
| ES2075006T3 (es) | 1995-10-01 |
| KR960004707B1 (ko) | 1996-04-12 |
| MX166707B (es) | 1993-01-28 |
| IE891206L (en) | 1989-10-15 |
| NO176439C (no) | 1995-04-05 |
| JP2721699B2 (ja) | 1998-03-04 |
| DK181589D0 (da) | 1989-04-14 |
| AU608706B2 (en) | 1991-04-11 |
| JPH01311028A (ja) | 1989-12-15 |
| DE68923115T2 (de) | 1995-11-02 |
| DE68923115D1 (de) | 1995-07-27 |
| CA1339792C (en) | 1998-03-31 |
| IL89924A0 (en) | 1989-12-15 |
| US5004688A (en) | 1991-04-02 |
| KR890016166A (ko) | 1989-11-28 |
| NO891532D0 (no) | 1989-04-13 |
| NO891532L (no) | 1989-10-16 |
| EP0337492A1 (en) | 1989-10-18 |
| AU3277989A (en) | 1989-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0337492B1 (en) | Purification of hepatitis proteins | |
| US4683293A (en) | Purification of pichia produced lipophilic proteins | |
| KR940010283B1 (ko) | 단백질이 생성된 배양배지로부터 그 단백질을 추출 및 정제하는 방법 | |
| EP2129684B1 (en) | Method of purification of hydrophobic proteins | |
| EP0477285B1 (en) | Processes for the recovery of microbially produced chymosin | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| US5139943A (en) | Processes for the recovery of microbially produced chymosin | |
| Sitrin et al. | Survey of licensed hepatitis B vaccines and their production processes | |
| EP0243103B1 (en) | Purification of pre-s hbsag by polymerized serum albumin affinity binding | |
| CA2078365C (en) | Pichia pastoris linear plasmids and dna fragments thereof | |
| KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| JPS61148127A (ja) | ＨＢｃ抗原の精製方法 | |
| EP0384058A1 (en) | Isolation of hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells | |
| KR0122431B1 (ko) | 당함량이 낮은 바이러스 표면 항원 입자의 제조 방법 | |
| WO1987000553A1 (en) | Process for preparing hetero-protein | |
| Milburn | Optimization of large scale virus-like particle purification | |
| JPH04229187A (ja) | 組換えヒトγインターフェロンの抽出および精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |