NO171147B - Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb Download PDFInfo
- Publication number
- NO171147B NO171147B NO875142A NO875142A NO171147B NO 171147 B NO171147 B NO 171147B NO 875142 A NO875142 A NO 875142A NO 875142 A NO875142 A NO 875142A NO 171147 B NO171147 B NO 171147B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- carried out
- particles
- centrifugation
- hbsag
- proteins
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 title description 2
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 title description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 9
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 abstract description 4
- 238000005188 flotation Methods 0.000 abstract description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 abstract 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 14
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 8
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- QCOXCILKVHKOGO-UHFFFAOYSA-N n-(2-nitramidoethyl)nitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NCCN[N+]([O-])=O QCOXCILKVHKOGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108010002730 protein S precursor Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot hepatitt B.
Alle typer vanskeligheter som forekommer i forbindelse med industriell fremstilling av vaksiner mot hepatitt B ved rensing av antigenet HBsAG fra menneskeblod, har helt naturlig ledet til forskning for oppnåelse av antigeniske proteiner fra mikroorganismer som er transfisert med gener som koder hepatitt B viruset.
M. Michel et al. har uttrykt antigener fra kappen til hepatitt B viruset fra eggstokkceller hos kinesisk hamster (CHO)
(se M. Michel (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81,7708-7712), transfisert med et plasmid som bærer det fullstendige EBsAg-genet. Disse cellene utskiller kontinuerlig i cellekulturmediet HBsAg-partikler som inneholder både pre-S2- og S-proteiner.
Under en slik ekspresjon er imidlertid HBsAg-partiklene til stede i cellekulturmediet som inneholder uønskede stoffer slik som proteiner fra kalveserumet benyttet for cellevekst, celleproteiner og DNA og retrovirale partikler. Disse retrovirale partiklene kommer fra den opprinnelige cellen før transfeksjon.
Foreliggende oppfinnelse foreslår at disse ulempene over-vinnes ved tilveiebringelse av en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot viral hepatitt B ved ekspresjon av HBsAg-genet innført i CHO-celler, hvilket gjør det mulig å produsere en vaksine mot hepatitt B industrielt.
Et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte som gjør det mulig å fremstille en vaksine som har en ekstremt høy renhetsgrad, spesielt hva angår det cellulære DNA eller DNA-fragmenter samt hva angår retrovirusen som forurenser CHO-cellene.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en ny rekombinant vaksine mot hepatitt B, hvor antigeniske overflatepartikler av hepatitt B fremstilles ved ekspresjon fra en kultur av CEO-celler transfisert med et plasmid som bærer EBsAg-genet for derved å frigjøre de antigeniske overflatepartiklene i kulturmediet, karakterisert ved at man
utvinner supernatant-kulturmediet fra i det minste en kultur, fortrinnsvis foretatt med et lite animalsk serum-innhold,
utsetter supernatantmediet for steriliserende filtrering,
utsetter det for konsentrasjon, fortrinnsvis ca. 50
ganger, fortrinnsvis ved ultrafiltrering,
behandler konsentratet med et ikke-nedbrytende utfellingsmiddel valgt fra polyetylenglykol og ammoniumsulfat, under slike betingelser som utfeller de tunge DNA-materialene, hvilken utfelling også trekker med seg de retrovirale partiklene, og proteiner,
foretar en ny konsentrasjon av det antigeniske preparatet,
fortrinnsvis med et ikke-nedbrytende utfellingsmiddel under slike betingelser som utfeller de antigeniske EBsAg-overflatepartiklene, og deretter gjenoppløser bunnfallet i et lite volum,
utfører en hastighetsregulert sonesentrifugering i en ikke-kaotropisk densitetsgradient for retrovirusene slik at deres integritet bibeholdes for derved å oppnå deres separering fra EBsAg-partiklene, avhengig av deres stør-relse og densitet, fortrinnsvis ved også å oppnå distinksjon mellom de antigeniske EBsAg-partiklene på den ene side, og separering mellom EBsAg, DNA og proteiner på den annen side, — utfører en isopyknisk sentrifugering av
fIotasjonstypen, hvilket eliminerer de lette og tunge nukleinsyrene og proteinene, og
utfører kromatografi på en anionutveksler for å adsorbere sporene av nukleinsyrer og gjenværende ikke-EBsAg-proteiner.
Med ikke-nedbrytende utfellingsmidler menes midler som, naturligvis, ikke nedbryter EBsAg-antigenene og spesielt de av type S og pre S, men også slike som ikke har noen kotro-pisk eller dissosierende effekt for de retrovirale partiklene. Det foretrukne middel er polyetylenglykol (PEG). Som nevnt kan også ammoniumsulfat anvendes.
Rensetrinnene denaturerer således ikke EBsAg-partiklene og spesielt denaturerer de ikke pre S-proteinene som er de mest eksponerte. Blant egnede utfellingsmidler foretrekkes polyetylenglykol (PEG) ved mer spesielt å velge en molekylvekt av størrelsesorden 4.000-20.000, hvilket under egnede betingelser slik som mer spesielt en PEG-konsentrasjon av størrelsesorden 5$, gjør det mulig å utfelle de retrovirale partiklene samtidig som det også spesielt muliggjøres utfelling av de tunge DNA-klasser mens EBsAg-partiklene holdes i supernatanten. Disse partiklene kan utvinnes i et meget lite volum, fortrinnsvis etter å ha utfelt dem ved tilsetning av PEG til høyere konsentrasjon.
Densitetsgradienten i hvilken den hastighetsregulerte sonesentrifugeringen utføres, tilveiebringes også slik at den ikke får noen uheldig innvirkning på EBsAg-antigenet, inkludert S- og pre S-antigenititeter. Videre tilveiebringes denne gradienten slik at den ikke har noen kaotropisk effekt på de retrovirale partiklene slik at deres integritet opprettholdes. Denne gradienten som har lav ionisk styrke, er fortrinnsvis en sukrosegradient. I en variant kan andre densitetsgradienter også benyttes, spesielt glycerol.
Den hastighetsregulerte sonesentrifugeringen som utføres i en slik densitetsgradient, muliggjør eliminering av de retrovirale partiklene på en meget effektiv måte. Samtidig kan en viss DNA-rensing oppnås, spesielt i tunge kjeder og i proteiner.
Den isopykniske sonesentifugeringen av fIotasjonstypen på en saltoppløsning-densitetsgradient, slik som KBr, foretas derved på et preparat som praktisk talt er fullstendig fritt for retrovirale partikler. Dersom retovirale partikler forurenser prøven som skal renses, ville imidlertid den kaotropiske effekten til saltet som danner densitetsgradienten, ødelegge den virale struktur og ville frigjøre det virale RNA-genomet i den tette sonen av gradienten hvor det ville stoppe og derved gjøre det mulig å separere fra HBsAg-antigenet.
Dette trinnet muliggjør eliminering av praktisk talt alle proteinene samt eksisterende lette eller tunge DNA-spor.
Ytterlig sørger trinnet med anionutvekslingskromatografi for adsorpsjon av mulige nukleinsyrespor samt av DNA og RNA som fremdeles er tilbake og av proteiner.
Andre fordeler og egenskper ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra nedenstående eksempel.
1. Fremstilling av cellekulturen
En CHO-cellekoloniklon transfisert med et rekombinant plasmid (FR-A 84 03564 publisert som FR 2 560 890) som bærer genet for hepatitt B-viruset som koder for HBS-antigenet (pre S- og S-områder), formeres fra en beholder med celleforråd, i fer-menter ingsenheter av økende volumer. Den siste formeringen utføres i en 300 liters fermentor, idet cellene formeres på mikrokuler i suspensjon i kulturmediet. For disse for-meringstrinnene inneholder vekstmediet 4-10$ CS (kalveserum), fortrinnsvis 5$.
2. Kulturer, innhøsting og konsentrasjon
Den første innhøsting foretas etter 3-4 dager med dyrking i 300 liters fermentoren: Etter dekantering av kulene som understøtter cellene, fjernes 250 1 supernatant og erstattes med et ekvivalent volum av nytt medium inneholdende 0,2-4$ CS, fortrinnsvis 1-2$. Celledyrkingen fortsettes i fermentoren i 3-4 dager, hvoretter en ny innhøsting av 250 1 foretas. Denne operasjonen kan foretas med opptil 10 suksessive inn-høstinger, og disse holdes ved +4°C for rensing derav. Som en generell regel har den første innhøstingen og innhøsting nr. 7 og de etterfølgende et lavt HBs-antigeninnhold slik at de ikke bibeholdes for rensingstrinnene.
I dette eksempelet ble innhøstinger 2-6 beholdt for rensing og inneholdt 1% CS.
Etter blanding av innhøstingsmaterialet filtreres preparatet, som har et volum på 1.250 1, på en 0,2 mikrometer membran, konsentreres deretter ved ultrafiltrering ca. 50 ganger på en membran med et sperrepunkt på 100.000 dalton, hvilket gir konsentrert innhøstingsmateriale R.
3. Fraksjonerte utfellinger
Det konsentrerte innhøstingsmaterialet R underkastes fraksjonering ved selektiv utfelling i et første trinn for de høymolekylvektige komponentene, spesielt tunge klasser av DNA og retrovirale partikler, idet HBS-antigenet forblir i suspensjon, og i et annet trinn utfelles EBs-antigenet. Ut-fellingsmiddelet velges slik at de retrovirale partiklene beholder sin opprinnelige størrelse og densitet på den ene side, og på den annen side slik at antigenisiteten til HBs-partiklene ikke påvirkes i uheldig grad. Det foretrukne utfellingsmiddel er polyetylenglykol, fortrinnsvis av 6.000
MW.
En konsentrasjon på 5$ av PEG 6000 anvendes for den første utfellingen, og det oppnådde bunnfall elimineres ved sentrifugering. PEG 6000 tilsettes til supernatanten S for en endelig konsentrasjon av 9,5$; idet bunnfallet etter sentrifugering oppløses fullstendig i et volum som er lik omtrent en 625-del av det behandlede innhøstingsvolum, nemlig ca. 2 liter, av antigenisk EC-preparat.
Ved dette trinnet er ytelsesevnen m.h.t. eliminering av det cellulære DNA, og ikke-HBsAg-protein gitt ved verdiene i følgende tabell:
Mens utvinningsgraden av EBs-antigenene er 80$, ble det notert elimineringsfaktorer på 42.000 for DNA og 38,5 for proteinene.
Revers-transkriptaseaktiviteten som reflekterer retrovirus-innholdet, er ikke detekterbar i innhøstingene, og er enkelte ganger svakt positiv i innhøstingsmaterialaet som er konsentrert 50 ganger, og den er i alle tilfeller negativ i supernatanten etter behandling med 5$ PEG.
Effekten m.h.t. fjerning av et retrovirus ved hjelp av dette behandlingstrinnet med 5$ PEG ble målt ved å supplere et konsentrert innhøstingsmateriale med MuLV (murin-leukemi virus), og dette ga en elimineringsfaktor på 7.
4. Hastighetsregulert sonesentrifugering
En sukrosegradient (0-40$) dannes i en K2-Electronucleonics rotor (se Progress in Separation and Purification, utgiver Perry og Van Oss, Copywright 1971 av John Wiley and Sons, Inc., USA.): når rotasjonshastigheten når 35.000 omdr./min., tilføres rotoren ved en kontinuerlig strømningshastighet på 2 l/time først 500 ml av EC-prøve som skal renses (konsentrat), deretter i de neste 30 min. tilføres en f osfatbuf f er, 65 mm, pH 6,8. Etter stopping av rotoren fraksjoneres innholdet i rotoren, og fraksjonene titreres med henblikk på deres innhold av HBs-antigen. De HBsAg-rike fraksjonene finnes også her i gradientens mindre tette lag, som inneholder mindre enn 5$ sukrose; de blandes under identiske forhold med dem som oppnås fra behandlingen av andre 500 ml konsentratfraksjoner.
Blandingen av disse fraksjonene dialyseres for derved å fjerne sukrosen og konsentreres deretter ved ultrafiltrering til et volum på 0,361 1. Dette gir et preparat Z10. HBsAg-utbyttet er 80$. Ytelsesevnen m.h.t. fjerning av EDNA og ikke-HBsAg-proteiner var:
Selvom det herved oppnås betydelig resultater m.h.t. fjerning r av DNA og ikke-HBsAg-proteiner, så er den aktuelle sentri-fugeringshastigheten av særlig interesse p.g.a. dens effekt når det gjelder å oppnå distinksjon mellom antigenet og de retrovirale partiklene.
Således, når konsentratet med hensikt forurenses med et murin-retrovirus (murin-leukemi virus) og deretter underkastes sentrifugering under de nevnte forhold, så gjenfinnes de retrovirale partiklene titrert ved revers transkriptase i gradientens tette lag med en enzymatisk aktivitetstopp ved 33-35$ sukrose.
Retroviruspartiklene har knyttet seg til deres iso-tette sone i gradienten ved å bevege seg gjennom størstedelen av gradienten, mens HBsAg-partiklene, som har lavere sedimenterings-konstant (40s), samtidig kun har beveget seg over en liten strekning av gradienten. Separering derav oppnås ved hjelp av en kort sentrifugeringstid.
Revers-transkriptaseaktiviteten målt i blandingen av de HBsAg-rike fraksjonene representerer 0,013$ av det som finnes i retrovirustoppen, nemlig en fjerningsfaktor på 77.
5. Isopycnisk sentrifugering av fIotasjonstypen
Rotoren er en sonerotor av typen TI15-Beckman sonal av Beckman, Palo Alto, California, USA, med en total kapasitet på ca. 1700 ml (se A. Fritsch, Les Centrifications Prépara-tives en Gradient de densité, 2. utgave). En densitetsgradient dannes ved innføring ved rotorens periferi av suksessive volumer av kaliumbromidoppløsning (KBr) for derved å oppnå en gradient med densiteter mellom 1,17 og 1,35. Et av de introduserte lag er dannet av den prøve til hvilken KBr har blitt tilsatt slik at lagets densitet er lik 1,25, slik at ved begynnelsen av sentrifugeringen finnes alle urenhetene og antigenet i gradientens tette del.
Etter sentrifugering ved 31.000 omdr./min. i 20 timer og etter fraksjonering av rotorens innhold, finnes HBsAg-partiklene i deres iso-tette sone (d 1,22-1,23), mens praktisk talt alle de andre proteinene og DNA'en finnes i gradientens tette lag. Blandingen av de EBsAg-rike fraksjonene dialyseres mot fosfatbuffer 65 mM pH 6,8 for å fjerne KBr og utbalansere prøven i bufferen som vil bli benyttet for kromatografi. Preparat Z20 oppnås.
Mens HBsAg-utbyttet i denne sentrifurering er nær 100$, ble meget høye elimineringsfaktorer for DNA og ikke-HBsAg-protein oppnådd.
De er henholdsvis 350 for DNA og 58 for nevnte ikke-HBsAg-proteiner.
En retrovirus-fjerningsfaktor kunne ikke beregnes i dette trinnet fordi revers-transkriptaseaktiviteten blir totalt ødelagt i et KBr-medium. Denne inaktivering skyldes sann-synligvis den kaotropiske effekten til saltet på viruset. Det er interessant å bemerke at denne kaotropiske effekten skulle frigjøre det virale genomet (RNA) i mediet, hvilket ville være til stede etter sentrifugering i de tette gradi-entlagene slik som den cellulære DNA, og skilte seg således fra antigen-toppen.
6. Anionutvekslingskrornatografi
Det antigeniske preparatet Z20 dialysert etter isopycnisk sentrifugering, føres på Whatman DE 52-cellulose som på for-hånd er utbalansert i en fosfatbuffer 65 mM pH 6,8. Under disse betingelsene blir HBS-antigenet ikke adsorbert på utveksleren, mens de resterende spor av DNA og de forurensende proteiner fikseres på utveksleren:
En høy elimineringsfaktor på 25 ganger oppnås for ikke-HBsAg-proteinene, mens DNA ikke lenger er detekterbar ved hjelp av dot-blot-teknikken etter hybridisering med en probe merket med P32 (sensitivitetsgrense = 12,5 pg/ml).
For å måle elimineringsfaktoren for DNA ble det til et sett 20-preparat tilsatt en kjent mengde DNA, og kromatografering ble foretatt på anionutveksleren. DNA-mengden funnet i ut-løpet fra kolonnen var 1000-10.000 ganger mindre enn den innledende mengde.
Det således oppnådde antigeniske preparat hadde etter rensing følgende egenskaper:
Etter elektroforese på polyakrylamidgel 1 et dissosiasjons-medium spredte polypeptidene farget med sølvnitrat seg utover tre hovedbånd: .P22 meci en tilsynelatende molekylvekt på 22.000 dalton .P26 med tilsynelatende molekylvekt på 26.000 dalton .P34 med en tilsynelatende molekylvekt på 34.000 dalton
som alle tre gjenkjennes ved immunoavtrykk med et anti-S monoklonalt antistoff hvor bare P34 polypeptidet gjenkjennes med et anti-pre S 2 monoklonalt antistoff.
7. Fremstilling av vaksiner og immunogenisitet
Det kromatograferte preparatet filtreres på en ste-ril iser ingsmembran, oppvarmes deretter til +60°C i 60 min. og etter avkjøling tilsettes formaldehyd (100 jjg/ml) og in-kubasjon foretas i 48 timer ved +30°C. Dette antigeniske preparatet fortynnes i en fysiologisk buffer, og et additiv slik som aluminiumhydroksyd tilsettes for oppnåelse av vaksiner.
Forskjellige doser av HBsAg-antigener ble injisert subkutant i marsvin, og antistoff-reaksjonene (anti-S og anti-pre S 2) ble målt og sammenlignet med dem oppnådd i dyr som var injisert med like doser av antigen oppnådd fra menneskeplasma (Hevac B vaksine - Pasteur Vaccins Mårnes La Coquette-Frankrike).
Anti-S-antistoffene, generelt betegnet anti-HBsAg, ble målt ved hjelp av Ausab-Abbott-teknikken (Abbott Laboratories, USA) og anti-pre S2-antistof f ene ble målt ved hjelp av den immunoenzymatiske metoden ved bruk av et syntetisk peptid med 31 aminosyrer på den faste fasen, inkludert pre S2-epitopen, for derved å fange antistoffene som ble gjenkjent i et annet trinn, med et anti-IgG-antistoff konjugert med peroksydase; etter tilsetning av substratet (H2O2) pg av et kromogen (ortofenylendiamin), ble det utviklede farven målt ved 492 nm, hvis intensitet var proporsjonal med mengden av opp-fangede antistoffer.
Som resultatene i tabellen viser oppnås en ekvivalent anti-S respons eller reaksjon med de to typene av hepatitt B vaksine, mens en høyere anti-pre S2 respons eller reaksjon observeres med den rekombinante vaksinen (CHO).
Claims (11)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av en ny rekombinant vaksine mot hepatitt B, hvor antigeniske overflatepartikler av hepatitt B dannes ved ekspresjon fra en kultur av CHO-celler som er transfisert med et plasmid som bærer HBsAg-genet for derved å frigjøre de antigeniske overflatepartiklene i kulturmediet, karakterisert ved at supernatant-kulturmediet fra i det minste en kultur utvinnes, spesielt i et medium med et lavt innhold av animalsk serum,
supernatanten underkastes steriliserende filtrering, supernatanten konsentreres,
konsentratet utfelles ved hjelp av et ikke-nedbrytende utfellingsmiddel valgt fra polyetylenglykol og ammoniumsulfat, under betingelser som utfeller de tunge DNA-klassene, de retrovirale partiklene og proteiner,
en ny konsentrasjon utføres,
en hastighetsregulert sonesentrifugering utføres i en ikke-kaotropisk densitetsgradient for de retrovirale partiklene og valgt slik at det oppnås separering av disse fra HBsAg-partiklene, avhengig av deres størrelse og densitet,
en isopycnisk sonesentrifugering av fIotasjonstypen utføres, hvilket fjerner de lette og tunge nukleinsyrene og proteinene, og
kromatografi på et anionutvekslingsmedium foretas for derved å adsorbere de gjenværende spor av nukleinsyrer og gjenværende ikke-HBsAg-proteiner.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det foretas utfelling med polyetylenglykol, spesielt PEG 6000.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det foretas en første utfelling med en PEG-konsentrasjon av størrelsesorden 5$.
4.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at den nye konsentra-sjonen utføres med et ikke-nedbrytende middel som utfeller de antigeniske EBsAg-partiklene, hvoretter bunnfallet oppløses på nytt i et lite volum.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at utfellingen foretas med PEG, spesielt PEG 6000 ved 9,5$.
6.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at den hastighetsregulerte sonesentrifugeringen utføres i en sukrosegradient.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at sentrifugeringen utføres i en K-2-Electronucleonic rotor.
8.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 6 og 7, karakterisert ved at de fraksjoner som har en sukrosegrad mindre enn 25$ utvelges, idet de andre fraksjonene kasseres.
9.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at sonesentrifugeringen av rotasjonstypen utføres i en KBr-gradient.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at fraksjonene med densitetstoppen 1,22-1,23 oppsamles.
11.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, karakterisert ved at kromatografi utføres på DE 52-cellulose.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8617265A FR2608052B1 (fr) | 1986-12-10 | 1986-12-10 | Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO875142D0 NO875142D0 (no) | 1987-12-09 |
NO875142L NO875142L (no) | 1988-06-13 |
NO171147B true NO171147B (no) | 1992-10-26 |
NO171147C NO171147C (no) | 1993-02-03 |
Family
ID=9341743
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO875142A NO171147C (no) | 1986-12-10 | 1987-12-09 | Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0273811B1 (no) |
JP (1) | JPS63215639A (no) |
KR (1) | KR880007732A (no) |
AT (1) | ATE109353T1 (no) |
CA (1) | CA1306689C (no) |
DE (1) | DE3750330T2 (no) |
DK (1) | DK645687A (no) |
FR (1) | FR2608052B1 (no) |
IL (1) | IL84729A (no) |
NO (1) | NO171147C (no) |
PT (1) | PT86321B (no) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1073604A (zh) * | 1991-12-01 | 1993-06-30 | 高真南 | 制备高免疫原性乙型肝炎疫苗的方法 |
WO1993012815A1 (en) * | 1991-12-27 | 1993-07-08 | Gensci Limited | Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1356413A (en) * | 1971-09-09 | 1974-06-12 | Pfizer Ltd | Method of obtaining purified australia antigen from blood serum |
US4088748A (en) * | 1976-11-02 | 1978-05-09 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis B surface antigen |
US4162192A (en) * | 1978-09-28 | 1979-07-24 | Juridical Foundation | Method for purification of HBs antigen |
FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
US4624918A (en) * | 1984-07-09 | 1986-11-25 | Genentech, Inc. | Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof |
US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
-
1986
- 1986-12-10 FR FR8617265A patent/FR2608052B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-12-03 EP EP87402743A patent/EP0273811B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-03 DE DE3750330T patent/DE3750330T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-03 AT AT87402743T patent/ATE109353T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-12-07 IL IL84729A patent/IL84729A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-12-09 DK DK645687A patent/DK645687A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-12-09 CA CA000553878A patent/CA1306689C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-09 NO NO875142A patent/NO171147C/no unknown
- 1987-12-09 PT PT86321A patent/PT86321B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-12-10 JP JP62313100A patent/JPS63215639A/ja active Pending
- 1987-12-10 KR KR870014091A patent/KR880007732A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL84729A (en) | 1993-02-21 |
DK645687D0 (da) | 1987-12-09 |
DE3750330T2 (de) | 1994-11-17 |
EP0273811A3 (en) | 1988-08-03 |
JPS63215639A (ja) | 1988-09-08 |
DE3750330D1 (de) | 1994-09-08 |
PT86321A (fr) | 1988-01-01 |
ATE109353T1 (de) | 1994-08-15 |
KR880007732A (ko) | 1988-08-29 |
NO171147C (no) | 1993-02-03 |
PT86321B (pt) | 1990-11-07 |
NO875142D0 (no) | 1987-12-09 |
FR2608052B1 (fr) | 1990-04-13 |
EP0273811B1 (fr) | 1994-08-03 |
DK645687A (da) | 1988-06-11 |
EP0273811A2 (fr) | 1988-07-06 |
NO875142L (no) | 1988-06-13 |
FR2608052A1 (fr) | 1988-06-17 |
IL84729A0 (en) | 1988-05-31 |
CA1306689C (en) | 1992-08-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR960004707B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제 방법 | |
von Ehrenstein | [76] Isolation of sRNA from intact Escherichia coli cells | |
JP3782104B2 (ja) | 医薬品等級プラスミドdnaの製造方法 | |
KR20180097558A (ko) | 지카 바이러스 백신 | |
EP0271667A1 (en) | Purification of pichia produced lipophilic proteins | |
EP2129684B1 (en) | Method of purification of hydrophobic proteins | |
CN112391383B (zh) | 一种质粒dna的产业化纯化方法及质粒dna | |
DK172936B1 (da) | Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst | |
CN108823245A (zh) | 一种病毒样颗粒的纯化方法 | |
KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
CN103131676A (zh) | 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用 | |
US3975344A (en) | Interferon purification | |
CN111378017B (zh) | 小反刍兽疫病毒的亚单位f蛋白及其制备方法和应用 | |
NO171147B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb | |
TWI268933B (en) | Method for separating protein from animal milk | |
CN113564129B (zh) | 一种狐狸逆转录病毒毒株及其应用 | |
CN109134622A (zh) | 口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法 | |
RU2230325C2 (ru) | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а | |
SE447789B (sv) | Forfarande for framstellning av forsommar-meningo-encephalitis-virus-vacciner och genom forfarandet framstellda vacciner | |
KR100257218B1 (ko) | 비형간염바이러스표면항원단백질의제조방법및이를포함하는비형간염백신 | |
CN108570098A (zh) | 一种百日咳多种抗原成分的分离纯化方法 | |
RU2080876C1 (ru) | Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита в, очищенная частица поверхностного антигена гепатита в человека и вакцина против гепатита в | |
EP0205625A1 (en) | Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation | |
RU2701692C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS X3351 - ПРОДУЦЕНТ ВАКЦИННОГО БЕЛКА gp 51 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | |
SU728720A3 (ru) | Способ получени вакцины против гепатита в |