PT751988E

PT751988E - Producao e isolamento altamente eficientes de particulas virais

Info

Publication number: PT751988E
Application number: PT95914170T
Authority: PT
Inventors: Christopher P Prior; David M Weber; Richard S Gore; James J Harter; Michael E Hrinda; Jonathan J Mitschelen; Thomas W Irish; Pierre M Bay; George C Tarr
Original assignee: Immune Response Corp Inc
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 2000-05-31
Also published as: CA2186034A1; DK0751988T3; ES2141929T3; EP0751988A4; US5661023A; WO1995025789A1; AU2127395A; JPH10500286A; EP0751988A1; CA2186034C; US6080571A; GR3033268T3; DE69515028T2; DE69515028D1; JP3313117B2; ATE189697T1; EP0751988B1

Description

DESCRIÇÃO

"PRODUÇÃO Ε ISOLAMENTO ALTAMENTE EFICIENTES DE PARTÍCULAS VIRAIS" Área da Invenção

Esta invenção é dirigida para um processo para produzir partículas virais a partir de células não líticas, partículas virais essas que são úteis como imunogénios e/ou vacinas, utilizando um sistema de bioreactor de perfusão. A invenção é também dirigida para um processo para isolar partículas retrovirais utilizando cromatografia de troca aniónica.

Desenvolvimentos Relatados

Os procedimentos laboratoriais clássicos para produzir quantidades significativas de partículas virais a partir de células não líticas envolvem principalmente a expansão e a conjugação de culturas descontínuas múltiplas. Os métodos de aumento da escala são problemáticos uma vez que requerem medidas de segurança consideráveis e custos com trabalhadores, equipamento e gestão de materiais de desperdício para cumprir os padrões governamentais de confinamento de produtos biológicos perigosos, particularmente quando está envolvida a produção de vírus altamente infecciosos. Adicionalmente, a produção de vacinas virais envolve geralmente a cultura de células infectadas em densidades baixas, o que para sistemas de baixa produção, como são os retrovírus HIV-1 (lentiviridae), resulta em títulos virais relativamente baixos. 0 estatuto epidémico de infecções de HIV tem levado a esforços extensos para preparar HIV e outras partículas retrovirais para a construção de numerosos antigénios derivados 1

V destes. A PCT WO 88/09670 concedida a Jonas Salk e Dennis J. Cario é dirigida para a preparação de imunogénios de HIV não infectantes/inactivados, de aqui em diante referidos como imunogénios tipo Salk, que são desprovidos das glicoproteinas do envelope gp 160 ou gp 120. O método usual para preparar estes imunogénios e vacinas HIV (que incluem ambos HIV-1 e HIV-2) envolve culturas descontinuas múltiplas de células infectadas com HIV e passos de isolamento das partículas de HIV utilizando inactivação, filtração e ultracentrifugação (sedimentação isopicnica em gradientes de sacarose)(de aqui em diante referidos como "Processo Clássico") é apresentado na Fig. 1. Esta última técnica é particularmente limitante em termos de volume, muito trabalhosa e requer um investimento de capital elevado para o aumento de escala. O método também produz apenas cerca de 10 doses de imunogénio tipo Salk possuindo um conteúdo de proteína total de cerca de 100 μg/mL ou 8-10 μg/mL por ELISA baseada em p24 por 1 litro de suspensão de cultura de células. Assim, o próprio processo conducente à forma de dosagem não tem sido empregue para produção industrial devido à sua baixa produção e à necessidade de manipular múltiplas unidades de operação de fluidos infecciosos, para não mencionar a necessidade de alcançar uma vacina possuindo um elevado grau de pureza que seja adequada para administração a humanos. Assim, são necessários processos de aumento de escala mais seguros, menos trabalhosos e menos dispendiosos, com elevada resolução, para a produção de partículas virais, e mais particularmente para a produção em larga escala. São descritos sistemas de bioreactores de perfusão como alternativas a culturas descontínuas múltiplas para produzir densidades celulares elevadas e as suas biomoléculas segregadas. W.R. Tolbert, et al., Perfusion Culture Systems for Production na página 97 em Large-Scale Mammalian Cell Culture, editado por J. Feder e W.R. Tolbert, Academic Press, Inc. (1985) revelam a 2

L·, t utilização de sistemas de bioreactores de perfusão para produzir densidades celulares elevadas enquanto são removidos desperdícios metabólicos numa corrente de perfusão e colheita parcial de células numa corrente de colheita. W.R. Tolbert, et al., também revelam a utilização de sistemas de bioreactores de perfusão para produzir e manter densidades celulares elevadas enquanto que concomitantemente são removidas biomoléculas segregadas e desperdícios metabólicos numa corrente de perfusão. G. Schmid, et al., J. Biotech., 22, 31 (1992) revelam que a utilização de um sistema de bioreactor de perfusão com e sem retenção parcial de uma cultura de hibridomas em suspensão produz concentrações de anticorpos e produtividades específicas quase idênticas, mas provoca um aumento na contagem de células viáveis e produção em espaço-tempo por um factor de 2,5. M. Kloppinger, et al.: Flow Cytometric Process Monitoring of Hybridoma Cells in Batch and Perfusion Culture, na página 125 em Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, editado por R.E. Spier, et al., Butterworth & Co. Ltd. (1989), revelam que um bioreactor de perfusão perfusa IgG em meio livre de células com uma produção de IgG seis vezes mais alta em comparação com as culturas descontínuas. M. Tokashiki, et al.; High Density Culture of Hybridomas Recycling High Molecular Weight Components, na página 355, em Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, editado por R.E. Spier, et al., Butterworth & Co. Ltd. (1989), revelam a utilização de um sistema de bioreactor de perfusão para produzir uma cultura de hibridomas com alta densidade com uma retenção concomitante de componentes de alto peso molecular produzidos pelos hibridomas enquanto são perfusadas substâncias de baixo peso molecular, incluindo desperdícios metabólicos, do meio de cultura. Nenhuma destas referências, no entanto, revela ou sugere a utilização de um bioreactor de perfusão para a produção de partículas virais. 3 p ^ ^ A produção de partículas virais em sistemas de bioreactor são descritas nas referências seguintes. L. Fabry et al., High Density Microcarrier Cell Culture For Virai Vaccine Production, na pág. 361 em Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, editado por R.E. Spier, et al., Butterwoth & Co. Ltd. (1989), revela a utilização de um bioreactor de perfusão para o crescimento de uma linha celular dependente do seu ancoramento até à confluência com a perfusão concomitante de desperdícios metabólicos, seguida pela infecção da linha celular com geração de vírus polio. L. Fabry, et al., também revelam que as cinéticas de replicação virai e a taxa específica de produção de partículas virais para o bioreactor de ' perfusão são semelhantes aquelas preparadas em culturas convencionais. L. Fabry, et al., não revelam ou sugerem utilizar um bioreactor de perfusão para o crescimento de uma sistema celular com concomitante produção de partículas virais. J. B. Clarke e J. B. Griffiths, Cytotechnology, 4, 145 (1990), revelam a operação de dois sistemas de bioreactor utilizando culturas em suspensão para produções de modo descontínuo de HIV. J. B. Clarke e J. B. Griffiths também revelam operar um sistema de bioreactor de leito fixo em que células produtoras de HIV que estão retidas num transportador são suspendidas em meio de crescimento, removidas daí e ressuspendidas em meio de crescimento fresco. J. B. Clarke e J. B. Griffiths, contudo, não revelam a produção de partículas virais num bioreactor de perfusão contendo um meio de crescimento e células não líticas infectadas por vírus sob condições em que o meio de crescimento é sujeito a perfusão a partir do reactor, o meio de crescimento contendo células e os vírus são colhidos do bioreactor, e meio de crescimento fresco é adicionado ao bioreactor.

Após a produção de partículas virais a partir de uma cultura de células, os processos para isolamento de partículas virais, particularmente partículas de retorvírus, estão cheios 4 ·> ·> Γ L--- de problemas. As culturas descontínuas múltiplas convencionais produzem elevados volumes de soluções possuindo títulos virais baixos. A manipulação destes títulos virais baixos em elevados volumes de solução é um problema de gestão de resíduos significativo. Adicionalmente, estas soluções devem ser purificadas até um elevado grau de purificação para remover quantidades significativas de restos celulares, resíduos metabólicos e factores do meio de crescimento das desejadas partículas virais. Além disso, o meio de cultura contém tipicamente uma elevada percentagem de soro bovino fetal, como um factor de crescimento, que é uma mistura complexa de componentes que desafiam adversamente os processos de isolamento. 0 isolamento de retrovírus HIV é particularmente problemático, uma vez que os vírus são produzidos em títulos baixos num meio dispendioso e contendo elevado soro e o seu isolamento requer múltiplos passos de ultracentrifugaçâo que são altamente limitativos durante o processo e intensamente trabalhosos. Assim, para isolar partículas virais são necessários elevada mão-de-obra, grandes quantidades de materiais de purificação, utilização de equipamento de elevada manutenção e espaço significativo em instalações BSL3 dispendiosas. Adicionalmente, é necessário controlar substâncias estranhas no meio de crescimento no qual as partículas virais são produzidas. Consequentemente, é necessário um método para isolar partículas de retrovírus que seja alternativo em termos de eficiência de custos e que permita um aumento de escala.

Numerosas referências revelam métodos para isolar proteínas virais individuais. WO9113906 revela o fraccionamento da proteína virai de HIV recombinante não de fusão, gp 120, por cromatografia de troca iónica, e purificação da fracção exibindo afinidade de ligação específica a CD4 por interacção hidrofóbica e cromatografia de exclusão. US 4,531,311 revela a separação da proteína transcriptase reversa recombinante de HIV das proteínas 5

Γ celulares contaminantes utilizando uma catiónica. JP61051571 revela a purificação de um antigénio de vírus de herpes de suíno através da sua adsorção a uma resina de troca iónica, seguida por eluição selectiva do antigénio utilizando um tampão. C. M. Nalin, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87(19) 7593 (1990) e C. M. Nalin, et al., J. Cell Biochem. Suppl. 14D, 108 (1990) revelam a purificação da proteína Rev recombinante de HIV por cromatografia de troca iónica e de filtração em gel. J. Rittenhouse, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171 (1) 60 (1990) revelam a purificação de proteases recombinantes de HIV-1 e HIV-2 por cromatografia de troca iónica em Mono S., seguida de cromatografia em pepstatina-agarose. A. Billich, et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371(3) 265 (1990) revelam a purificação de uma protease recombinante de HIV-1 por cromatografia de troca catiónica em Mono S., precedida por cromatografia de filtração em gel em Superose R e ultrafiltração. J. K. K. Li, et al., J. Cell Biochem. Suppl. 11C, 181 (1987) revelam a purificação em gradiente do vírus do tumor mamário em murganho, um vírus do tipo B, seguido por rebentamento do vírus e por separação dos polipéptidos estruturais virais utilizando afinidade sequencial e cromatografia de troca iónica em coluna. J. E. Newman, et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 86 Meet., 329 T-43 (1986) revelam o isolamento de proteínas estruturais de HTLV-3 através da passagem sobre uma resina de actividade de lentil lactina, seguida de posterior purificação utilizando passos de cromatografia de troca iónica em HPLC e filtração em gel. Estas referências, contudo, não revelam nem sugerem que uma partícula retroviral, mais particularmente uma partícula de HIV, possa ser purificada por uma cromatografia de troca aniónica. Várias referências revelam a aplicação de cromatografia de troca iónica à purificação de partículas virais. EP 0302,692 revela a purificação do vírus da hepatite A (HAV) por cromatografia de troca aniónica para remover o ADN. J02195877 6

revela a purificação de um retrovirus ou de componentes deste através do seu contacto com um gel de sulfato de celulose ou gel de sulfato de polissacárido com ligações cruzadas (adsorvente catiónico) e subsequente eluição a partir deste. EP 0459,842 revela a utilização de um passo de cromatografia de troca aniónica para purificar partículas de retrovirus. Esta referência, contudo, não revela nem sugere que uma partícula retroviral, mais particularmente uma partícula de HIV, possa ser purificada por cromatografia de troca aniónica através de ligação das partículas a uma resina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Especificamente, a invenção é dirigida a um processo para. purificar partículas virais, compreendendo colocar em contacto as referidas partículas virais com uma resina de troca aniónica em tentáculo e eluir as referidas partículas virais da referida, resina de troca aniónica em tentáculo, em que a referida resina de troca aniónica em tentáculo é uma resina em que a porção desta, possuindo a capacidade de se ligar a uma partícula carregada negativamente, está 'situada próximo do fim ou no fim de uma parte espaçadora que está distai ao local de ligação da parte espaçadora ao componente da estrutura da resina. De acordo com uma realização preferida as partículas virais são partículas de retrovirus.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A Figura 1 é um diagrama para obter partículas de HIV através do "Processo Clássico" contendo um componente de produção a montante que utiliza um sistema de cultura descontínua múltipla e um componente de isolamento a jusante que utiliza passos de inactivação, filtração e ultracentrifugação. 7

celulares contaminantes utilizando uma resina de troca catiónica. JP61051571 revela a purificação de um antigénio de vírus de herpes suíno através da sua adsorção a uma resina de troca iónica, seguida por eluição selectiva do antigénio utilizando um tampão. C. M. Nalin, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87(19) 7593 (1990) e C. M. Nalin, et al., J. Cell Biochem. Suppl. 14D, 108 (1990) revelam a purificação da proteína Rev recombinante de HIV por cromatografia de troca iónica e de filtração em gel. J. Rittenhouse, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171(1) 60 (1990) revelam a purificação de proteases recombinantes de HIV-1 e HIV-2 por cromatografia de. troca iónica em Mono S., seguida de cromatografia em pepstatina-agarose. A. Billich, et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371(3) 265 (1990) revelam a purificação de uma protease recombinante de HIV-1 por cromatografia de troca catiónica em Mono S., precedida por cromatografia de filtração em gel em Superose R e ultrafiltração. J. K. K. Li, et al., J. Cell Biochem. Suppl. 11C, 181 (1987) revelam a purificação em gradiente do vírus do tumor mamário em murganho, um vírus do tipo B, seguido por rebentamento do vírus e por separação dos polipéptidos estruturais virais utilizando afinidade sequencial e cromatografia de troca iónica em coluna. J. E. Newman, et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 86 Meet., 329 T-43 (1986) revelam o isolamento de proteínas estruturais de HTLV-3 através da passagem sobre uma resina de actividade de lentil lactina, seguida de posterior purificação utilizando passos de cromatografia de troca iónica em HPLC e filtração em gel. Estas referências, contudo, não revelam nem sugerem que uma partícula retroviral, mais particularmente uma partícula de HIV, possa ser purificada por uma cromatografia de troca aniónica. Várias referências revelam a aplicação de cromatografia de troca iónica à purificação de partículas virais. EP 0302,692 revela a purificação do vírus da hepatite A (HAV) por cromatografia de troca aniónica para remover o ADN. J02195877 6

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U, ^ revela a purificação de um retrovirus ou de componentes deste através do seu contacto com um gel de sulfato de celulose ou gel de sulfato de polissacárido com ligações cruzadas (adsorvente catiónico) e subsequente eluição a partir deste. EP 0459,842 revela a utilização de um passo de cromatografia de troca aniónica para purificar partículas de retrovirus. Esta referência, contudo, não revela nem sugere que uma partícula retroviral, mais particularmente uma partícula de HIV, possa ser purificada por cromatografia de troca aniónica através de ligação das partículas a uma resina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Especificamente, a invenção é dirigida a um processo para purificar partículas virais, compreendendo colocar em contacto as referidas partículas virais com uma resina de troca aniónica em tentáculo e eluir as referidas partículas virais da referida resina de troca aniónica em tentáculo, em que a referida resina de troca aniónica em tentáculo é uma resina em que a porção desta, possuindo a capacidade de se ligar a uma partícula carregada negativamente, está situada próximo do fim ou no fim de uma parte espaçadora que está distai ao local de ligação da parte espaçadora ao componente da estrutura da resina. De acordo com uma realização preferida as partículas virais são partículas de retrovirus.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A Figura 1 é um diagrama para obter partículas de HIV através do "Processo Clássico" contendo um componente de produção a montante que utiliza um sistema de cultura descontínua múltipla e uma componente de isolamento a jusante que utiliza passos de inactivação, filtração e ultracentrifugação. 7 Γ L· t A Figura 2 é um diagrama para obter partículas de HIV através de um processo possuindo um componente de produção a montante que utiliza um sistema de bioreactor de perfusão e um componente de isolamento a jusante que utiliza passos de inactivação, filtração e cromatografia de troca aniónica. A Figura 3 apresenta cromatogramas de fraccionação de HIV-1 numa coluna C4 de HPLC de fase reversa (Vydac®) para o seguinte: 0 lote de partículas de HIV-1 padrão de referência preparados pelo sistema de cultura descontínua múltipla do "Processo Clássico" (Cromatograma A) ; um lote de partículas de HIV-1 preparadas pelo sistema de cultura descontínuo múltiplo "Clássico" (Cromatograma B); e dois lotes de partículas de HIV- 1 preparadas pelo sistema de bioreactor de perfusão (Cromatogramas C e D) . Cada cromatograma é para aproximadamente 100 μg de produto que foi desnaturado por aquecimento a 80°C durante 15 minutos em guanidina-HCl (Gu-HCl) a 6 M e ditiotreitol (DTT) a 10 mM. Os padrões de eluição foram obtidos utilizando um gradiente de acetonitrilo a uma taxa de fluxo de 1 mL/minuto Medido contra Unidades de Absorvância Arbitrária (AU). A Figura 4 é uma transferência de Western que apresenta perfis de coloração de antigénio de um lote de partículas de HIV-1 a concentrações de 0,1, 0,25, 0,5 e 1 μg/mM (utilizando anti-soro New York Humano isolado de doentes infectados com HIV) preparadas pelo sistema de bioreactor de perfusão e isoladas utilizando passos de inactivação, filtração e cromatografia de troca aniónica (pistas 2-5, respectivamente) e o perfil de coloração para o lote de partículas de HIV-1 padrão de referência, a uma concentração de 1 μg/mM foram preparadas pelo "Processo Clássico" (pista 6) relativo a marcadores de baixo peso molecular (pista 1). 8

Lc, K ^ A Figura 5 é uma SDS Pageque mostra o perfil de coloração para o lote de partículas de HIV-1 padrão de referência preparadas pelo "Processo Clássico" (pista 7), o perfil de coloração de partículas de HIV-1 isoladas a partir da colheita final de um sistema de bioreactor de perfusâo que foi operado durante cinco semanas (pista 6) e os perfis de coloração de partículas de HIV-1 isoladas a partir da colheita durante a primeira, segunda, terceira, quarta e quinta semanas de operação do sistema de bioreactor de perfusâo (pistas 1-5, respectivamente) e o perfil de coloração para marcadores de baixo peso molecular (pista 8). A Figura 6 apresenta uma operação de 52 dias de um sistema de bioreactor de perfusâo para crescer células infectadas com HIV com produção concomitante de HIV-1, em que foram mantidas três condições de estado estacionário, entre os dias 10 a 24, dias 28 a 43, e finalmente dias 46 a 51. A medida de produtividade, concentração de p24, é apresentada como uma função de densidade celular média para as três fases das condições de estado estacionário (SS).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como utilizados acima, e ao longo da descrição da invenção, os seguintes termos, salvo indicação em contrário, serão entendidos como possuindo os seguintes significados:

Definições "Doente" inclui humanos e outros mamíferos. "Partículas virais" incluem viriões completos (vírus), bem como partículas virais relacionadas, mas não proteínas virais individuais. A fonte das partículas virais para cultura de 9

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células pode ser de um doente infectado com virus ou vírus propagados em laboratório, por passagem repetida em sistemas celulares susceptíveis. Exemplos de partículas virais incluem, cápsulas, partículas do centro, viriões desprovidos de uma ou mais proteínas do envelope, envelopes de viriões sem o centro da cápsula nuclear, fragmentos do envelope de virião e viriões deficientes ou incompletos. Partículas virais preferidas são partículas de retrovírus. "Partículas de retrovírus" significa aqueles vírus que contêm ARN como seu material genómico, incluindo vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como HIV-1 e HIV-2, HIV desprovido de proteínas gp 120 e/ou 160, HTLV-1, HTLV-2, vírus AKR AKR-L#1, vírus da leucemia Moloney, e BLV. Partículas de retrovírus preferidas incluem HIV, HIV desprovido de proteínas gp 120 e/ou 160, HTLV-1 e HTLV-2, e mais preferido é HIV-1. "Sistema celular" inclui linfomas T, HUT-78, H9, HZ 321, linha celular de fibroblastos W/Fu 78A1, SC-1, monócitos humanos, células CEM, e células Molt-4. "Meio de crescimento" significa uma solução contendo uma mistura de nutrientes que suporta o crescimento e sobrevivência de um sistema de células de mamíferos. O meio de crescimento pode conter ou não soro e proteínas. "Resina de troca iónica em tentáculo" significa um resina em que a porção desta possuindo a capacidade para ligar uma partícula de carga negativa está situada próximo do fim ou no fim de uma parte espaçadora que está distai ao local de ligação da parte espaçadora ao componente da estrutura da resina. Um exemplo de uma resina de troca iónica em tentáculo é TMAE Fractogel® de E.M. Merck. 10

Aspectos preferidos de acordo com a invenção no processo de preparar partículas virais são como se segue: em que as referidas partículas virais da referida resina de troca iónica em tentáculo são colocadas em contacto com uma resina aniónica e as referidas partículas virais são eluídas da referida resina de troca aniónica; em que a resina de troca aniónica é uma resina Q-SEPHAROSE; em que a referida eluição é realizada com NaCl a cerca de 0,6 até cerca de 2 M. em que a referida eluição é realizada com NaCl a cerca de 1 M. em que a referida resina de troca iónica em tentáculo é TMAE Fractogel®. em que a referida purificação compreende ainda a lavagem da referida resina de troca iónica em tentáculo com NaCl a cerca de 0,1 até cerca de 0,55 M após o referido contacto e antes da referida eluição, e/ou em que as referidas partículas virais são partículas retrovirais, mais preferencialmente as partículas retrovirais são HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2 ou HIV desprovidas de proteínas gp 120 e/ou 160, e mais preferencialmente as partículas retrovirais são HIV-1.

Sistemas de bioreactor de perfusão utilizáveis de acordo com a invenção são configurados para permitir a retenção de células e de partículas virais no bioreactor, para manter uma perfusão contínua do meio de crescimento dentro e fora do bioreactor e para facilitar a recolha (remoção) de meio de 11 p U, ^^ crescimento contendo as células e partículas virais e refrescar o meio de crescimento (substituição de meio de crescimento recolhido por meio de crescimento fresco). Estes bioreactores podem ser configurados para perfusão interna e/ou externa relativa ao bioreactor. Um sistema de bioreactor utilizado de acordo com a invenção é apresentado na Figura 2. 0 sistema de bioreactor de perfusão na Figura 2 utiliza um filtro de perfusão de fibra oca externo, com um módulo de tubagem que recircula as células novamente para o reactor a partir do lado de retenção da membrana do filtro, enquanto que o meio de crescimento contendo produtos residuais é retirado pelo lado permeável. 0 tamanho do poro do filtro é seleccionado de modo a que haja uma retenção completa ou quase completa de partículas virais no bioreactor, tal como utilizando um ultrafiltro de 500 Kd MWCO® a um filtro com um poro de tamanho de 0,1 μ. Sob controlo de um sensor de nível, uma bomba de alimentação fornece meio fresco para manter um volume constante dentro do reactor. As células são colhidas assepticamente através de um tubo profundo que alcança abaixo do líquido de superfície no bioreactor. Este sistema presta-se a culturas de alta densidade em que é crucial manter células com alta viabilidade e taxa de crescimento, e minimizar o resíduo no bioreactor. O bioreactor é ajustado para operar com uma taxa de perfusão que suporta a densidade celular óptima para um sistema celular antes da taxa de crescimento e viabilidade decrescerem significativamente. Além disso, para manter a densidade celular óptima, taxa de crescimento e viabilidade, o meio de crescimento deve ser recolhido para levar a densidade celular a um nível tal que a densidade celular não exceda a densidade máxima. As células devem ser colhidas antes de as células alcançarem o estado estacionário de crescimento, e as células devem exibir 12

substancialmente uma fase logarítmica de crescimento de estado estacionário. A colheita pode ser contínua ou intermitente. A percentagem de volume de meio de crescimento que deve ser recolhida é aproximadamente igual à taxa de crescimento do sistema celular (μ) que é igual a [ln(densidade celular f inal/densidade celular inicial)]/tempOfinai_tempoiniciai) xlOO. Por exemplo, se a densidade celular aumenta 30% em cada 24 horas, então deve ser recolhido por dia 30% do volume do reactor. Assim, recolhas diárias de cerca de 20% a cerca de 80% de meio de crescimento é recolhido por dia, mais preferencialmente cerca de 20% até cerca de 50% do meio de crescimento é recolhido por dia. Esta recolha também reduz o resíduo no bioreactor pela remoção de células mortas antes que elas lisem. Além disso, uma recolha diária do meio de crescimento proporciona a remoção de partículas virais numa corrente única de produto concentrado. 0 filtro de perfusão utilizado de acordo com a invenção possui um tamanho de poro que suporta a eliminação de um peso molecular que retém tanto o sistema de células como as partículas virais e mantém a perfusão. A determinação do peso molecular eliminado é determinada pelo tamanho das partículas virais que devem ser retidas. Para produção de partículas de HIV de acordo com a invenção, filtros de fibra oca Tipo A de Sepracor Inc., possuindo poros de 0,1 μ e ultrafiltros de fibra oca de A/G Technology Inc., com uma retenção de peso molecular de 500 000 dalton, retêm tanto o sistema de células como as partículas virais e mantêm uma taxa de fluxo de perfusão total para períodos médios de 5-10 dias até que o entupimento afecte a taxa de perfusão. Como uma alternativa a ter apenas um único filtro, uma linha de filtros de perfusão, utilizados sequencialmente, suportam a perfusão durante uma operação de produção virai contínua, p. ex., uma linha de 5 filtros de perfusão suporta uma operação de um bioreactor em contínuo durante aproximadamente 5 semanas. 13 Ο componente do filtro de perfusão é também operável de tal modo que proporcione a regeneração automática de um filtro, tal como por uma limpeza asséptica in si tu de um filtro de perfusão com uma solução básica, tal como hidróxido de sódio aquoso. Quando a pressão transmembranar do filtro alcança um certo ponto devido ao inicio de entupimento, um controlador pára a recirculação do meio de crescimento contendo o sistema celular e as partículas virais através do filtro, purga o filtro com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover as células, limpa o filtro com uma solução básica, e faz passar PBS pelo filtro antes de repor o filtro em serviço. Este passo de regeneração proporciona a operação de um filtro num bioreactor de alta densidade celular durante cerca de 3 meses a um taxa de perfusão máxima em contínuo de cerca de 4 volumes de reactor por dia. Este nível de automação reduz a decisão do operador e a manipulação bem como reduz custos associados à utilização de fibra oca. 0 sistema de clarificação Trio (Sepracor, Inc.)é modificado para este passo de regeneração do filtro. 0 inoculo para o bioreactor é preparado de acordo com métodos conhecidos para cultura de tecidos. Por exemplo, um sistema celular é colocado num frasco de cultura de tecido T75, contendo meio de crescimento capaz de suportar o seu crescimento, tal como RPMI 1640/10% de soro bovino fetal para iniciar o crescimento. A cultura é subsequentemente expandida para frascos rolantes para proporcionar pelo menos cerca de 2 x 105 células/mL no bioreactor. São preferidas densidades superiores de sementeira de modo a minimizar a fase de crescimento para cerca de 5 até cerca de 10 dias. Após a inoculação do bioreactor com um sistema celular infectado com HIV, quando a densidade celular alcança cerca de 1 x 106 células/mL, é iniciada a perfusão a cerca de um volume de reactor/dia. A cerca de 2 x 106 células/mL a perfusão é aumentada para cerca de dois volumes de reactor/dia e a cerca de 4 x 106 14

U células/mL a perfusão é aumentada para a taxa máxima de 4 volumes/dia. Quatro volumes de reactor/dia suportarão uma densidade máxima de mais do que 8 x 10° células/mL.

As colheitas do bioreactor contendo células e partículas virais podem ser isoladas de acordo com métodos conhecidos.

As partículas retrovirais são também isoladas de acordo com a invenção. Inicialmente, as colheitas do bioreactor contendo células e partículas retrovirais são clarificadas utilizando um filtro possuindo um tamanho de poro de cerca de 0,5 até cerca de 1,7, preferencialmente cerca de 0,7 até cerca de 1,5, mais preferencialmente cerca de 1,2 μ, para deixar passar as partículas retrovirais e reter as células e outros resíduos. As colheitas clarificadas de partículas retrovirais infecciosas são reunidas e bem misturadas para assegurar homogeneidade.

As partículas retrovirais infecciosas são então sujeitas a inactivação adicionando beta-propiolactona (BPL) (a cerca de 0,25 mL de BPL/mL de sobrenadante) com mistura constante, seguida de incubação da mistura a cerca de 2°C até cerca de 8°C, preferencialmente a cerca de 4°C até cerca de 6°C durante cerca de 18 até cerca de 24 horas. A mistura é então elevada a 37°C e mantida a esta temperatura durante 2 até cerca de 5 horas, preferencialmente cerca de 3 até cerca de 4 horas para hidrolisar BPL residual. Este passo serve para reduzir quimicamente a infecciosidade do vírus por alquilação dos vários componentes estruturais, tais como lípidos, proteínas, ácido nucleico, etc. A inactivação por BPL não é considerada como sendo um passo de inactivação definitivo, e como tal as partículas retrovirais tratadas com BPL devem ainda ser consideradas infecciosas e tratadas como tal. 15 íí ^^ \1 ' A solução contendo as partículas retrovirais tratadas com BPL é então concentrada cerca de 10 até cerca de 20 vezes por ultrafiltração de fluxo tangencial utilizando uma membrana de polisulfona de retenção de 300 000 PM. O concentrado é então diafiltrado contra cerca de 5 até cerca de 10 volumes de PBS, a pH de cerca de 7 até cerca de 8, preferencialmente cerca de 7,5, para proporcionar as condições de tampão requeridas para o passo subsequente de cromatografia de troca aniónica e para aumentar a capacidade de ligação durante esse passo cromatográfico. Este passo serve para remover mais de 90% da albumina na fase permeável, enquanto retém as partículas retrovirais. A solução diafiltrada contendo as partículas retrovirais é passada através de uma ou mais colunas contendo resina de troca aniónica, tal como TMAE Fractogel® (E.M. Merck) ou Q-Sepharose. É preferida uma resina de troca aniónica em tentáculo uma vez que o local desta para ligação de partículas aniónicas possui a mais elevada capacidade de ligação para partículas da dimensão virai e assim, produz o grau de purificação mais elevado em comparação com resinas de troca aniónica sem ser em tentáculo. As taxas de fluxo elevadas das resinas de troca aniónica facilitam a rápida purificação de lotes de grandes dimensões em uma unidade de operação em comparação com a sedimentação isopícnica que requer a utilização de múltiplas ultracentrífugas. O rápido tempo de operação das colunas permite que o equipamento seja novamente armazenado deixando espaço livre para outras operações, incluindo procedimentos de ultrafiltração. Como facto importante, as resinas foram seleccionadas em função da sua estabilidade para NaOH, que é. utilizado para retirar das colunas material biológico fortemente ligado, para sanificação, descontaminação e inactivação de endotoxinas. 16

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A resina de troca aniónica deve também facilitar a remoção de contaminantes enquanto preserva a integridade estrutural das partículas virais a sofrer purificação. Contaminantes aniónicos, tais como ADN e endotoxina, são co-concentrados , com as partículas virais, mas estes contaminantes particulares ligam-se tenazmente às resinas permitindo a eluição selectiva das partículas virais através de uma concentração salina elevada, tal como NaCl a cerca de 1,0 M. Cada passo de cromatografia de troca aniónica alcança uma redução de pelo menos dois logs ou quatro logs para a redução cumulativa de contaminantes aniónicos para dois passos. Análise dos produtos virais eluídos por HPLC de exclusão de tamanho, transferência de Western e SDS-PAGE, também não apresentam alteração estrutural detectável nas partículas virais eluídas, durante pelo menos 24 horas. 0 armazenamento das partículas virais eluídas no tampão de eluição durante vários dias resulta em alteração de estrutura detectável. Assim, sugere-se a diluição imediata do eluente para prevenir o fenómeno de dissociação e para manter a consistência dos componentes estruturais, particularmente para a manutenção do perfil imunogénico quando o produto é emulsificado em Adjuvante Incompleto de Freund.

Quando uma solução diafiltrada contendo as partículas retrovirais é passada através de uma coluna contendo a resina aniónica em tentáculo TMAE Fractogel®, a resina é subsequentemente lavada com NaCl a cerca e 0,1 até cerca de 0,55 M, preferencialmente cerca de 0,3 a cerca de 0,5 M, mais preferencialmente NaCl a cerca de 0,5 M a pH de cerca de 6 a cerca de 7,5, preferencialmente pH de cerca de 6,2 a cerca de 6,8, mais preferencialmente pH de cerca de 6,5, e eluída utilizando uma concentração de NaCl mais elevada a cerca de 0,6 até cerca de 2 M, preferencialmente cerca de 0,8 a cerca de 1,4 M, mais preferencialmente NaCl a cerca de 1 M, a cerca de 6 até cerca de 7,5, preferencialmente pH a cerca de 6,2 até cerca de 17 r U, ^—ç- 6,8, mais preferencialmente pH a cerca de 6,5. A coluna pode ser sanificada com NaOH a cerca de 0,7 até cerca de 1,3 M, preferencialmente NaOH a cerca de 1 M. A solução eluida contendo as partículas retrovirais, particularmente HIV, é suficientemente diluída cerca de quatro até cerca de oito vezes, preferencialmente seis vezes, para reduzir a concentração salina para dentro da gama de NaCl a cerca de 0,05 até cerca de 0,25 M, preferencialmente cerca de 0,1 até cerca de 0,2 M a pH de cerca de 6,2 a cerca de 7,7, preferencialmente pH a cerca de 6,6 a cerca de 7,5, para prevenir a desagregação parcial das partículas de HIV-1 quando expostas à concentração de NaCl mais elevada do eluente, durante períodos de tempo prolongados, tais como maiores do que cerca de 18 horas. Esta primeira coluna é o passo de purificação mais crítico e eficiente no processo, alcançando uma purificação de cerca de 4 0 vezes para a taxa de proteína total. A análise de SDS-PAGE mostra que o grosso dos componentes do meio se encontram no fluxo de passagem pela coluna, mais contaminantes são removidos pela lavagem com NaCl, e para partículas de HIV é determinável a partir da fracção de eluição um padrão de proteína reconhecido comparado com o padrão referência de HIV-1.

Após diluição e mistura para assegurar homogeneidade, a solução de partículas retrovirais é aplicada a uma segunda resina de troca aniónica, tal como uma coluna de Q-Sepharose®. A segunda aplicação é realizada utilizando cerca de metade da quantidade de resina em comparação com a utilização da primeira resina, se a primeira resina tiver sido uma resina de troca aniónica em tentáculo. A cromatografia utilizando Q-Sepharose® é realizada lavando a resina com NaCl desde cerca de 0,3 até cerca de 0,8 M, mais preferencialmente NaCl a cerca de 0,6 M e as partículas virais são eluídas utilizando um eluente como descrito na primeira aplicação de resina. 18 r

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As fracções do eluente com partículas virais de cerca de 1 M, após o segundo passo de cromatografia de troca aniónica, são concentradas 5 vezes utilizando uma placa de ultrafiltração e sistema de grelha contendo um membrana de retenção de polisulfoná 300 000 PM. 0 concentrado é então diafiltrado contra solução salina para reduzir a concentração de sais até á força isotónica e para reduzir os níveis de fosfato em preparação para formulação do produto. O produto purificado é congelado a -70°C, e é sujeito a irradiação com cobalto (cerca de 2 até 4,5 megarads) durante aproximadamente 24 horas. Este procedimento serve como passo de inactivação definitiva por desintegração do ácido nucleico em pedaços de aproximadamente 200 pares de bases, como determinado por análise por PCR. 0 produto é formulado diluído com solução salina a 0,9% para que a injecção alcance a concentração de antigénio requerida (concentração de p24), e é misturado em condições de assepsia com um volume igual de Adjuvante Incompleto de Freund, utilizando um dispositivo de agitação, durante aproximadamente 1 hora. 0 material final (o grosso do imunogénio), agora pronto para enchimento asséptico, surge como uma emulsão quase branca. A presente invenção é ainda exemplificada, mas não limitada, pelos seguintes exemplos, que ilustram os processos de acordo com a invenção. A linha celular do hospedeiro utilizada para produção de partículas virais é uma cronicamente infectada com um linfoma T designado IPL 1, para o qual é desenvolvido um meio de crescimento livre de soro (IMAT) que sustém uma boa produção de vírus e taxas de crescimento comparáveis com as de células cultivadas em soro de bovino fetal (FBS) a 10%. O IMAT é formado por adição dos componentes da seguinte lista 19

Cone.

0,OlOg/L 0,OlOg/L 5,0mL/L 0,00045g/L 0,0002g/L 0,OOlg/L 0,000021g/L 0,0000515g/L 0,0025mL/L 0,000611g/L 1,OOOg/L _Componente_

Transferrina, Humana (HOLO)Hl(Miles)

Insulina, Recombinante Humana, Zn Albumina, Soro Humano (25%) Colesterol

Acetato de DL-Alfa-Tocoferol Óleo de Fígado de Bacalhau Ácido Linoleico Ácido DL-Alfa-Lipoico Tween 80 Etanolamina F.B.

Pluronic F-68, grau NF a RPMI 1640 contendo glucose a 4 g/L e L-glutamina a 0,3 g/L. a redução no conteúdo de proteína do meio sem soro facilita na eficiência do processo de purificação. Células de Manufacturer' s Working Cell Bank (MWCB) são expandidas em frascos T seguido de frascos de rotação ou rolantes, progredindo de T25-»T75-»T150-»frascos rolantes de 850 cm2, para proporcionar inóculo para o bioreactor. Na altura da sementeira, a uma densidade mínima de 2 x 105 células/mL, as células estão em crescimento exponencial com viabilidades acima de 65%. Estes requisitos são necessários de modo a minimizar a fase de arranque no bioreactor dentro de 5 dias a seguir à sementeira inicial. Quando as células começam a crescer, 24 horas após a sementeira, e alcançam uma densidade entre 5 x 105 e 9 x 105, é proporcionado um fornecimento contínuo de meio fresco e o meio utilizado é removido numa base contínua. A taxa de troca de meio começa a aproximadamente 0,5 volumes de reactor/dia e é aumentada para 4 volumes de reactor/dia quando a densidade celular alcança cerca de 2 até cerca de 4 x 106 20

células/mL. Neste estado contínuo de perfusão, são alcançadas densidades celulares de cerca de 8 x 106, o que é uma consequência de distribuir nutrientes e remover produtos residuais numa base contínua. Assim, a perfusão alcança uma densidade celular tipicamente cerca de 10 até cerca de 20 vezes mais elevada do que a densidade celular diária média obtida em rotação onde as células são crescidas de um modo descontínuo. A configuração do bioreactor que permite a retenção das células enquanto é mantida perfusão contínua é apresentada na Figura 2. 0 princípio envolve um dispositivo de filtração de fibra oca externo com um módulo de tubagem que recircula as células de volta para o reactor do lado de retenção da membrana do filtro, enquanto que o meio utilizado é retirado pelo lado permeável. A utilização de um filtro de fibra oca, com um tamanho de poro de 0,1 micron, para a remoção de produtos residuais resulta na quase completa retenção de partículas virais no bioreactor, facilitando assim a remoção das partículas virais na colheita diária juntamente com as células. Uma bomba de alimentação fornece meio fresco que mantém o volume constante sob controlo de um sensor de nível. Foi verificado que para IPL 1B MWCB, uma taxa de perfusão de 4 volumes de reactor/dia suportará uma densidade de cerca de 6 até cerca de 8 x 10' células/mL a cujo ponto o crescimento celular se aproxima da fase estacionária. Esta condição resultará na redução da viabilidade da cultura e/ou da taxa de crescimento. Para manter as células com uma taxa de crescimento óptimo é requerido recolha diária de fluido do reactor para reduzir a densidade, por exemplo para cerca de 3 até cerca de 6 x 10° células/mL, o que é quase equivalente a recolher um terço do volume do reactor/dia. Isto também mantém a viabilidade elevada e reduz os resíduos celulares através da remoção de células mortas. Mais importante, este volume de recolha diária do interior do reactor permite a remoção de partículas virais. 21 Γ L· t 0 passo inicial na colheita e purificação de partículas virais da recolha diária requer a remoção de células e resíduos celulares utilizando procedimentos de micro-filtração. Isto envolve a utilização de um dispositivo de filtração sem-fim, utilizando uma membrana com um tamanho de poro no intervalo de cerca de 0,65 até cerca de 0,8 microns. Este procedimento serve para separar as células e os resíduos celulares das partículas virais.

Este procedimento envolve tipicamente adicionar beta-propiolactona (BPL) à colheita clarificada para uma concentração final de 0,25 ml de BPL por litro de sobrenadante, seguido de incubação a 4°C durante 18-24 horas e depois a 37°C durante 5 horas para inactivar o BPL. A mistura é subsequentemente mantida a 4°C durante 0-6 dias até processamento posterior. Este passo de inactivação serve para reduzir quimicamente a infecciosidade das partículas virais por alquilação dos vários constituintes estruturais do vírus, tais como lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. Salienta-se que este passo de inactivação com. BPL não é uma inactivação definitiva do vírus e o material é ainda considerado infeccioso e é tratado como tal. 0 material tratado com BPL é deixado alcançar a temperatura ambiente e é concentrado 10-20 vezes por ultrafiltração de fluxo tangencial utilizando uma membrana de retenção 300 000 PM. A mistura concentrada é então diafiltrada contra 5-10 volumes de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,5. O tamanho do poro da membrana utilizada neste passo serve para reter partículas de HIV enquanto é removida mais de 90% da albumina de soro bovino e outras proteínas do meio de crescimento, e outras moléculas relativamente pequenas na parte permeável. 22 p U, ^ Ο ρΗ do material concentrado e diafiltrado é ajustado para pH 7,5 e é aplicado numa coluna contendo resina TMAE Fractogel® a uma taxa de fluxo linear de 50 cm/hr. A coluna é lavada com aproximadamente 3-5 volumes de coluna de NaCl a 0,5 M, pH 6,5. 0 produto ligado é então eluido utilizando NaCl a 1,0 M, pH 6,5, e o pico inteiro que absorve a 280 nm é recolhido. A coluna é subsequentemente sanificada após lavagem com 1-2 volumes de coluna com NaOH a 1,0 N. O produto contido na fracção de eluição com NaCl a 1,0 N é diluído seis vezes para reduzir a concentração de sais para um intervalo entre 0,1-0,2 M de NaCl e pH 6,5-7,5. É então aplicado a uma coluna de Q-Sepharose Fast Flow® que contém aproximadamente metade da quantidade de resina em comparação com a coluna de TMAE Fractogel®, a uma taxa de fluxo linear de 100 cm/hr. A coluna é lavada com 3-5 volumes de coluna de NaCl a 0,6 M, pH 6,5. O produto ligado é novamente eluido utilizando o tampão NaCl a 1,0 M. A fracção de NaCl a 1,0 M da coluna Q-Sepharose Fast Flow® é concentrada aproximadamente 5 vezes utilizando um dispositivo de placa e grelha de ultrafiltração contendo uma membrana de retenção de 100 000-300 000 PM. 0 concentrado é então diafiltrado contra PBS pH 7,5 para reduzir a concentração de sais. Para minimizar perda de produto no espaço morto após concentração, o equipamento é lavado com um volume de espaço morto de solução salina (0,9% NaCl) e a lavagem é adicionada à fracção diafiltrada. 0 material é congelado a -70°C, e é sujeito a uma irradiação com cobalto (2 a 4,5 megarads durante aproximadamente 24 horas), que serve como passo de inactivação virai final.

Neste estágio, o produto pré-formulado é diluído com 0,9% de solução salina para injecção para conseguir a concentração desejada de antigénio (concentração de p24), e é assepticamente 23 U >·—t misturado com igual volume de Adjuvante Incompleto de Freund utilizando um dispositivo de agitação durante aproximadamente 15-20 minutos. O trabalho inclui a caracterização de HIV-1 desprovido de gpl20 de acordo com a invenção que é essencial para o estabelecimento de um novo padrão de referência para controlo de consistência lote a lote e para demonstrar a comparabilidade do material preparado pelo "Processo Clássico". Os dados de caracterização mostram a comparabilidade do produto do material preparado pela metodologia da cultura descontinua/gradiente de sacarose utilizando procedimentos conhecidos de HPLC (Figura 3), transferência de Western (Figura 4), e SDS-Page (Figura 5), consistência de produto seja isolado do material de partida no inicio ou no fim da operação do bioreactor por transferência de Western (Figura 4), e consistência de produto entre HPLC de diferentes operações em bioreactor (Figura 3). O desempenho de uma operação em bioreactor típica (Figura 6) mostra uma fase de crescimento que dura até ao dia 6, tempo em que a fase de produção foi iniciada pelo início da colheita de células diária. A fase de produção durou 48 dias. A Figura 6 mostra que o bioreactor foi mantido em três diferentes densidades celulares em estado estacionário controlando o volume de colheita. Nesta cultura (Figura 6) a densidade celular em estado estacionário é mantida em aproximadamente 3,5 X vo o \—1 células/mL entre os dias 10-24; em aproximadamente 6 X 106 células/mL entre os dias 28-43; e em aproximadamente 7 X 106 células/mL entre os dias 46-51. A medida da produtividade, concentração de p24, é apresentada como função da densidade celular média para cada período de estado estacionário. Claramente, densidades celulares mais elevadas aumentam a produção de p24. Adicionalmente, uma taxa de crescimento mais rápida é desejável uma vez que requer um maior volume de 24 colheita para manter uma densidade celular em estado estacionário. Uma vez que o produto é recuperado da colheita de células diária, isto traduz-se numa produção diária superior de partículas virais.

Lisboa, 16 de Fevereiro de 2000

AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

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u REIVINDICAÇÕES 1. Processo para purificar partículas virais, compreendendo colocar em contacto as referidas partículas virais com uma resina de troca aniónica em tentáculo e eluir as referidas partículas virais da referida resina de troca aniónica em tentáculo, em que a referida resina de troca aniónica em tentáculo é uma resina em que a porção desta, possuindo a capacidade de ligar uma partícula carregada negarivamente, está situada próximo do fim ou no fim de uma parte espaçadora que está distai do local de ligação da parte espaçadora ao componente da estrutura da resina.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda colocar em contacto as referidas partículas virais da referida resina de troca aniónica em tentáculo com uma resina de troca aniónica e eluir as referidas partículas virais da referida resina de troca aniónica.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2 em que a resina de troca aniónica é uma resina de Q-SEPKAROSE.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a referida eluição é efectuada com NaCl de cerca de 0,6 M a cerca de 2 M.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a referida eluição é efectuada com NaCl a cerca de 1 M.
6. Processo· de acordo com a reivindicação 1, em que a referida resina de troca aniónica em tentáculo é TMAE FRACTOGEL®. l Lzj ^
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida purificação compreende ainda a lavagem da referida resina de troca aniónica em tentáculo com NaCl de cerca de 0,1 a cerca de 0,55 M após o referido contacto e antes da referida eluição.
8. Processo para purificar partículas retrovirais, compreendendo colocar em contacto as referidas partículas virais com uma resina de troca aniónica em tentáculo e eluir as referidas partículas retrovirais da referida resina de troca aniónica em tentáculo, em que a referida resina de troca aniónica em tentáculo é uma resina em que a porção desta, possuindo a capacidade de se ligar a uma partícula carregada negativamente, está situada próximo do fim ou no fim de uma parte espaçadora que está distai do local de ligação do parte espaçadora ao componente da estrutura da resina.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda colocar em contacto as referidas partículas retrovirais da referida resina de troca aniónica em tentáculo com uma resina de troca aniónica e eluir as referidas partículas retrovirais da referida resina de troca aniónica.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9 em que a resina de troca aniónica é uma resina de Q-SEPHAROSE.
11. Processo de acordo com a reivindicação 8 em que a referida eluição é efectuada com NaCl de cerca de 0,6 M a cerca de 2 M. 2
12. Processo de acordo com a reivindicação 8 em que a referida eluição é efectuada com NaCl a cerca de 1 M.
13. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a referida troca aniónica em tentáculo é TMAE FRACTOGEL®.
14. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a referida purificação compreende ainda a lavagem da referida resina de troca aniónica em tentáculo com NaCl a cerca de 0,1 a cerca de 0,55 M após o referido contacto e antes da referida eluição.
15. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que as referidas partículas retrovirais são HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2 ou HIV desprovidas de proteínas gp 120 e/ou 160.
16. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que as referidas partículas retrovirais são HIV-1.
17. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que as referidas partículas retrovirais são HIV desprovidas de proteínas gp 120 e/ou 160. Lisboa, 16 de Fevereiro de 2000 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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