KR100537718B1

KR100537718B1 - 에이형 간염 바이러스 백신 항원의 제조방법

Info

Publication number: KR100537718B1
Application number: KR10-1999-0002965A
Authority: KR
Inventors: 이성희; 정용주; 김현석; 전영중
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2005-12-20
Also published as: KR20000052109A

Abstract

본 발명은 A형 간염 바이러스를 세포배양을 통해 증식시킨후 불활화시키고 바이러스 증식세포로부터 바이러스를 회수하여 농축, 정제하여 A형 간염 예방백신의 항원을 제조하는 방법에 관한 것으로, 배양물에 칼슘이온과 글루타민이 함유되지 않은 부유배지를 첨가하여 배양하여 바이러스가 세포밖으로 유출되도록 하고, 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거하고 바이러스원액을 수득하며, 이 바이러스원액을 농축하고 정제함을 특징으로 한다.

Description

에이형 간염 바이러스 백신 항원의 제조방법{A process for producing antigens of hepatitis B vaccine}

본 발명은 세포배양을 이용하여 A형 간염 바이러스를 배양하고 배양세포에서 바이러스를 분리하고 정제하여 A형 간염 백신의 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.

세포배양을 통한 A형 간염 바이러스의 증식은 1979년 Provot와 Hilleman에 의해 처음 확인되었고(Provost, P.J., Hilleman, M.R., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1979, 160, p.213) 그 후 여러 종류의 세포배양에서 A형 간염 바이러스의 증식이 확인되었다. A형 간염 바이러스의 증식은 원숭이 신장세포인 BS-C-1 세포, BGM, VERO, FRhK-4, 사람 폐세포인 MRC-5 세포 등을 이용한 경우가 대부분이다(Journal of General Virology, 1991, 72, p. 2159-2166).

A형 간염 바이러스는 배양세포에 감염되면 세포 내에서 증식하여 세포 내에 두 가지 형태의 바이러스로 존재하는데, A형 간염 바이러스의 RNA를 포함한 완전한 형태의 바이러스와 RNA가 없는 바이러스 외피만 있는 불완전한 바이러스 형태가 세포내에 있게 된다. 배양세포 안에 있는 두 가지 형태의 바이러스 모두 A형 간염 백신의 항원으로 사용할 수 있으며(Summary of 35th Meeting of the Society of Japanese Virologists, 1987, p.257), 세포를 파쇄하여 유리 바이러스를 얻는 방법으로 바이러스 배양세포의 동결-해동 방법을 주로 이용하였다(Journal of Virology, 1986, p.307-313, vol 58, No.2). 유리 바이러스를 얻는 종래의 기술은 바이러스를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전법에 의해 농축하고 농도구배 원심분리하여 바이러스를 분획하여 정제하였다(Virology, 155, 1986, p.732-736).

대부분의 A형 간염 바이러스의 증식세포는 부착성 세포로서 배양용기에 붙어서 자라는 세포들이다. 세포내에 존재하는 바이러스를 회수하려면 부착세포를 용기로부터 떼어내는 공정이 필요한데, 이제까지 대부분 동결-해동 방법, 혹은 트립신을 이용하여 떼어낸 후 초음파 파쇄 등의 방법을 사용하였다. 그러나, 기존의 방법은 대량의 배양용기를 사용한 바이러스 배양을 할 경우 산업적으로 이용하기 어려운 단점이 있었다. 또한, 바이러스의 농축, 정제 공정에 사용하는 폴리에틸렌글리콜과 염화세슘(CsCl)은 인체에 사용하기에 부적절한 물질이며 대량의 바이러스 원액을 농축할 경우 많은 시간이 필요하게 된다.

앞서 기술한 기존 A형 간염 백신 항원의 제조 공정에서 그 단점으로 대량세포배양을 통한 바이러스 회수에 있어서 냉동-해동 공정 및 효소-초음파처리 기술은 대량의 바이러스 회수에 있어서 산업적 응용에 제한이 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜이나 염화세슘용액을 이용한 바이러스 농축, 정제는 인체에 유해한 물질을 사용함으로 백신제조에 적합하지 않은 단점이 있다. 따라서, 본 발명에서는 바이러스가 증식한 배양세포에서 효과적으로 바이러스를 회수하기 위해 세포배양용 부유배지를 사용하여 단순히 배지를 교체하는 방법으로 바이러스를 효과적으로 분리할 수 있었다. 바이러스 원액의 농축은 PEG 농축 대신 한외여과(ultrafiltration)을 이용하여 시간 및 장치의 절감을 이룰 수 있었다. 바이러스 정제에 사용한 용액은 직접 제조한 농도구배액을 사용하였는데, 이 물질은 의료용 조영제로 사용할 수 있는 물질로서 이를 이용하여 백신의 안전성을 높일 수 있었다. 백신 원액에 남아 있는 농도구배액은 투석을 하여 제거하였다. 바이러스 배양세포에서 바이러스를 분리하는 공정에서 사용한 부유배지는 칼슘이온과 글루타민이 들어있지 않은 배지로서 이를 첨가하고 3일 동안 배양할 경우 배양용기에 부착한 세포가 떨어지고 세포가 파쇄되면서 세포 안에 있는 바이러스가 세포 밖으로 유출된다. 부유배지를 첨가하여 바이러스를 회수할 경우 바이러스가 증식한 배양세포에 부유배지를 교체하는 것 만으로 바이러스를 세포밖으로 분리해 낼 수 있었으며 세포는 원심분리나 필터에 의해 간단히 제거시키고 바이러스 원액만을 분리해 낼 수 있었다. 바이러스원액은 한외여과법에 의해 농축한 후, 30%에서 76%까지의 농도구배액으로 이루어진 농도구배를 제조하고 농축한 바이러스를 상층에 올려 원심분리하여 밀도구배에 따라 바이러스 분획을 얻을 수 있었다. 바이러스의 형태에 따라 완전한 형태의 바이러스와 RNA가 들어있지 않은 바이러스의 두 가지 분획을 얻을 수 있었고 이들 모두 A형 간염 백신의 항원성이 있음을 확인하였다.

본 발명은 A형 간염 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 배양하고, 이 배양물에 칼슘이온과 글루타민이 함유되지 않은 부유배지를 첨가한 후 배양하여 바이러스가 세포밖으로 유출되도록 하고, 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거하고 바이러스원액을 수득하며, 이 바이러스원액을 농축하고 정제하여 A형 간염 백신 항원을 제조하는 방법을 제공한다.

이하에서는 본 발명에 따른 A형 간염 백신 항원의 제조방법과 관련하여 더욱 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 A형 간염 백신 항원의 제조방법에는 먼저 바이러스 숙주세포인 MRC-5 세포(ATCC CCL-171)를 롤러바틀에서 1주일 동안 배양한다. 세포가 배양용기 위에서 완전히 증식한 후 A형 간염 바이러스(ATCC VR-1357, 스트레인 PA21)를 감염시키고 최소배지로 교체하여 4주 동안 배양하는데 1주에 한번씩 배지를 교환해 주었다. 바이러스 배양이 끝난 후에는 배양세포를 인산염 완충액으로 세척해 주고 부유배지를 첨가하여 3일 동안 배양하여 바이러스를 세포 내에서 유리시킨 후 세포는 원심분리하여 제거하고 상등액을 취해 바이러스 원액으로 하여 포르말린이 0.05%(v/v) 되도록 첨가하여 37℃에서 12일 동안 불활화시켰다. 바이러스 원액은 100 KDa의 세공(pore) 크기를 갖는 필터로(Filtron, Ultrasette^TM) 1/20 까지 농축하였다. 농도구배액이 30%, 40%, 50%, 60%, 76%로 농도구배된 튜브 위에 농축 바이러스를 넣고 10℃, 40,000 rpm에서 18시간 동안 초원심분리한다. 원심분리한 후 튜브의 맨 아래에 구멍을 뚫고 분획을 얻어 각 분획마다 A형 간염 바이러스의 항원성을 측정하였다(도 1). 항원성이 있는 분획을 모아 3배의 인산염 완충액과 섞고 다시 10℃, 30,000 rpm에서 6시간 동안 원심분리하여 바이러스 침전물을 얻은 후 주사용수로 녹여내어 투석용 낭에 넣고 인산염 완충액 안에 넣어 4℃에서 12시간 동안 방치하여 잔류 농도구배액을 제거하였다(도 3). 여기서 얻은 A형 간염 바이러스액을 A형 간염 백신의 항원으로 사용하였다.

실시예 1

바이러스 배양세포에서 바이러스 분리

A형 간염 바이러스에 감염된 MRC-5세포는 850㎠의 롤러바틀에서 37℃ 조건에서 4주 동안 배양하는데 이때 사용한 배지의 조성은 다음과 같다.

이얼스염(Earle's salt) 함유 최소필수배지(MEM) 9.4 g/L

태아소혈청(FBS) 2 %

중탄산나트륨2.2 g/L

네오마이신/페니실린100 U/ml

L-글루타민2 mM

바이러스를 접종한 후 1주일에 한번씩 상기한 배지를 롤러바틀 1개당 200ml 씩 교환해 주었다. 바이러스가 증식하면 배양세포를 인산염 완충액 100ml로 3번 세척해 주고 부유배지를 롤러바틀 1개에 100ml 씩 넣고 3일 동안 세포내의 바이러스를 유리시켰다. 부유배지는 칼슘 이온과 L-글루타민 및 혈청이 들어있지 않은 배지로서 세포의 성장을 정지시키고 부착세포를 롤러바틀 표면에서 떼어내어 감염세포 안에 있는 바이러스를 세포 밖으로 나오게 하는 작용을 특징으로 하는 배지이다. 회수한 바이러스액은 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 회수하였다. 부유배지의 조성은 다음과 같다.

이얼스염 함유 최소필수배지 8 - 10 g/L

(CaCl₂ 및 L-글루타민 없음)

중탄산나트륨1.5 - 3 g/L

실시예 2

부유배지와 동결-해동 방법의 바이러스 항원비교

바이러스 항원을 배양세포에서 회수하는 방법으로 부유배지와 동결-해동 방법을 비교하여 항원의 양을 비교하였다. 80㎠ 플라스크에서 바이러스를 배양한 후 부유배지를 20ml 넣고 3일 후에 회수한 것과, 20ml의 인산염 완충액을 넣고 에탄올-드라이아이스 혼합물 위에서 동결과 37℃ 수조에서 해동을 3회 반복하여 회수하여 바이러스 부유액을 얻었다. 각각의 회수액을 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취해 바이러스 부유액을 얻었고, 남아 있는 세포는 5ml의 인산염 완충액을 넣고 100W에서 1분 동안 초음파 처리하여 세포내에 남아있는 바이러스를 회수하였다. 각각의 시료를 ELISA 방법으로 항원가를 측정하였고 이의 결과는 하기 표1에 나타나 있다.

바이러스항원 회수방법		항원가 (ELISA 단위/80㎠ 플라스크)
부유배지	바이러스 부유액	3.85
부유배지	세포 파쇄 후	0.483
동결-해동	바이러스 부유액	3.5
동결-해동	세포 파쇄후	0.924

상기 결과로 부터 부유배지를 첨가하여 항원을 회수한 것과 동결-해동 방법으로 한 경우 바이러스 항원가의 차이가 나지 않았으며, 세포내의 바이러스 항원은 동결-해동 방법이 부유배지를 사용한 회수방법보다 많이 잔류해 있음을 알 수 있다. 따라서 부유배지를 이용할 경우 한번의 배지 교체 만으로 세포 안에 있는 바이러스 항원을 대부분 회수할 수 있었다.

실시예 3

바이러스 농축

바이러스 회수액은 Filtron 사의 Ultrasette^TM 제품을 사용하여 한외여과방법으로 1/20로 농축하여 바이러스 농축액을 제조하였다.

실시예 4

농도구배액의 제조

주사용수 1ml에 다이아트리조에이트 메그루민(diatrizoate meglumine) 660mg과 다이아트리조에이트 소디움(diatrizoate sodium) 100mg을 넣고 녹이고 탄산나트륨 용액과 수산화나트륨용액 혹은 염산으로 pH를 6.0에서 7.7 사이로 맞추었다. 이 용액을 76%의 원액으로 하여 단계적으로 희석하여 농도구배 초원심분리의 충진 용액으로 사용하였다. 농도구배액의 점도는 25℃에서 15 cps, 37℃에서 9.1 cps 이고, 삼투압는 1,870 mOsm/kg이다.

실시예 5

초원심분리 공정

A형 간염 바이러스 정제법 중 농도 기울기 물질로는 슈크로스, 염화세슘 등이 사용되고 있는데 본 발명에서는 농도구배액을 사용하였다. 100 ml 용량의 튜브를 준비하여 인산염 완충액에 농도구배액을 농도별로 희석하여 준비한 후 다음과 같은 순서로 채웠다.

1. 76% 농도구배액 15 ml

2. 60% 농도구배액 15 ml

3. 50% 농도구배액 15 ml

4. 40% 농도구배액 15 ml

5. 30% 농도구배액 10 ml

6. A형 간염 바이러스 농축액30 ml

총용량100 ml

상술한 방법으로 채워넣은 각 튜브를 45Ti 회전자에 넣고 10℃, 40,000 rpm으로 18 시간 동안 원심분리한 후 튜브의 아래에 구멍을 뚫고 3ml 씩 분획을 받아 ELISA 법으로 A형 간염 바이러스 항원을 측정하여 바이러스 항원이 포함된 분획만을 회수하였다(도 1).

실시예 6

농도구배액 제거공정

실시예 3에서 회수한 분획에 포함되어 있는 농도구배액을 제거하기 위해 모은 분획의 3배 부피의 인산염 완충액으로 희석하고 30,000 rpm에서 6시간 동안 원심분리하여 바이러스 침전물을 얻었다. 상등액은 원심분리한 후 바로 제거하고 바이러스 침전물에 주사용수를 넣어 녹였다. 이때 대부분의 농도구배액이 제거되었으나 아직 미량이 남아 있어 이를 다시 제거하기 위해 투석을 수행하였다. 분자량 크기가(MWCO) 10,000인 투석낭 안에 바이러스 액을 넣고 이를 다시 인산염 완충액 안에 넣어 4℃에서 12시간 동안 방치하여 잔류 농도구배액을 제거하였다. 농도구배액이 제거된 것을 확인하기 위해 Toyo TSK 3000 SW 칼럼을 사용하여 HPLC로 280 nm에서 분획을 분석한 결과 투석을 한 후 농도구배액이 현저히 제거된 것을 확인하였다(도 3). 대조로 농도구배액이 제거되기 전의 분획에 대해 HPLC 하였으며 이의 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다.

본 발명은 A형 간염 백신의 항원을 제조하는 방법중에서 부유배지를 사용하여 세포 안에 존재하는 바이러스를 효과적으로 세포 외부로 회수할 수 있어 대규모의 바이러스 항원 제조공정을 단순화시킬 수 있었다. 정제공정에는 인체에 무해한 농도구배액을 사용하여 농도구배 초원심분리법으로 바이러스를 정제할 수 있었고, 다시 투석 과정을 거쳐 미량 잔류하고 있는 농도구배액을 제거시켜 A형 간염 바이러스 항원만을 얻을 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 농도구배 초원심분리 후 분획번호에 따른 A형 간염 바이러스의 ELISA 항원가.

도 2는 바이러스원액을 투석하여 농도구배액을 제거하기 전 Toyo TSK 3000 SW 칼럼을 사용한 HPLC.

도 3은 본 발명에 따라 바이러스원액을 투석하여 농도구배액을 제거한 후 Toyo TSK 3000 SW 칼럼을 사용한 HPLC.

Claims

A형 간염 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 배양한 후 배양물로부터 상기 바이러스를 회수, 농축 및 정제하는 것을 포함하는 A형 간염 백신 항원의 제조방법에 있어서, 배양 후 칼슘이온과 글루타민을 함유하지 않는 최소필수배지(MEM)로 추가 배양하여 바이러스를 회수하고 농축 및 정제하는 것을 특징으로 하는 A형 간염 백신 항원의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 농축은 한외여과로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제는 다이아트리조에이트 메그루민과 다이아트리조에이트 소디움이 함유된 농도구배액을 농도구배물질로 하여 초원심분리법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.