NO171147B - Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb - Google Patents

Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb Download PDF

Info

Publication number
NO171147B
NO171147B NO875142A NO875142A NO171147B NO 171147 B NO171147 B NO 171147B NO 875142 A NO875142 A NO 875142A NO 875142 A NO875142 A NO 875142A NO 171147 B NO171147 B NO 171147B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
carried out
particles
centrifugation
hbsag
proteins
Prior art date
Application number
NO875142A
Other languages
English (en)
Other versions
NO171147C (no
NO875142D0 (no
NO875142L (no
Inventor
Philippe Jean Adamowicz
Marie Noelle Mevelec
Marc Girard
Original Assignee
Pasteur Vaccins
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Vaccins filed Critical Pasteur Vaccins
Publication of NO875142D0 publication Critical patent/NO875142D0/no
Publication of NO875142L publication Critical patent/NO875142L/no
Publication of NO171147B publication Critical patent/NO171147B/no
Publication of NO171147C publication Critical patent/NO171147C/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011Details
    • C12N2730/10011Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot hepatitt B.
Alle typer vanskeligheter som forekommer i forbindelse med industriell fremstilling av vaksiner mot hepatitt B ved rensing av antigenet HBsAG fra menneskeblod, har helt naturlig ledet til forskning for oppnåelse av antigeniske proteiner fra mikroorganismer som er transfisert med gener som koder hepatitt B viruset.
M. Michel et al. har uttrykt antigener fra kappen til hepatitt B viruset fra eggstokkceller hos kinesisk hamster (CHO)
(se M. Michel (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81,7708-7712), transfisert med et plasmid som bærer det fullstendige EBsAg-genet. Disse cellene utskiller kontinuerlig i cellekulturmediet HBsAg-partikler som inneholder både pre-S2- og S-proteiner.
Under en slik ekspresjon er imidlertid HBsAg-partiklene til stede i cellekulturmediet som inneholder uønskede stoffer slik som proteiner fra kalveserumet benyttet for cellevekst, celleproteiner og DNA og retrovirale partikler. Disse retrovirale partiklene kommer fra den opprinnelige cellen før transfeksjon.
Foreliggende oppfinnelse foreslår at disse ulempene over-vinnes ved tilveiebringelse av en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot viral hepatitt B ved ekspresjon av HBsAg-genet innført i CHO-celler, hvilket gjør det mulig å produsere en vaksine mot hepatitt B industrielt.
Et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte som gjør det mulig å fremstille en vaksine som har en ekstremt høy renhetsgrad, spesielt hva angår det cellulære DNA eller DNA-fragmenter samt hva angår retrovirusen som forurenser CHO-cellene.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en ny rekombinant vaksine mot hepatitt B, hvor antigeniske overflatepartikler av hepatitt B fremstilles ved ekspresjon fra en kultur av CEO-celler transfisert med et plasmid som bærer EBsAg-genet for derved å frigjøre de antigeniske overflatepartiklene i kulturmediet, karakterisert ved at man
utvinner supernatant-kulturmediet fra i det minste en kultur, fortrinnsvis foretatt med et lite animalsk serum-innhold,
utsetter supernatantmediet for steriliserende filtrering,
utsetter det for konsentrasjon, fortrinnsvis ca. 50
ganger, fortrinnsvis ved ultrafiltrering,
behandler konsentratet med et ikke-nedbrytende utfellingsmiddel valgt fra polyetylenglykol og ammoniumsulfat, under slike betingelser som utfeller de tunge DNA-materialene, hvilken utfelling også trekker med seg de retrovirale partiklene, og proteiner,
foretar en ny konsentrasjon av det antigeniske preparatet,
fortrinnsvis med et ikke-nedbrytende utfellingsmiddel under slike betingelser som utfeller de antigeniske EBsAg-overflatepartiklene, og deretter gjenoppløser bunnfallet i et lite volum,
utfører en hastighetsregulert sonesentrifugering i en ikke-kaotropisk densitetsgradient for retrovirusene slik at deres integritet bibeholdes for derved å oppnå deres separering fra EBsAg-partiklene, avhengig av deres stør-relse og densitet, fortrinnsvis ved også å oppnå distinksjon mellom de antigeniske EBsAg-partiklene på den ene side, og separering mellom EBsAg, DNA og proteiner på den annen side, — utfører en isopyknisk sentrifugering av
fIotasjonstypen, hvilket eliminerer de lette og tunge nukleinsyrene og proteinene, og
utfører kromatografi på en anionutveksler for å adsorbere sporene av nukleinsyrer og gjenværende ikke-EBsAg-proteiner.
Med ikke-nedbrytende utfellingsmidler menes midler som, naturligvis, ikke nedbryter EBsAg-antigenene og spesielt de av type S og pre S, men også slike som ikke har noen kotro-pisk eller dissosierende effekt for de retrovirale partiklene. Det foretrukne middel er polyetylenglykol (PEG). Som nevnt kan også ammoniumsulfat anvendes.
Rensetrinnene denaturerer således ikke EBsAg-partiklene og spesielt denaturerer de ikke pre S-proteinene som er de mest eksponerte. Blant egnede utfellingsmidler foretrekkes polyetylenglykol (PEG) ved mer spesielt å velge en molekylvekt av størrelsesorden 4.000-20.000, hvilket under egnede betingelser slik som mer spesielt en PEG-konsentrasjon av størrelsesorden 5$, gjør det mulig å utfelle de retrovirale partiklene samtidig som det også spesielt muliggjøres utfelling av de tunge DNA-klasser mens EBsAg-partiklene holdes i supernatanten. Disse partiklene kan utvinnes i et meget lite volum, fortrinnsvis etter å ha utfelt dem ved tilsetning av PEG til høyere konsentrasjon.
Densitetsgradienten i hvilken den hastighetsregulerte sonesentrifugeringen utføres, tilveiebringes også slik at den ikke får noen uheldig innvirkning på EBsAg-antigenet, inkludert S- og pre S-antigenititeter. Videre tilveiebringes denne gradienten slik at den ikke har noen kaotropisk effekt på de retrovirale partiklene slik at deres integritet opprettholdes. Denne gradienten som har lav ionisk styrke, er fortrinnsvis en sukrosegradient. I en variant kan andre densitetsgradienter også benyttes, spesielt glycerol.
Den hastighetsregulerte sonesentrifugeringen som utføres i en slik densitetsgradient, muliggjør eliminering av de retrovirale partiklene på en meget effektiv måte. Samtidig kan en viss DNA-rensing oppnås, spesielt i tunge kjeder og i proteiner.
Den isopykniske sonesentifugeringen av fIotasjonstypen på en saltoppløsning-densitetsgradient, slik som KBr, foretas derved på et preparat som praktisk talt er fullstendig fritt for retrovirale partikler. Dersom retovirale partikler forurenser prøven som skal renses, ville imidlertid den kaotropiske effekten til saltet som danner densitetsgradienten, ødelegge den virale struktur og ville frigjøre det virale RNA-genomet i den tette sonen av gradienten hvor det ville stoppe og derved gjøre det mulig å separere fra HBsAg-antigenet.
Dette trinnet muliggjør eliminering av praktisk talt alle proteinene samt eksisterende lette eller tunge DNA-spor.
Ytterlig sørger trinnet med anionutvekslingskromatografi for adsorpsjon av mulige nukleinsyrespor samt av DNA og RNA som fremdeles er tilbake og av proteiner.
Andre fordeler og egenskper ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra nedenstående eksempel.
1. Fremstilling av cellekulturen
En CHO-cellekoloniklon transfisert med et rekombinant plasmid (FR-A 84 03564 publisert som FR 2 560 890) som bærer genet for hepatitt B-viruset som koder for HBS-antigenet (pre S- og S-områder), formeres fra en beholder med celleforråd, i fer-menter ingsenheter av økende volumer. Den siste formeringen utføres i en 300 liters fermentor, idet cellene formeres på mikrokuler i suspensjon i kulturmediet. For disse for-meringstrinnene inneholder vekstmediet 4-10$ CS (kalveserum), fortrinnsvis 5$.
2. Kulturer, innhøsting og konsentrasjon
Den første innhøsting foretas etter 3-4 dager med dyrking i 300 liters fermentoren: Etter dekantering av kulene som understøtter cellene, fjernes 250 1 supernatant og erstattes med et ekvivalent volum av nytt medium inneholdende 0,2-4$ CS, fortrinnsvis 1-2$. Celledyrkingen fortsettes i fermentoren i 3-4 dager, hvoretter en ny innhøsting av 250 1 foretas. Denne operasjonen kan foretas med opptil 10 suksessive inn-høstinger, og disse holdes ved +4°C for rensing derav. Som en generell regel har den første innhøstingen og innhøsting nr. 7 og de etterfølgende et lavt HBs-antigeninnhold slik at de ikke bibeholdes for rensingstrinnene.
I dette eksempelet ble innhøstinger 2-6 beholdt for rensing og inneholdt 1% CS.
Etter blanding av innhøstingsmaterialet filtreres preparatet, som har et volum på 1.250 1, på en 0,2 mikrometer membran, konsentreres deretter ved ultrafiltrering ca. 50 ganger på en membran med et sperrepunkt på 100.000 dalton, hvilket gir konsentrert innhøstingsmateriale R.
3. Fraksjonerte utfellinger
Det konsentrerte innhøstingsmaterialet R underkastes fraksjonering ved selektiv utfelling i et første trinn for de høymolekylvektige komponentene, spesielt tunge klasser av DNA og retrovirale partikler, idet HBS-antigenet forblir i suspensjon, og i et annet trinn utfelles EBs-antigenet. Ut-fellingsmiddelet velges slik at de retrovirale partiklene beholder sin opprinnelige størrelse og densitet på den ene side, og på den annen side slik at antigenisiteten til HBs-partiklene ikke påvirkes i uheldig grad. Det foretrukne utfellingsmiddel er polyetylenglykol, fortrinnsvis av 6.000
MW.
En konsentrasjon på 5$ av PEG 6000 anvendes for den første utfellingen, og det oppnådde bunnfall elimineres ved sentrifugering. PEG 6000 tilsettes til supernatanten S for en endelig konsentrasjon av 9,5$; idet bunnfallet etter sentrifugering oppløses fullstendig i et volum som er lik omtrent en 625-del av det behandlede innhøstingsvolum, nemlig ca. 2 liter, av antigenisk EC-preparat.
Ved dette trinnet er ytelsesevnen m.h.t. eliminering av det cellulære DNA, og ikke-HBsAg-protein gitt ved verdiene i følgende tabell:
Mens utvinningsgraden av EBs-antigenene er 80$, ble det notert elimineringsfaktorer på 42.000 for DNA og 38,5 for proteinene.
Revers-transkriptaseaktiviteten som reflekterer retrovirus-innholdet, er ikke detekterbar i innhøstingene, og er enkelte ganger svakt positiv i innhøstingsmaterialaet som er konsentrert 50 ganger, og den er i alle tilfeller negativ i supernatanten etter behandling med 5$ PEG.
Effekten m.h.t. fjerning av et retrovirus ved hjelp av dette behandlingstrinnet med 5$ PEG ble målt ved å supplere et konsentrert innhøstingsmateriale med MuLV (murin-leukemi virus), og dette ga en elimineringsfaktor på 7.
4. Hastighetsregulert sonesentrifugering
En sukrosegradient (0-40$) dannes i en K2-Electronucleonics rotor (se Progress in Separation and Purification, utgiver Perry og Van Oss, Copywright 1971 av John Wiley and Sons, Inc., USA.): når rotasjonshastigheten når 35.000 omdr./min., tilføres rotoren ved en kontinuerlig strømningshastighet på 2 l/time først 500 ml av EC-prøve som skal renses (konsentrat), deretter i de neste 30 min. tilføres en f osfatbuf f er, 65 mm, pH 6,8. Etter stopping av rotoren fraksjoneres innholdet i rotoren, og fraksjonene titreres med henblikk på deres innhold av HBs-antigen. De HBsAg-rike fraksjonene finnes også her i gradientens mindre tette lag, som inneholder mindre enn 5$ sukrose; de blandes under identiske forhold med dem som oppnås fra behandlingen av andre 500 ml konsentratfraksjoner.
Blandingen av disse fraksjonene dialyseres for derved å fjerne sukrosen og konsentreres deretter ved ultrafiltrering til et volum på 0,361 1. Dette gir et preparat Z10. HBsAg-utbyttet er 80$. Ytelsesevnen m.h.t. fjerning av EDNA og ikke-HBsAg-proteiner var:
Selvom det herved oppnås betydelig resultater m.h.t. fjerning r av DNA og ikke-HBsAg-proteiner, så er den aktuelle sentri-fugeringshastigheten av særlig interesse p.g.a. dens effekt når det gjelder å oppnå distinksjon mellom antigenet og de retrovirale partiklene.
Således, når konsentratet med hensikt forurenses med et murin-retrovirus (murin-leukemi virus) og deretter underkastes sentrifugering under de nevnte forhold, så gjenfinnes de retrovirale partiklene titrert ved revers transkriptase i gradientens tette lag med en enzymatisk aktivitetstopp ved 33-35$ sukrose.
Retroviruspartiklene har knyttet seg til deres iso-tette sone i gradienten ved å bevege seg gjennom størstedelen av gradienten, mens HBsAg-partiklene, som har lavere sedimenterings-konstant (40s), samtidig kun har beveget seg over en liten strekning av gradienten. Separering derav oppnås ved hjelp av en kort sentrifugeringstid.
Revers-transkriptaseaktiviteten målt i blandingen av de HBsAg-rike fraksjonene representerer 0,013$ av det som finnes i retrovirustoppen, nemlig en fjerningsfaktor på 77.
5. Isopycnisk sentrifugering av fIotasjonstypen
Rotoren er en sonerotor av typen TI15-Beckman sonal av Beckman, Palo Alto, California, USA, med en total kapasitet på ca. 1700 ml (se A. Fritsch, Les Centrifications Prépara-tives en Gradient de densité, 2. utgave). En densitetsgradient dannes ved innføring ved rotorens periferi av suksessive volumer av kaliumbromidoppløsning (KBr) for derved å oppnå en gradient med densiteter mellom 1,17 og 1,35. Et av de introduserte lag er dannet av den prøve til hvilken KBr har blitt tilsatt slik at lagets densitet er lik 1,25, slik at ved begynnelsen av sentrifugeringen finnes alle urenhetene og antigenet i gradientens tette del.
Etter sentrifugering ved 31.000 omdr./min. i 20 timer og etter fraksjonering av rotorens innhold, finnes HBsAg-partiklene i deres iso-tette sone (d 1,22-1,23), mens praktisk talt alle de andre proteinene og DNA'en finnes i gradientens tette lag. Blandingen av de EBsAg-rike fraksjonene dialyseres mot fosfatbuffer 65 mM pH 6,8 for å fjerne KBr og utbalansere prøven i bufferen som vil bli benyttet for kromatografi. Preparat Z20 oppnås.
Mens HBsAg-utbyttet i denne sentrifurering er nær 100$, ble meget høye elimineringsfaktorer for DNA og ikke-HBsAg-protein oppnådd.
De er henholdsvis 350 for DNA og 58 for nevnte ikke-HBsAg-proteiner.
En retrovirus-fjerningsfaktor kunne ikke beregnes i dette trinnet fordi revers-transkriptaseaktiviteten blir totalt ødelagt i et KBr-medium. Denne inaktivering skyldes sann-synligvis den kaotropiske effekten til saltet på viruset. Det er interessant å bemerke at denne kaotropiske effekten skulle frigjøre det virale genomet (RNA) i mediet, hvilket ville være til stede etter sentrifugering i de tette gradi-entlagene slik som den cellulære DNA, og skilte seg således fra antigen-toppen.
6. Anionutvekslingskrornatografi
Det antigeniske preparatet Z20 dialysert etter isopycnisk sentrifugering, føres på Whatman DE 52-cellulose som på for-hånd er utbalansert i en fosfatbuffer 65 mM pH 6,8. Under disse betingelsene blir HBS-antigenet ikke adsorbert på utveksleren, mens de resterende spor av DNA og de forurensende proteiner fikseres på utveksleren:
En høy elimineringsfaktor på 25 ganger oppnås for ikke-HBsAg-proteinene, mens DNA ikke lenger er detekterbar ved hjelp av dot-blot-teknikken etter hybridisering med en probe merket med P32 (sensitivitetsgrense = 12,5 pg/ml).
For å måle elimineringsfaktoren for DNA ble det til et sett 20-preparat tilsatt en kjent mengde DNA, og kromatografering ble foretatt på anionutveksleren. DNA-mengden funnet i ut-løpet fra kolonnen var 1000-10.000 ganger mindre enn den innledende mengde.
Det således oppnådde antigeniske preparat hadde etter rensing følgende egenskaper:
Etter elektroforese på polyakrylamidgel 1 et dissosiasjons-medium spredte polypeptidene farget med sølvnitrat seg utover tre hovedbånd: .P22 meci en tilsynelatende molekylvekt på 22.000 dalton .P26 med tilsynelatende molekylvekt på 26.000 dalton .P34 med en tilsynelatende molekylvekt på 34.000 dalton
som alle tre gjenkjennes ved immunoavtrykk med et anti-S monoklonalt antistoff hvor bare P34 polypeptidet gjenkjennes med et anti-pre S 2 monoklonalt antistoff.
7. Fremstilling av vaksiner og immunogenisitet
Det kromatograferte preparatet filtreres på en ste-ril iser ingsmembran, oppvarmes deretter til +60°C i 60 min. og etter avkjøling tilsettes formaldehyd (100 jjg/ml) og in-kubasjon foretas i 48 timer ved +30°C. Dette antigeniske preparatet fortynnes i en fysiologisk buffer, og et additiv slik som aluminiumhydroksyd tilsettes for oppnåelse av vaksiner.
Forskjellige doser av HBsAg-antigener ble injisert subkutant i marsvin, og antistoff-reaksjonene (anti-S og anti-pre S 2) ble målt og sammenlignet med dem oppnådd i dyr som var injisert med like doser av antigen oppnådd fra menneskeplasma (Hevac B vaksine - Pasteur Vaccins Mårnes La Coquette-Frankrike).
Anti-S-antistoffene, generelt betegnet anti-HBsAg, ble målt ved hjelp av Ausab-Abbott-teknikken (Abbott Laboratories, USA) og anti-pre S2-antistof f ene ble målt ved hjelp av den immunoenzymatiske metoden ved bruk av et syntetisk peptid med 31 aminosyrer på den faste fasen, inkludert pre S2-epitopen, for derved å fange antistoffene som ble gjenkjent i et annet trinn, med et anti-IgG-antistoff konjugert med peroksydase; etter tilsetning av substratet (H2O2) pg av et kromogen (ortofenylendiamin), ble det utviklede farven målt ved 492 nm, hvis intensitet var proporsjonal med mengden av opp-fangede antistoffer.
Som resultatene i tabellen viser oppnås en ekvivalent anti-S respons eller reaksjon med de to typene av hepatitt B vaksine, mens en høyere anti-pre S2 respons eller reaksjon observeres med den rekombinante vaksinen (CHO).

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en ny rekombinant vaksine mot hepatitt B, hvor antigeniske overflatepartikler av hepatitt B dannes ved ekspresjon fra en kultur av CHO-celler som er transfisert med et plasmid som bærer HBsAg-genet for derved å frigjøre de antigeniske overflatepartiklene i kulturmediet, karakterisert ved at supernatant-kulturmediet fra i det minste en kultur utvinnes, spesielt i et medium med et lavt innhold av animalsk serum, supernatanten underkastes steriliserende filtrering, supernatanten konsentreres, konsentratet utfelles ved hjelp av et ikke-nedbrytende utfellingsmiddel valgt fra polyetylenglykol og ammoniumsulfat, under betingelser som utfeller de tunge DNA-klassene, de retrovirale partiklene og proteiner, en ny konsentrasjon utføres, en hastighetsregulert sonesentrifugering utføres i en ikke-kaotropisk densitetsgradient for de retrovirale partiklene og valgt slik at det oppnås separering av disse fra HBsAg-partiklene, avhengig av deres størrelse og densitet, en isopycnisk sonesentrifugering av fIotasjonstypen utføres, hvilket fjerner de lette og tunge nukleinsyrene og proteinene, og kromatografi på et anionutvekslingsmedium foretas for derved å adsorbere de gjenværende spor av nukleinsyrer og gjenværende ikke-HBsAg-proteiner.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det foretas utfelling med polyetylenglykol, spesielt PEG 6000.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det foretas en første utfelling med en PEG-konsentrasjon av størrelsesorden 5$.
4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at den nye konsentra-sjonen utføres med et ikke-nedbrytende middel som utfeller de antigeniske EBsAg-partiklene, hvoretter bunnfallet oppløses på nytt i et lite volum.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at utfellingen foretas med PEG, spesielt PEG 6000 ved 9,5$.
6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at den hastighetsregulerte sonesentrifugeringen utføres i en sukrosegradient.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at sentrifugeringen utføres i en K-2-Electronucleonic rotor.
8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 6 og 7, karakterisert ved at de fraksjoner som har en sukrosegrad mindre enn 25$ utvelges, idet de andre fraksjonene kasseres.
9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at sonesentrifugeringen av rotasjonstypen utføres i en KBr-gradient.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at fraksjonene med densitetstoppen 1,22-1,23 oppsamles.
11. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, karakterisert ved at kromatografi utføres på DE 52-cellulose.
NO875142A 1986-12-10 1987-12-09 Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb NO171147C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8617265A FR2608052B1 (fr) 1986-12-10 1986-12-10 Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO875142D0 NO875142D0 (no) 1987-12-09
NO875142L NO875142L (no) 1988-06-13
NO171147B true NO171147B (no) 1992-10-26
NO171147C NO171147C (no) 1993-02-03

Family

ID=9341743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO875142A NO171147C (no) 1986-12-10 1987-12-09 Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0273811B1 (no)
JP (1) JPS63215639A (no)
KR (1) KR880007732A (no)
AT (1) ATE109353T1 (no)
CA (1) CA1306689C (no)
DE (1) DE3750330T2 (no)
DK (1) DK645687A (no)
FR (1) FR2608052B1 (no)
IL (1) IL84729A (no)
NO (1) NO171147C (no)
PT (1) PT86321B (no)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1073604A (zh) * 1991-12-01 1993-06-30 高真南 制备高免疫原性乙型肝炎疫苗的方法
WO1993012815A1 (en) * 1991-12-27 1993-07-08 Gensci Limited Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1356413A (en) * 1971-09-09 1974-06-12 Pfizer Ltd Method of obtaining purified australia antigen from blood serum
US4088748A (en) * 1976-11-02 1978-05-09 Merck & Co., Inc. Hepatitis B surface antigen
US4162192A (en) * 1978-09-28 1979-07-24 Juridical Foundation Method for purification of HBs antigen
FR2560890B1 (fr) * 1984-03-07 1987-10-16 Grp Genie Genetique Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention
US4624918A (en) * 1984-07-09 1986-11-25 Genentech, Inc. Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them

Also Published As

Publication number Publication date
IL84729A (en) 1993-02-21
DK645687D0 (da) 1987-12-09
DE3750330T2 (de) 1994-11-17
EP0273811A3 (en) 1988-08-03
JPS63215639A (ja) 1988-09-08
DE3750330D1 (de) 1994-09-08
PT86321A (fr) 1988-01-01
ATE109353T1 (de) 1994-08-15
KR880007732A (ko) 1988-08-29
NO171147C (no) 1993-02-03
PT86321B (pt) 1990-11-07
NO875142D0 (no) 1987-12-09
FR2608052B1 (fr) 1990-04-13
EP0273811B1 (fr) 1994-08-03
DK645687A (da) 1988-06-11
EP0273811A2 (fr) 1988-07-06
NO875142L (no) 1988-06-13
FR2608052A1 (fr) 1988-06-17
IL84729A0 (en) 1988-05-31
CA1306689C (en) 1992-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR960004707B1 (ko) B형 간염 표면 항원의 정제 방법
von Ehrenstein [76] Isolation of sRNA from intact Escherichia coli cells
JP3782104B2 (ja) 医薬品等級プラスミドdnaの製造方法
KR20180097558A (ko) 지카 바이러스 백신
EP0271667A1 (en) Purification of pichia produced lipophilic proteins
EP2129684B1 (en) Method of purification of hydrophobic proteins
CN112391383B (zh) 一种质粒dna的产业化纯化方法及质粒dna
DK172936B1 (da) Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst
CN108823245A (zh) 一种病毒样颗粒的纯化方法
KR910008643B1 (ko) B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법
CN103131676A (zh) 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用
US3975344A (en) Interferon purification
CN111378017B (zh) 小反刍兽疫病毒的亚单位f蛋白及其制备方法和应用
NO171147B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb
TWI268933B (en) Method for separating protein from animal milk
CN113564129B (zh) 一种狐狸逆转录病毒毒株及其应用
CN109134622A (zh) 口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法
RU2230325C2 (ru) Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а
SE447789B (sv) Forfarande for framstellning av forsommar-meningo-encephalitis-virus-vacciner och genom forfarandet framstellda vacciner
KR100257218B1 (ko) 비형간염바이러스표면항원단백질의제조방법및이를포함하는비형간염백신
CN108570098A (zh) 一种百日咳多种抗原成分的分离纯化方法
RU2080876C1 (ru) Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита в, очищенная частица поверхностного антигена гепатита в человека и вакцина против гепатита в
EP0205625A1 (en) Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation
RU2701692C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS X3351 - ПРОДУЦЕНТ ВАКЦИННОГО БЕЛКА gp 51 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
SU728720A3 (ru) Способ получени вакцины против гепатита в