KR0122431B1 - 당함량이 낮은 바이러스 표면 항원 입자의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이러스 표면 항원 입자내에 존재하는 당을 제거하는 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 계면 활성재를 이용하여 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자내에 불필요하게 존재하는 당을 제거하여 당함량이 낮은 바이러스 표면 항원 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

당함량이 낮은 바이러스 표면 항원 입자의 제조 방법

본 발명은 B형 간염 바이러스 등의 바이러스 표면 항원 입자내에 존재하는 당을 제거하는 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 계면 활성제를 이용하여 바이러스 표면 항원 입자 내에 불필요하게 존재하는 당을 제거하여 당함량이 낮은 바이러스 표면 항원 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae)의 일종으로 여러가지 간질환, 특히 간암 발생의 가장 중요한 요인중의 하나로 알려져 왔다. HBV는 1963년에 브로치(Brauch, S. Blumberg)에 의해 혈청에서 처음 발견된 이래로 많은 연구자들에 의해 유전자 재조합 기술을 이용하여 분자 생물학, 면역학 및 생화학적 관점에서 활발하게 연구되어 왔다(Tiollas, P., Science 213, 406-411(1981)). HBV에 감염된 환자의 혈청으로부터 두가지 형태의 바이러스 입자가 분리되었는데 그중 하나는 이중나선 DNA 가 없는 22nm 크기의 표면 항원 입자이고 또 다른 하나는 이중나선 DNA를 감싸고 있는 핵과 외피로 구성된 42nm의 데인입자로 밝혀졌다(Robinson, W.S., Annu, Rev. Microbiol. 31, 357(1977)).

B형 간염 환자의 혈액내에 다량 존재하는 22nm 크기의 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자는 이들에 대한 항체 형성을 유도하며 생성된 항체는 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 방어 능력을 가질 수 있음이 알려지면 B형 간염 예방을 위한 백신 제조에 이용되어져 왔다.

표면 항원 입자는 B형 간염 바이러스 유전자내의 외피 단백질을 암호화하는 1개의 ORF(open reading frame)으로부터 만들어지는데 이 ORF은 프리 S1(108개 아미노산), 프리 S2(55개 아미노산) 및 S(226개 아미노산)의 세 부분으로 나누어져 있으며 서로 다른 개시 코돈에서 전사를 시작하여 S(226개 아미노산 : P24), 프리 S2+S(281개 아미노산 : P30) 및 프리 S1+프리 S2+S(389개 아미노산 : P39) 등 세가지의 폴리펩티드를 합성한다. 이들은 당화 여부에 따라 각각 p24/gp27, p30/gp33/gp36 및 p39/gp42로 불리며 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자는 다양한 폴리펩티드가 분자간(inter) 또는 분자내(intra) 디설파이드(disulfide)결합을 이루므로서 형성된다(K.H. Heermann, et al., J. Virol. 52, 396-402, 1984).

초기의 B형 간염 백신은 B형 간염 환자의 혈장에서 직접 표면항원을 추출하여 만든 혈장 유래 백신이었으나 최근에는 공급이 수월하고 안전성도 높은 재조합 미생물 유래 백신, 특히 재조합 효모 유래 백신이 이용되는 추세이다(W.J. McAleer, et, al., Nature 307, 178-180, 1984). 처음으로 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자를 구성하는 폴리펩티드 중에서 90% 이상을 차지하는 S를 이용한 재조합 S 백신이 제조되었고 프리 S 부분의 중요성이 인식되면서 이들을 포함한 재조합 백신의 개발이 활발히 진행되고 있다.

재조합 효모로부터 제조된 B형 간염 바이러스 표면 항원은 숙주 세포의 특성으로 인해 혈장 유래 항원과는 상이한 점이 존재한다. 예를들어 혈장 유래 S 단백질은 일부가 당화된 형태로 존재하지만 효모 유래 S 단백질에는 당화가 일어나지 않고(P.V. Valenznela, et al., Nature 298, 347-350, (1982))프리 S2 부분의 당화도 그 형태가 다르다(T. lmamura, et al., Virol. 61, 3543-3549, (1987)). 특히 문제가 되는 것은 효모 유래 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자 내에는 과량의 효모 유래 당이 삽입된다는 점이다. 입자내에 과량 존재하는 당은 당화된 폴리펩티드에 의한 것이기 보다 입자가 형성될 때 어떤 식으로든 주위에서 끼어 들어간 물질로 인한 것이다. 이들이 어떤 형태의 당인지, 어떤 메커니즘에 의해 입자 안으로 끼어 들어가는지에 대해서는 밝혀진 바가 없다. 그리고 일단 입자 안으로 끼어 들어간 당은 일반적인 정제 과정에서는 제거시키기가 힘들다. 이와 같이 B형 간염 표면 항원 입자 내에 끼어 존재하는 당은 불필요한 항체 형성을 유도할 수 있고 대부분의 표유동물 혈액 내에 존재하는 항-효모 항체와 반응할 수 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 여러 방안이 제시되었다. 예컨대 국제 특허출원 공개 제WO 92/19741 호에서는 효모 세포내의 전체 당 함량을 낮추는 방법에 대하여 개시하고 있다. 이 특허 문헌에 개시된 방법은 튜니카마이신(tunicamycin)과 같은 N-당화 억제제를 효모 세포 배양시 첨가하거나, 효모 세포에서 과당화(hyperglycosyla-tion)시 만노즈 신장(elongation)을 담당하는 유전자를 돌연변이시킨 균주(mnn9^-)에서 B형 간염 바이러스 표면 항원을 발현시키는 방법을 이용하였다. 그러나 튜니카마이신을 처리한 경우 세포 성장에 필수적인 당 단백질의 합성 마저 방해받으므로 세포가 잘 자라지 못하고 따라서 단백질 수율이 현저히 떨어질 뿐 아니라 튜니카마이신을 대량으로 얻기 힘들므로 실제 생산에서 사용하기 어렵다. 돌연변이 균주인 mnn9^-세포를 이용하는 경우 세포 배양 조건이 까다로와 역시 단백질 수율이 매우 낮은 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 세포 배양이 쉽고 단백질 수율도 높은 보통의 재조합 효모 균주에서 B형 간염 바이러스 표면 항원을 정제할 때 적당한 계면 활성제를 처리하면 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자 내에 끼어 있던 불필요한 당이 제거되기 쉬운 형태로 됨을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스 표면 항원 정제시 항원 입자내에 존재하는 당을 제거하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자의 정제시 표면 항원 입자가 발현된 세포 배양액을 계면 활성제로 처리한 다음 분리하므로서 표면 항원 입자에 존재하는 당을 제거하여 당함량이 낮은 B형 간염 바이러스 표면 항원을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 특히 B형 간염 바이러스 표면 항원에 한정되지 않으며 기타 바이러스의 표면 항원에도 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자를 발현시킬 수 있는 어떠한 세포에도 적용이 가능하고 특히 정제과정중에 입자형성이 이루어지는 세포로부터 B형 간염 바이러스 표면 항원을 정제할때 특히 바람직하다. 정제과정 중에 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자 형성이 이루어지는 대표적인 세포로는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia) 또는 한세눌라(Hansenulla) 등의 효모 세포를 그 예로 들 수 있으며 일반적으로 B형 간염 바이러스 표면 항원을 발현시키는데 사용되는 재조합 균주가 모두 포함된다.

본 발명의 방법으로 정제 가능한 B형 간염 바이러스 표면 항원은 S형, 프리 S2+S형 및 프리 S1+프리 S2+S형과 이들의 혼합물을 포함한다.

또한 본 발명의 방법은 당이 과량 포함되어 있는 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자로부터 당을 제거하는데에 있어서 정제 초기, 정제 중간 또는 정제 완료 후를 불문하고 정제 과정중 어떤 단계에서든지 적용이 가능하다.

본 발명에 사용되는 계면 활성제로는 트리톤-N 계열, 트리톤-X 계열, 트윈 계열 또는 데옥시콜레이트 등 다양한 종류의 비이온성 계면 활성제가 사용될 수 있으며 특히 트리톤-X 계열의 계면 활성제가 바람직하다. 트리톤-X 계열의 계면 활성제로는 트리톤 X-100 및 트리톤 X-114 등을 들 수 있다. 사용되는 계면 활성제 농도는 0.05 내지 2% 범위, 바람직하게는 0.1 내지 1.5% 범위이다. 계면 활성제 처리시의 pH조건은 5.5 내지 10.5 범위이며 pH 6.5 내지 8.0 범위가 바람직하다. 이 pH 범위에서 사용가능한 완충용액은 모두 이용될 수 있다. 계면 활성제 처리 온도는 0 내지 30℃가 바람직하고 4내지 20℃가 더욱 바람직하며, 처리시간은 1 내지 16시간이 바람직하고 2 내지 10시간이 더욱 바람직하다.

계면 활성제 처리과정후 당과 단백질을 분리시키는 과정은 기존의 단백질 분리 방법을 이용할 수 있으나 초원심분리법과 겔 여과 크로마토그래피법이 특히 바람직하다. 초원심분리법을 이용하는 경우에 적당한 물질로 밀도구배를 형성시켜 밀도 차이에 의해 당과 B형 간염 표면 항원을 분리한다. 밀도 구배를 형성시키기 위해 첨가하는 물질로는 자당, 브롬화 칼륨 또는 염화 세슘 등을 이용할 수 있다. 초원심 분리공정 중에도 계면 활성제가 포함되어 있어야 하며 계면 활성제의 종류 및 그 농도는 B형 간염 표면 항원 입자에 처리한 것과 동일하게 하는 것이 바람직하다. 밀도구배 범위는 1.1 내지 1.3g/㎤가 바람직하다.

겔 여과 크로마토그래피를 이용할 경우에는 아가로스 겔로 채워진 크로마토그래피 컬럼 상에서 실시하는 것이 바람직하다. 컬럼에 사용될 수 있는 다른 적당한 극성 매질로는 덱스트란 겔 및 폴리아크릴아미드 겔로 구성되는 군으로부터 선택할 수 있으나 특히 이들에 한정되는 것은 아니다. 겔 여과를 위한 충진물질로서 사용되는 극성 매질은 60,000 내지 20,000,000 바람직하게는 백만 정도의 분자량 배제 제한(molecular weight cutoff)을 갖는 것이 적당하다. 겔 여과 크로마토그래피에 사용되는 완충용액은 상용의 pH 6 내지 8의 완충용액이 모두 사용가능하고 염화나트륨을 포함하는 트리스 또는 인산 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때에도 0.1내지 2%의 계면 활성제가 포함되어 있어야 하며 B형 간염 표면 항원에 처리한 것과 동일한 계면 활성제를 사용하는 것이 바람직하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적이며 어떠한 의미에서도 본 발명의 범위를 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

정제 초기 단계에서 S항원 입자내의 당 제거

S 항원 유전자가 포함된 발현 벡터 pYSAG101에 의해 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지에(Saccaro myces cerevisiae)균주(대한민국 공고 제90-5959호 참조)를 배양하여 얻은 효모 세포 케익 2㎏에 완충용액(100mM 인산나트륨, pH7.2, 0.3% 트윈 20, 0.15M 염화나트륨, 10mM EDTA, 1mM PMSF) 4ℓ를 혼합한 후, 0.5㎜의 유리구슬 3ℓ가 들어 있는 다이노밀(Dynomill; Mahlbehalter, Switzerland)에서 분당 600 내지 700ml의 속도로 2회 통과시켜 효모 세포를 파쇄하였다. 이때의 온도는 10℃였다. 효모 파쇄액을 유리 구슬과 분리하고 유리구슬을 6ℓ의 완충용액으로 세척하여 효모 파쇄액에 첨가하였다. 상온에서 2 내지 3시간 교반한 후 8℃에서 8,500rpm으로 30분간 원심분리하여 세포 찌꺼기와 B형 간염 바이러스 표면 항원 함유 상등액을 분리하였다.

이어 하기와 같이 상기 S 항원 함유 상등액을 실리카(Aerosil 380)에 배치 결합시켰다. 먼저 건조 실리카를 물과 함께 10% 슬러리(건조중량/슬러리 부피)로 제조하고 2ℓ의 실리카 슬러리를 S 항원 함유 상등액에 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 교반하였다. 5,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 S 항원이 흡착된 실리카를 0.15몰 염화나트륨이 포함된 pH 7.2의 인산 완충용액으로 2회 세척하였다. 그 다음에 1몰의 요소가 포함된 50mM 탄산 완충용액(pH 9.5)2ℓ로 상온에서 2내지 3시간 저어주면서 S 항원을 실리카에서 탈착시켰다. 실리카에서 탈착된 S 함유 상등액은 분자량 배제 제한 십만을 갖는 나선형 한외여과기(Spiral Ultrafiltration Cartridge; Amicon, U.S.A.)을 이용하여 다이아 여과 및 농축하였다. 이때 사용한 완충용액은 pH 7.2의 염화나트륨-인산 완충용액이었다.

농축한 S 항원 함유 상등액중 20ml(A)에는 최종 농도가 1%가 되도록 트리톤 X-100을 첨가하여 잘 섞어주고 나머지는(B) 그대로 4℃에서 16시간 동안 방치하였다. 그 다음 A와 B를 각각 초원심분리용 튜브(로터 : 70Ti)에 넣고 염화세슘이 최종 25%( w/v) 가 되도록 잘 섞은 뒤 베크만(Beckman) 초원심분리기를 이용하여 15℃에서 55,000rpm으로 40시간 동안 원심분리하였다. 원심분리가 끝난 뒤 A와 B를 각각 튜브 바닥에서부터 1ml씩 분획하여 각 분획별로 당 정량 및 B형 간염 바이러스 표면 항원 정량 실험을 수행하였다. 이때 당 정량에는 안스론(Anthrone) 시약(Aldrich Chemical Company, U.S.A.)을 사용하였고 B형 간염 표면 항원 정량에는 오스자임 킷트(Anszyme kit; Abbott Lab, U.S.A.)를 이용하였다.

A 튜브와 B 튜브로부터 얻은 분획중 B형 간염 바이러스 표면 항원이 포함된 부분을 모아 세파로스 CL-4B로 충진된 컬럼에서 각각 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 사용된 완충용액은 염화나트륨-인산완충용액(pH 7.2)이었고 이때의 순도는 A와 B의 경우 모두 95% 이상이었다. 로우리(Lowry)법을 이용한 단백질 정량과 안스론 방법을 이용한 당 정량 결과, 트리톤 X-100을 처리한 뒤 초원심분하였을 때 단백질의 양을 기준으로 하여 A 튜브로부터 얻은 분획은 당 함량이 5%(w/w)였고 B 튜브로부터 얻은 분획은 65%(w/v)로 나타났다. 이는 B형 간염 표면 항원 조정제 단계에서 트리톤 X-100을 처리한 경우에 당 함량이 현격히 감소하였음을 나타낸다.

[실시예 2]

정제 완료 후 S 항원 입자내의 당 제거

실시예 1의 B 튜브로부터 얻은 분획에 최종농도가 1%가 되도록 트리톤 X-100을 넣고 잘 섞은 후 4℃에서 16시간 동안 방치하였다. 여기에 25%(w/v) 염화 세슘 농도가 되도록 염화 세슘을 넣고 잘 녹인 뒤 베크만 초원심분리기(로터 : 70Ti)를 이용하여 15℃에서 55,000rpm으로 40시간 동안 원심분리하였다. 실시예 1에서와 동일한 방법으로 분획하여 당 함량을 정량한 결과 65%(w/v)이던 것이 1% 미만으로 당 함량의 현격한 감소를 보였다.

[실시예 3]

정제 완료 후 프리 S2+S 항원 입자내의 당 제거

사카로마이세스 세레비지에 KCTC 0098BP 균주(대한민국 특허출원 제93-29980호 참조)를 배양하여 얻은 효모 세포 케익 2㎏에 완충용액(50mM 트리스, pH 7.2, 1M 티오시안산 나트륨, 0.15M 염화나트륨, 10mM EDTM, 1mM PMSF)4ℓ를 혼합한 후, 0.5mm의 유리구슬 3ℓ가 들어있는 다이노밀에서 분당 600내지 700ml의 속도로 2회 통과시켜 효모 세포를 파쇄하였다. 이때의 온도는 10℃였다. 효모 파쇄액을 유리구슬과 분리하고 유리구슬을 6ℓ의 완충용액으로 세척한 다음 효모 파쇄액에 혼합하였다. 효모 파쇄액에 계면 활성제인 트윈 20을 0.1%(w/v)가 되도록 넣고 상온에서 2 내지 3시간 교반하였다. 상기 파쇄액에 5N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 11.5까지 높이고 상온에서 30분 내지 1시간 동안 교반시켰다. 여기에 20% 아세트산을 천천히 가하여 pH가 5.2가 되도록 하고 상온에서 30분간 교반하고 30분간 방치하였다. 이후 8℃에서 원심분리하여 세포 찌꺼기와 침전물을 함께 제거하였다.

여기에 다시 5N 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.2로 높였다.

프리 S2+S 항원 함유 상등액을 0.15몰 염화 나트륨 용액으로 2배 희석한 후 실리카(Aerosil 380)에 배치 결합시켰다. 이는 하기와 같이 실시하였다. 먼저 건조 실리카를 물과 함게 10% 슬러리(건조중량/슬러리 부피)로 제조하고 1ℓ의 실리카 슬러리를 프리 S2+S 항원 함유 상등액에 첨가하여 4℃에서 하룻밤동안 교반하였다. 5,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 프리 S2+S 항원이 흡착된 실리카를 0.15몰 염화나트륨이 포함된 pH 7.2의 인산 완충용액으로 2회 세척하였다. 그 다음에 1몰 요소를 포함하는 50mM 탄산 완충용액 2ℓ로 상온에서 2 내지 3시간 교반하면서 프리 S2+S 항원을 실리카에서 탈착시켰다. 이때 완충용액의 최종 pH는 9.2였다. 용출된 프리 S2+S 항원 함유 상등액과 실리카는 8,700rpm에서 원심분리하여 분리하였다.

상기에서 얻은 프리 S2+S 항원 함유 상등액에 요소를 첨가하여 최종 요소 농도가 4몰이 되도록 하고 미리 4몰 요소가 포함된 50mM 탄산 완충용액(pH 9.2)으로 평형시킨 페닐 아가로스 컬럼에 접촉시켰다. 평형 완충용액으로 컬럼을 세척한 후 20% 에틸렌 글리콜이 포함된 평형 완충용액으로 프리 S2+S 항원을 컬럼에서 용출시켰다. 용출액에 포함되어 있는 요소와 에틸렌 글리콜을 제거하고 다음 단계의 정제를 위해 다이아 여과 및 농축을 실시하였다. 이때 분자량 배제 제한 십만인 막을 지닌 나선형 한외 여과기를 이용하였다.

그 다음 농축된 프리 S2+S 항원 분류액을 겔 여과 크로마토그래피하였다. 세파로즈 CL-4B 8ℓ를 컬럼에 충진하고 0.15몰 염화 나트륨이 포함된 pH 7.2의 인산염 완충용액으로 평형시킨 후 프리 S2+S 항원 함유 분류액을 컬럼과 접촉시키고 동일한 완충용액으로 용출시켜서 프리 S2+S 항원이 포함된 분획을 모았다.

정제한 프리 S2+S 항원 용액 일부는 비교용으로 남겨두고 나머지 용액에 최종 농도 1%가 되도록 트리톤 X-100을 넣고 잘 섞은 후 4℃에서 16시간 동안 방치하였다. 여기에 25%(w/v) 염화 세슘 농도가 되도록 염화 세슘을 넣고 잘 녹인 뒤 베크만 초원심분리기(로터 : 70Ti)를 이용하여 15℃에서 55,000rpm으로 40시간 동안 원심분리하고 프리 S2+S 항원이 포함된 부분을 모아 당 함량을 정량하였다. 트리톤 X-100을 처리하지 않은 용액의 당함량은 25.4%(w/w)였고 트리톤 X-100을 처리한 경우는 8%(w/w)로 나타났다.

본 발명의 참뜻과 본질을 벗어나지 않는 적당한 변화 및 변경이 본 기술분야의 통상의 지식의 가진자에 의해 용이하게 이루어질 수 있으며 이러한 변화 및 변경도 본 발명의 범위에 당연히 포함된다.

Claims (10)

1. 바이러스 표면 항원 입자의 정제시 표면 항원 입자가 포함된 용액을 계면 활성제로 처리함을 포함하는, 당함량이 낮은 표면 항원 입자를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 표면 항원 입자가 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자인 방법.
3. 제2항에 있어서, B형 간염 표면 항원 입자가 S, 프리 S2+프리 S, 프리 S1+프리 S2+S형 또는 그들의 혼합물인 방법.
4. 제1항에 있어서, 계면 활성제가 데옥시콜레이트, 트리톤-N 계열, 트리톤-X 계열 및 트윈 계열 비이온성 계면 활성제 중에서 선택되는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 계면 활성제의 농도가 0.05내지 2%가 되도록 처리하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 계면 활성제 처리시 pH가 5.5 내지 10.5이고, 온도가 0내지 30℃이고 반응시간이 1내지 16시간인 방법.
7. 제1항에 있어서, 계면 활성제 처리후 당 및 B형 간염 표면 항원 입자를 분리하기 위하여 초원심분리 또는 겔 여과 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 계면 활성제의 존재하에 초원심분리 또는 겔 여과 크로마토그래피를 실시하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 초원심분리시 밀도구배를 형성하기 위한 물질이 자당, 브롬화 칼륨 및 염화 세슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
10. 제7항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피시 분자량 배제 제한이 60,000 내지 20,000,000인 아가로스겔, 덱스트란 겔 및 폴리아크릴아미드 겔로 이루어진 군으로부터 선택된 극성 메트릭스상에서 겔 여과시키는 방법.