KR100251015B1 - B형간염표면항원의정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 B형 간염 표면 항원(HBs 항원)의 정제 방법에 관한 것으로, (a) B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 계면활성제의 존재하에 용해시킨 후 HBs 항원을 포함하는 상등액을 분리하는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻어진 HBs 항원 함유 상등액을 실리카와 접촉시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카를 pH 8.8 내지 11.0의 완충용액과 접촉시켜 HBs 항원을 탈착시키는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 산화 화합물을 포함하는 완충용액으로 평형된 음이온 교환수지에 통과시킨 다음, 0.05 내지 0.1M 염화나트륨을 포함하는 완충용액으로 세척하고, 0.15 내지 0.5M 염화나트륨을 포함하는 완충용액으로 HBs 항원을 용출시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 용출된 HBs 항원 함유 분획을 젤 투과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 본 발명의 정제방법에 의하면 HBs 항원을 불순물 없이 고순도로 정제할 수 있다.

Description

B형 간염 표면 항원의 정제방법{METHOD FOR PURIFICATION OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN}

본 발명은 B형 간염 표면 항원(이하 HBs 항원)을 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 효모에서 발현된 HBs 항원을 세포 파쇄, 실리카 흡탈착, 음이온 교환 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피를 거쳐 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

B형 간염은 전세계적으로 심각한 공중 보건상의 문제가 되는 질병으로, B형 간염 바이러스(HBV)의 보균자 수는 약 2 - 3억에 달하는데, 특히 아시아와 아프리카 지역은 전체 인구의 약 10% 정도가 HBV 보균자이다. 이와 같이 중요한 B형 간염에 대하여 현재까지는 효과적인 치료제가 없으므로 예방 차원에서 백신의 중요성이 부각되고 있다.

1955년 블럼버그 등이 B형 간염 환자의 혈액에서 오스트랄리아(Australia) 항원을 발견하고, 1971년 크루그만 등이 HBV를 함유하고 있는 사람 혈청을 가열 처리하여 능동 면역을 시도함으로써 B형 간염 백신의 개발 가능성을 보여준 이후, B형 간염 보균자의 혈장으로부터 HBs 항원을 분리 정제한 1세대 B형 간염 백신이 상업화되었다(Hilleman, M. R., et al., Develop. Biol. Standard, 54, 3(1983)). 그러나 이러한 혈장 유래 백신은 혈청내 바이러스의 불활성화 과정 등 정제 공정이 번거롭고 많은 비용이 들 뿐 아니라, 혈액의 공급이 충분치 못하고 혈액을 통해 전염될 수 있는 다른 병원균을 접종자에게 감염시킬 위험성이 있는 등의 문제점을 갖고 있다. 따라서, 혈장 유래 백신 대신 유전 공학 기법을 이용한 재조합 B형 간염 백신을 개발할 필요성이 대두되었다.

발렌주엘라 등에 의해 효모에서 HBs 항원 단백질 생산이 성공적으로 이루어져(Valenzuela, P., et al., Nature, 298, 347(1982)) 2세대 백신으로 불리는 재조합 B형 간염 백신이 생산 판매되고 있으나, 대량 생산에 적합한 정제 공정을 위해서는 아직도 개선할 여지가 많은 실정이다.

일반적으로 B형 간염 보균자의 혈장에서는 직경 22nm의 구형 입자, 동일한 직경을 갖는 원통형 입자 및 직경 42nm의 데인 입자로 불리우는 바이러스 입자로 된 3 가지 형태의 항원이 발견된다. 직경 22nm의 구형 및 원통형 입자는 HBs 항원으로만 구성되어 있으나 데인 입자는 HBs 항원 및 HBc 항원(B형 간염 핵 항원), 그리고 DNA형의 핵산으로 구성되어 있다. 이들 구형, 원통형 및 데인 입자는 보균자의 혈장내에 대개 10,000:10:1 의 비율로 존재하는데, 혈장 유래 백신은 이들 입자 중에서도 22nm의 구형 입자를 백신화한 것이다.

22nm의 구형 입자는 S 단백질, M 단백질, L 단백질이라고 하는 3 가지 단백질로 이루어져 있다. 이들 단백질은 본래 바이러스가 갖고 있는 4개의 ORF(open reading frame)로 구성되는 유전자 중에서 하나의 동일한 ORF로부터 만들어진 것으로, 단백질 합성이 개시되는 시작 코돈에 따라 각 단백질이 구분된다. 구형 입자의 구성에 있어 각 단백질이 차지하는 비율은 서로 다른데, S 단백질 주요 구성 성분이며 M 단백질과 L 단백질은 소량 존재한다. 데인 입자와 원통형 입자에서도 S 단백질이 가장 많은 비율을 차지하고 있지만 L 단백질도 주요 구성 성분으로 포함되어 있다.

재조합 B형 간염 백신은 혈장 유래 백신과 마찬가지로 22nm의 구형 입자로 되지만, 이를 구성하는 표면 항원은 S 단백질로만 이루어져 있고 입자의 직경이 약간 작다. 또한 혈장 유래 표면 항원은 각 단백질과 그의 당화된 형태의 단백질로도 구성되어 있으나, 재조합 표면 항원은 전혀 당화가 되어 있지 않다. 그러나 효모에서 발현되는 재조합 HBs 항원은 침강 속도(sedimentation rate)와 부유 밀도(buoyant density)가 혈장 유래 HBs 항원과 동일하여 밀도나 지질 함량 등의 물리 화학적 성질이 동일할 뿐 아니라 항원성 및 면역 반응성이 높은 입자로 밝혀져(Nature, 298, 347-350(1982)), 표면 항원의 성분이나 당화 유무가 면역성 등에 별로 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

재조합 생물체에 의해 발현되는 재조합 HBs 항원 단백질을 백신화하기 위해서는 재조합 생물체 유래의 불순 단백질을 제거하는 정제 과정이 필수적이다. 통상적으로 재조합 HBs 항원의 정제에는 왐플러 등의 방법(Wampler, E. D. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82, 6830(1985)) 및 스티븐 등의 방법(Stephenne, J. et al., Vaccine, 8(Suppl.), S69(1990))이 이용된다. 이들 방법에서는 정제된 HBs 항원의 순도를 높이기 위해서 소수성 상호 작용에 기초한 부틸 아가로즈 컬럼 크로마토그래피나 전자 친화력을 이용한 음이온 컬럼 크로마토그래피를 이용한다. 그러나, 이러한 방법은 HBs 항원이 이들 고정 담체에 전부 흡착되기 어렵고 또한 일단 담체에 흡착된 항원은 잘 용출되지 않기 때문에 수율이 낮을 뿐 아니라, 이들 고정 담체의 단위당 흡착될 수 있는 HBs 항원의 양이 적다는 단점이 있다.

이외에도 항원 항체 반응에 의한 친화 크로마토그래피 분리에 의해 HBs 항원을 정제하는 방법(Howsen, B. et al., Jounal of Immunological Method, 8,185(1975))이 제안되었다. 이 방법은 정제 효율은 극히 양호한 반면, 백신을 대규모로 생산하는 경우에는 크로마토그래피용 HBs 항체를 얻기 위해서 대량의 성인 혈청이 필요하고 HBs 항체를 고도로 정제해야 하며 시아노겐 브로마이드(CNBr) 등을 사용하여 고정 담체에 결합시켜 친화성 고정 담체를 형성시켜야 하기 때문에 대량 생산에는 적합하지 않다. 뿐만 아니라, 이 친화 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피는 HBs 항체와 겔과의 결합이 비교적 약하기 때문에 용출시에 HBs 항체와 HBs 항체-HBs 항원 반응 생성물이 발생할 수 있으며, 이것이 백신에 혼입되는 경우에는 자가 면역 질환이나 신장병 등을 유발시킬 염려가 있다.

이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 개선하고 보다 효율적으로 고순도 HBs 항원을 정제하기 위해 거듭 연구한 결과, HBs 항원 함유 용액을 실리카 흡탈착시킨 다음, 산화 화합물을 포함하는 완충용액을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피한 후, 젤 투과 크로마토그래피를 수행함으로써 HBs 항원을 98% 이상의 고순도로 얻을 수 있음을 알아 내어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 산업적 규모로 수행될 수 있는 방식으로 B형 간염 표면 항원을 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 정제과정 중 실리카 흡탈착 과정을 거친 HBs 함유 용액을 DEAE 세파로즈 컬럼 크로마토그래피하여 용출된 분획들의 UV 흡광도 변화를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따른 정제 과정 중 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 HBs 함유 분획을 CL-4B 젤 여과 크로마토그래피하여 용출된 분획들의 UV 흡광도 변화를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 (a) B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 계면활성제의 존재하에 용해시킨 후 HBs 항원을 포함하는 상등액을 분리하는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻어진 HBs 항원 함유 상등액을 실리카와 접촉시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카를 pH 8.8 내지 11.0의 완충용액과 접촉시켜 HBs 항원을 탈착시키는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 산화 화합물을 포함하는 완충용액으로 평형된 음이온 교환수지에 통과시킨 다음, 0.05 내지 0.1M 염화나트륨을 포함하는 완충용액으로 세척하고, 0.15 - 0.5M 염화나트륨 염화나트륨을 포함하는 완충용액으로 HBs 항원을 용출시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 용출된 HBs 항원 함유 분획을 젤 투과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는, 재조합 효모로부터 발현된 B형 간염 표면 항원의 정제 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 공정은 B형 간염 바이러스 보균자 혈장이나, 또는 HBs 항원을 발현할 수 있는 임의의 형질전환된 효모의 배양액으로부터 HBs 항원을 정제하는데 유효하다. 형질전환주로 적절한 것은 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 한세눌라(Hansenula), 토룰로피스(Torulopis), 피치아(Pichia) 및 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 효모들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 중 특히 바람직한 것은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisie)이다.

상기와 같은 재조합 효모는 통상적인 방법으로, 즉 동화성 질소원, 무기염, 적절한 pH의 분자 산소 및 기타 조절 상태하에 수성 발효 조건에서 적절한 탄소 에너지원을 사용하여 배양함으로써 HBs 항원이 발현된 효모 세포를 얻는다.

HBs 항원이 발현된 효모 세포를 -70℃ 냉동고에서 꺼내어 완충용액(0.5M NaCl, 10mM EDTA, 0.1M 포스페이트, pH7.0, 0.01% 티메로잘)에 녹인다. 효모 세포와 완충용액 비율이 1:1에서 1:10 사이가 되도록 하여 혼합한 후, 유리구슬 파쇄기(glass bead beator, 또는 Dynomill)를 이용하여 효모 세포벽을 파쇄한다. 세포 파쇄용액에 트윈(Tween)계 또는 트리톤(Triton)계 중성 계면활성제를 0.1 내지 1.0%의 농도로 첨가한 다음, 저온실에서 10 시간 내지 수일 동안 교반한 후 NaOH를 첨가하여 pH를 9 내지 11.5로 조정하고 1 내지 5 시간 동안 교반한다. 다시 1 내지 5N HCl을 첨가하여 pH를 2 내지 5로 적정한 후 원심분리기(Beckman사, Rotor: JA-14, 미국)로 6000rpm에서 15분간 원심분리하여 세포내 침전물은 버리고 HBs 항원을 함유하는 상등액을 얻는다.

상기 HBs 함유 상등액에 NaOH를 첨가하여 pH를 5 내지 7.5로 조정한 후 중성 계면활성제, 예를 들면 트윈-20, 트리톤 X-100 등을 0.05 내지 0.5% 범위의 농도로 첨가한다.

상기 용액에 실리카를 가하여 혼합하고 상온 또는 저온실에서 3 내지 16 시간 동안 교반하여 실리카에 HBs 항원을 흡착시킨다. 본 발명에 사용되기에 적당한 실리카로는 100 내지 500㎡/g 범위 내에서 허용가능한 표면적을 갖는 미립 수화 실리카 또는 무수 실리카가 포함된다. 미립 실리카 중 대표적인 예는 에어로실 380(Aerosil 380; 데구싸사, 미국 뉴저지)이다.

상기와 같이 실리카 처리된 상등액으로부터 HBs 항원-실리카 결합체를 원심 분리법 등과 같은 통상의 방법으로 분리한 다음, 실리카를 pH 6 내지 8 의 완충용액, 바람직하게는 인산나트륨-염화나트륨 완충용액으로 1 내지 3회 세척하여 오염 물질을 제거한다. 오염 단백질이 제거된 실리카를 pH 8.8 내지 11.0의 적당한 완충용액과 2시간 동안 접촉시킴으로써 HBs 항원을 탈착시킨다. 이렇게 탈착된 용액에서의 HBs 항원은 그 단백질 순수도가 약 90% 이상 된다.

탈착된 HBs 항원 용액을 10 내지 200mM 농도의 산화 화합물, 예를 들면 카르복실기, 인산기, 황산기 또는 붕산기를 갖는 화합물을 포함하는 완충용액으로 평형된 음이온 교환수지, 예를 들면 DEAE 또는 Q 세파로즈 등의 음이온 교환 수지에 통과시켜 HBs 항원을 특이적으로 부착시킨다. 그런 다음 상기 완충용액으로 컬럼에 유리되어 있는 불순물들을 제거한다.

다시 0.05 내지 0.1M의 염화 나트륨을 함유하는 상기 완충용액으로 세척하여 컬럼에 부착되어 있는 이물질을 용출시킨다. 이물질이 제거된 HBs 항원은 0.15 내지 0.5M 염화 나트륨을 함유하는 상기 완충용액으로 용출시킨다. 용출된 HBs 항원은 백신으로 사용할 수 있는 수준의 순도를 갖는다.

상기와 같이 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 용액을 더욱 정제하거나 또는 용액의 성분을 바꾸기 위하여 젤 투과 크로마토그래피(gel permission chromatography, GPC)를 수행할 수 있다. 즉, 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 용액을 분자량 10만을 단절시키는 한외여과막(MWCO: 100000dal)으로 농축한 다음 침전물을 800rpm에서 20분간 원심분리하여 제거한 후 GPC를 거쳐 HBs 항원 함유 분획만을 모으면 보다 순수한 HBs 항원을 얻을 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(단계 1) HBs 항원 함유 상등액의 분리

HBs 항원을 발현하도록 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cervisiae) 균주(대한민국 특허 공고 90-5929 호 참조)를 배양하여 얻은 효모세포 케익 2kg을 완충용액(0.5M NaCl, 10mM EDTA, 0.1M 포스페이트, pH 7.0 0.01% 티메로잘) 6ℓ에 현탁시킨 후, 유리구슬이 들어있는 세포파쇄기(Dynomill, WAB사, 스웨덴)에 0.5ℓ/분의 유속으로 2회 통과시켜 세포벽을 파쇄하였다. 효모 파쇄액을 유리구슬과 분리하여 유리구슬을 6ℓ의 상기 완충용액으로 세척한 다음 다시 효모 파쇄액에 합치고, 4℃ 저온실에서 5일간 교반하였다. 이 용액에 5N NaOH를 첨가하여 pH를 11로 맞춘 후 3시간 동안 휘저어 주었다. 다시 5N HCl을 첨가하여 pH를 3.8로 적정한 다음 고속원심분리기(Beckman사, Rotor: JA-14, 미국)로 6000rpm에서 15분간 원심분리하여 HBs 항원을 함유하는 상등액을 취하여 12ℓ를 얻었다.

(단계 2) 실리카 흡탈착

단계 1에서 얻은 HBs 항원 함유 상등액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7로 맞춘 다음 계면활성제인 트윈-20 0.2%를 첨가하여 혼합하였다. 여기에 2ℓ 실리카(Aerosil 380) 분말을 같은 부피의 증류수로 현탁한 것을 첨가하여 4℃ 저온실에서 12시간 동안 교반하여 HBs 항원을 실리카에 흡착시켰다. 이 용액을 원심분리기로 5000rpm에서 10분간 원심분리한 후 실리카를 취하여 10ℓ PBS 용액으로 세척하여 불순물을 제거하였다.

이어서, 실리카에 흡착된 HBs 항원 탈착을 위해 1mM EDTA-10mM 카보네이트(pH 9.3) 완충용액 5ℓ를 상기 불순물을 제거한 실리카에 넣고 충분히 혼합한 다음 3시간 동안 상온에서 교반하고, 고속원심분리기(Beckman사, Rotor: JA-14, 미국)로 7000rpm에서 20분간 원심분리하여 침전된 실리카를 제거하고 HBs 항원을 함유한 맑은 상등액을 취하였다.

(단계 3) 음이온 교환 크로마토그래피

단계 2에서 얻어진 탈착된 HBs 항원 함유 용액을 10㎖ 취하여 20mM 보레이트(pH 9.3) 완충용액으로 투석한 후 동일 완충용액으로 평형된 DEAE-세파로즈젤(파마시아사, 스웨덴) 2㎖가 들어있는 컬럼에 통과시켜 HBs 항원을 젤에 부착시킨 후 동일 완충용액으로 유리된 물질을 제거하였다. 이어서 0.5M 염화나트륨이 함유된 상기 완충용액 5㎖를 컬럼에 통과시켜 부착된 HBs 항원을 용출시켰다. 용출된 HBs 항원을 효소면역측정법으로 정량한 결과 수율은 89%였다.

실시예 2 내지 5

음이온 교환 크로마토그래피 단계시 완충용액으로 각각 20mM 글라이신 용액(pH 9.6), 20mM 카보네이트 용액(pH 9.3), 20mM 에탄올아민-20nM 포스페이트 용액(pH 9.3) 및 20mM 에탄올아민-20mM 설페이트 용액(pH 9.3)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같이 수행하여 HBs 항원을 정제하였다. 각 경우의 수율은 표 1에 나타내었다.

비교예 1 및 2

음이온 교환 크로마토그래피 단계시 완충용액으로 각각 20mM 트리스 용액(pH 8.8) 및 20mM 에탄올아민 용액(pH 9.3)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같이 수행하여 HBs 항원을 정제하였다. 각 경우의 수율은 표 1에 나타내었다.

	음이온 교환 크로마토그래피시 완충용액	수율(%)
실시예	1	20mM 보레이트 용액(pH 9.6)	89
	2	20mM 글라이신 용액(pH 9.3)	92
	3	20mM 카보네이트 용액(pH 9.3)	95
	4	20mM 에탄올아민-20mM 포스페이트 용액(pH 9.3)	87
	5	20mM 에탄올아민-20mM 설페이트 용액(pH 9.3)	89
비교예	1	20mM 트리스 용액(pH 8.8)	23
	2	20mM 에탄올아민 용액(pH 9.3)	21

상기 표 1에서 보듯이, 트리스나 에탄올아민과 같은 양이온 완충용액 만을 사용한 비교예 1 및 2보다 완충용액에 산화 화합물을 함유시킨 실시예 1 내지 5의 수율이 월등히 높음을 알 수 있다.

실시예 6

실시예 1에서 얻은 실리카에서 탈착된 HBs 항원 용액 중 3ℓ를 20mM 글라이신-80mM 카보네이트(pH 9.3) 완충용액으로 평형된 DEAE 세파로즈 젤 컬럼에 통과시킨 후 평형 완충용액으로 컬럼을 세척하고 각각 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 및 1M 농도의 염화나트륨을 함유하는 상기 완충용액을 연속적으로 컬럼에 통과시켜 컬럼에 부착된 물질들을 용출시켰다. 도 1은 DEAE 세파로즈 컬럼 크로마토그래피로부터 용출된 분획들의 UV 흡광도 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, HBs 항원은 0.15M 및 0.2M 농도의 염화나트륨 분획에서 용출되었으며, 순도가 매우 높았다. 염화나트륨 농도별 HBs 항원 비율은 표 2에 나타내었다.

분획	초기용액	컬럼통과액및 세척액	완충용액에 포함된 염화나트륨 농도
			0.05M	0.1M	0.15M	0.2M	0.3M	0.5M	1M
항원비율(%)	100	5.1	1.3	3.5	59.6	17	3.4	1.5	0.6

HBs 비율이 높은 것으로 나타난 0.15M 및 0.2M 농도 분획을 모아 한외여과막으로 농축하여 부피를 50㎖로 줄인 다음 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상등액을 PBS로 평형된 세파로즈 CL-4B 젤 2ℓ를 함유하는 컬럼에 통과시켜 분자량에 따라 더욱 정제하였다. 도 2는 CL-4B 젤 여과 크로마토그래피로부터 용출된 분획들의 UV 흡광도 변화를 나타낸 것이다. 상기 크로마토그래피를 통해 일정한 분자량의 HBs 항원 분획을 모음으로써 보다 순수하고 균일한 HBs 항원 단백질을 정제하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 재조합 효모에서 발현된 HBs 항원을 실리카 흡탈착, 산화화합물 함유 완충용액을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피함으로써 HBs 항원이 불순 단백질 없이 고순도로 정제됨을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 백신 제조에 직접 사용되기에 충분한 순도와 물성을 갖는 HBs 항원 입자를 효율적으로 정제하여 산업적 규모에 사용하기에 적합한 방법이다.

Claims (3)

1. (a) B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 계면활성제의 존재하에 용해시킨 후 HBs 항원을 포함하는 상등액을 분리하는 단계;

   (b) 단계 (a)에서 얻어진 HBs 항원 함유 상등액을 실리카와 접촉시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카를 pH 8.8 내지 11.0의 완충용액과 접촉시켜 HBs 항원을 탈착시키는 단계;

   (c) 단계 (b)에서 얻어진 HBs 항원 함유액을 산화 화합물을 포함하는 완충용액으로 평형된 음이온 교환수지에 통과시킨 다음, 0.05 내지 0.1M 염화나트륨을 포함하는 완충용액으로 세척하고, 0.05 - 0.5M 염화나트륨을 포함하는 완충용액으로 HBs 항원을 용출시키는 단계; 및

   (d) 단계 (c)에서 용출된 HBs 항원 함유 분획을 젤 투과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는,

   재조합 효모로부터 발현된 B형 간염 표면 항원의 정제 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 산화 화합물이 탄산기, 인산기, 붕산기 또는 황산기 함유 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 산화 화합물의 농도가 10 내지 200mM의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.

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