JPH10500286A - ウイルス粒子の効率の高い生産および単離 - Google Patents

ウイルス粒子の効率の高い生産および単離

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルス粒子を生産するための連続プロセスに関し、灌流増殖培地においてウイルス感染された生存可能な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および上記細胞を含有する培地を、上記灌流増殖培地中に残存する細胞の定常状態の対数期増殖を維持する速度で取り出す工程を包含する。本発明はまた、レトロウイルス粒子を精製するプロセスに関し、レトロウイルス粒子および不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂に通す工程、およびレトロウイルス粒子を樹脂から溶出する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス粒子の効率の高い生産および単離 発明の分野 本発明は、灌流バイオリアクターシステムを使用して非溶菌細胞からウイルス 粒子を生産するプロセスに関し、このウイルス粒子は免疫原および/またはワク チンとして有用である。本発明はまた、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用 してレトロウイルス粒子を単離するプロセスに関する。報告されている開発 非溶菌細胞から大量のウイルス粒子を生産するための古典的な研究室手順は、 主に多段階のバッチ培養の拡張およびプールを包含する。スケールアップ法は、 考慮すべき安全尺度、および労賃、(特に、感染性の高いウイルスの生産を伴う 場合)政府の生物学的危険封じ込めの基準を満たすための装置および老廃物の処 理を必要とするという問題がある。さらに、ウイルスワクチンの生産は、一般に 感染細胞を低密度で培養する工程を包含する。これはレトロウイルスHIV-1(レ ンチウイルス)(lentiviridae)のような低生産システムのためであり、比較的低 いウイルス力価を生じる。 HIV感染の流行の現状は、HIVおよび他のレトロウイルス粒子由来の多数の抗原 を構築するために、HIVおよび他のレトロウイルス粒子を調製する多大な努力を 導いた。Jonas SalkおよびDennis J.CarloのPCT国際公開番号第WO 88/09670号は 、非感染性で不活性なHIV免疫原(本明細書では以後ソーク型免疫原という)の 調製に関しており、このHIV免疫原は、エンベロープ糖タンパク質gp160またはgp 120を欠損している。これらの免疫原およびHIVワクチン(HIV-1およびHIV-2の両 方を含む)を調製するための通常の方法は、HIV感染細胞の多段階のバッチ培養 、ならびに不活性化、濾過、および超遠心(ショ糖勾配における等密度遠心)工 程を使用するHIV粒子の単離(本明細書では以後「古典的プロセス」という)を 包含し、この方法は、図1に示されている。後者の技術は特に容量に限界があり 、 労働集中的であり、そしてスケールアップのために高価な設備投資が必要である 。この方法はまた、細胞培養懸濁液1リットルあたり約100μg/mLの総タンパク 質含有量またはp24に基づくELISAにより8〜10μg/mLを有する約10用量のソーク 型免疫原を生産するのみである。従って、投与形態を導くプロセッシングは、ヒ トへの投与に適切な極めて高い程度の純度を有するワクチンを達成する必要性は 言うまでもなく、その低い収量および感染液の多段階単位の操作を扱う必要のた めに、工業的生産に役立たない。それゆえ、より安全で、より労働集中的でなく 、そして高い分離性を伴うよりコスト効率の良いスケールアッププロセスが、ウ イルス粒子の生産、そしてより詳細には、スケールアップ生産のために必要とさ れている。 灌流バイオリアクターシステムは、高細胞密度およびそれらの分泌生体分子を 生産するための従来の多段階のバッチ培養の代替方法として記載されている。W. R.Tolbertら,「生産のための灌流培養システム」,97頁,Large-Scale Mammali an Cell Culture,J.FederおよびW.R.Tolbert編,Academic Press,Inc.(1985) は、灌流バイオリアクターシステムを使用して灌流中に代謝老廃物を除去しなが ら、そして回収流中に部分的に細胞を回収しながら高細胞密度を生成することを 開示している。W.R.Tolbertらはまた、灌流中に分泌生体分子および代謝老廃物 を同時に取り出しながら灌流バイオリアクターシステムを使用して高細胞密度を 生成し、および維持することを開示している。G.Schmidら,J.Biotech.,22,31 (1992)は、ハイブリドーマ懸濁培養を部分的に保持する、または保持しない灌流 バイオリアクターシステムの使用がほとんど同一の抗体濃度および特異的な生産 性を生み出すが、生存細胞数の増加および2.5の要素による時空収量の増加をも たらすことを開示している。M.Kloppingerら、「バッチ培養および灌流培養にお けるハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリーによるプロセス調整」,125頁 ,Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses,R.E.S pierら編,Butterworth & Co.Ltd.(1989)は、灌流バイオリアクターが、バッチ 培養と比較して6倍高いIgGの生産を有する無細胞含有培地中のIgGを灌流するこ とを開示している。M.Tokashikiら、「高分子量成分を再利用するハイブリドー マの高密度培養」,355頁,Advances in Animal Cell Biology and Technolog y for Bioprocesses,R.E.Spierら編,Butterworth & Co.Ltd.(1989)は、灌流 バイオリアクターシステムを使用して、代謝老廃物を含む低分子量の基質を培養 培地から灌流しながらハイブリドーマにより生産された高分子量成分を同時に維 持するハイブリドーマの高密度培養を生成することを開示している。しかし、こ れらの参考文献はいずれも、ウイルス粒子の生産のために灌流バイオリアクター を使用することを開示または示唆していない。 バイオリアクターシステムにおけるウイルス粒子の生産は、以下の参考文献に 記載されている。L.Fabryら、「ウイルスワクチン生産のための高密度マイクロ キャリアー細胞培養」,361頁,Advances in Animal Cell Biology and Technol ogy for Bioprocesses,R.E.Spierら編,Butterworth & Co.Ltd.(1989)は、同 時に代謝老廃物の灌流をしながら、密集に達するまで足場依存性細胞株を増殖す るために灌流バイオリアクターを使用し、その後、細胞株をポリオウイルス世代 で感染させることを開示している。L.Fabryらはまた、ウイルス複製の速度論お よび灌流バイオリアクターについてのウイルス粒子生産の比速度が、従来の培養 で調製されたものと類似することを開示している。L.Fabryらは、同時にウイル ス粒子の生産を有する細胞システムの増殖のために、灌流バイオリアクターを使 用することを開示または示唆していない。J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffiths,Cyt otechnology,4,145(1990)は、HIVのバッチ様式の生産のために懸濁培養を使用 する2つのバイオリアクターシステムの操作を開示している。J.B.Clarkeおよび J.B.Griffithsはまた、固定化ベッドバイオリアクターシステムの操作を開示し ており、ここではキャリア中に保持されているHIV生産細胞は、増殖培地中に懸 濁され、そこから取り出され、そして新鮮な増殖培地に再懸濁される。しかし、 J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffithsは、増殖培地がバイオリアクターから灌流され 、細胞およびウイルスを含む増殖培地がバイオリアクターから回収され、そして 新鮮な増殖培地がバイオリアクターに添加される条件下で、増殖培地およびウイ ルス感染された非溶菌細胞を含む灌流バイオリアクターにおいてウイルス粒子を 生産することを開示していない。 細胞培養からのウイルス粒子の生産に続いて、ウイルス粒子、特にレトロウイ ルス粒子を単離するためのプロセスは、問題をはらんでいる。従来の多段階のバ ッチ培養では低いウイルス力価を有する大量の溶液を生産する。大量の溶液にお いてこれらの低ウイルス力価を扱うことは、老廃物処理の重大な問題である。さ らに、これらの溶液は所望のウイルス粒子から大量の細胞破片、代謝老廃物、お よび増殖培地要素を除去するために高純度に精製されなければならない。さらに 、培養培地は代表的には、高い割合のウシ胎児血清を増殖因子として含有し、こ の培養培地は単離プロセスを不利に要求する成分の複雑な混合物である。HIVレ トロウイルスの単離は、特に問題である。なぜなら、ウイルスは高価で血清含量 の高い培地中に低い力価で生産され、およびその単離は処理量が高度に制限され ており、そして労働集中的である多段階の超遠心工程を必要とするからである。 従って、高い人力の必要、大量の精製物質、高度な維持装置の使用、および高価 なBSL3施設におけるかなりの床面積を、レトロウイルス粒子の単離のために必要 とする。さらに、レトロウイルス粒子が生産される増殖培地中の外来基質を制御 する必要がある。従って、レトロウイルス粒子を単離するための代替となるコス ト効率の良い、そしてスケールアップが可能な方法が必要である。 多数の参考文献が、個々のウイルスタンパク質を単離するための方法を開示し ている。国際公開第WO9113906号は、非融合組換えHIVウイルスタンパク質gp120 をイオン交換クロマトグラフィーで分画し、そしてCD4特異的結合親和性を示す 画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー により精製することを開示している。米国特許第4,531,311号は、組換えHIV逆転 写酵素タンパク質を、混入する細胞性タンパク質から陽イオン交換樹脂を使用す ることにより分離することを開示している。日本国特許第61051571号は、ブタヘ ルペスウイルス抗原をイオン交換樹脂に対するその抗原の吸着、その後の緩衝液 を使用するこの抗原の選択的溶出により精製することを開示している。C.M.Nali nら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87 (19)7593(1990)およびC.M.Nalinら,J.Ce ll Biochem.Suppl.14D,108(1990)は、組換えHIV Revタンパク質のイオン交換 クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を開示してい る。J.Rittenhouseら,Biochem.Biophys.Res.Commun.171 (1)60(1990)は、組 換えHIV-1およびHIV-2プロテアーゼを、Mono Sにおけるイオン交換クロマトグラ フィー、その後のペプスタチンアガロースクロマトグラフィーにより精製する ことを開示している。A.Billichら,Biol.Chem.Hoppe-Seyler371 (3)265(1990) は、組換えHIV-1プロテアーゼを、予めSuperose Rにおけるゲル濾過クロマトグ ラフィーおよび限外濾過を行ってから、Mono Sにおける陽イオン交換クロマトグ ラフィーにより精製することを開示している。J.K.K.Liら,J.Cell Biochem.Su ppl.11C,181(1987)は、マウス乳房腫瘍ウイルス、B型ウイルスの勾配精製、 その後のウイルスの破壊、および一連のアフィニティークロマトグラフィーおよ びイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるウイルス構造ポリペプチドの分 離を開示している。J.E.Newmanら,Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.86 Meet .,329 T-43(1986)は、HTLV-3構造タンパク質をレンズマメレクチンアフィニテ ィー樹脂に通し、その後HPLCイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過工程 を使用してさらに精製することにより単離することを開示している。しかし、こ れらの参考文献は、レトロウイルス粒子、より詳細にはHIV粒子が陰イオン交換 クロマトグラフィーにより精製され得ることを開示または示唆していない。 いくつかの参考文献はウイルス粒子の精製のためのイオン交換クロマトグラフ ィーの適用を開示している。欧州特許第0302,692号は、陰イオン交換クロマトグ ラフィーでDNAを除去することによりA型肝炎ウイルス(HAV)を精製することを開 示している。日本国公開番号第2195877号は、レトロウイルスまたはその成分を セルロース硫酸ゲルまたは架橋した多糖硫酸ゲル(陽イオン性吸着剤)と接触さ せ、続いてそこから溶出することにより精製することを開示している。欧州特許 第0459,842号は、レトロウイルス粒子を精製するために陽イオン交換クロマトグ ラフィー工程を使用することを開示している。しかし、これらの参考文献は、レ トロウイルス粒子、より詳細にはHIV粒子が、粒子を樹脂に結合させることによ り陰イオン交換クロマトグラフィーで精製され得ることを開示または示唆してい ない。 発明の要旨 本発明は、ウイルス粒子を生産する連続プロセスに関し、灌流増殖培地におい てウイルス感染された生存可能な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および上記 細胞を含有する培地を上記灌流増殖培地中に残存する細胞の定常状態の対数期増 殖を維持する速度で取り出す工程を包含する。 本発明はまた、レトロウイルス粒子を精製するプロセスに関し、レトロウイル ス粒子および不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂に通す工程、およびレトロウ イルス粒子を樹脂から溶出する工程を包含する。 図面の簡単な説明 図1は、多段階のバッチ培養システムを使用する上流の生産成分および不活化 工程、濾過工程、および限外濾過工程を使用する下流の単離成分を有する「古典 的プロセス」によりHIV粒子を得るための図である。 図2は、灌流バイオリアクターシステムを使用する上流の生産成分および不活 化工程、濾過工程、および陰イオン交換クロマトグラフィー工程を使用する下流 の単離成分を有するプロセスによりHIV粒子を得るための図である。 ロマトグラフを示す:「古典的プロセス」の多段階のバッチ培養システムにより 調製されたHIV-1粒子の参考標準ロット(クロマトグラフA);「古典的な」多 段階のバッチ培養システムにより調製されたHIV-1粒子のロット(クロマトグラ フB);そして灌流バイオリアクターシステムにより調製されたHIV-1粒子の2 つのロット(クロマトグラフCおよびD)。それぞれのクロマトグラフは、6M グアニジン-HCl(Gu-HCl)および10mMジチオトレイトール(DTT)中で15分間、80℃ で加熱することにより変性させた約100μgの産物である。溶出パターンは、任意 の吸光単位(AU)に対して測定した1mL/分の流速でのアセトニトリル勾配を使用 することにより得られた。 図4は、ウェスタンブロットであり、0.1、0.25、0.5、および1μg/mMの濃度 のHIV-1粒子のロットの抗原染色プロフィールを示す(HIV感染患者から単離した Human New York抗血清を使用する)。HIV-1粒子は、灌流バイオリアクターシス テムにより調製し、そして不活化工程、濾過工程、および陰イオン交換クロマト グラフィー工程(それぞれレーン2〜5)を使用して単離した。そして濃度1μ g/mMのHIV-1粒子の参考標準ロットについての染色プロフィールを低分子量マー カー(レーン1)に対して「古典的プロセス」により調製した(レーン6)。 図5は、SDS Pageであり、「古典的プロセス」により調製したHIV-1粒子の参 考標準ロットについての染色プロフィール(レーン7)、5週間操作された灌流 バイオリアクターシステムの最終回収物から単離されたHIV-1粒子の染色プロフ ィール(レーン6)、ならびに灌流バイオリアクターシステムの操作の第1週、 第2週、第3週、第4週、および第5週の間の回収物から単離されたHIV-1粒子 の染色プロフィール(それぞれレーン1〜5)、ならびに低分子量マーカーの染 色プロフィール(レーン8)を示す。 図6は、同時にHIV-1生産を伴うHIV感染細胞を増殖するための52日間の灌流バ イオリアクターの運転を示す。ここで、10日目〜24日目の間、28日目〜43日目の 間、および最後の46日目〜51日目の間、3つの定常状態条件が維持された。生産 性の尺度(p24濃度)が3相の定常状態(SS)条件についての平均細胞密度の関数 として示される。 発明の詳細な説明 先に使用したように、そして発明の説明を通して、以下の用語は、他に示さな い限り、以下の意味を有することが理解されるものとする:定義 「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物を包含する。 「ウイルス粒子」は、完全なビリオン(ウイルス)ならびに関連するウイルス粒 子を包含するが、個々のウイルスタンパク質は包含しない。細胞培養のためのウ イルス粒子の供給源はウイルスに感染した患者に由来し得るか、または感受性の 細胞系で繰り返し継代することにより実験室で増殖させたウイルスに由来し得る 。ウイルスの例としては、カプシド、コア粒子、1以上のエンベロープタンパク 質が涸渇したビリオン、核カプシドコアを伴わないビリオンエンベロープ、ビリ オンエンベロープフラグメント、および欠損ビリオンまたは不完全なビリオンが 挙けられる。好ましいウイルス粒子はレトロウイルス粒子である。 「レトロウイルス粒子」は、RNAをゲノム物質として有するウイルスを意味し 、HIV-1およびHIV-2のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)、gp 120および/または 16 0タンパク質が涸渇したHIV、HTLV-1、HTLV-2、AKRウイルスAKR-L#1、サル白血病 ウイルス、およびBLVを包含する。好ましいレトロウイルス粒子としては、HIV、 gp 120および/または160タンパク質が涸渇したHIV、HTLV-1およびHTLV-2が挙げ られ、さらに好ましくはHIV-1である。 「細胞系」は、T-リンパ腫、HUT-78、H9、HZ321、W/Fu線維芽細胞78A1株、SC- 1、ヒト単球、CEM細胞、およびMolt-4細胞を包含する。 「増殖培地」は、哺乳動物細胞系の増殖および生存を支える栄養混合物を含有 する溶液を意味する。増殖培地は血清またはタンパク質を含んでもよく、または 含まなくてもよい。 「テンタクル(tentacle)陰イオン交換樹脂」は、負に帯電した粒子と結合する 能力を有する樹脂の部分が、スペーサー部分の端部またはその近傍に位置する樹 脂を意味する。ここで、このスペーサーの端部は、スペーサー部分の樹脂の骨格 (backbone)構成部分への付着部位とは遠位にある。テンタクル陰イオン交換樹脂 ウイルス粒子を調製するためのプロセスにおける本発明による好ましい局面は 以下の通りである: 除去した培地中に存在するウイルス粒子を細胞から分離し; 該細胞を含む該培地および該ウイルス粒子を、該細胞が定常状態の増殖に達す るする前に除去し; 該増殖培地を細胞の除去速度により規定される速度で新しく補充し; 該細胞および該ウイルス粒子を含む該培地を継続的にまたは断続的に除去し; 1日あたり、該細胞および該ウイルス粒子を含む該培地の約20%〜約80%を除 去し、さらに好ましくは1日あたり該増殖培地の約20%〜約50%を採取し; 該ウイルス粒子はレトロウイルス粒子であり、さらに好ましくはレトロウイル ス粒子はHTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2またはgp 120および/または160タンパク 質が涸渇したHIVであり、さらに好ましくは該レトロウイルス粒子はHIV-1であり ; 該増殖培地は無血清培地であり;および/または 該細胞はHIV-1に慢性的に感染したヒトT細胞リンパ腫である。 本発明によるレトロウイルス粒子を単離するための好ましい局面は以下の通り である: 上記レトロウイルス粒子がHTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2またはgp 120および /または160タンパク質が涸渇したHIVであり、さらに好ましくは該レトロウイル ス粒子はgp 120タンパク質またはgp160タンパク質が涸渇したHIVであり; 上記溶出を約0.6M〜約2M NaClを用いて行い、そしてさらに好ましくは該溶 出を約1M NaClを用いて行い; 陰イオン交換樹脂がテンタクル陰イオン交換樹脂であり; 精製が、さらに接触工程後かつ溶出工程前に約0.1〜約0.55M NaClで該樹脂を 洗浄する工程を包含する。 本発明により使用可能な灌流バイオリアクターシステムは、バイオリアクター 中に細胞およびウイルス粒子の保持を可能にし、バイオリアクター内および外へ の増殖培地の継続的な灌流を維持し、そして細胞およびウイルス粒子を含む増殖 培地の採取(除去)および増殖培地の新たな補充(採取した増殖培地と新たな増 殖培地の交換)を容易にするように配置される。これらのバイオリアクターは、 バイオリアクターに関する内部および/または外部の灌流のために設計され得る 。本発明に従って使用されるバイオリアクターシステムを図2に示す。 図2の灌流バイオリアクターシステムは、配管モジュールを有する外部の中空 繊維灌流フィルターを使用する。この配管モジュールは、老廃物を含む増殖培地 が浸透側から回収される一方で、フィルターメンブレンの保持側(retentate sid e)からリアクターへ細胞を再循環させる。フィルターのポアサイズは、バイオリ アクター内に完全またはほぼ完全にウイルス粒子を保持するように選択し、例え レベルセンサーの制御下で、供給ポンプは新鮮培地を補給してリアクター内の一 定の容量を維持する。バイオリアクター中の液体表面下に達する傾斜チューブを 通じて細胞を無菌的に採取する。このシステムは高密度培養にかなっており、こ こでは高い生存能と増殖速度を有する細胞を維持し、そしてバイオリアクターに おける破片を最小化することが重要である。 細胞増殖速度および生存能が顕著に低下する前に、細胞系の最適な細胞密度を 支える灌流速度で作動するようにバイオリアクターを調整する。さらに、最適な 細胞密度、増殖速度、および生存能を維持するために、増殖培地は、細胞密度が 最大密度を超過しないようなレベルに細胞密度を「カット-バック」しなければ ならない。細胞は定常状態増殖に到達する前に採取されるべきであり、そして細 胞は実質的に安定した状態の対数期増殖を示すべきである。採取は継続的または 断続的であり得る。採取されるべき増殖培地の容量のパーセントは、細胞系の増 殖速度(μ)にほぼ等しく、この増殖速度は[In(最終細胞密度/開始細胞密度)]/( 最終時間−開始時間)×100に等しい。例えば、細胞密度が24時間ごとに30%増加 する場合、1日あたりリアクター容量の30%が採取されなければならない。毎日 の採取として、1日あたり増殖培地の約20%〜約80%を採取し、さらに好ましく は1日あたり増殖培地の約20%〜約50%を採取する。この採取はまた、死細胞が 溶解する前に、それらを除去することによりバイオリアクター中の破片を減少さ せる。さらに、増殖細胞の毎日の採取は1つの濃縮された生産の流れにおけるウ イルス粒子の除去を提供する。 本発明により使用される灌流フィルターは、細胞系およびウイルス粒子の両方 を保持し、そして灌流を維持する分子量のカットオフを支持するポアサイズを有 する。分子量カットオフの決定は保持しようとするウイルス粒子のサイズによっ て決定される。本発明によるHIV粒子生産については、0.1μポアを有するSeprac or,Inc.のType A中空繊維フィルターおよび500,000ダルトンの分子量カットオ フを有するA/G Technology,Inc.の中空繊維限外濾過フィルターが、細胞系およ びウイルス粒子の両方を保持し、そして詰まりが灌流速度に影響を与えるまで、 平均5〜10日の間十分な灌流の流速を維持する。1つのフィルターを有する代わ りに、連続的に使用される多種の灌流フィルターが継続的なウイルス生産工程の 間、灌流を支える。例えば、多種の5つの灌流フィルターにより約5週間の継続 的なバイオリアクター工程が支持される。 灌流フィルターコンポーネントはまた、フィルターの自動的再生(例えば、水 酸化ナトリウム水溶液のような塩基性溶液での灌流フィルターのインサイチュの 無菌洗浄による)を提供する方法により使用できる。詰まりが始まることにより フィルターの膜透過圧がある設定点に到達する場合、コントローラーが細胞系お よびウイルス粒子を含む増殖培地のフィルターを通した再循環を中止し、フィル ターをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でパージして細胞を除去し、フィルターを 塩基性溶液で洗浄し、そしてフィルターを使用に戻す前にPBSで洗い流す。この 再生工程により、継続的な最大灌流速度である1日あたり約4リアクター容量で 高細胞密度のバイオリアクターでの約3ヶ月間のフィルターの操作を提供する。 このレベルの自動化は、操作者の決定および操作を減少させ、そして中空繊維の 使用に伴うコストをも減少させる。Trio透明化システム(Sepracor,Inc.)がこの フィルター再生工程のために改変される。 バイオリアクターのための接種物を公知の組織培養方法に従って調整した。例 えば、細胞系を、RPMI 1640/10%ウシ胎児血清のような細胞系の増殖を支え得る 増殖培地を含むT75組織培養フラスコに置き増殖を開始する。続いて、培養をロ ーラーボトルにまで拡大させバイオリアクター中に少なくとも約2×105細胞/mL を提供する。増殖期を約5日〜約10日へと最小化するためには、より高い播種密 度が好ましい。HIV感染細胞系を用いるバイオリアクターの接種後、細胞密度が 約1×106細胞/mLに達すると、灌流を約1リアクター容量/日で開始させる。約 2×106細胞/mLで、灌流を約2リアクター容量/日に増加し、そして約4×106細 胞/mLで、灌流を最大速度である4容量/日に増加する。4リアクター容量/日は 8×106細胞/mLを超える最大密度を支持する。 細胞およびウイルス粒子を含むバイオリアクター採取物は公知の方法に従って 単離され得る。 レトロウイルス粒子はまた、本発明に従って単離される。最初に、レトロウイ ルス粒子を通過させ、そして細胞および他の破片を保持する約0.5μ〜約1.7μ、 好ましくは約0.7μ〜約1.5μ、さらに好ましくは約1.2μのポアサイズを有する フィルターを用いて細胞およびレトロウイルス粒子を含むバイオリアクター採取 物を透明化する。透明化した採取物である感染性レトロウイルス粒子をプールし 、そして充分に混合して等質性を確認する。 次いで、感染性レトロウイルス粒子を、継続撹拌しながらβ-プロピオラクト ン(BPL)(約0.25mL BPL/L上清)を添加し、続いてこの混合物を約2℃〜約8℃、 好ましくは約4℃〜約6℃で約18時間〜約24時間インキュベートすることにより 不活性化に供する。次いで、このプールを37℃に上昇させ、約2時間〜約5時間 、好ましくは約3時間〜約4時間この温度に保って残留BPLを加水分解する。こ の工程は、脂質、タンパク質、核酸などのような種々の構造成分をアルキル化す ることによりウイルスの感染力を化学的に低下させる役割を果たす。BPL不活性 化は決定的な不活性工程とは考えられず、BPLだけで処理されたレトロウイルス 粒子は依然感染性であると考えるべきであり、そしてそれ相応に扱うべきである 。 次いで、BPLで処理したレトロウイルス粒子を含む溶液を、ポリスルホン300,0 00MWカットオフメンブレンを用いるタンゼンシャル(tangential)フロー限外濾過 により約10倍〜約20倍に濃縮する。次いで、濃縮物を約5容量〜約10容量のPBS に対してpH約7〜pH約8で、好ましくはpH約7.5でダイアフィルトレーションに かけて続く陰イオン交換クロマトグラフィー工程のために必要なバッファー条件 を提供し、そしてこのクロマトグラフィー工程中の結合能力を増加させる。この 工程はレトロウイルス粒子を保持しながら浸透において90%を超えるアルブミン を除去する役割を果たす。 ダイアフィルトレーションにかけたレトロウイルス粒子を含む溶液を、TMAE F 上のカラムを通過させる。テンタクル陰イオン交換樹脂が好ましい。なぜなら、 陰イオン粒子と結合するための樹脂の部位がウイルスサイズの粒子に対して最も 高い結合能を有し、従って非テンタクル陰イオン交換樹脂に比較して最も高い倍 率の精製を得るからである。陰イオン交換樹脂の高い流速により、複数の超遠心 分離機の使用を必要とする等密度沈降に比較して1ユニットの操作における大き なロットサイズの迅速な精製を容易にする。カラムの交換時間が速いため、保管 場所に備品を戻すことが可能になり、限外濾過手順を包含する他の操作が可能な スペースができる。重要なことは、殺菌、混入物の除去、およびエンドトキシン の不活性化のために、強固に結合した生物学的な物質をカラムから除去するため に用いられるNaOHに対する安定性を対象に樹脂を選択することである。 陰イオン交換樹脂はまた、精製を受けるウイルス粒子の構造全体を保存しなが ら混入物の除去を容易にすべきである。DNAおよびエンドトキシンのような陰イ オン性混入物は、ウイルス粒子と共に濃縮されるが、しかしこれらの特定の混入 物は樹脂と強く結合し、約1.0MのNaClのような高塩濃度によるウイルス粒子の 選択的な溶出を可能にする。各陰イオン交換クロマトグラフィー工程により、2 つの工程についての陰イオン性混入物の累積的な減少について、少なくとも2桁 または4桁の減少を達成する。溶出したウイルス粒子のサイズ排除HPLC、ウエス タンブロットおよびSDS-PAGE分析もまた、少なくとも約24時間は溶出したウイル ス粒子の検出可能な構造変化を示さない。数日間の溶出緩衝液中の溶出ウイルス 粒子を保存すると検出可能な構造変化を生じる。従って、解離現象を防ぎ、そし て構造成分の整合性(consistency)を維持するために直ちに希釈することが、産 物が不完全フロイントアジュバント中で乳化される場合、特に免疫原性プロフィ ールの維持のために提案される。 レトロウイルス粒子を含むダイアフィルトレート溶液を、テンタクル陰イオン て、pH約6〜約7.5、好ましくはpH約6.2〜6.8、より好ましくはpH約6.5で、約0. 1〜0.55M NaCl、好ましくは0.3〜0.5M NaCl、より好ましくは0.5M NaClを用いて 洗浄し、そしてpH約6〜7.5で、好ましくはpH約6.2〜約6.8で、より好ましくはp H約6.5で約0.6〜2M NaCl、好ましくは約0.8〜約1.4M NaCl、より好ましくは約 1M NaClのより高いNaCl濃度を使用して溶出する。カラムを約0.7〜約1.3M NaOH 、好ましくは約1M NaOHで殺菌し得る。 レトロウイルス粒子(特に、HIV)を含有する溶出溶液を、約4倍〜約8倍、 好ましくは約6倍に十分に希釈して塩濃度を、pH約6.2〜約7.7、好ましくはpH約 6.6〜約7.5で、約0.05M〜約0.25M、好ましくは約0.1M〜約0.2M NaClの範囲内に 減少させ、長期間の間(例えば、18時間より長く)、溶出の高NaCl濃度下に曝露 された場合、HIV-1粒子の部分的な分解を防止する。この第一のカラムは、全タ ンパク質の比率に対して約40倍の精製を達成するプロセスにおいて最も重要で効 率的な精製工程である。SDS-PAGE分析により、培地成分の大部分がカラム素通り 中に存在し、さらに混入物がNaCl洗浄液の洗浄により除去され、そしてHIV粒子 について、HIV-1参照標準と比較した認識可能なタンパク質パターンが、溶出画 分から決定できることが示される。 希釈および混合して均質性を確認した後、レトロウイルス粒子の溶液を第二の するクロマトグラフィーを樹脂を約0.3M〜約0.8M NaCl、より好ましくは約0.6M NaClで洗浄し、そしてウイルス粒子を第一の樹脂の適用において記載したように 溶出液を使用して溶出する。 第二の陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて、約1Mのウイルス粒子溶出 画分をポリスルホン300,000MWカットオフメンブレンを含む限外濾過プレートお よびフレームシステムを用いて5倍濃縮する。次いで、濃縮物を生理食塩水に対 して透析して、塩濃度を等張強度に減少させ、そして製品製剤の調製物中のリン 酸レベルを減少させる。精製産物を-70℃で凍結し、そして約24時間のコバルト 照射(約2〜約4.5メガラド)に供する。この手順は、核をPCR分析により測定さ れるように約200塩基対の断片に剪断することによる最終的な不活性化工程とし て作用する。 産物を注射のために0.9%生理食塩水で必要とされる濃度の抗原(p24濃度)に 達するように希釈して処方し、そして振とうデバイスを用いて、約1時間、等容 量の不完全フロイントアジュバントと無菌的に混合する。(無菌量として今回用 意された)最終物質(大量の免疫原)は、粘性の灰白色の乳濁液のような外観で ある。 本発明はさらに例証されるが、本発明に従うプロセスを例示する以下の実施例 により制限されない。 ウイルスの粒子の生成に使用する宿主細胞株は、IPL-1と称されるTリンパ腫 で慢性的に感染される。このために、無血清増殖培地(IMAT)を、優れたウイルス の産生を維持し、そして10%ウシ胎児血清(FBS)において培養された細胞に匹敵 する増殖速度を維持するように改良する。IMATは、以下のリスト: に由来する成分を4g/Lのグルコースおよび0.3g/LのL-グルタミンを含有するRPM I 1640に添加することにより形成される。無血清培地のタンパク質含量の減少は 、下流のプロセシングの効率を補助する。 Manufacturer's Working Cell Bank(MWCB)由来の細胞を、Tフラスコ中で増 殖後、スピナーまたはローラーボトル(T25→T75→T150→850cm2ローラーボトル へと進行する)中で増殖させ、バイオリアクターのための接種物を提供する。2 ×105細胞/mLの最少密度で播種の際は、細胞は65%よりも高い生存率で指数関数 的に増殖する。これらの必要条件は、バイオリアクター中の遅滞期(lag phase )を、最初の播種後5日以内に最小化するために必要である。細胞が増殖し始め 、播種後24時間で5×105〜9×105に密度が達成される場合、新鮮な培地の連続 的な供給を提供し、そして使用済みの培地を連続的に除去する。培地交換の速度 は約0.5リアクター容量/日で開始し、細胞密度が約2×106〜約4×106細胞/mL に達する場合、4リアクター容量/日に増加させる。この連続的な灌流の状態に おいて、約8×106個の細胞密度が達成される。これは連続的な栄養物の送達、 および老廃物の除去の結果である。それゆえ、灌流は、代表的にスピナーにおい て得られる毎日の平均細胞密度(ここでは細胞がバッチモードで増殖される)よ りも約10倍〜約20倍高い細胞密度を達成する。 連続的な灌流を維持しながら細胞の保持を可能にするリアクターの構成を図2 に表す。原理は、使用済み培地を浸透側から回収しながら、フィルターメンブレ ンの保持側(retentate side)からリアクターへ細胞を再循環する配管モジュー ルを有する外部の中空繊維濾過デバイスを含む。老廃物を除去するために中空繊 維フィルターを0.1ミクロンポアサイズて使用すると、ほとんど完全にウイルス 粒子をバイオリアクター中に維持する。したがって、毎日の採取において細胞と ともにウイルス粒子を除去することを容易にする。フィードポンプはレベルセン サーの制御下で一定の容量を維持して新鮮な培地を供給する。本発明者らはIPLI B MWCBについて4リアクター容量/日の灌流速度が、約6×107〜約8×107細胞 /mLの密度を支持するとしている。この時点で細胞増殖は定常期に近づく。この 条件の結果、培養物の生存率および/または増殖速度の減少を生じる。最適な増 殖速度で細胞を維持するために、リアクター液の毎日の採取が、「カット-バッ ク」密度(例えば、約3×106〜約6×106細胞/mL)で要求され、この密度は採 取リアクター容量/日のおよそ3分の1に等しい。このことはまた、高い生存率 を維持し、そして死細胞の除去により細胞破片を減少する。最も重要なことに、 リアクターの内側からの毎日の採取容量がウイルス粒子の除去を可能にする。 毎日の採取からのウイルス粒子の回収および精製における最初の工程は、精密 濾過(micro-filtration)手順を用いる細胞および細胞破片の除去を必要とする 。このことは、約0.65ミクロン〜0.8ミクロンの範囲のポアサイズを有するメン ブレンを利用するデットエンド(dead-end)濾過のデバイスの使用を包含する。 この手順はウイルス粒子から細胞および細胞破片を分離する役割を果たす。 この手順は代表的に、分類された採取物にβプロピオラクトン(BPL)を1リ ットルの上清あたり最終濃度0.25mL BPLで添加した後、4℃で18〜24時間インキ ュベーションし、次いで37℃で5時間インキュベートしてBPLを不活性化する工 程を包含する。続いてこのプールを、さらなるプロセスを行うまで、4℃で0〜 6日間保持する。この不活性化工程は、ウイルスの種々の構造組成(例えば、脂 質、タンパク質、核酸など)をアルキル化することによりウイルス粒子の感染力 を化学的に減少する役割を果たす。本発明者らはこのBPL不活性化工程は、最終 的なウイルスの不活性化ではないことを指摘し、そして本物質はさらに感染性で あると思われ、ならびにそのように処理される。 BPLで処置される物質は、周囲温度に達することが可能であり、そして300,000 MWカットオフメンブレンを用いるタンゼンシャルフロー限外濾過により10倍〜20 倍濃縮される。次いで、濃縮プールを5〜10容量のリン酸緩衝化生理食塩水(PB S)pH7.5に対して透析する。この工程で使用されるメンブレンのポアサイズは、 増殖培地から90%より多くのヒト血清アルブミンおよび他のタンパク質、ならび に浸透における他の比較的小さな分子を除去しながら、HIV粒子を保持する役割 を果たす。 濃縮され透析された物質のpHを、pH7.5に合わせ、そして50cm/時間の直線フ 3〜5のカラム容量の0.5M NaCl pH6.5で洗浄する。次いで、結合産物を1.0M Na Cl pH6.5を用いて溶出し、そして280nMで吸収する全ピークを回収する。続いて カラムを、1.0N NaOHで1〜2カラム容量の洗浄をした後、殺菌する。1.0M NaCl 溶出画分に含まれる産物を6倍希釈し、0.1M〜0.2M NaClの塩濃度およびpH6.5〜 ー速度で適用する。カラムを3〜5カラム容量の0.6M NaCl pH6.5で洗浄する。 結合産物を再び、1.0M NaCl緩衝液で溶出する。 カットオフメンブレンを含む限外濾過プレートおよびフレームデバイス用いて約 5倍濃縮する。次いで、濃縮物をPBS p7.5に対して透析して塩濃度を減少させる 。濃縮後のデットスペース中の産物の損失を最小化するために、器具に1デット スペース容量の生理食塩水(0.9% NaCl)を流し込み、そして洗浄物を透析画分 に添加する。物質を-70℃に凍結し、そしてコバルト照射(2〜4.5メガラド、約 24時間)に供する。これは最終的なウイルス不活性化工程として働く。 この段階で前もって処方された産物を注射のために0.9%生理食塩水で、必要と される濃度の抗原(p24濃度)に達するように希釈し、そして振盪デバイスを用 いて、約15分〜20分間、等容量の不完全フロイントアジュバントと無菌的に混合 する。 本研究は、多くの整合性(consistency)濃度を制御するための新規の参照標 準を確立するために、および「古典的プロセス」により調製される物質との同等 性を示すために、必要不可欠である本発明に従って調製されるgp120の減少され るHIV-1の特徴づけを包含する。特徴づけのデータは、公知のHPLC手順(図3) 、ウェスタンブロット手順(図4)およびSDS-PAGE手順(図5)を用いることに よるバッチ培養/スクロース勾配方法論によって調製される物質に対する産物同 等性、バイオリアクター工程のウエスタンブロット(図4)の開始時にまたは終 了時から出発物質が単離されるかどうかの産物整合性、そして異なるバイオリア クター工程のHPLC間の産物整合性(図3)を示す。 代表的なバイオリアクター工程の実施(図6)は、増殖期が6日目まで続き、 6日目に生産期が毎日の細胞採取を始めることにより開始されたことを示す。生 産期は48日間続いた。図6はバイオリアクターが、3つの異なる安定状態の細胞 密度で採取容量を制御することにより維持されたことを示す。この工程(図6) において安定状態の細胞密度が、約3.5×106細胞/mLで10日間〜24日間維持され ;約6×106細胞/mLで28日間〜43日間維持され;および約7×106で46日間〜51 日間維持される。生産性(p24濃度)の測定は各定常状態期間についての平均細 胞密度の関数として示される。明らかに、高い細胞密度の上昇がp24を生じる。 さらに、より速い増殖速度が、これがより大きな採取容量を安定状態の細胞密度 を維持するために必要であるので望ましい。産物が毎日の細胞の採取から回収さ れるので、このことは毎日のウイルス粒子のより高い生産と解釈される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG), AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C H,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB ,GE,HU,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LK,LR,LT,LU,LV,MD,MG,MN,M W,MX,NL,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SI,SK,TJ,TT,UA,US, UZ,VN (72)発明者 ミッチェレン, ジョナサン ジェイ. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 18074, パーキオメンビル,ヒルデブランド ロ ード 652 (72)発明者 アイリッシュ, トーマス ダブリュー. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19464, ポッツタウン,ディアー リッジ ドラ イブ 2136 (72)発明者 ウェーバー, デイビッド エム. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19460, フェニックスビル,サウス メイン ス トリート 308 (72)発明者 ゴーア, リチャード エス. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 18966, サウザンプトン,クッシュモア ロード 1388 (72)発明者 ハーター, ジェイムズ ジェイ. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19063, メディア,ウエスト バルチモア パイ ク 1016, アパートメント シー−11 (72)発明者 ベイ, ピエレ エム. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19130, フィラデルフィア,バトンウッド スト リート 1801, アパートメント 1718 (72)発明者 タル, ジョージ シー. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19403, ノーリスタウン,エジプト ロード 87

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.ウイルス粒子を生産する連続プロセスであって、灌流増殖培地においてウイ ルス感染された生存可能な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および該細胞を含 有する培地を該灌流増殖培地中に残存する細胞の定常状態の対数期増殖を維持す る速度で取り出す工程を包含する、プロセス。 2.前記取り出された培地中に存在するウイルス粒子が前記細胞から分離される 、請求項1に記載のプロセス。 3.前記細胞および前記ウイルス粒子を含む前記培地が、該細胞が定常状態の増 殖に到達する前に取り出される、請求項1に記載のプロセス。 4.前記増殖培地が、前記細胞を取り出す速度により定義される速度で補充され る、請求項1に記載のプロセス。 5.前記細胞および前記ウイルス粒子を含有する前記培地が、連続的にまたは断 続的に取り出される、請求項1に記載のプロセス。 6.前記細胞および前記ウイルス粒子を含有する前記培地の約20%〜約80%が1 日あたりに取り出される、請求項1に記載のプロセス。 7.前記細胞および前記ウイルス粒子を含有する前記培地の約20%〜約50%が1 日あたりに取り出される、請求項6に記載のプロセス。 8.前記ウイルス粒子がレトロウイルス粒子である、請求項1に記載のプロセス 。 9.前記レトロウイルス粒子が、HTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2、またはgp120 タンパク質および/またはgp160タンパク質の欠損したHIVである、請求項8に記 載のプロセス。 10.前記レトロウイルス粒子がHIV-1である、請求項9に記載のプロセス。 11.前記増殖培地が無血清培地である、請求項1に記載のプロセス。 12.前記細胞がHIV-1に慢性的に感染しているヒトT細胞リンパ腫である、請 求項1に記載のプロセス。 13.レトロウイルス粒子を精製するためのプロセスであって、該レトロウイル ス粒子および不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂と接触させる工程、および該 レトロウイルス粒子を該樹脂から溶出させる工程を包含する、プロセス。 14.前記レトロウイルス粒子が、HTLV-1、HTLV-2、HIV-1、HIV-2、またはgp12 0タンパク質および/またはgp160タンパク質の欠損したHIVである、請求項13 に記載のプロセス。 15.前記レトロウイルス粒子がgp120タンパク質またはgp160タンパク質の欠損 したHIVである、請求項14に記載のプロセス。 16.前記溶出工程が、約0.6M〜約2M NaClで行われる、請求項13に記載のプ ロセス。 17.前記溶出工程が、約1M NaClで行われる、請求項16に記載のプロセス。 18.前記陰イオン交換樹脂がテンタクル陰イオン交換樹脂である、請求項13 に記載のプロセス。 に記載のプロセス。 20.前記精製工程が、前記接触工程後および前記溶出工程前に約0.1M〜約0.55 M NaClで前記樹脂を洗浄する工程をさらに包含する、請求項13に記載のプロセ ス。
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