JPH10500286A

JPH10500286A - ウイルス粒子の効率の高い生産および単離

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Publication number: JPH10500286A
Application number: JP7524824A
Authority: JP
Inventors: マイケルイー．ヘリンダ，; クリストファーピー．プライアー，; ジョナサンジェイ．ミッチェレン，; トーマスダブリュー．アイリッシュ，; デイビッドエム．ウェーバー，; リチャードエス．ゴーア，; ジェイムズジェイ．ハーター，; ピエレエム．ベイ，; ジョージシー．タル，
Original assignee: ザイミューンリスポンスコーポレイション
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 1998-01-13
Anticipated expiration: 2017-08-12
Also published as: US5661023A; DK0751988T3; ES2141929T3; EP0751988A1; DE69515028T2; DE69515028D1; WO1995025789A1; JP3313117B2; US6080571A; PT751988E; CA2186034A1; EP0751988B1; EP0751988A4; CA2186034C; ATE189697T1; AU2127395A; GR3033268T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ウイルス粒子を生産するための連続プロセスに関し、灌流増殖培地においてウイルス感染された生存可能な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および上記細胞を含有する培地を、上記灌流増殖培地中に残存する細胞の定常状態の対数期増殖を維持する速度で取り出す工程を包含する。本発明はまた、レトロウイルス粒子を精製するプロセスに関し、レトロウイルス粒子および不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂に通す工程、およびレトロウイルス粒子を樹脂から溶出する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルス粒子の効率の高い生産および単離発明の分野本発明は、灌流バイオリアクターシステムを使用して非溶菌細胞からウイルス粒子を生産するプロセスに関し、このウイルス粒子は免疫原および／またはワクチンとして有用である。本発明はまた、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してレトロウイルス粒子を単離するプロセスに関する。報告されている開発非溶菌細胞から大量のウイルス粒子を生産するための古典的な研究室手順は、主に多段階のバッチ培養の拡張およびプールを包含する。スケールアップ法は、考慮すべき安全尺度、および労賃、（特に、感染性の高いウイルスの生産を伴う場合）政府の生物学的危険封じ込めの基準を満たすための装置および老廃物の処理を必要とするという問題がある。さらに、ウイルスワクチンの生産は、一般に感染細胞を低密度で培養する工程を包含する。これはレトロウイルスHIV-1（レンチウイルス）(lentiviridae)のような低生産システムのためであり、比較的低いウイルス力価を生じる。 HIV感染の流行の現状は、HIVおよび他のレトロウイルス粒子由来の多数の抗原を構築するために、HIVおよび他のレトロウイルス粒子を調製する多大な努力を導いた。Jonas SalkおよびDennis J.CarloのPCT国際公開番号第WO 88/09670号は、非感染性で不活性なHIV免疫原（本明細書では以後ソーク型免疫原という）の調製に関しており、このHIV免疫原は、エンベロープ糖タンパク質gp160またはgp 120を欠損している。これらの免疫原およびHIVワクチン（HIV-1およびHIV-2の両方を含む）を調製するための通常の方法は、HIV感染細胞の多段階のバッチ培養、ならびに不活性化、濾過、および超遠心（ショ糖勾配における等密度遠心）工程を使用するHIV粒子の単離（本明細書では以後「古典的プロセス」という）を包含し、この方法は、図１に示されている。後者の技術は特に容量に限界があり、労働集中的であり、そしてスケールアップのために高価な設備投資が必要である。この方法はまた、細胞培養懸濁液１リットルあたり約100μg/mLの総タンパク質含有量またはp24に基づくELISAにより８〜10μg/mLを有する約10用量のソーク型免疫原を生産するのみである。従って、投与形態を導くプロセッシングは、ヒトへの投与に適切な極めて高い程度の純度を有するワクチンを達成する必要性は言うまでもなく、その低い収量および感染液の多段階単位の操作を扱う必要のために、工業的生産に役立たない。それゆえ、より安全で、より労働集中的でなく、そして高い分離性を伴うよりコスト効率の良いスケールアッププロセスが、ウイルス粒子の生産、そしてより詳細には、スケールアップ生産のために必要とされている。灌流バイオリアクターシステムは、高細胞密度およびそれらの分泌生体分子を生産するための従来の多段階のバッチ培養の代替方法として記載されている。W. R.Tolbertら，「生産のための灌流培養システム」，97頁，Large-Scale Mammali an Cell Culture，J.FederおよびW.R.Tolbert編，Academic Press，Inc．(1985) は、灌流バイオリアクターシステムを使用して灌流中に代謝老廃物を除去しながら、そして回収流中に部分的に細胞を回収しながら高細胞密度を生成することを開示している。W.R.Tolbertらはまた、灌流中に分泌生体分子および代謝老廃物を同時に取り出しながら灌流バイオリアクターシステムを使用して高細胞密度を生成し、および維持することを開示している。G.Schmidら，J.Biotech.，22，31 (1992)は、ハイブリドーマ懸濁培養を部分的に保持する、または保持しない灌流バイオリアクターシステムの使用がほとんど同一の抗体濃度および特異的な生産性を生み出すが、生存細胞数の増加および2.5の要素による時空収量の増加をもたらすことを開示している。M.Kloppingerら、「バッチ培養および灌流培養におけるハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリーによるプロセス調整」，125頁，Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses，R.E.S pierら編，Butterworth & Co.Ltd．(1989)は、灌流バイオリアクターが、バッチ培養と比較して６倍高いIgGの生産を有する無細胞含有培地中のIgGを灌流することを開示している。M.Tokashikiら、「高分子量成分を再利用するハイブリドーマの高密度培養」，355頁，Advances in Animal Cell Biology and Technolog y for Bioprocesses，R.E.Spierら編，Butterworth & Co.Ltd．(1989)は、灌流バイオリアクターシステムを使用して、代謝老廃物を含む低分子量の基質を培養培地から灌流しながらハイブリドーマにより生産された高分子量成分を同時に維持するハイブリドーマの高密度培養を生成することを開示している。しかし、これらの参考文献はいずれも、ウイルス粒子の生産のために灌流バイオリアクターを使用することを開示または示唆していない。バイオリアクターシステムにおけるウイルス粒子の生産は、以下の参考文献に記載されている。L.Fabryら、「ウイルスワクチン生産のための高密度マイクロキャリアー細胞培養」，361頁，Advances in Animal Cell Biology and Technol ogy for Bioprocesses，R.E.Spierら編，Butterworth & Co.Ltd．(1989)は、同時に代謝老廃物の灌流をしながら、密集に達するまで足場依存性細胞株を増殖するために灌流バイオリアクターを使用し、その後、細胞株をポリオウイルス世代で感染させることを開示している。L.Fabryらはまた、ウイルス複製の速度論および灌流バイオリアクターについてのウイルス粒子生産の比速度が、従来の培養で調製されたものと類似することを開示している。L.Fabryらは、同時にウイルス粒子の生産を有する細胞システムの増殖のために、灌流バイオリアクターを使用することを開示または示唆していない。J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffiths，Cyt otechnology，4，145(1990)は、HIVのバッチ様式の生産のために懸濁培養を使用する２つのバイオリアクターシステムの操作を開示している。J.B.Clarkeおよび J.B.Griffithsはまた、固定化ベッドバイオリアクターシステムの操作を開示しており、ここではキャリア中に保持されているHIV生産細胞は、増殖培地中に懸濁され、そこから取り出され、そして新鮮な増殖培地に再懸濁される。しかし、 J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffithsは、増殖培地がバイオリアクターから灌流され、細胞およびウイルスを含む増殖培地がバイオリアクターから回収され、そして新鮮な増殖培地がバイオリアクターに添加される条件下で、増殖培地およびウイルス感染された非溶菌細胞を含む灌流バイオリアクターにおいてウイルス粒子を生産することを開示していない。細胞培養からのウイルス粒子の生産に続いて、ウイルス粒子、特にレトロウイルス粒子を単離するためのプロセスは、問題をはらんでいる。従来の多段階のバッチ培養では低いウイルス力価を有する大量の溶液を生産する。大量の溶液においてこれらの低ウイルス力価を扱うことは、老廃物処理の重大な問題である。さらに、これらの溶液は所望のウイルス粒子から大量の細胞破片、代謝老廃物、および増殖培地要素を除去するために高純度に精製されなければならない。さらに、培養培地は代表的には、高い割合のウシ胎児血清を増殖因子として含有し、この培養培地は単離プロセスを不利に要求する成分の複雑な混合物である。HIVレトロウイルスの単離は、特に問題である。なぜなら、ウイルスは高価で血清含量の高い培地中に低い力価で生産され、およびその単離は処理量が高度に制限されており、そして労働集中的である多段階の超遠心工程を必要とするからである。従って、高い人力の必要、大量の精製物質、高度な維持装置の使用、および高価なBSL3施設におけるかなりの床面積を、レトロウイルス粒子の単離のために必要とする。さらに、レトロウイルス粒子が生産される増殖培地中の外来基質を制御する必要がある。従って、レトロウイルス粒子を単離するための代替となるコスト効率の良い、そしてスケールアップが可能な方法が必要である。多数の参考文献が、個々のウイルスタンパク質を単離するための方法を開示している。国際公開第WO9113906号は、非融合組換えHIVウイルスタンパク質gp120 をイオン交換クロマトグラフィーで分画し、そしてCD4特異的結合親和性を示す画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することを開示している。米国特許第4,531,311号は、組換えHIV逆転写酵素タンパク質を、混入する細胞性タンパク質から陽イオン交換樹脂を使用することにより分離することを開示している。日本国特許第61051571号は、ブタヘルペスウイルス抗原をイオン交換樹脂に対するその抗原の吸着、その後の緩衝液を使用するこの抗原の選択的溶出により精製することを開示している。C.M.Nali nら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．87 （19）7593(1990)およびC.M.Nalinら，J.Ce ll Biochem.Suppl．14D，108(1990)は、組換えHIV Revタンパク質のイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を開示している。J.Rittenhouseら，Biochem.Biophys.Res.Commun．171 （1）60(1990)は、組換えHIV-1およびHIV-2プロテアーゼを、Mono Sにおけるイオン交換クロマトグラフィー、その後のペプスタチンアガロースクロマトグラフィーにより精製することを開示している。A.Billichら，Biol.Chem.Hoppe-Seyler371 （3）265(1990) は、組換えHIV-1プロテアーゼを、予めSuperose Rにおけるゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行ってから、Mono Sにおける陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製することを開示している。J.K.K.Liら，J．Cell Biochem.Su ppl．11C，181(1987)は、マウス乳房腫瘍ウイルス、Ｂ型ウイルスの勾配精製、その後のウイルスの破壊、および一連のアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるウイルス構造ポリペプチドの分離を開示している。J.E.Newmanら，Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.86 Meet .，329 T-43(1986)は、HTLV-3構造タンパク質をレンズマメレクチンアフィニティー樹脂に通し、その後HPLCイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過工程を使用してさらに精製することにより単離することを開示している。しかし、これらの参考文献は、レトロウイルス粒子、より詳細にはHIV粒子が陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製され得ることを開示または示唆していない。いくつかの参考文献はウイルス粒子の精製のためのイオン交換クロマトグラフィーの適用を開示している。欧州特許第0302,692号は、陰イオン交換クロマトグラフィーでDNAを除去することによりＡ型肝炎ウイルス(HAV)を精製することを開示している。日本国公開番号第2195877号は、レトロウイルスまたはその成分をセルロース硫酸ゲルまたは架橋した多糖硫酸ゲル（陽イオン性吸着剤）と接触させ、続いてそこから溶出することにより精製することを開示している。欧州特許第0459,842号は、レトロウイルス粒子を精製するために陽イオン交換クロマトグラフィー工程を使用することを開示している。しかし、これらの参考文献は、レトロウイルス粒子、より詳細にはHIV粒子が、粒子を樹脂に結合させることにより陰イオン交換クロマトグラフィーで精製され得ることを開示または示唆していない。発明の要旨本発明は、ウイルス粒子を生産する連続プロセスに関し、灌流増殖培地においてウイルス感染された生存可能な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および上記細胞を含有する培地を上記灌流増殖培地中に残存する細胞の定常状態の対数期増殖を維持する速度で取り出す工程を包含する。本発明はまた、レトロウイルス粒子を精製するプロセスに関し、レトロウイルス粒子および不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂に通す工程、およびレトロウイルス粒子を樹脂から溶出する工程を包含する。図面の簡単な説明図１は、多段階のバッチ培養システムを使用する上流の生産成分および不活化工程、濾過工程、および限外濾過工程を使用する下流の単離成分を有する「古典的プロセス」によりHIV粒子を得るための図である。図２は、灌流バイオリアクターシステムを使用する上流の生産成分および不活化工程、濾過工程、および陰イオン交換クロマトグラフィー工程を使用する下流の単離成分を有するプロセスによりHIV粒子を得るための図である。ロマトグラフを示す：「古典的プロセス」の多段階のバッチ培養システムにより調製されたHIV-1粒子の参考標準ロット（クロマトグラフＡ）；「古典的な」多段階のバッチ培養システムにより調製されたHIV-1粒子のロット（クロマトグラフＢ）；そして灌流バイオリアクターシステムにより調製されたHIV-1粒子の２つのロット（クロマトグラフＣおよびＤ）。それぞれのクロマトグラフは、６M グアニジン-HCl(Gu-HCl)および10mMジチオトレイトール(DTT)中で15分間、80℃ で加熱することにより変性させた約100μgの産物である。溶出パターンは、任意の吸光単位(AU)に対して測定した１mL/分の流速でのアセトニトリル勾配を使用することにより得られた。図４は、ウェスタンブロットであり、0.1、0.25、0.5、および１μg/mMの濃度のHIV-1粒子のロットの抗原染色プロフィールを示す（HIV感染患者から単離した Human New York抗血清を使用する）。HIV-1粒子は、灌流バイオリアクターシステムにより調製し、そして不活化工程、濾過工程、および陰イオン交換クロマトグラフィー工程（それぞれレーン２〜５）を使用して単離した。そして濃度１μ g/mMのHIV-1粒子の参考標準ロットについての染色プロフィールを低分子量マーカー（レーン１）に対して「古典的プロセス」により調製した（レーン６）。図５は、SDS Pageであり、「古典的プロセス」により調製したHIV-1粒子の参考標準ロットについての染色プロフィール（レーン７）、５週間操作された灌流バイオリアクターシステムの最終回収物から単離されたHIV-1粒子の染色プロフィール（レーン６）、ならびに灌流バイオリアクターシステムの操作の第１週、第２週、第３週、第４週、および第５週の間の回収物から単離されたHIV-1粒子の染色プロフィール（それぞれレーン１〜５）、ならびに低分子量マーカーの染色プロフィール（レーン８）を示す。図６は、同時にHIV-1生産を伴うHIV感染細胞を増殖するための52日間の灌流バイオリアクターの運転を示す。ここで、10日目〜24日目の間、28日目〜43日目の間、および最後の46日目〜51日目の間、３つの定常状態条件が維持された。生産性の尺度（p24濃度）が３相の定常状態(SS)条件についての平均細胞密度の関数として示される。発明の詳細な説明先に使用したように、そして発明の説明を通して、以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有することが理解されるものとする：定義「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物を包含する。「ウイルス粒子」は、完全なビリオン(ウイルス)ならびに関連するウイルス粒子を包含するが、個々のウイルスタンパク質は包含しない。細胞培養のためのウイルス粒子の供給源はウイルスに感染した患者に由来し得るか、または感受性の細胞系で繰り返し継代することにより実験室で増殖させたウイルスに由来し得る。ウイルスの例としては、カプシド、コア粒子、１以上のエンベロープタンパク質が涸渇したビリオン、核カプシドコアを伴わないビリオンエンベロープ、ビリオンエンベロープフラグメント、および欠損ビリオンまたは不完全なビリオンが挙けられる。好ましいウイルス粒子はレトロウイルス粒子である。「レトロウイルス粒子」は、RNAをゲノム物質として有するウイルスを意味し、HIV-1およびHIV-2のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)、gp 120および/または 16 0タンパク質が涸渇したHIV、HTLV-1、HTLV-2、AKRウイルスAKR-L#1、サル白血病ウイルス、およびBLVを包含する。好ましいレトロウイルス粒子としては、HIV、 gp 120および/または160タンパク質が涸渇したHIV、HTLV-1およびHTLV-2が挙げられ、さらに好ましくはHIV-1である。「細胞系」は、T-リンパ腫、HUT-78、H9、HZ321、W/Fu線維芽細胞78A1株、SC- 1、ヒト単球、CEM細胞、およびMolt-4細胞を包含する。「増殖培地」は、哺乳動物細胞系の増殖および生存を支える栄養混合物を含有する溶液を意味する。増殖培地は血清またはタンパク質を含んでもよく、または含まなくてもよい。「テンタクル(tentacle)陰イオン交換樹脂」は、負に帯電した粒子と結合する能力を有する樹脂の部分が、スペーサー部分の端部またはその近傍に位置する樹脂を意味する。ここで、このスペーサーの端部は、スペーサー部分の樹脂の骨格 (backbone)構成部分への付着部位とは遠位にある。テンタクル陰イオン交換樹脂ウイルス粒子を調製するためのプロセスにおける本発明による好ましい局面は以下の通りである：除去した培地中に存在するウイルス粒子を細胞から分離し；該細胞を含む該培地および該ウイルス粒子を、該細胞が定常状態の増殖に達するする前に除去し；該増殖培地を細胞の除去速度により規定される速度で新しく補充し；該細胞および該ウイルス粒子を含む該培地を継続的にまたは断続的に除去し；１日あたり、該細胞および該ウイルス粒子を含む該培地の約20％〜約80％を除去し、さらに好ましくは１日あたり該増殖培地の約20％〜約50％を採取し；該ウイルス粒子はレトロウイルス粒子であり、さらに好ましくはレトロウイルス粒子はHTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2またはgp 120および/または160タンパク質が涸渇したHIVであり、さらに好ましくは該レトロウイルス粒子はHIV-1であり；該増殖培地は無血清培地であり；および/または該細胞はHIV-1に慢性的に感染したヒトＴ細胞リンパ腫である。本発明によるレトロウイルス粒子を単離するための好ましい局面は以下の通りである：上記レトロウイルス粒子がHTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2またはgp 120および /または160タンパク質が涸渇したHIVであり、さらに好ましくは該レトロウイルス粒子はgp 120タンパク質またはgp160タンパク質が涸渇したHIVであり；上記溶出を約0.6Ｍ〜約２Ｍ NaClを用いて行い、そしてさらに好ましくは該溶出を約１Ｍ NaClを用いて行い；陰イオン交換樹脂がテンタクル陰イオン交換樹脂であり；精製が、さらに接触工程後かつ溶出工程前に約0.1〜約0.55Ｍ NaClで該樹脂を洗浄する工程を包含する。本発明により使用可能な灌流バイオリアクターシステムは、バイオリアクター中に細胞およびウイルス粒子の保持を可能にし、バイオリアクター内および外への増殖培地の継続的な灌流を維持し、そして細胞およびウイルス粒子を含む増殖培地の採取（除去）および増殖培地の新たな補充（採取した増殖培地と新たな増殖培地の交換）を容易にするように配置される。これらのバイオリアクターは、バイオリアクターに関する内部および/または外部の灌流のために設計され得る。本発明に従って使用されるバイオリアクターシステムを図２に示す。図２の灌流バイオリアクターシステムは、配管モジュールを有する外部の中空繊維灌流フィルターを使用する。この配管モジュールは、老廃物を含む増殖培地が浸透側から回収される一方で、フィルターメンブレンの保持側(retentate sid e)からリアクターへ細胞を再循環させる。フィルターのポアサイズは、バイオリアクター内に完全またはほぼ完全にウイルス粒子を保持するように選択し、例えレベルセンサーの制御下で、供給ポンプは新鮮培地を補給してリアクター内の一定の容量を維持する。バイオリアクター中の液体表面下に達する傾斜チューブを通じて細胞を無菌的に採取する。このシステムは高密度培養にかなっており、ここでは高い生存能と増殖速度を有する細胞を維持し、そしてバイオリアクターにおける破片を最小化することが重要である。細胞増殖速度および生存能が顕著に低下する前に、細胞系の最適な細胞密度を支える灌流速度で作動するようにバイオリアクターを調整する。さらに、最適な細胞密度、増殖速度、および生存能を維持するために、増殖培地は、細胞密度が最大密度を超過しないようなレベルに細胞密度を「カット-バック」しなければならない。細胞は定常状態増殖に到達する前に採取されるべきであり、そして細胞は実質的に安定した状態の対数期増殖を示すべきである。採取は継続的または断続的であり得る。採取されるべき増殖培地の容量のパーセントは、細胞系の増殖速度(μ)にほぼ等しく、この増殖速度は[In(最終細胞密度/開始細胞密度)]/( 最終時間−開始時間)×100に等しい。例えば、細胞密度が24時間ごとに30％増加する場合、１日あたりリアクター容量の30％が採取されなければならない。毎日の採取として、１日あたり増殖培地の約20％〜約80％を採取し、さらに好ましくは１日あたり増殖培地の約20％〜約50％を採取する。この採取はまた、死細胞が溶解する前に、それらを除去することによりバイオリアクター中の破片を減少させる。さらに、増殖細胞の毎日の採取は１つの濃縮された生産の流れにおけるウイルス粒子の除去を提供する。本発明により使用される灌流フィルターは、細胞系およびウイルス粒子の両方を保持し、そして灌流を維持する分子量のカットオフを支持するポアサイズを有する。分子量カットオフの決定は保持しようとするウイルス粒子のサイズによって決定される。本発明によるHIV粒子生産については、0.1μポアを有するSeprac or，Inc.のType A中空繊維フィルターおよび500,000ダルトンの分子量カットオフを有するA/G Technology，Inc.の中空繊維限外濾過フィルターが、細胞系およびウイルス粒子の両方を保持し、そして詰まりが灌流速度に影響を与えるまで、平均５〜10日の間十分な灌流の流速を維持する。１つのフィルターを有する代わりに、連続的に使用される多種の灌流フィルターが継続的なウイルス生産工程の間、灌流を支える。例えば、多種の５つの灌流フィルターにより約５週間の継続的なバイオリアクター工程が支持される。灌流フィルターコンポーネントはまた、フィルターの自動的再生(例えば、水酸化ナトリウム水溶液のような塩基性溶液での灌流フィルターのインサイチュの無菌洗浄による)を提供する方法により使用できる。詰まりが始まることによりフィルターの膜透過圧がある設定点に到達する場合、コントローラーが細胞系およびウイルス粒子を含む増殖培地のフィルターを通した再循環を中止し、フィルターをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でパージして細胞を除去し、フィルターを塩基性溶液で洗浄し、そしてフィルターを使用に戻す前にPBSで洗い流す。この再生工程により、継続的な最大灌流速度である１日あたり約４リアクター容量で高細胞密度のバイオリアクターでの約３ヶ月間のフィルターの操作を提供する。このレベルの自動化は、操作者の決定および操作を減少させ、そして中空繊維の使用に伴うコストをも減少させる。Trio透明化システム(Sepracor，Inc.)がこのフィルター再生工程のために改変される。バイオリアクターのための接種物を公知の組織培養方法に従って調整した。例えば、細胞系を、RPMI 1640/10％ウシ胎児血清のような細胞系の増殖を支え得る増殖培地を含むT75組織培養フラスコに置き増殖を開始する。続いて、培養をローラーボトルにまで拡大させバイオリアクター中に少なくとも約２×10⁵細胞/mL を提供する。増殖期を約５日〜約10日へと最小化するためには、より高い播種密度が好ましい。HIV感染細胞系を用いるバイオリアクターの接種後、細胞密度が約１×10⁶細胞/mLに達すると、灌流を約１リアクター容量/日で開始させる。約２×10⁶細胞/mLで、灌流を約２リアクター容量/日に増加し、そして約４×10⁶細胞/mLで、灌流を最大速度である４容量/日に増加する。４リアクター容量/日は８×10⁶細胞/mLを超える最大密度を支持する。細胞およびウイルス粒子を含むバイオリアクター採取物は公知の方法に従って単離され得る。レトロウイルス粒子はまた、本発明に従って単離される。最初に、レトロウイルス粒子を通過させ、そして細胞および他の破片を保持する約0.5μ〜約1.7μ、好ましくは約0.7μ〜約1.5μ、さらに好ましくは約1.2μのポアサイズを有するフィルターを用いて細胞およびレトロウイルス粒子を含むバイオリアクター採取物を透明化する。透明化した採取物である感染性レトロウイルス粒子をプールし、そして充分に混合して等質性を確認する。次いで、感染性レトロウイルス粒子を、継続撹拌しながらβ-プロピオラクトン(BPL)(約0.25mL BPL/L上清)を添加し、続いてこの混合物を約２℃〜約８℃、好ましくは約４℃〜約６℃で約18時間〜約24時間インキュベートすることにより不活性化に供する。次いで、このプールを37℃に上昇させ、約２時間〜約５時間、好ましくは約３時間〜約４時間この温度に保って残留BPLを加水分解する。この工程は、脂質、タンパク質、核酸などのような種々の構造成分をアルキル化することによりウイルスの感染力を化学的に低下させる役割を果たす。BPL不活性化は決定的な不活性工程とは考えられず、BPLだけで処理されたレトロウイルス粒子は依然感染性であると考えるべきであり、そしてそれ相応に扱うべきである。次いで、BPLで処理したレトロウイルス粒子を含む溶液を、ポリスルホン300,0 00MWカットオフメンブレンを用いるタンゼンシャル(tangential)フロー限外濾過により約10倍〜約20倍に濃縮する。次いで、濃縮物を約５容量〜約10容量のPBS に対してpH約７〜pH約８で、好ましくはpH約7.5でダイアフィルトレーションにかけて続く陰イオン交換クロマトグラフィー工程のために必要なバッファー条件を提供し、そしてこのクロマトグラフィー工程中の結合能力を増加させる。この工程はレトロウイルス粒子を保持しながら浸透において90％を超えるアルブミンを除去する役割を果たす。ダイアフィルトレーションにかけたレトロウイルス粒子を含む溶液を、TMAE F 上のカラムを通過させる。テンタクル陰イオン交換樹脂が好ましい。なぜなら、陰イオン粒子と結合するための樹脂の部位がウイルスサイズの粒子に対して最も高い結合能を有し、従って非テンタクル陰イオン交換樹脂に比較して最も高い倍率の精製を得るからである。陰イオン交換樹脂の高い流速により、複数の超遠心分離機の使用を必要とする等密度沈降に比較して１ユニットの操作における大きなロットサイズの迅速な精製を容易にする。カラムの交換時間が速いため、保管場所に備品を戻すことが可能になり、限外濾過手順を包含する他の操作が可能なスペースができる。重要なことは、殺菌、混入物の除去、およびエンドトキシンの不活性化のために、強固に結合した生物学的な物質をカラムから除去するために用いられるNaOHに対する安定性を対象に樹脂を選択することである。陰イオン交換樹脂はまた、精製を受けるウイルス粒子の構造全体を保存しながら混入物の除去を容易にすべきである。DNAおよびエンドトキシンのような陰イオン性混入物は、ウイルス粒子と共に濃縮されるが、しかしこれらの特定の混入物は樹脂と強く結合し、約1.0ＭのNaClのような高塩濃度によるウイルス粒子の選択的な溶出を可能にする。各陰イオン交換クロマトグラフィー工程により、２つの工程についての陰イオン性混入物の累積的な減少について、少なくとも２桁または４桁の減少を達成する。溶出したウイルス粒子のサイズ排除HPLC、ウエスタンブロットおよびSDS-PAGE分析もまた、少なくとも約24時間は溶出したウイルス粒子の検出可能な構造変化を示さない。数日間の溶出緩衝液中の溶出ウイルス粒子を保存すると検出可能な構造変化を生じる。従って、解離現象を防ぎ、そして構造成分の整合性(consistency)を維持するために直ちに希釈することが、産物が不完全フロイントアジュバント中で乳化される場合、特に免疫原性プロフィールの維持のために提案される。レトロウイルス粒子を含むダイアフィルトレート溶液を、テンタクル陰イオンて、pH約６〜約7.5、好ましくはpH約6.2〜6.8、より好ましくはpH約6.5で、約0. 1〜0.55M NaCl、好ましくは0.3〜0.5M NaCl、より好ましくは0.5M NaClを用いて洗浄し、そしてpH約６〜7.5で、好ましくはpH約6.2〜約6.8で、より好ましくはp H約6.5で約0.6〜２M NaCl、好ましくは約0.8〜約1.4M NaCl、より好ましくは約１M NaClのより高いNaCl濃度を使用して溶出する。カラムを約0.7〜約1.3M NaOH 、好ましくは約１M NaOHで殺菌し得る。レトロウイルス粒子（特に、HIV）を含有する溶出溶液を、約４倍〜約８倍、好ましくは約６倍に十分に希釈して塩濃度を、pH約6.2〜約7.7、好ましくはpH約 6.6〜約7.5で、約0.05M〜約0.25M、好ましくは約0.1M〜約0.2M NaClの範囲内に減少させ、長期間の間（例えば、18時間より長く）、溶出の高NaCl濃度下に曝露された場合、HIV-1粒子の部分的な分解を防止する。この第一のカラムは、全タンパク質の比率に対して約40倍の精製を達成するプロセスにおいて最も重要で効率的な精製工程である。SDS-PAGE分析により、培地成分の大部分がカラム素通り中に存在し、さらに混入物がNaCl洗浄液の洗浄により除去され、そしてHIV粒子について、HIV-1参照標準と比較した認識可能なタンパク質パターンが、溶出画分から決定できることが示される。希釈および混合して均質性を確認した後、レトロウイルス粒子の溶液を第二のするクロマトグラフィーを樹脂を約0.3M〜約0.8M NaCl、より好ましくは約0.6M NaClで洗浄し、そしてウイルス粒子を第一の樹脂の適用において記載したように溶出液を使用して溶出する。第二の陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて、約１Ｍのウイルス粒子溶出画分をポリスルホン300,000MWカットオフメンブレンを含む限外濾過プレートおよびフレームシステムを用いて５倍濃縮する。次いで、濃縮物を生理食塩水に対して透析して、塩濃度を等張強度に減少させ、そして製品製剤の調製物中のリン酸レベルを減少させる。精製産物を-70℃で凍結し、そして約24時間のコバルト照射（約２〜約4.5メガラド）に供する。この手順は、核をPCR分析により測定されるように約200塩基対の断片に剪断することによる最終的な不活性化工程として作用する。産物を注射のために0.9%生理食塩水で必要とされる濃度の抗原（p24濃度）に達するように希釈して処方し、そして振とうデバイスを用いて、約１時間、等容量の不完全フロイントアジュバントと無菌的に混合する。（無菌量として今回用意された）最終物質（大量の免疫原）は、粘性の灰白色の乳濁液のような外観である。本発明はさらに例証されるが、本発明に従うプロセスを例示する以下の実施例により制限されない。ウイルスの粒子の生成に使用する宿主細胞株は、IPL-1と称されるＴリンパ腫で慢性的に感染される。このために、無血清増殖培地(IMAT)を、優れたウイルスの産生を維持し、そして10%ウシ胎児血清（FBS）において培養された細胞に匹敵する増殖速度を維持するように改良する。IMATは、以下のリスト：に由来する成分を４g/Lのグルコースおよび0.3g/LのL-グルタミンを含有するRPM I 1640に添加することにより形成される。無血清培地のタンパク質含量の減少は、下流のプロセシングの効率を補助する。 Manufacturer's Working Cell Bank（MWCB）由来の細胞を、Ｔフラスコ中で増殖後、スピナーまたはローラーボトル（T25→T75→T150→850cm²ローラーボトルへと進行する）中で増殖させ、バイオリアクターのための接種物を提供する。２ ×10⁵細胞/mLの最少密度で播種の際は、細胞は65％よりも高い生存率で指数関数的に増殖する。これらの必要条件は、バイオリアクター中の遅滞期（lag phase ）を、最初の播種後５日以内に最小化するために必要である。細胞が増殖し始め、播種後24時間で５×10⁵〜９×10⁵に密度が達成される場合、新鮮な培地の連続的な供給を提供し、そして使用済みの培地を連続的に除去する。培地交換の速度は約0.5リアクター容量／日で開始し、細胞密度が約２×10⁶〜約４×10⁶細胞/mL に達する場合、４リアクター容量／日に増加させる。この連続的な灌流の状態において、約８×10⁶個の細胞密度が達成される。これは連続的な栄養物の送達、および老廃物の除去の結果である。それゆえ、灌流は、代表的にスピナーにおいて得られる毎日の平均細胞密度（ここでは細胞がバッチモードで増殖される）よりも約10倍〜約20倍高い細胞密度を達成する。連続的な灌流を維持しながら細胞の保持を可能にするリアクターの構成を図２に表す。原理は、使用済み培地を浸透側から回収しながら、フィルターメンブレンの保持側（retentate side）からリアクターへ細胞を再循環する配管モジュールを有する外部の中空繊維濾過デバイスを含む。老廃物を除去するために中空繊維フィルターを0.1ミクロンポアサイズて使用すると、ほとんど完全にウイルス粒子をバイオリアクター中に維持する。したがって、毎日の採取において細胞とともにウイルス粒子を除去することを容易にする。フィードポンプはレベルセンサーの制御下で一定の容量を維持して新鮮な培地を供給する。本発明者らはIPLI B MWCBについて４リアクター容量／日の灌流速度が、約６×10⁷〜約８×10⁷細胞 /mLの密度を支持するとしている。この時点で細胞増殖は定常期に近づく。この条件の結果、培養物の生存率および／または増殖速度の減少を生じる。最適な増殖速度で細胞を維持するために、リアクター液の毎日の採取が、「カット-バック」密度（例えば、約３×10⁶〜約６×10⁶細胞／mL）で要求され、この密度は採取リアクター容量／日のおよそ３分の１に等しい。このことはまた、高い生存率を維持し、そして死細胞の除去により細胞破片を減少する。最も重要なことに、リアクターの内側からの毎日の採取容量がウイルス粒子の除去を可能にする。毎日の採取からのウイルス粒子の回収および精製における最初の工程は、精密濾過（micro-filtration）手順を用いる細胞および細胞破片の除去を必要とする。このことは、約0.65ミクロン〜0.8ミクロンの範囲のポアサイズを有するメンブレンを利用するデットエンド（dead-end）濾過のデバイスの使用を包含する。この手順はウイルス粒子から細胞および細胞破片を分離する役割を果たす。この手順は代表的に、分類された採取物にβプロピオラクトン（BPL）を１リットルの上清あたり最終濃度0.25mL BPLで添加した後、４℃で18〜24時間インキュベーションし、次いで37℃で５時間インキュベートしてBPLを不活性化する工程を包含する。続いてこのプールを、さらなるプロセスを行うまで、４℃で０〜６日間保持する。この不活性化工程は、ウイルスの種々の構造組成（例えば、脂質、タンパク質、核酸など）をアルキル化することによりウイルス粒子の感染力を化学的に減少する役割を果たす。本発明者らはこのBPL不活性化工程は、最終的なウイルスの不活性化ではないことを指摘し、そして本物質はさらに感染性であると思われ、ならびにそのように処理される。 BPLで処置される物質は、周囲温度に達することが可能であり、そして300,000 MWカットオフメンブレンを用いるタンゼンシャルフロー限外濾過により10倍〜20 倍濃縮される。次いで、濃縮プールを５〜10容量のリン酸緩衝化生理食塩水（PB S）pH7.5に対して透析する。この工程で使用されるメンブレンのポアサイズは、増殖培地から90%より多くのヒト血清アルブミンおよび他のタンパク質、ならびに浸透における他の比較的小さな分子を除去しながら、HIV粒子を保持する役割を果たす。濃縮され透析された物質のpHを、pH7.5に合わせ、そして50cm／時間の直線フ３〜５のカラム容量の0.5M NaCl pH6.5で洗浄する。次いで、結合産物を1.0M Na Cl pH6.5を用いて溶出し、そして280nMで吸収する全ピークを回収する。続いてカラムを、1.0N NaOHで１〜２カラム容量の洗浄をした後、殺菌する。1.0M NaCl 溶出画分に含まれる産物を６倍希釈し、0.1M〜0.2M NaClの塩濃度およびpH6.5〜ー速度で適用する。カラムを３〜５カラム容量の0.6M NaCl pH6.5で洗浄する。結合産物を再び、1.0M NaCl緩衝液で溶出する。カットオフメンブレンを含む限外濾過プレートおよびフレームデバイス用いて約５倍濃縮する。次いで、濃縮物をPBS p7.5に対して透析して塩濃度を減少させる。濃縮後のデットスペース中の産物の損失を最小化するために、器具に１デットスペース容量の生理食塩水（0.9% NaCl）を流し込み、そして洗浄物を透析画分に添加する。物質を-70℃に凍結し、そしてコバルト照射（２〜4.5メガラド、約 24時間）に供する。これは最終的なウイルス不活性化工程として働く。この段階で前もって処方された産物を注射のために0.9%生理食塩水で、必要とされる濃度の抗原（p24濃度）に達するように希釈し、そして振盪デバイスを用いて、約15分〜20分間、等容量の不完全フロイントアジュバントと無菌的に混合する。本研究は、多くの整合性（consistency）濃度を制御するための新規の参照標準を確立するために、および「古典的プロセス」により調製される物質との同等性を示すために、必要不可欠である本発明に従って調製されるgp120の減少されるHIV-1の特徴づけを包含する。特徴づけのデータは、公知のHPLC手順（図３）、ウェスタンブロット手順（図４）およびSDS-PAGE手順（図５）を用いることによるバッチ培養／スクロース勾配方法論によって調製される物質に対する産物同等性、バイオリアクター工程のウエスタンブロット（図４）の開始時にまたは終了時から出発物質が単離されるかどうかの産物整合性、そして異なるバイオリアクター工程のHPLC間の産物整合性（図３）を示す。代表的なバイオリアクター工程の実施（図６）は、増殖期が６日目まで続き、６日目に生産期が毎日の細胞採取を始めることにより開始されたことを示す。生産期は48日間続いた。図６はバイオリアクターが、３つの異なる安定状態の細胞密度で採取容量を制御することにより維持されたことを示す。この工程（図６）において安定状態の細胞密度が、約3.5×10⁶細胞/mLで10日間〜24日間維持され；約６×10⁶細胞/mLで28日間〜43日間維持され；および約７×10⁶で46日間〜51 日間維持される。生産性（p24濃度）の測定は各定常状態期間についての平均細胞密度の関数として示される。明らかに、高い細胞密度の上昇がp24を生じる。さらに、より速い増殖速度が、これがより大きな採取容量を安定状態の細胞密度を維持するために必要であるので望ましい。産物が毎日の細胞の採取から回収されるので、このことは毎日のウイルス粒子のより高い生産と解釈される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ミッチェレン，ジョナサンジェイ. アメリカ合衆国ペンシルバニア 18074, パーキオメンビル，ヒルデブランドロード 652 (72)発明者アイリッシュ，トーマスダブリュー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19464, ポッツタウン，ディアーリッジドライブ 2136 (72)発明者ウェーバー，デイビッドエム. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19460, フェニックスビル，サウスメインストリート 308 (72)発明者ゴーア，リチャードエス. アメリカ合衆国ペンシルバニア 18966, サウザンプトン，クッシュモアロード 1388 (72)発明者ハーター，ジェイムズジェイ. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19063, メディア，ウエストバルチモアパイク 1016，アパートメントシー−11 (72)発明者ベイ，ピエレエム. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19130, フィラデルフィア，バトンウッドストリート 1801，アパートメント 1718 (72)発明者タル，ジョージシー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19403, ノーリスタウン，エジプトロード 87

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルス粒子を生産する連続プロセスであって、灌流増殖培地においてウイルス感染された生存可能な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および該細胞を含有する培地を該灌流増殖培地中に残存する細胞の定常状態の対数期増殖を維持する速度で取り出す工程を包含する、プロセス。２．前記取り出された培地中に存在するウイルス粒子が前記細胞から分離される、請求項１に記載のプロセス。３．前記細胞および前記ウイルス粒子を含む前記培地が、該細胞が定常状態の増殖に到達する前に取り出される、請求項１に記載のプロセス。４．前記増殖培地が、前記細胞を取り出す速度により定義される速度で補充される、請求項１に記載のプロセス。５．前記細胞および前記ウイルス粒子を含有する前記培地が、連続的にまたは断続的に取り出される、請求項１に記載のプロセス。６．前記細胞および前記ウイルス粒子を含有する前記培地の約20％〜約80％が１日あたりに取り出される、請求項１に記載のプロセス。７．前記細胞および前記ウイルス粒子を含有する前記培地の約20％〜約50％が１日あたりに取り出される、請求項６に記載のプロセス。８．前記ウイルス粒子がレトロウイルス粒子である、請求項１に記載のプロセス。９．前記レトロウイルス粒子が、HTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2、またはgp120 タンパク質および／またはgp160タンパク質の欠損したHIVである、請求項８に記載のプロセス。１０．前記レトロウイルス粒子がHIV-1である、請求項９に記載のプロセス。１１．前記増殖培地が無血清培地である、請求項１に記載のプロセス。１２．前記細胞がHIV-1に慢性的に感染しているヒトＴ細胞リンパ腫である、請求項１に記載のプロセス。１３．レトロウイルス粒子を精製するためのプロセスであって、該レトロウイルス粒子および不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂と接触させる工程、および該レトロウイルス粒子を該樹脂から溶出させる工程を包含する、プロセス。１４．前記レトロウイルス粒子が、HTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2、またはgp12 0タンパク質および／またはgp160タンパク質の欠損したHIVである、請求項１３に記載のプロセス。１５．前記レトロウイルス粒子がgp120タンパク質またはgp160タンパク質の欠損したHIVである、請求項１４に記載のプロセス。１６．前記溶出工程が、約0.6M〜約２M NaClで行われる、請求項１３に記載のプロセス。１７．前記溶出工程が、約１M NaClで行われる、請求項１６に記載のプロセス。１８．前記陰イオン交換樹脂がテンタクル陰イオン交換樹脂である、請求項１３に記載のプロセス。に記載のプロセス。２０．前記精製工程が、前記接触工程後および前記溶出工程前に約0.1M〜約0.55 M NaClで前記樹脂を洗浄する工程をさらに包含する、請求項１３に記載のプロセス。