KR100194247B1

KR100194247B1 - 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법

Info

Publication number: KR100194247B1
Application number: KR1019960017426A
Authority: KR
Inventors: 이영미; 윤경희; 임국진; 박순재
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR970073604A

Abstract

본 발명은 재조합 B형 간염 표면 항원(HBs 항원)의 정제 방법에 관한 것으로, (a) B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 계면활성제의 존재하에 용해시킨 후 HBs 항원을 포함하는 상등액을 분리하는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻어진 HBs 항원홀 함유하는 상등액을 실리카와 접촉시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카를 pH 6-8의 완충용액으로 세척하고, pH 8.8-11.0의 완충용액으로 HBs 항원을 탈착시키는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 pH 7 내지 9로 조정하고 0.5M 이하의 염을 첨가하여 음이온 교환 수지에 통과시킨 다음, HBs 항원 함유 분획을 투석여과(diafiltration) 및 농축시키는 단계; (d) 농축된 HBs 항원 함유 분획을 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피한 후, 투석여과하는 단계; (e) 단계 (d)에서 얻어진 HBs 항원 함유 분획을 단백질 분해 효소로 처리한 후,투석여과 및 농축하는 단계, 및 (f) 단계 (e)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는, 본 발명의 HBs 항원 정제방법에 의하면 HBs 항원을 불순물 없이 고순도로 정제할 수 있다.

Description

재조합 B형 간염 표면 항원의 정재방법

제1도는 본 발명에 따른 정제 과정증 1차 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질의 프로필을 나타낸 것이고,

제2도는 본 발명에 따른 정제 과정중 2차 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질의 프로필을 나타낸 것이고,

재3도는 본 발명에 따른 정제 과정중 1차 겔 여과 크로마토그레피로부터 용출된 단백질 분획을 단백질 분해 효소로 처리한 후 SDS-전기영동한 결과이고,

제4a도 및 제4b도는 본 발명에 따른 정제 과정중 1차 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질 분획을 트립신으로 처리한 샘플(4a)과 처리하지 않은 샘플(4b)을 각각 겔 여과 크로마토그래피한 후 SDS-전기영동한 결과이다.

본 발명은 B형 간염 표면 항원(이하 HBs 항원)을 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 효모에서 발현된 HBs 항원을 실리카 흡착, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 단백질 분해 효소 처리 및 겔 여과 크로마토그래피를 거쳐 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

B형 간염은 전세계적으로 심각한 공중보건상의 문제가 되는 질병으로, B형 간염 바이러스(HBV)의 보균자 수는 약 2-3억에 달하는데, 특히 아시아와 아프리카 지역은 전체 인구의 약 10% 정도가 HBV보균자이다. 이와 같이 중요한 B형 간염에 대하여 현재까지는 효과적인 치료제가 없으므로 예방 차원에서 백신의 중요성이 부각되고 있다.

1955년 블럼버그 등이 B형 간염 환자의 혈액에서 오스트랄리아(Australia) 항원을 발견하고, 1971년 크루그만 등이 HBV를 함유하고 있는 사람 혈청을 가열 처리하여 능동 면역을 시도함으로써 B형 간염 백신의 개발 가능성을 보여준 이후, B형 간염 보균자의 혈장으로부터 HBs 항원을 분리 정제한 1세대 B형 간염 백신이 상업화되었다(Hilleman, M. R., et al., Develop. Bio1. Standard, 54, 3(1983)). 1세대 백신혈장 유래 HBs 항원의 정제에는 통상적으로 바린 등의 방법(Barin, F. et al., Ann. Microbiol., 120B, 87(1978)) 또는 힐러만 등의 방법(Hilleman, M, R et al., Develop. Biol. Standard, 54, 3(1983))이 이용 되는데,여기에서는 바이러스 불활성화 과정으로 펩신 처리,우레아에 의한 변성 및 회복, 포름 알데하이드 처리를 수행한다 그러나 이러한 혈강 유래 백신은 혈청내 바이러스의 불활성화 과정 등 정제 공정이 번거롭고 많은 비용이 들 뿐 아니라, 혈액의 공급이 충분치 뭇하고 혈액을 통해 전염될 수 있는 다른 병원균을 접종자에게 감염시킬 위험성이 있는 등의 문제점을 갖고 있다. 따라서, 혈장 유래 백신 대신 유전 공학 기법을 이용한 재조합 B형 간염 백신을 개발할 필요성이 대두되었다.

발렌주엘라 등에 의해 효모에서 HBs 항원 단백질 생산이 성공적으로 이루어져 (Valenzuela, P., et al., Nature, 298, 347(1982)) 2세대 백신으로 불리는 재조합 B형 간염 백신이 생산 판매되고 있으나, 대량 생산에 적합한 정제 공정을 위해서는 아직도 개선할 여지가 많은 실정이다.

일반적으로 B형 간염 보균자의 혈장에서는 직경 22nm의 구형 입자, 동일한 직경을 갖는 원통형 입자 및 직경 42nm의 데인 입자로 불리우는 바이러스 입자로 된 3가지 형태의 항원이 발견된다. 직경 2?nm의 구형 및 원통형 입자는 HBs 항원으로만 구성되어 있으나 데인 입자는 HBs 항원 및 HBc 항훤(B형 간염 핵 항원), 그리고 DNA형의 핵산으로 구성되어 있다. 이들 구형, 원통형 및 데인 입자는 보균자의 혈장내에 대개 10,000:10:1의 비율로 존재하는데, 혈장 유래 백신은 이들 입자 중에서도 22nm의 구형 입자를 백신화한 것이다.

22nm의 구형 입자는 S 단백질, M 단백질, L 단백질이라고 하는 3 가지 단백질로 이루어져 있다. 이들 단백질은 본래 바이러스가 갖고 있는 4개의 ORF(open reading frame)로 구성되는 유전자 중에서 하나의 동일한 ORF로부터 만들어진 것으로, 단백질 합성이 개시되는 시작 코돈에 따라 각 단백질이 구분된다. 구형 입자의 구성에 있어 각 단백질이 차지하는 비율은 서로 다른데, S 단백질이 주요 구성 성분이며 M 단백질과 L 단백질은 소량 존재한다. 데인 입자와 원통형 입자에서도 S 단백질이 가장 많은 비율을 차지하고 있지만 L 단백질도 주요 구성 성분으로 포함되어 있다.

재조합 B형 간염 백신은 혈장 유래 백신과 마찬가지로 22nm의 구형 입자로 되지만, 이를 구성하는 표면 항원은 S 단백질로만 이루어져 있고 입자의 직경이 약간 작다. 또한 혈장 유래 표면 항원은 각 단백질과 그의 당화된 형태의 단백질로도 구성되어 있으나, 재조합 표면 항원은 전혀 당화가 되어 있지 않다. 그러나 효모에서 발현되는 재조합 HBs 항원은 침강 속도(sedimentation rate)와 부유 밀도(buoyant density)가 혈장 유래 HBs 항원과 동일하여 밀도나 지질 함량 등의 물리 화화적 성질이 동일할 뿐 아니라 항원성 및 면역 반응성이 높은 입자로 밝혀져(Nature, 298, 347-350(1982)), 표면 항원의 성분이나 당화 유무가 면역성 등에 별로 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

재조합 생물체에 의해 발현되는 재조합 HBs 항원 단백질을 백신화하기 위해서는 재조합 생물체 유래의 불순 단백질을 제거하는 정제 과정이 필수적이다. 통상적으로 재조합 HBs 항원의 정제에는 왐플러 등의 방법 (Wampler, E. D. et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 6830(1985)) 및 스티븐 등의 방법(Stephenne, J. ef al., Vaccine, 8(Suppl.), S69(1990))이 이용된다. 이들 방법에서는 정제된 HBs 항원의 순도를 높이기 위해서 소수성 상호 작용에 기초한 부틸 아가로즈 컬럼 크로마토그래피나 전자 친화력을 이용한 음이온 컬럼 크로마토그래피를 이용한다. 그러나, 이러한 방법은 HBs 항원이 이들 고정 담체에 전부 흡착되기 어렵고 또한 일단 담체에 흡착된 항원은 잘 용출이 되지 않기 때문에 수율이 낮을 뿐 아니라, 이들 고정 담체의 단위당 흡착될 수 있는 HBs 항원의 양이 적다는 단점이 있다.

이외에도 항원 항체 반응에 의한 친화 크로마토그래피 분리에 의해 HBs 항원을 정제하는 방법(Howsen, B. et al., Jounal of Immunological Method, 8, 185(1975))이 제안되었다. 이 방법은 정제 효율은 극히 양호한 반면, 백신을 대규모로 생산하는 경우에는 크로마토그래피용 HBs 항체를 얻기 위해서 대량의 성인 혈청이 필요하고 HBs 항체를 고도로 정제해야 하며 시아노겐 브로마이드(CNBr) 등을 사용하여 고정 담체에 결합시켜 친화성 고정 담체를 형성시켜야 하기 때문에 대량 생산에는 적합하지 않다. 뿐만 아니라, 이 친화 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피는 HBs 항체와 겔과의 결합이 비교적 약하기 때문에 용출시에 HBs 항체와 HBs 항체-HBs 항원 반응 생성물이 발생할 수 있으며, 이것이 백신에 혼입되는 경우에는 자가 면역 질환이나 신장병 등을 유발시킬 염려가 있다.

이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 개선하고 보다 효율적으로 고순도 HBs 항원을 정제하기 위해 거듭 연구한 결과, HBs 항원 함유 용액을 실리카 흡착, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피한 후 단백질 분해 효소로 처리하여 불순 단백질을 제거하고 다시 겔 여과 크로마토그래피를 수행함으로써 HBs 항원을 보다 고순도로 얻을 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 산업적 규모로 수행될 수 있는 방식으로 B형 간염 표면 항원을 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는

(a) B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 계면활성제의 존재하에 용해시킨 후 HBs 항원을 포함하는 상등액을 분리하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 얻어진 HBs 항원을 함유하는 상등액을 실리카와 접촉시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카를 pH 6-8의 완충용액으로 세척하고, pH 8.8-11.0의 완충용액으로 HBs 항원을 탈착시키는 단계;

(c) 단계 (b)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 pH 7 내지 9로 조정하고 0.5M 이하의 염을 첨가하여 음이온 교환 수지에 통과시킨 다음, HBs 항원 함유 분획을 투석여과(diafiltration) 및 농축시키는 단계;

(d) 농축된 HBs 항원 함유 분획을 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피한 후, 투석여과하는 단계;

(e) 단계 (d)에서 얻어진 HBs 항원 함유 분획을 단백질 분해 효소로 처리한 후, 투석여과 및 농축하는 단계; 및

(f) 단계 (e)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는, 재조합 효모로부터 발현된 B형 간염 표면 항원의 정제 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 정제 단계를 상세히 설명한다

본 발명의 공정은 HBs 항원을 발현할 수 있는 임의의 형질전환된 효모의 배양액으로부터 HBs 항원을 정제하는데 유효하다. 형질전환주로 적절한 것은 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomayces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharo-myces), 로도토룰라(Rhodotorula), 한세눌라(Hansenula), 토룰로피스(Torulopis), 피치아(Pichia) 및 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 효모들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 중 특히 바람직한 것은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisie)이다.

상기와 같은 재조합 효모는 통상적인 방법으로, 즉 동화성 질소원, 무기염, 적절한 pH의 분자 산소 및 기타 조절 상태하에 수성 발효 조건에서 적절한 탄소 에너지원을 사용하여 배양함으로써 HBs 표면 항원이 발현된 효모 세포를 얻는다.

HBs 항원이 발현된 효모 세포를 비이드 밀 내에서 군질화시켜 용해한다. 이때, 세포를 충분히 용해하고 HBs 항원이 세포 내의 막등으로부터 완전히 녹아 나오게 하기 위해 세포를 비이드 밀 내에서 균질화한 후 수시간 내지 수일 동안 계면활성제의 존재하에 교반해 준다. 이때 계면활성제는 소수성이 강한 HBs 항원을 용해된 세포 잔류물이나 막 등으로부터 분리시켜 용액내로 녹아 나오게 하기 위한 것으로, 예를 들면 트리톤(Triton) X-100, 트윈 20(Tween 20), 트윈 80 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 0.05 내지 1.5%, 바람직하게는 0.1 내지 1.0%의 농도로 사용할 수 있다. 이 단계에서 완충용액은 pH 6 내지 9로 유지될 수 있는 시스템이면 본 발명에 사용하기에 적합하며, 바림직하게는 트리스 용액 이다.

이와 같이 용해된 효모 세포 펠릿으로부터 원심분리나 기타 임의의 통상적인 방법에 의해 HBs 항원을 함유하는 상등액을 분리한다. 세포 펠릿내에 남아 있는 임의의 잔류 HBs 항원은, 세포 펠릿을 즉시 pH 6 내지 8의 완층용액으로 더 세척하고 원심분리 등에 의해 상등액을 얻은 다음 앞에서 얻은 HBs 항원 함유 상등액과 합하여 이후의 정제 단계에 사용한다.

다음 단계로, HBs 항원 함유 상등액을 실리카로 흡착 크로마토그래피한다 흡착 크로마토그래피는 컬럼법 또는 배치법으로 수행할 수 있는데,본 발명에서는 배치법이 바람직하다. 본 발명에 사용되기에 적당한 실리카로는 100내지 500m²/g 범위 내에서 허용가능한 표면적을 갖는 미립 수화 실리카 또는 무수 실리카가 포함된다. 미립 실리카 중 대표적 인 예는 에어로실 380(Aerosil 380; 데구싸사, 미국 뉴저지 )이다. 배치법으로 흡착시키는 경우, 미립 실리카를 층분한 물에 분산시켜 10%(건조증량/슬러리 부피)실리카 슬러리로 만들어 HBs 항원 함유 상등액과 접촉시킨다. 이때 사용되는 건조 실리카의 양은 처리되는 세포 케익 질량의 5%(w/w) 정도이다.

상기와 같이 실리카 처리된 상등액으로부터 HBs 항원-실리카 결합체을 원심분리법 등과 같은 통상의 방법으로 분리한 다음,실리카를 pH 6 내지 8 의 완충용액, 바람직하게는 인산나트륨-염화나트륨 완충용액으로 1 내지 3회 세척하여 오염 물질을 제거한다. 오염 단백질이 제거된 실리카를 pH 8.8 내지 11.0의 적당한 완충용액, 바람직하개는 탄산나트륨-중탄산나트륨 완충용액과 약 2시간 동안 접촉시킴으로써 표면 항원을 탈착시킨다. 이때 완충용액에는 1 내지 8M 요소 또는 0.1 내지 0.3%의 계면활성제가 포함되는데, 계면활성제로는 나트륨 데옥시콜레이트가 바람직하다 실리카로부터 탈착된 HBs 항원 함유액은 원심분리법 등으로 실리카와 분리하여 다음 단계에 이용한다. 단,나트륨 데옥시콜레이트를 이용하여 HBs 항원을 탈착시킨 경우에는 반복적인 투석여과를 실시하여 이를 제거한다.

상기 나트름 데옥시콜레이트가 충분히 제거되지 않은 경우에는 다음과 같이 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 먼저, 투석여과가 끝난 HBs 항원 함유액에 최종 능도가 0.5M이 되도륵 염화 나트륨 첨가하고 잘 녹인 후 pH를 7 내지 9로 맞추어 DEAE나 Q 세파로즈(Sepharose) 등의 음이온 교환 수지가 들어 있는 컬럼에 통과시킨다. 컬럼은 0.5M 염화 나트륨이 포함된 pH 7 내지 9의 완충용액, 바람직하게는 트리스 또는 인산 완충용액으로 미리 평형화시킨다. 이로써 나트륨 데옥시콜레이트만이 음이온 교환 수지에 붙게 되어 제거가 가능해진다.

음이온 교환 수지에 붙지 않고 흘러 나온 HBs 항원 함유액은 농축기로 농측 및 투석여과한 다음, 오염물로부터 HBs 항원 입자를 분리시키기에 적절한 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행한다. 겔 여과는 아가로스, 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 겔 등으로 충진된 컬럼상에서 수행하는 것이 바람직하나, 이들로 제한되지는 않는다. 겔 여과를 위한 충진물질로 사용되는 이들 극성 매트릭스는 적어도 1백만의 분자량 배제 제한을 가져야 한다. HBs 항원 함유액을 겔 여과 컬럼에 접촉시키기 전에 pH 6내지 8의 완충용액, 바람직하게는 염화나트륨이 포함된 트리스 또는 인산 완충액으로 컬럼을 평형화시켜야 한다. HBs 항원 함유액이 용출되면 HBs 항원이 포함된 분획만을 모아 다음 정제 단게를 수행한다.

상기와 같이 얻어진 HBs 항원 함유 분획은 단백질 분해 효소를 처리하여 불순 단백질을 제거한다. 이때, HBs 함유 분획은 그중의 HBs 항원의 농도가 전체 단백질의 5% 이상이 바람직하고, 20% 이상이면 더욱 바람직하며, 40% 이상이 가장 바람직하다. 이것은 정제가 진행됨에 따라 HBs 항원이 더욱 안정한 형태의 입자로 구성되기 때문인데, 상기 언급한 순도를 갖지 못할 경우 HBs 항원이 다른 불순 단백질들과 함께 분해 효소에 의해 절단될 수 있다.

단백질 분해 효소로는 상응되는 것들을 사용할 수 있으며, 펩신 또는 트립신이 바람직하다. 펩신을 사용할 경우에는 상기 HBs 항원 함유 분획에 적절한 산을 첨가하여 pH가 약 2 내지 4가 되도륵 한다. 이때 사용되는 산은 무기산 또는 유기산일 수 있으며, 예를 들면 염산, 황산, 인산 또는 아세트산이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효소 작용의 최적화를 위해 반응액의 pH를 조절하는 방법으로 산을 첨가하는 방법 이외에 농축 및 투석여과 방법을 이용할 수 있는데 이 방법은 농축 및 투석 과정에서 완충용액을 반복 사용함으로써 pH를 조절하는 것이다. 상기 농측 및 투석여과 과정에서 완충용액으로는 인산용액, 글리신 용액, 시트르산 응력, 숙신산 용액 등을 사용할 수 있으며 각 용액의 pH는 약 2 내지 4 정도가 적당하다. 농축 및 투석여과는 HBs 항원의 통과는 막지만 오염 단백질 및 전해질의 통과는 허용하기 때문에 충분한 분자량 배제 제한을 갖는 막을 사용하여 수행될 수 있다. 5,000 내지 500,000, 바람직하게는 75,000 내지 100,000의 분자량 배제 제한을 갖는 상업적으로 구입할 수 있는 농축 막이 본 발명에 사용하기 적당하다.

트립신을 처리할 경우에는 상기 HBs 항원 함유 분획에 적절한 산 또는 염기를 첨가하여 pH가 약 7 내지 9가 되도록 한다. 사용가능한 산은 펩신 처리시와 같고,염기는 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 펩신의 경우와 마찬가지로 산 또는 염기를 이용한 방법 외에 농축 및 투석여과 방법을 이용할 수 있는데, 이 때 완충용액으로는 트리스, 인산, HEPES, 붕소수, 카보네이트 용액 등을 사용할 수 있으며, 역시 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 각 용액의 pH는 약 7내지 9가 적당하다. 농축 및 투석여과 막의 선택 조건은 펩신의 경우와 동일하다.

단백질 분해 효소의 양은 처리하고자 하는 HBs 항원 함유 분획의 전체 단백질 양의 1/2000 내지 1/20, 바람직하게는 1/1000 내지 1/100이다. HBs 항원을 함유하는 단백질 용액의 농도는 로리(Lowry)등의 방법으로 측정할 수 있다(Lowry, 0. H. et al. J. Biol. Chem.,193, 265-275(1951)). 단백질 분해 효소를 HBs 항원 함유 분획에 넣고 적당한 크기의 삼각 플라스크에 담아 진탕 배양기 내에서 강하게 진탕시킨다. 단백질 분해 효소로 펩신이나 트립신을 사용한 경우 배양기내의 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 또한 반응 시간은 2 내지 30 시간, 바람직하게는 4 내지 10 시간이다.

HBs 항원의 정제에 단백질 분해 효소를 사용하는 본 발명의 방법은, 혈장유래 단백질을 펩신을 사용하여 정제한 종래의 기술과 유사하다고 볼 수도 있겠지만, 양 기술간에는 펩신을 처리하게 되는 단백질 풀(pool)의 기원과 조성이 전혀 상이하다는 점에 근본적인 차이가 있다. 즉, 혈장 유래의 단백질 풀에 존재하는 HBs 항원은 혈장을 수득할 당시부터 이미 완전한 형태의 22nm 입자를 이루고 있으나, 재조합 HBs 항원은 정제하는 과정에서 완전한 형태의 입자를 이루어가는 것이므로 동일한 펩신 처리라 하더라도 처리시 점이나 처리 조건은 전혀 다르게 되는 것이다. 예를 들어, 유사한 수준의 정제 순도를 갖는 혈장 유래 및 효모 유래 재조합 HBs 항원을 각각 동일한 비율로 펩신 처리하며 같은 시간 동안 반응시킨다면, 입자 구성의 차이로 인하여 효모 유래 재조합 HBs 항원만 부분적으로 절단되는 현상이 나타날 수 있다. 또한 혈장 유래 HBs 항원의 정제에서는 펩신 처리의 일차 목적이 혈장내 바이러스의 불활성화인데 반해,재조합 HBs 항원 정제에서 펩신 처리의 목적은 재조합 생물체 유래의 불순 단백질을 제거하는 것이라는 차이도 있다.

상기와 같이 단백질 분해 효소에 의해 불순 단백질이 제거된 HBs 함유액은 전술한 1차 겔 여과 크로마토그래피 과정과 동일한 조건으로 겔 여과 크로마토그래피한 후 HBs 항원을 함유하는 분획만을 모은다.

이와 같이 본 발명에 따라 정제된 HBs 항원은 백신 제조에 직접 사용될 수 있는 정도의 순도를 갖는다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 휘한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다. [실시예 1]

(단계 1) HBs 항원 함유 상등액의 분리

HBs 항원을 발현하도륵 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주(대한만국 특허 공고 90-5959 호 참조)를 배양하여 얻은 효모세포 케익 2kg에 완충용액(100mM 트리스, pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.5% 트리톤 X-100) 4l를 혼합한 후, 0.5mm의 유리구슬 3l가 들어있는 다이노밀(Oynomill)에 600 내지 700ml/분의 속도로 2회 통과시켜 효모 세포를 파쇄하였다. 이때의 온도는 10℃였다. 효모 파쇄액을 유리구슬과 분리하여 유리구슬을 4l의 완충용액으로 세척한 다음 다시 효모 파쇄액에 합치고, 4℃에서 3일간 교반하였다. 효모 파쇄액의 부피는 약 91였다. 교반된 효모 파쇄액을 8℃에서 원심분리하여 세포 찌꺼기와 침전물을 함께 제거하고 상등액만을 모았다. 이때 HBs 항원 함유 상등액의 부피는 약 8l 였고 오자임 킷트(Auzyme kit)로 정량하였을 때 HBs 항원의 양은 102mg이었다.

(단계 2) 실리카 흡착

단계 1에서 얻은 HBs 항원 함유 상등액을 0.15M 염화 나트륨 용액으로 2배 회석한 후 다음과 같이 실리카(Aerosil 380)에 배치 결합시켰다. 먼저 건조 실리카를 물에 분산시켜 10% 슬러리(건조중량/슬러리 부피)로 제조하고 1.5ℓ의 실리카 슬러리를 HBs 항원 함유 상등액에 첨가하여 4℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 5,500rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 HBs 항원이 흡착된 실리카를 0.15M 소금이 포함된 pH 7.2의 인산 완충용액으로 2회 세척하였다 그 다음에 0.25% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 10mM 탄산 완층용액 7l로 상온에서 2 내지 3시간 저어주면서 HBs 항원을 실리카에서 탈착시켰다. 이때 완층용액의 최종 pH는 9.2였다. 용출된 HBs 항원 함유 상등액과 실리카는 8,700rpm에서 원심분리에 의해 분리하였다. 분리된 상등액에 포함된 HBs 항원의 양은 오자임 킷트로 정량하였을 때 137mg이었다.

(단계 3) 음이온 교환 크로마토그래피

단계 2에서 얻어진 HBs 항원 함유 상동액을 음이온 교환 수지인 DEAE 세파로즈로 충진된 컬럼에 통과시켰다. 이때 DEAE 컬럼은 미리 0.5M 염화 나트륨이 포함된 20mM 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 평형화시키고, HBs 항원 함유 상등액은 같은 용액 조건이 되도륵 염화 나트륨을 첨가하여 녹인 후 pH을 8.0으로 맞추었다. DEAE 컬럼을 통과시켰을 때 결합하지 않고 흘러 나온 용액 내의 HBs 항원의 양은 117mg이었다.

(단계 4) 1차 겔 여과 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 HBs 항원 함유 분뵉을 다음 단계의 정제를 위해 분자량 배제 제한 십만의 막을 포함하는 아미콘 중공 여과기 투석여과 시스템을 이용하여 투석여과 및 농측하였다. 농측된 HBs 항원 함유액을 겔 여과 크토마토그래피하기 위해, 먼저 세파로즈 CL-4B(분자량 배제제한 약 2,000,000) 8l를 컬럼(10 x 100cm)에 충진하고 0.135M 염화 나트륨과 0.1% 나트륨 데옥시콜레이트가 포함된 pH 8.0의 트리스 완충용액으로 평형화시켰다. 평형화된 컬럼에 HBs 항원 함유액을 접촉시킨 후 상기와 동일한 완충용액으로 용출시켜 HBs 항원 함유 분획을 모았다. 제1도는 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 HBs 항원 함유 분획을 1차 겔 여과 크로마토그래피하여 용출된 단백질의 프로필을 나타낸 것이다.

(단계 5) 단백질 분해 효소 처리에 의한 불순 단백질 제거

겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 HBs 항원 함유 분획의 단백질 양을 BCA 정량법(BCA assay kit, 미국 피어스사)에 의하여 정량한 다음, 총 단백질 양의 1/500 수준의 트립신을 넣어 37℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 용액을 다음 단계의 정제플 위해 분자량 배제 제한 십만의 막을 포함하는 아미콘 중공 여과기를 이용하여 농축하였다.

(단계 6) 2차 겔 여과 크로마토그래피

단계 5에서 농축된 HBs 항원 함유액을 겔 여과 크로마토그래피하기 위해, 먼저 세파로즈 CL-4B 2l를 컬럼(5 × 100cm)에 충진하고 0.135M 염화 나트륨이 포함된 pH 8.0의 트리스 완충용액으로 평형화시켰다. 평형화된 컬럼에 HBs 항원 함유액을 접촉시킨 다음, 동일한완충용액으로 용출시켜 HBs 항원 함유 분획을 모았다. 이때 UV 스캐닝하여 280nm에서의 흡광도을 이용해 계산된 HBs 항원의 양은 132mg 이었다.

제2도는 1차 겔 여과 크로마토그래피에서 얻어진 단백질 분획을 트립신 처리하고, 얻어진 HBs 항원 함유액을 다시 2차 겔 여과 크로마토그래피하여 용출된 단백질의 프로필을 나타낸 것이다. 여기에서 보면, 1차 겔 여과 크로마토그래피에서 얻어진 분획에 비해 불순 단백질이 상당히 분리된 것을 알 수 있다.

상기 방법으로 정제된 HBs 항원 함유액은 0.2μm 여과기를 통해 여과한 다음 4℃에서 보관하였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 재조합 효모 세포 케익 2Kg에 완충용액(20nM 트리스, pH 8.0, 0.15M 염화 나트륨, 20mM EDTA, 0.5% 트리론 X-100)을 가하고, 유리구슬 4l가 들어 있는 다이노밀(Type KD5, Mahlbehalter, 스위스)에 넣어 파쇄한 다음, 세포 파쇄액을 고속도로 원심분리하여 상등액만율 모았다. 상등액에 10% 실리카 슬러리를 넣어 HBs 항원을 흡착시킨 후, pH 9.0 이상의 20mM 카보네이트 용액을 사용하여 항원을 실리카로부터 탈착시키고, 원심분리하여 실리카와 상등액을 분리하였다. 분리된 HBs 항원 함유 상등액을 0.3M 염화 나트름 존재하에 DEAE 세파로즈 음이온 교환 수지로 충진된 컬럼에 통과시켜 효모에서 유래된 핵산, 색소들 및 음이온과 친화를 갖는 불순 단백질들을 재거하였다. 음이온 교환 수지를 통과한 HBs 항원 함유액을 나선형 한외여과기(TyPe SIY100, 아미콘, 미국)를 이용하여 농축하고 실시예 1과 동일한 방식으로 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 용출된 각 분획을 SDS-전기영동하여 HBs 항원이 포함된 분획을 확인, 수집한 다음, 20mM 트리스(pH 8.0)의 존재하에 나선형 한외여과기( Type SIY100. 아미콘, 미국)를 이용하여 다시 농측 및 투석여과 한 후 로리법으로 단백질 농도를 측정하였다.

상기 단백질 용액의 일부를 취하여 총단백질 양의 1/50, 1/100, 1/200 및 1/500의 수준이 되도록 각각 트립신을 첨가하여 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 각 반응액을 SDS-전기영동였다. 또한 상기 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 HBs 항원 함유 분획을 일부 취한 다음 1.0N 염산을 이용하여 pH를 약 3.0으로 맞추고, 단백질 양의 1/50, 1/100, 1/200 및 1/500의 수준이 되도륵 각각 펩신을 첨가하여, 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 반응액을 SDS-전기영동하여 트립신 처리에 의한 정제 효과와 팹신 처리에 의한 정제 효과를 비교, 확인하였다.

제3도는 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질 분획을 단백질 분해 효소인 트립신과 펩신으로 각각 처리한 후 SDS-전기영동한 결과이다. 제3도에서, 1번 및 10번 열은 각각 단백질 분해 효소 처리 전의 샘플이고, 2, 4, 6 및 8번 열은 트립신을 각각 1/50, 1/100, 1/200및 1/500의 비율로 처리한 후의 샘플이며, 3, 5, 7 및 9번 열은 펩신을 각각 1/50, 1/100, 1/200 및 1/500의 비율로 처리한 후의 샘플이다. 여기에서 보듯이 대부분의 불순 단백질이 트립신 및 펩신의 분해 작용에 의해 잘려 나간 것을 알 수 있다. 따라서, HBs 항원 함유 단백질에 대한 펩신 및 트립신의 양이 상기와 같은 비율일 때 3시간의 반응으로 정제 효과를 얻을 수 있으며, 펩신 및 트립신의 비율을 더 낮출 경우 반응 시간을 증가시킴으로써 동일한 정제 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3]

실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 효모 세포를 파쇄하였다. 파쇄시 유속은 500 내지 700ml/분이었으며 다이노밀에 2회 통과시켜 환전히 파쇄되도륵 하였다. 유리구슬에 붙어 있는 단백질들은 파쇄에 사용한 것과 동일한 완충용액 6l로 씻어 내어 파쇄액과 함께 모았다. 이 용액을 고속도로 원심분리하여 얻은 상등액에 10% 실리카 슬러리 3l를 가하여 HBs 항원을 흡착시킨 후, pH 9.0 이상의 카보네이트 용액을 사용하여 항원을 실리카로부터 탈착시키고, 원심분리하여 실리카와 상등액을 분리하였다. 분리된 hbs 항원 함유 상등액을 0.3M 염화나트륨 존재하에 음이온 교환 수지로 충진된 컬럼에 통과시켜 효모에서 유래된 핵산, 색소들 및 음이온 친화성 불순 단백질들을 제거하였다. 음이온 교환 수지를 통과한 HBs 항원 함유액율 나선형 한외여과기(Type S1Y100, 아미콘, 미국)를 이용하여 400ml로 농축하고 최종 농도가 25%가 되도록 염화 세슘을 가한 후 초원심분리(L8-80, 베크만, 미국)하였다. 이때 사용한 로터는 70Ti로 40,000rpm에서 40시간 동안 회전시켜 밀도 구배가 이루어지게 하였다. 초원심분리가 끝난 후 오자임키트로 HBs 항원 함유 분획을 확인, 수집하여 20mM 트리스로 투석여과한 뒤, 로리법으로 단백질 농도를 측정하였다. 상기 단백질 용액에 전체 단백질양의 1/500 수준이 되도륵 트립신을 넣은 뒤, 37℃ 진탕 배양기에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 0.1M 염화 나트륨을 포함하는 인산 완충용액(pH 7.2)으로 투석여과 및 농축한 후, 동일한 완충용액으로 평형화시키고 CL/4B 세파로즈 컬럼에 접촉시켰다. 동일한 완충용액으로 용출시키고 용출된 각 분획을 SDS-전기영동하였다.

[비교 실시예 1]

트립신 처리 과정을 생략하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 최종 CL/4B 세파로즈 컬럼으로부터 용출된 각 분획을 SDS-전기영동하여 실시예 3의 결과와 비교하였다.

제4a도 및 제4b도는 1차 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질 분획을 트립신으로 처리한 샘플(4a)과 처리하지 않은 샘플(4b)을 각각 다시 겔 여과 크로마토그래피한 후 SDS-전기영동한 결과이다. 이들 결과에서 보듯이,트립신 처리한 실시예 3의 경우 hbs 항원이 98% 이상의 순도로 정제된 반면, 트립신 처리하지 않은 비교예의 경우는 HBs 항원 함유 분획의 순도가 약 90%로 불순 단백질이 존재함을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 재조합 효모에서 발현된 HBs 항원을 실리카 흉착, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 단백질 분해 효소 처리 및 2차 겔 여과 크로마토그래피함으로써 HBs 항원이 불순 단백질 없이 고순도로 정제됨을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 백신 제조에 직접 사용되기에 충분한 순도와 물성을 갖는 HBs 항원 입자를 효율적으로 정제하여 산업적 규모에 사용하기에 적합한 방법이다.

Claims

(a) B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 계면활성제의 존재하에 용해시킨 후 HBs 항원을 포함하는 상등액을 분리하는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻어진 HBs 항원을 함유하는 상등액을 실리카와 접촉시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카를 pH 6-8의 완충용액으로 세척하고, 나트륨 데옥시콜레이트를 포함하는 pH 8.8-11.0의 완충용액으로 HBs 항원을 탈착시키는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 pH 7 내지 9로 조정하고 0.5M 이하의 염을 첨가하여 음이온 교환 수지에 통과시킨 다음, HBs 항원 함유 분획을 투석여과(diafiltration) 및 농축 시키는 단계; (d) 농축된 HBs 항원 함유 분획을 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피한 후, 투석여과하는 단계; (e) 단계 (d)에서 얻어진 HBs 항원 함유 분획을 단백질 분해 효소로 처리한 후, 투석여과 및 농축하는 단계; 및 (f) 단계 (e)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 분자량 배제 제한을 갖는 물질을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는, 재조합 효모로부터 방현된 B형 간염 표면 항원의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 계면활성제가 트윈 20, 트윈 80, 트리톤 X-100 또는 나트륨 데옥시콜레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 계면활성제의 농도가 0.05 내지 1.5%인 것을 특징으로하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 실리카가 100 내지 500m²/g의 표면적을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 단계 (b)에서 나트륨 데옥시콜레이트의 농도가 0.1 내지 0.3%인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 상기 음이온 교환 수지가 DEAE 또는 Q-세파로즈인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 투석여과가 5,000 내지 500,000의 분자량 배제 제한을 갖는 막을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 겔 여과 크로마토그래피가 100만 이상의 분자량 배제 제한을 갖는 아가로스, 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 겔로 충전된 컬럼에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(e)에서 상기 단백필 분해 효소가 트립신 또는 펩신인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(e)에서 HBs 항원 함유 분획의 HBs 항원 농도가 전체 단백질의 5% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단백질 분해 효소를 HBs 항원 함유 분획의 전체 단백질 양의 l/2,000 내지 1/20의 비율로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 단백질 분해 효소 처리를 25 내지 45℃의 온도에서 2 내지 30 시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.