DE3750330T2 - Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B.
- Die Schwierigkeiten aller Art, auf die man bei der industriellen Herstellung von Impfstoffen gegen Hepatits B durch Reinigung des Antigens HBsAg ausgehend von menschlichem Blut stößt, haben ganz natürlich dazu geführt, die Expression von antigenen Proteinen ausgehend von Mikroorganismen, die mit Genen transfiziert sind, die für das Hepatitis B-Virus kodieren, anzustreben.
- M. Michel et al. haben Antigene der Hülle des Hepatitis B-Virus ausgehend von Ovarialzellen des chinesichen Hamsters (CHO) (siehe die Literaturstelle 1), die mit einem Plasmid transfiziert waren, das das vollständige HBsAg-Gen trug, exprimiert. Diese Zellen scheiden auf kontinuierliche Weise im Zellkulturmedium HBsAg-Teilchen aus, die zugleich die Proteine Prä-52 und S enthalten.
- Jedoch befinden sich bei dieser Expression die HBsAg-Teilchen im Zellkulturmedium, das unerwünschte Substanzen enthält, wie beispielsweise Proteine des verwendeten Kälberserums, das für das Zellwachstum verwendet wird, zelluläre Proteine und DNA und retrovirale Teilchen. Diese retroviralen Teilchen stammen aus der Originalzelle vor Transfektion her.
- Die Patentanmeldung EP-A-0 168 234 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von HBsAg, das durch Expression in rekombinanten Zellen erhalten wurde. In diesem Verfahren wird der Kulturüberstand, der zuvor konzentriert worden ist, einer Fraktionierung durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat in zwei Schritten unterzogen, dialysiert, dann einer Chromatographie auf Anionenaustauscher, die einer Gelpermeationschromatographie vorangeht, unterzogen. Als Variante können diese Chromatographien durch eine Immunaffinitätsadsorption ersetzt werden.
- Ein solches Verfahren ist kostspielig, da es die Behandlung durch Chromatographie oder durch Immunaffinität des Präparats erfordert, welches noch einen nennenswerten Prozentsatz an Verunreinigungen aufweist. Darüberhinaus wäre es unbrauchbar, um die Entfernung von retroviralen Teilchen zu garantieren, die im Kulturüberstand anwesend sind.
- Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, diese Nachteile zu überwinden und ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen die virale Hepatitis B durch Expression des HBsAg-Gens, das in CHO-Zellen eingeführt wurde, bereitzustellen, welches es gestattet, aufindustrielle Weise einen Impfstoff gegen Hepatitis B herzustellen.
- Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein solches Herstellungsverfahren bereitzustellen, das es gestattet, einen derartigen Impfstoff zu erzeugen, der einen extrem hohen Reinheitsgrad aufweist, insbesondere bezüglich DNA oder Fragmente zellulärer DNA sowie bezüglich des Retrovirus, der die CHO-Zellen kontaminiert.
- Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, einen solchen Impfstoff bereitzustellen, der ein besonders hohes Schutzvermögen aufweist.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinierten Impfstoffs gegen Hepatitis B, der gleichzeitig die Proteine Prä-S2 und S des Oberflächenantigens des Hepatitis B-Virus enthält, in dem man antigene Oberflächenteilchen von Hepatitis B ausgehend von einer Kultur von CHO-Zellen, die mit einem das HBsAg-Gen tragenden Plasmid transfiziert sind, durch Expression derart erzeugt, daß die antigenen Oberflächenteilchen im Kulturmedium freigesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, daß
- - man das überstehende Kulturmedium mindestens einer vorzugsweise mit einem schwachen Tierserumgehalt durchgeführten Kultur gewinnt,
- - man eine Sterilfiltration des Überstands vornimmt,
- - man eine vorzugsweise 50fache Konzentration des Überstands vornimmt, vorzugsweise durch Ultrafiltration,
- - man eine Fällung des Konzentrats vornimmt mit Hilfe eines Fällungsmittels, das nicht abbauend ist, unter Bedingungen, die die schweren Klassen von DNA fällen, wobei die Fällung auch die retroviralen Teilchen und Proteine mitschleppt,
- - man eine erneute Konzentration des antigenen Präparats vornimmt mit Hilfe eines Fällungsmittels, das nicht abbauend ist, unter Bedingungen, die die antigenen HBsAg- Oberflächenteilchen fällen, dann den Niederschlag in einem geringen Volumen aufnimmt,
- - man eine Geschwindigkeits-Zonalzentrifugation in einem Gradienten vornimmt, der für die retroviralen Teilchen nicht chaotrop ist, so daß deren Integrität erhalten bleibt, um die Abtrennung von HBsAg-Teilchen nach deren Größe und Dichte zu gestatten, wobei man vorzugsweise auch eine Unterscheidung zwischen den antigenen HBsAg-Teilchen einerseits und andererseits eine Auftrennung zwischen HBsAg, DNA und Proteinen erhält,
- - man eine isopyknische Flotations-Zonalzentrifugation vornimmt, die die leichten und schweren Nukleinsäuren und die Proteine entfernt, und
- - man eine Chromatographie auf einem Anionenaustauscher vornimmt, um die verbleibenden Spuren von Nukleinsäuren und der verbleibenden Nicht-HBsAg-Proteine zu adsorbieren.
- Unter Fällungsmitteln, die nicht abbauend sind, versteht man Mittel, die natürlich die HBsAg-Antigene, und insbesondere diejenigen vom Typ S und Prä-S, nicht abbauen, die aber auch keine chaotrope oder dissoziierende Wirkung auf die retroviralen Teilchen aufweisen. Das bevorzugte Mittel ist Polyethylenglykol (PEG). Unter den anderen Mitteln kann man insbesondere Ammoniumsulfat aufführen.
- Die Reinigungsschritte denaturieren demgemäß die HBsAg-Teilchen nicht, und insbesondere denaturieren sie nicht die Prä-S- Proteine, die die exponiertesten sind. Unter den geeigneten Fällungsmitteln zieht man Polyethylenglykol (PEG) vor, wobei man insbesondere ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 4000 bis 20000 wählt, was unter geeigneten Bedingungen, insbesondere denjenigen einer PEG-Konzentration in der Größenordnung von 5%, gestattet, die retroviralen Teilchen zu fällen, wobei dies ebenso gestattet, insbesondere die schweren Klassen von DNA zu fällen, während im Überstand des Niederschlags die HBsAg-Teilchen verbleiben. Diese können in einem sehr geringen Volumen, vorzugsweise nachdem man sie durch Zugabe von PEG mit einer größeren Konzentration gefällt hat, gewonnen werden.
- Der Dichtegradient, in dem man die Geschwindigkeits- Zonalzentrifugation bewirkt, wird ebenfalls so vorgesehen, daß das HBsAg-Antigen, einschließlich der Antigenitäten von S und Prä-S, nicht verändert wird. Darüberhinaus wird dieser Gradient so vorgesehen, daß er keine chaotrope Wirkung auf die retroviralen Teilchen ausübt, so daß deren Integrität erhalten bleibt. Vorzugsweise ist dieser Gradient von geringer Ionenstärke ein Saccharose-Gradient. Als Variante kann man auch andere Dichtegradienten, insbesondere Glycerin, verwenden.
- Die Geschwindigkeits-Zonalzentrifugation, die so in einem derartigen Dichtegradienten bewirkt wird, gestattet auch auf äußerst wirksamen Weise die Entfernung der retroviralen Teilchen. Gleichzeitig kann man eine gewisse Reinigung bezüglich DNA, insbesondere der schweren Ketten, und bezüglich Proteinen erreichen.
- Die isopyknische Flotations-Zonalzentrifugation auf einem Salzdichtegradienten, wie beispielsweise KBr, wird demgemäß mit einem Präparat, das praktisch völlig frei von retroviralen Teilchen ist, durchgeführt. Wenn jedoch retrovirale Teilchen die zu reinigende Probe verunreinigen, würde die chaotrope Wirkung des Salzes, das den Dichtegradienten aufbaut, die Virusstruktur zerstören und das RNA-Virusgenom in der dichten Zone des Gradienten freisetzten, wo es verbleiben würde, was demgemäß die Abtrennung des HBsAg-Antigens gestatten würde.
- Dieser Schritt gestattet eine Entfernung von praktisch allen Proteinen sowie von verbleibenden Spuren leichter oder schwerer DNA.
- Schließlich gestattet der Schritt der Ionenaustauschchromatographie die eventuellen Spuren von Nukleinsäuren, sowohl von noch verbleibender DNA als auch RNA, und von Proteinen zu adsorbieren.
- Andere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beschreibung, die als nicht-beschränkendes Beispiel gegeben wird, offenkundig.
- Ein Klon der Zellinie CHO, der mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert ist (Patentanmeldung FR-A-84 03564, veröffentlicht unter der Nr. 2 560 890), welches das Gen des Hepatitis B-Virus umfaßt, das für das HBs-Antigen (die Regionen Prä-S und S) kodiert, wird ausgehend von einer Ampulle der Zellbank zu Fermentationseinheiten mit wachsenden Volumina verdünnt (d multiplie). Die letzte Verdünnung (demultiplication) wird in einem 300 l-Fermentor durchgeführt, wobei sich die Zellen auf im Kulturmedium suspendierten Mikrokügelchen ausbreiten. Für diese Verdünnungsschritte enthält das Wachstumsmedium 4 bis 10% SV (Kälberserum), vorzugsweise 5%.
- Die erste Ernte wird am Ende von 3 bis 4 Tagen der Kultur in dem 300 l-Fermentor durchgeführt: nach Dekantieren der Kügelchen, die die Zellen tragen, werden 250 l Überstandsmedium abgezogen und durch ein äquivalentes Volumen an neuem Medium, das 0,2 bis 4%, vorzugsweise 1 bis 2%, SV enthält, ersetzt. Die Zellkultur wird 3 bis 4 Tage in dem Fermentor fortgesetzt, an deren Ende eine neue Ernte von 250 l durchgeführt wird. Man kann so mit bis zu 10 aufeinanderfolgenden Ernten verfahren, die bei +4ºC bis zur Reinigung aufbewahrt werden. Als allgemeine Regel weisen die erste Ernte, die Ernte Nr. 7 und die darauffolgenden einen geringen HBs-Antigentiter auf, so daß sie nicht für die Reinigungsschritte aufbewahrt werden.
- In dem vorliegenden Beispiel wurden die Ernten Nr. 2 bis 6 zur Reinigung aufbewahrt und enthielten 1% SV.
- Nach Mischen der Ernten wird das Präparat mit einem Volumen von 1250 l über eine 0,2 um-Membran filtriert, dann durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einem Abschnittspunkt von 100 000 Dalton ungefähr 50fach konzentriert, was die konzentrierte Ernte R ergibt.
- Die konzentrierte Ernte R wird einer Fraktionierung durch selektive Fällungen unterzogen, beim ersten Mal von Verbindungen mit höheren Molekulargewichten, insbesondere schwerer DNA-Klassen und retroviralen Teilchen, wobei das HBs- Antigen in Suspension verbleibt, und beim zweiten Mal des HBs- Antigens. Das Fällungsmittel wird so gewählt, daß einerseits die retroviralen Teilchen ihre ursprüngliche Größe und Dichte behalten und andererseits die Antigenität der HBs-Teilchen nicht verändert wird. Das bevorzugte Fällungsmittel ist Polyethylenglykol, vorzugsweise PM 6000.
- Man verwendet für die erste Fällung eine Konzentration von 5% PEG 6000, und der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand S wird mit PEG 6000 auf eine Endkonzentration von 9,5% (Gew./Vol.) versetzt; nach Zentrifugieren wird der Niederschlag vollständig in einem Volumen, das ungefähr gleich dem 625. Teil des behandelten Erntevolumens ist, gelöst, was ungefähr 2 l antigenes Präparat EC ergibt.
- In diesem Stadium werden die Leistungen der Entfernung der zellulären DNA und der Nicht-HBsAg-Proteine in der folgenden Tabelle angegeben: Volumen in l gesamt Nicht-HBsAg-Proteine Mischung Ernte R Überstand S
- Obwohl der Prozentsatz der Rückgewinnnung des HBs-Antigens 80% betrug, sind Entfernungsfaktoren von 42000 für DNA und 38,5 für die Proteine festgestellt worden.
- Die Reverse Transkriptase-Aktivität, die die Retrovirustiter widerspiegelt, ist in den Ernten nicht nachweisbar und gelegentlich leicht positiv in der Ernte, die 50fach konzentriert ist, und in allen Fällen ist sie im Überstand nach Behandlung mit PEG 5% (Gew./Vol.) negativ.
- Das Entfernungsvermögen für ein Retrovirus durch diesen Schritt der Behandlung mit 5% (Gew./Vol.) PEG ist durch Versetzten mit einer konzentrierten Ernte mit MuLV (Mäuse-Leukämievirus) gemessen worden: ein Entfernungsfaktor von 7 wurde erhalten.
- Ein Saccharose-Gradient (0-40%) wird in einem Rotor K2- Electronucleonics (Literaturstelle 2) gebildet; wenn die Rotationsgeschwindigkeit 35000 U/min erreicht, wird der Rotor mit einem kontinuierlichen Durchsatz von 2 l/h zuerst mit 500 ml zu reinigender EC-Probe (Konzentrat), dann in den folgenden 30 min mit einem 65 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, beschickt. Nach Anhalten des Rotors wird der Inhalt des Rotors fraktioniert, und die Fraktionen werden auf ihren Gehalt an HBs-Antigen titriert. Die mit HBsAg angereicherten Fraktionen werden in den weniger dichten Schichten des Gradienten gefunden, der weniger als 25% (Gew./Vol.) Saccharose enthält; sie werden mit denen gemischt, die aus der Behandlung unter identischen Bedingungen aus anderen Fraktionen von 500 ml Konzentrat hervorgegangen sind.
- Die Mischung dieser Fraktionen wird dialysiert, um die Saccharose zu entfernen, und anschließend durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 0,36 l konzentriert. Man erhält ein Präparat Z10. Die Ausbeute an HBsAg beträgt 80%. Die Leistungen der Entfernung von DNA und von Nicht-HBsAg-Proteinen sind gewesen: Volumen in l gesamt Nicht-HBsAg-Proteine
- Obwohl diese Geschwindigkeitszentrifugation beachtliche Ergebnisse der Entfernung von DNA und von Nicht-HBsAg-Proteinen ergibt, ist sie vor allem für ihr Vermögen der Unterscheidung zwischen dem Antigen und den retroviralen Teilchen von Bedeutung. In der Tat findet man, wenn das Konzentrat willkürlich mit einem Mäuse-Retrovirus (Mäuse-Leukämievirus) verunreinigt, dann einer Zentrifugation unter den vorstehend zitierten Bedingungen unterworfen wird, die retroviralen Teilchen, die mit Reverser Transkriptase titriert werden, in den dichten Schichten des Gradienten mit einem enzymatischen Aktivitätspeak bei 33-35% Saccharose.
- Die retroviralen Teilchen haben ihre gleich dichte Zone des Gradienten erreicht, indem sie den größten Teil des Gradienten durchlaufen haben, während gleichzeitig die HBsAg-Teilchen mit einer geringeren Absetzungskonstanten (40 S) nur einen geringen Weg im Gradienten zurückgelegt haben. Ihre Abtrennung wird durch eine kurze Zentrifugationszeit sichergestellt.
- Die Reverse Transkriptase-Aktivität, die in der Mischung von Fraktionen, die mit HBsAg angereichert sind, gemessen wird, stellt 0,013% von derjenigen dar, die im retroviralen Peak gefunden wird, was ein Entfernungsfaktor von 77 ist.
- Der Rotor ist ein Zonalrotor vom Typ Ti15-Beckman, der durch die Firma Beckman, Palo Alto, Kalifornien, USA, im Handel ist, mit einer Gesamtkapazität von ungefähr 1700 ml (Literaturstelle 3). Ein Dichtegradient wird aufgebaut, indem man durch den äußeren Teil des Rotors aufeinanderfolgende Volumina von Kaliumbromid(KBr)-Lösung derart einführt, daß ein Dichtegradient zwischen 1,17 und 1,35 eingeschlossen aufgebaut wird. Eine der eingeführten Schichten besteht aus der mit KBr so versetzten Probe, daß die Dichte der Schicht gleich 1,25 ist, derart, daß am Beginn der Zentrifugation alle Verunreinigungen und das Antigen sich im dichten Teil des Gradienten befinden.
- Nach 20stündiger Zentrifugation bei 31000 U/min und nach Fraktionierung des Inhalts des Rotors werden die HBsAg-Teilchen in der mit ihnen gleich dichten Zone (d 1,22-1,23) gefunden, während fast alle anderen Proteine und die DNA in den dichteren Schichten des Gradienten gefunden werden. Die Mischung der mit HBsAg angereicherten Fraktionen wird gegen 65 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, dialysiert, um das KBr zu entfernen und die Probe in dem Puffer zu äquilibrieren, welcher für die Chromatographie verwendet wird. Man erhält das Präparat Z20.
- Obwohl die Ausbeute an HBsAg in dieser Zentrifugation nahezu 100% beträgt, werden sehr bedeutende Entfernungsfaktoren für DNA und Nicht-HBsAg-Proteine erhalten: Volumen in l gesamt Nicht-HBsAg-Proteine
- Sie sind 350 für die DNA bzw. 58 für die Nicht-HBsAG-Proteine.
- Ein Faktor für die Entfernung für Retrovirus konnte in diesem Schritt nicht berechnet werden, da die Aktivität der Reversen Transkriptase im KBr-Medium vollständig zerstört wird. Diese Inaktivierung hat ihren Grund wahrscheinlich in der chaotropen Wirkung des Salzes auf das Virus. Es ist von Bedeutung festzustellen, daß diese chaotrope Wirkung das Virusgenom (RNA) im Medium freisetzen müßte, das sich nach Zentrifugation in den dichten Schichten des Gradienten wie zelluläre DNA, und demnach vom Antigen-Peak getrennt, befindet.
- Das antigene Präparat Z20, das nach der isopyknischen Zentrifugation dialysiert wurde, wird über Anionenaustauscher, vorzugsweise über DE 52-Cellulos Whatman®, der zuvor in 65 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert worden war, geschickt. Unter diesen Bedingungen wird das HBsAg-Antigen nicht auf dem Austauscher adsorbiert, während die verbleibenden Spuren von DNA und die kontaminierenden Proteine auf dem Austauscher festgehalten werden: Volumen in l gesamt Nicht-HBsAg-Proteine nach Chromatogr.
- Ein bedeutender Entfernungsfaktor von 25fach wird für Nicht- HBsAg-Proteine erhalten, während die DNA mit der Dot-Blot- Technik nach Hybridisierung mit einer mit P32 markierten Sonde nicht mehr nachweisbar ist (Empfindlichkeitsgrenze = 12,5 pg/ml).
- Um den Entfernungsfaktor für die DNA zu messen, wird ein Präparat Z20 mit einer bekannten Menge DNA versetzt und über Anionenaustauscher chromatographiert. Der im Eluat der Säule gefundene DNA-Gehalt war 1000- bis 10000fach unter dem Ausgangstiter.
- Das so nach Reinigung erhaltene antigene Präparat weist die folgenden Eigenschaften auf:
- - HBsAg-Proteine 1 ug
- - Nicht-HBsAg-Proteine 50 ng
- - DNA 10&supmin;&sup5; pg
- Nach Elektrophorese auf Polyacrylamidgel in dissoziierendem Medium verteilen sich die mit Silbernitrat angefärbten Polypeptide auf 3 Hauptbanden:
- - P&sub2;&sub2; mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 22000 Dalton
- - P&sub2;&sub6; mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 26000 Dalton
- - P&sub3;&sub4; mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 34000 Dalton,
- die alle drei durch Immunabdruck mit einem monoklonalen Anti-S- Antikörper erkannt werden und von denen lediglich das Polypeptid P&sub3;&sub4; durch Immunabdruck mit einem monoklonalen Prä- S2-Antikörper erkannt wird.
- Das chromatographierte Präparat wird über eine sterilisierende Membran filtriert, dann wird es 60 min auf 60ºC erwärmt und nach Abkühlen wird es mit Formaldehyd (100 ug/ml) versetzt und 48h bei +30ºC inkubiert. Dieses antigene Präparat wird in physiologischem Puffer verdünnt mit einem Adjuvans wie Aluminiumhydroxid versetzt, um Impfstoffe zu erhalten.
- Verschiedene Dosen von HBs-Antigenen sind auf subkutanem Weg Meerschweinchen injiziert worden, und die Antikörperantworten (Anti-S und Anti-Prä-S2) sind gemessen worden und mit denjenigen verglichen worden, die bei Tieren erhalten wurden, denen gleiche Dosen von Antigen, das von menschlichem Plasma abstammte, injiziert wurden (Impfstoff Hevac B - Pasteur Vaccins - MARNES-LA-COQUETTE - FRANKREICH). Tiere mit Antwort/geimpfte Tieren Anti-S-Antwort Anti-Prä-S2-Antwort Potenz
- Die Anti-S-Antikörper, allgemein als Anti-HBsAg bezeichnet, wurden durch die Ausab-Abbott -Technik (Abbott Laboratories, USA) gemessen, und die Anti-Prä-S2-Antikörper wurden durch immunenzymatisches Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Peptids mit 31 Aminosäuren auf der festen Phase, das das Prä-S2-Epitop umfaßte, gemessen, um die Antikörper einzufangen, die zu einem zweiten Zeitpunkt mit einem an die Peroxidase konjugierten Anti-IgG-Antikörper erkannt wurden; nach Zugabe des Substrats (H&sub2;O&sub2;) und eines Chromogens (ortho- Phenylendiamin) wurde die entwickelte Färbung bei 492 nm gemessen, deren Intensität proportional zu der Menge eingefangener Antikörper ist.
- Wie es die Ergebnisse der Tabelle anzeigen, wird mit den zwei Typen von Hepatitis B-Impfstoff eine bezüglich Anti-S gleichwertige Antwort erhalten, während bei dem rekombinierten Impfstoff (CHO) eine stärkere Anti-Prä-S2-Antwort beobachtet wird.
- 1. M. Michel, (1984) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 81, 7708-7712.
- 2. Progress In Separation and Purification, herausgegeben von Perry und Van Oss, Copyright 1972 by John Wiley & Sons Inc., USA.
- 3. A. Fritsch, Les Centrifugations Preparatives en Gradient de densite, 2. Auflage.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinierten Impfstoffes
gegen Hepatitis B, der gleichzeitig die Proteine Prä-S2 und S
des Oberflächenantigens des Hepatitis B-Virus enthält, in dem
man antigene Oberflächenteilchen von Hepatitis B ausgehend von
einer Kultur von CHO-Zellen (Ovarialzellen des chinesischen
Hamsters), die mit einem das HBsAg-Gen tragenden Plasmid
transfiziert sind, durch Expression derart erzeugt, daß die
antigenen Oberflächenteilchen im Kulturmedium freigesetzt
werden, dadurch gekennzeichnet, daß
- man das überstehende Kulturmedium mindestens einer
Kultur, insbesondere in einem Medium mit einem schwachen
Tierserumgehalt, gewinnt,
- man eine Sterilfiltration des Überstands vornimmt,
- man eine Konzentration des Überstands vornimmt,
- man eine Fällung des Konzentrats vornimmt mit Hilfe
eines Fällungsmittels, das nicht abbauend ist, unter
Bedingungen, die die schweren Klassen von DNA, die retroviralen
Teilchen sowie Proteine fällen,
- man eine erneute Konzentration vornimmt mit Hilfe eines
Fällungsmittels, das nicht abbauend ist, unter Bedingungen, die
die antigenen HBsAg-Oberflächenteilchen fällen, dann den
Niederschlag in einem geringen Volumen aufnimmt,
- man eine Geschwindigkeits-Zonalzentrifugation in einem
Gradienten vornimmt, der für die retroviralen Teilchen nicht
chaotrop ist und der so ausgewählt ist, daß er deren Trennung
von HBsAg-Teilchen nach deren Größe und Dichte gestattet,
- man eine isopyknische Flotations-Zonalzentrifugation
vornimmt, die die leichten und schweren Nukleinsäuren und
Proteine entfernt, und
- man eine Chromatographie in einem Anionenaustauschmedium
vornimmt, um die verbleibenden Spuren von Nukleinsäuren und die
verbleibenden Nicht-HBsAg-Proteine zu adsorbieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Fällungen mit Polyethylenglykol, insbesondere PEG 6000,
bewirkt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
die erste Fällung mit einer Konzentration an PEG in der
Größenordnung von 5% Gew./Vol. bewirkt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß man die zweite Fällung mit PEG,
insbesondere PEG6000, zu 9'5% Gew./Vol. bewirkt
5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Geschwindigkeits-
Zonalzentrifugation in einem Saccharose-Gradienten vornimmt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Zentrifugation in einem Rotor vornimmt, den man
kontinuierlich beschickt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Fraktionen mit einem Saccharose-
Gehalt unterhalb von 25% Gew./Vol. auswählt, wobei die anderen
Fraktionen verworfen werden.
8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Flotations-Zonalzentrifugation in
einem KBr-Gradienten vornimmt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Fraktionen der Bande der Dichte 1,22-1,23 sammelt.
10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Chromatographie auf DE 52-Cellulose
vornimmt.
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