DE3325131A1 - Interferon e und seine herstellung und pharmazeutische verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Interferon-Präparat, das im folgenden kurz als Interferon - £ bzw. IFN-E bezeichnet ist und sich beispielsweise in der Humanmedizin sowie bei Zellkulturen als antiviral wirksames und/oder die Zellproliferation hemmendes Mittel vorteilhaft anwenden läßt, ferner Verfahren zur Herstellung dieses Interferon-Präparats und seine pharmazeutische Anwendung insbesondere zur Behandlung menschlicher Epithelialzellen zur Abwehr von Virusinfektionen.

Interferone sind Stoffe mit antiviralen Eigenschaften. Sie werden durch bestimmte Typen von Zellen erzeugt,

Oi92-(DBH-422)-SF-Sl

die durch Exposition gegenüber einem Virus, bestimmten Nucleinsäuren oder Antigen/Mitogen-Komplexen stimuliert wurden. Interferone stellen dabei extrem v/irksame Arzneimittel dar, die als klinische antivirale und Antitumor-Mittel als außerordentlich erfolgversprechend angesehen werden.

Gegenwärtig sind drei Typen menschlicher Interferone bekannt: Das Interferon-λ (IFN-oü , das ^aus menschlichen Leukocyten und Lymphoblastoidzellen erzeugt wird, das Interferon-ß (IFN-ß), das aus Fibroblasten erzeugt wird, sowie das Interferon-γ (IFN-y), das aus menschlichen T-Lymphocyten erzeugt wird. Alle drei oben genannten Interferone werden durch die betreffenden Zellen ausgeschieden, nachdem diese durch ein Virus, bestimmte Nucleinsäuren oder Antigen/Mitogen-Komplexe stimuliert wurden. Aus neueren Ergebnissen geht hervor, daß diese Interferone aus einem Gemisch strukturell miteinander in Beziehung stehender Proteine, also nicht aus einem einzigen Protein, bestehen. Die Humaninterferone können aufgrund ihrer unterschiedlichen Wirksamkeitsniveaus gegenüber menschlichen und Rinderzellkulturen voneinander unterschieden werden.

Die Wirksamkeitsbestimmung kann dabei nach einem Verfahren erfolgen, das in The Interferon System, William E. Stewart, Springer Verlag Co., New York, 1978 beschrieben ist und eine Modifizierung des Verfahrens von Ho und Enders darstellt, das in The Proceedings of the National Academy of Sciences, 45 (1959) 385-389 publiziert ist.

IFN-ot besitzt gegenüber Rindernierenzellkulturen eine antivirale Wirksamkeit, die 1 bis 5 mal größer ist als die Wirksamkeit gegenüber Zellkulturen von Human-

fibroblasten. IFN-ß besitzt eine antivirale Wirksamkeit gegenüber Rindernierenzellkultüren, die 1/100 bis 2/100 seiner Wirksamkeit gegenüber Zellkulturen von Humanfibroblasten entspricht. IFN-ξ besitzt schließlich gegenüber Rinderzellkulturen eine Wirksamkeit, die weniger als 1/100 der Wirksamkeit gegenüber Kulturen von Humanfibroblasten beträgt.

Beim produktivsten Verfahren zur Herstellung von IFN- <* aus menschlichen Leukocyten wird ungefähr eine Einheit Interferon pro 50 Zellen produziert. IFN-y wird aus menschlichen T-Lymphocyten in einer Ausbeute von etwa 1 Einheit pro 1000 Zellen erzeugt. Bei der Produktion von IFN-ß aus menschlichen Fibroblasten wird eine optimale Ausbeute von etwa 1 Einheit pro 15 Zellen erzielt.

Eine antivirale Einheit Interferon entspricht derjenigen Konzentration, die 50 % der Zellen in einer Kultur menschlicher Fibroblasten vor einem Befall mit Vesicular Stomatitis-Virus bei einer Standardkonzentration (1PFU/Zelle) schützt.

Antivirale Wirksamkeit wurde auch in Medien aus anderen Zellen menschlichen und tierischen Ursprungs festgestellt. Eine Beeinträchtigung der Vermehrung von Influenza-Virus wurde zuerst von Issacs und Lindenmann 1957 in Kulturen von Chorioallantoidalmembranen von Hühnern festgestellt. Ein weiteres Beispiel ist die Hela-Zellinie, bei der transformierte Krebszellen epithelialen bzw cervicalen Ursprungs vorliegen (vgl. G. Gey et al., Cancer Research, λ2_ (1952) 264-265). Interferon-Wirksamkeit wurde ferner bei verschiedenen transformierten oder neoplastischen Zellinien festgestellt, die sich Ursprung-

lieh von menschlichem Epithelialgewebe ableiteten (vgl Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines, Jameson et al, Archives of Virology 62 (1979) 209-219). Bei herkömmlichen Humaninterferon-Präparaten wurde festgestellt, daß sie gegenüber Humanzellkulturen antivirale Wirksamkeit besitzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges, antiviral wirksames Interferon-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, das sich beispielsweise zum Schutz von menschlichen Zellen gegenüber Virusinfektionen eignet, ferner seine pharmazeutische Anwendung, insbesondere in entsprechenden pharmazeutischen Mitteln.

Das Interferon-Präparat soll dabei auf einem Interferon beruhen, das normalem, gesundem menschlichem Epithelialgewebe eigen ist, wobei das Interferon-Präparat gegenüber menschlichen Epithelialzellen wirksamer sein soll als gegenüber anderen Arten menschlicher Zellen, beispielsweise menschlichen Fibroblastzellen. Mit dem Interferon-Präparat soll ferner eine Behandlung von Virusinfektionen oder Tumorwachstum in bestimmten Geweben durch Inkontaktbringen mit einem aus dem gleichen Gewebetyp abgeleiteten Interferon möglich sein.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Das erfindungsgemäße Interferon-Präparat, das als Interferon-£ bezeichnet wird, scheint wie die anderen Interferone aus mindestens zwei funktionell miteinander in Beziehung stehenden Proteinen zu bestehen; es kann beispielsweise dadurch erzeugt werden, daß normale menschliche Epithelialzellen einem Interferon-Induktionsverfahren unterworfen und anschließend unter Bedingungen inkubiert werden,

unter denen die Produktion des neuen Interferon-ε gefördert wird.

Im Gegensatz zu den vorbekannten Interferonen, Interferon- <* , Interferon-ß und Interferon-^besitzt das erfindungsgemäße IFN-£ eine antivirale Wirksamkeit gegenüber Rindernierenzellkulturen, die 1/4 bis etwa 1/2 der Wirksamkeit gegenüber Zellkulturen von Humanzellen beträgt. IFN-£ zeigt ferner keine signifikante Kreuzreaktivität mit gegen IFN-a, IFN-ß oder IFN-^ hergestellten Antiseren in Neutralisationstests. Es ist ferner bei pH 2 stabil. Seine Produktion durch Epithelialzellen wird durch Einführung von RNA-Syntheseinhibitoren oder Proteinsyntheseinhibitoren in die Kultur unterdrückt. Die antivirale Wirksamkeit IFN-£ enthaltender Pränarationen wird ferner durch Proteasen zerstört.

IFN-B kann aus allen Arten primärer humaner diploider Epithelzellen erzeugt werden. Kulturen von menschlichen epidermalen, conjunctivalen, vaginalen und oesophagealen Zellen wurden erfolgreich eingesetzt. Weitere Beispiele für andere Epirthelialgewebearten, die erfindungsgemäß verwendbar sind, stellen Nasal-, Pharyngeal-, Bronchial-, Pleural- und Intestinalgewebe dar; das Erfindungskonzept ist jedoch nicht auf die oben angeführten Gewebearten beschränkt.

überraschend erwies sich im Rahmen der Erfindung als besonders vorteilhaft, daß primäre Epithelialzellen durch die gleichen Verfahren, wie sie im Stand der Technik zur Erzeugung anderer Interferontypen aus Leukocyten, Lymphoblasten und Fibroblasten herangezogen werden, zur Interferon- £ -Produktion veranlaßt werden können.

Das erfindungsgemäße Interferon-Präparat ist erhältlich durch

(A) Erzeugung einer Kultur lebender Zellen, die zumindest einen Teil des DNA-Codes menschlicher Epithelialzellen enthalten,

(B) Inkubation der Zellen in einem Medium unter Bedingungen, unter denen die Synthese von Interferon gefördert wird,

und

(C) Gewinnung einer interferonreichen Fraktion aus diesen Zellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist entsprechend durch die obigen Verfahrensschritte (A) bis (C) gekennzeichnet.

Nach einem erfindungsgemäß bevorzugten Induktionsverfahren wird Newcastle Disease-Virus (insbesondere der Bankowski-Stamm) oder Sendai-Virus verwendet, wobei 100 bis 500 Epithelzellen zur Produktion einer Einheit IFN-S erforderlich sind.

Wie oben angegeben, wird IFN-£ durch primäre, diploide Epithelzellen menschlichen Ursprungs erzeugt. Unter primären, diploiden menschlichen Epithelzellen bzw Zellkulturen wird hierbei erfindungsgemäß Zellmaterial verstanden, das aus gesundem menschlichem Gewebe oder aus Kulturen solcher Zellen entnommen ist, beispielsweise nach dem Verfahren der US-PS 4 016 036, auf das hiermit Bezug genommen wird. Diese Arten von Zellkulturen sind von nicht-humanen Zellen, Humanzellen anderen als epithelialen Ursprungs sowie transformierten oder neoplastischen Epithelzellen zu unterscheiden.

Das erfindungsgemäße Interferon-Präparat kann ferner auch in natürlich oder künstlich transformierten eukaryotischen Zellen produziert werden, die den Teil der menschlichen Epithelialnucleinsaure enthalten, der für die Produktion von IFN-ε verantwortlich ist, ferner in Zellen, die durch DNA-Rekombxnationsverfahren modifiziert wurden.

Im Rahmen der Erfindung wurde ferner festgestellt, daß ein von einem gegebenen Typ von Humanzellen, beispielsweise Epithelzellen, produziertes Interferon eine größere antivirale Wirksamkeit gegenüber diesem speziellen Zelltyp aufweist als gegenüber anderen Arten von Humanzellen. Das erfindungsgemäße Interferon-ε besitzt dementsprechend höhere antivirale und Antitumorwirksamkeit bei der Behandlung von mit einem Tumor oder einer Virusinfektion befallenem Epithelgewebe im Vergleich zur Wirksamkeit gegenüber anderen Arten von Humanzellen.

Zur Produktion von IFN-6 können normale menschliche Epithelzellen in vitro (beispielsweise gemäß dem Verfahren von Green et al.) im Monolayer, im Mikrokapseln gemäß dem Verfahren von Jarvis et al.(US-Patentanmeldung Serial No. 2 43,586 vom 14.3.1981) oder nach anderen Verfahren kultiviert werden. Die Zellen werden dann einem IFN-Induktionsschritt unterworfen, in dem sie bestimmten Viren oder Nucleinsäuren ausgesetzt werden. So kann beispielsweise das Wachstumsmedium durch ein Medium ersetzt werden, das einen bekannten IFN-Inducer vom Virus- oder Nucleinsäuretyp enthält. Nach kurzer Inkubation, typischerweise in der Größenordnung von einer Stunde, wird der Inducer wieder abgetrennt, und die Zellen werden in normales, frischesWachsturns- oder Aufbewahrungsmedium verbracht und beispielsweise 24 h inkubiert. Durch die Exposition

der Zellen gegenüber dem Inducer wird die Expression des DNA-Codes der Zellen zur Produktion von Interferon-£ ausgelöst. Während der anschließenden Inkubation synthetisieren die Zellen IFN-ß und scheiden es aus. An diesem Punkt wird das Medium gewonnen; im Test, der beispielsweise nach dem Verfahren von Ho und Enders (Proceedings of the National Academy of Science, _45_ (1959) 385-389) durchgeführt wird, wird festgestellt, daß es IFN-S" mit antiviraler Wirksamkeit enthält.

Das aus diesem Verfahren resultierende Produkt zeigt keine signifikante Kreuzreaktivität gegenüber Antikörpern gegen IFN- <x , IFN-ß oder IFN- V in Neutralisationsversuchen. Es ist ferner bei pH 2 stabil und besitzt Proteincharakter. Aus Immunabsorptionsversuchen geht hervor, daß Anti-IFN-ß-Antiseren mit einem Teil des Interferon-Produkts der induzierten Epithelzellen reagiert. Das erfindungsgemäße Interferon weist ferner ein Wirksamkeitsproflil bei Säugerzellen auf, das von bekannten Interferontypen verschieden ist. Aufgrund dieser chemischen Eigenschaften stellt IFN- £ eine neuartige Substanz mit einzigartigen Eigenschaften dar.

IFN-£ konnte mit Erfolg aus normalen Epithelzellen gewonnen werden, die von der menschlichen Epidermis, Conjunctiva, Vagina und Oesophagus abgeleitet waren, wobei 'normale Induktion¹ (vgl. Field et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 5j$ (1967) 1004-1009) und 'Superinduktion' (vgl. Havell und Vilcek, Antimicrobial Agents in Chemotherapy, Vol. 2 (1972) 476-484) mit Nucleinsäure, Poly-1·C (Miles Laboratories), Newcastle Disease Virus (Baron und Issacs, British Medical Journal, 56 (1962) 18-20) und Sendai-Virus (Parair.fluenza-1 , vgl. Gresser

Proceedings of the Society of Experimental and Biological Medicine, Vol. 108 (1961) 303-307) herengezogen wurden.

Die Versuchsergebnisse zeigen, daß jedes der Induktionsverfahren und jeder der verschiedenen Typen der getesteten Zellkulturen zur Produktion von IFN-£ führten.

Das Produktionsniveau hängt von der Art des angewandten Inducers und den verschiedenen Modifizierungen der angewandten Induktionsverfahren ab. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß mit Newcastle Disease-Virus gute Ergebnisse erzielbar sind. Es können jedoch auch
andere Viren erfolgreich herangezogen werden, wie aus
der nachstehenden Tabelle 1 hervorgeht.

Tabelle I
Virus

Influenza-A

Parainfluenza-3 Masern

Mumps

Röteln

Zellverschmelzung (Respiratory syncytial)

Rabies-Virus (Tollwut) Vesiculare Stomatitis

Chikungunya Sindbis

Referenz

Gresser und Dull (1964); Andrews (1961)

Chany (1960)

Petralli, Merigan und Wilbur (1965a); DeMaeyer und Enders (1961)

Cantell (1961); Waddell, Wilbur und Merigan (1968)

Neva und Weller (1964)

Ray, GravelIe und Chin (1967); Moehring und Forsyth (1971)

Wiktor et al. (1972)

Marcus und Sekellick (1977); Vilcek, Yamazaki Und HaveIl (1977)

Zimmermann et al. (1972) Gresser und Enders (1962)

Virus

Pferde-Encephalitits (Western equine encephalitits)

Gelbfieber Poliovirus-Typ 1 Poliovirus-Typ 2 Encephalomyocarditis Rhinovirus-2 Rhinovirus-12

Reovirus-2 Blue tongue Adenoviren Varicella-zoster

Human-Cytomegalovirus

Herpes simplex Vaccinia

Referenz

Luby, Sanders und Sulkin (1971)

Wheelock und Sibley (1965); Wheelock und Edelman (1969)

Gresser, Chany und Enders (1965)

Smorodintsev et al. (1970); Ho und Enders (1959a,b)

Stewart II, Gosser und Lockart (1971a)

Smorodintsev et al. (1971a); Fiala (1972)

Gatmaitan, Stanley und Jackson (1973)

Oie, Loh und Ratnayake (1973) Jameson und Grossberg (1977) Lysov et al. (1971)

Vaczi, Horvath und Hadhazy (1965)

Vaczi, Horvath und Hadhazy (1965); Glasgow (1974)

Rasmussen et al. (1974)

Wheelock (1964); Epstein, Stevens und Merigan (1972)

Es wurde ferner im Rahmen der Erfindung festgestellt, daß von ausgewählten Arten menschlicher Zellen wie Epithelzellen, Fibroblasten, Vasculärzellen, Leberzellen, Nierenzellen udgl erzeugte Interferone besonders hohe antivirale bzw Antitumorwirksamkeit bei der Behandlung von menschlichem Gewebe besitzen, das aus dem ausgewählten Zelltyp besteht. So ist beispielsweise IFN-£ am wirksamsten, wenn es

zur Behandlung von Epithelzellen verwendet wird, und besitzt eine niedrigere Wirksamkeit bei der Behandlung anderer menschlicher Zellarten. In ähnlicher Weise ist IFN-ß (aus menschlichen Fibroblastzellen) bei der Behandlung von menschlichen Fibroblastzellen oder entsprechenden Geweben am wirksamsten, während es niedrigere Antivirus- und Antitumorwirksamkeit bei Zellen anderer menschlicher Gewebetypen aufweist.

Demgemäß kann zum Schutz eines gegebenen Zelltyps oder Gewebetyps vor Virusinfektionen, zum Stoppen der Vermehrung eines Virus, der einen gegebenen Zelltyp oder Gewebetyp befallen hat, oder zur Unterdrückung des Wachstums eines Tumors in einem gegebenen Gewebe folgende Verfahrensweise angewandt werden:

Zunächst wird eine Kultur von Zellen des betreffenden Typs nach üblichen Verfahren wie etwa (im Fall von Epithelzellen) dem oben erwähnten Green-Verfahren wachsen gelassen, In den Zellen der Kultur wird dann die Sxprimierung des Teils ihres DNA-Codes, der für die Produktion von Interferon-ε verantwortlich ist, durch geeignete Behandlung induziert. Dies kann beispielsweise durch IFN-Induktionsverfahren erfolgen, die nachstehend erläutert sind. Das Produkt wird dann gewonnen, typischerweise aus dem Medium nach Inkubation. Das Produkt kann als wirksamer antiviraler oder Antitumorwirkstoff zur Behandlung von Zellen oder Gewebe des betreffenden Typs verwendet werden. In vitro werden Kulturen durch Zusatz von 2 bis 5 Einheiten IFN-ß /ml gegen Virusbefall geschützt. Diese Konzentration ist zum Schutz von Epithelzellen einer Zelldichte von 0,5 · 10 bis 2,5 · 10 Zellen/cm wirksam.

Signifikante Mengen des erfindungsgemäßen Interferon-Präparats können ferner auch durch zwei an sich bekannte

zelluläre Verfahren erzeugt werden. Beim ersten Verfahren werden chemisch, durch Viren oder spontan transformierte eukaryotische Zellen eines Typs ähnlich den früher zur Herstellung von IFN-et aus menschlichen Lymphoblastoidzellinien angewandten Zellen verwendet. Beim zweiten Verfahren werden übliche DNA-Rekombinationstechniken angewandt, wie sie üblicherweise zur Herstellung von IFN-ot und IFN-ß Verwendung finden.

Beim ersten Verfahren können zur Produktion von IFN-befähigte transformierte Zellen durch Anwendung eines von zwei Verfahren erhalten werden: In vivo oder in vitro. Das erste Verfahren, das in vivo vorgenommen wird, umfaßt die direkte Isolierung aus frischem Gewebe transformierter Zellen; das zweite, in vitro vorgenommene Verfahren umfaßt eine Selektion, bei der Stamm normaler menschlicher diploider Zellen entweder einer Langzeitkultivierung unterzogen wird, bis eine kleine, aber erkennbare Anzahl der Population einer spontanen Transformation unterliegt, oder der ursprüngliche Stamm eine kurze Zeit mit einem Virus oder einem bekannten Mutagen wie EMS, MMS oder MNNG behandelt wird, um die Transformationsfrequenz zu erhöhen. Einige der nach einer der beiden in vitro Verfahrensweisen transformierten Zellen enthalten einen Teil des DNA-Codes der Epithelzellen, der für die Produktion von IFN-£ verantwortlich ist.

Bei den so transformierten Kulturen kann durch Anwendung üblicher Induktionsverfahren, wie sie bereits für normale menschliche diploide Epithelzellen beschrieben sind, die Produktion von IFN-£ induziert werden.

Beim zweiten Verfahren wird die aufgrund der IFN-Induktion in den Epithelzellen synthetisierte Messenger-RNA (mRNA) aus den Zellen extrahiert, ggf durch Ultra-

zentrifugieren odgl gereinigt, um eine mRNA-Fraktion höherer Spezifität zu erhalten, und der Extrakt als Nährboden für die Synthese der komplementären DNA (cDNA) verwendet. Die cDNA kann unter Verwendung des Enzyms Myoblastose-Reverstranscriptase aus Vögeln erzeugt werden. Das resultierende Endprodukt dieses Verfahrens, die doppeIsträngige komplementäre DNA (dscDNA), die die Sequenz enthält, welche die Synthese von IFN-£ codiert, und ein bakterieller oder eukaryotischer Vektor werden anschließend mit ;einem Restriktionsenzym behandelt, das die DNA spaltet und Bindungsstellen erzeugt, durch die die dscDNA und der Vektor gebunden werden können. Der Vektor und die DNA werden dann zusammengemischt, vereinigt und mit einer Ligase kovalent gebunden. An diesem Punkt des Verfahrens wird die Rekombinantvektor-Präparation zur Transformation einer bakteriellen oder eukaryotischen Zelle verwendet. Die transformierten Zellen enthalten so die DNA, die zu der gesamten RNA oder einem Teil davon komplementär ist, die ursprünglich in den Epithelzellen während ihrer IFN- £ -Produktionsstufe enthalten war.

Diese Rekombinantvektoren werden dann mit einem geeigneten Zelltyp inkubiert, bei dem der Vektor wirksam werden kann. Dies führt zu einer Zellpopulation, die einzelne Zellen enthält, die zur Synthese und Sekretion von IFN-£ in der Lage sind. Die Zellpopulation wird dann einem Screening-Schritt zur Erfassung einer Subpopulation von Zellen unterzogen, die IFN-£ erzeugen; diese Subpopulation wird dann zur Erzielung einer Zellinie kultiviert, die zur Produktion relativ hoher Mengen IFN-£ befähigt ist.

Weitere Einzelheiten des DNA-Rekombinationsverfahrens können beispielsweise den nachstehenden Druckschriften entnommen werden, auf die hier Bezug genommen wird:

1. US-PS 4 237 224 - Verfahren zur Herstellung biologisch funktioneiler molekularer Chimären;

2. Scheller, R. et al., Clones of Individual Repetitive Sequences from Sea urchins DNA Constructed with Synthetic Eco R₁ Sites, Science, 196 (1977) 197-200;

3. Blattner, F. et al., Charon Phages: Safer Derivatives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning, Science, 196 (1977) 161-169;

4. Broach, J. R., und Hicks, J. B., Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle, Cell, 2J_ (1980) 501-508; und

5. Hamer, D., Synthesis, Processing and Secretion of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell System, Recombinant DNA Abstracts, _1_ (1981) 4.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, deren Angaben nicht einschränkend sind.

Beispiel 1

Eine Epithelzellenkultur von menschlichen Epidermiszellen (vom Labor von H. Green, Massachusetts Institute of Technology) wurde zu einer Zelldichte von 1 bis 2 · Zellen/cm in einem MEM-Medium (minimal essential medium) (Hersteller Gibco) kultiviert, das 10 % durch Erhitzen inaktiviertes Kälberfetalserum enthielt, das 30 min bei 56 ⁰C inkubiert worden war (im folgenden kurz als HIFCS bezeichnet). Vier gleichartige Kulturen, die in MEM und

2 % HIFCS inkubiert waren, wurden 1 h bei 37 ⁰C O, 1, 10 bzw 100 ,ug/ml Poly-1-C-(9S), dh einer hochmolekularen Nucleinsäure, die handelsüblich ist (PL Laboratories, Milwaukee, Wisconsin) ausgesetzt (vgl. oben Induktionsverfahren von Field et al.)· Die Kulturen wurden dann zweimal mit MEM-Medium gewaschen und im gleichen Medium 24 h inkubiert, das mit 2 % HIFCS versetzt worden war. Das Medium wurde dann gesammelt und nach dem Verfahren von Stewart II, The Interferon System, S. 17-18, untersucht. In den mit 0 und 1 ,ug Poly-1-C/ml inkubierten Kulturen war keine antivirale Wirksamkeit feststellbar. In den Proben, die aus Kulturen erhalten waren, die mit 10 und 100 ,ug Poly-1«C/ml induziert worden waren, wurden etwa 10 Einheiten IFN-C /ml festgestellt.

Beispiel 2

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß ein modifiziertes 'Superinduktionsverfahren¹ angewandt wurde (vgl. oben Havell und Vilcek), um die IFN-6 -Produktion zu steigern. Hierbei wurden 50 ,ug/ml Cyclohexamid als Proteinsyntheseinhibitor zusammen mit dem Poly-1'C angewandt. Nach 1 h Inkubation wurden die Zellen gewaschen und weitere 3 h in MEM-Medium inkubiert, das 2 % HIFCS und 50 ,ug Cyclohexamid/ml enthielt. Die Zellen wurden dann anschließend wieder gewaschen und weitere 2 h in MEM-Medium inkubiert, das 50 /Ug Cyclohexamid/ml und 5,0 ,ug Actinomycin D/ml als RNA-Syntheseinhibitor enthielt. Bei Beendigung der Inkubation wurden die Zellen zweimal gewaschen und dann 24 h bei 37 ⁰C in normalem Medium inkubiert. Nach Gewinnung des Mediums und Untersuchung wie in Beispiel 1 wurde festgestellt, daß in den Kulturen, die mit 0 bzw 1 ,ug Poly-1-C/ml induziert worden waren, keine merkliche IFN-£ -Produktion vorlag, während bei der

mit 10 /Ug Poly-1-C/ml induzierten Kultur 100 Einheiten IFN-£ /ml erzeugt wurden. Die mit 100 ,ug Poly-1-C/ml induzierten Kulturen wiesen eine IFN-£ -Produktion von über 330 Einheiten/ml auf.

Beispiel 3

Eine Epithelzellenkultur aus Epidermiszellen, die 1 bis 2 · 10 Zellen (vgl Beispiel 1) enthielt, wurde zur Produktion von IFN-ε nach dem Induktionsverfahren mit Newcastle Disease-Virus (NDV) (vgl. oben Baron und Issacs) herangezogen. Als Virus wurde der Bankowski-Stamm

von NDV verwendet (erhältlich von Poultry Health

,USA,,
Laboratories, Davis, CrT^]T Vier 1-ml-Proben von MEM-

Medium mit 2 % HIFCS und ausreichend NDV für eine Endkonzentration von 0, 100 bis 200, 25 bis 50 und 1 bis Virus-PFU/Zelle in den Testproben wurden hergestellt. 0,2 ml der jeweiligen 1-ml-Viruspräparationen (Virus-Inducer) wurden dann zu den Zellkulturen zugesetzt, die in 5-min-Intervallen 30 min bei 37 C geschüttelt wurden. Die restlichen 0,8-ml-Mengen der NDV-Präparationen wurden dann zugesetzt, worauf die Kulturen nochmals 30 min inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellkulturen zweimal mit normalem Medium gewaschen, worauf 1 ml frisches Medium zu jeder Kultur zugesetzt wurde, wonach die Kulturen 24 h inkubiert wurden.

Danach wurde das Medium gewonnen, mit 0,1 N HCl auf pH 2 angesäuert und 5 bis 6 d bei 4 ⁰C gelagert, um das NDV zu inaktivieren. Danach wurde das gewonnene Medium mit 0,1 N NaOH neutralisiert und auf IFN-£ geprüft. Bei der kein NDV enthaltenden Probe (Kontrollprobe) war keine antivirale Wirksamkeit feststellbar. Die mit 100 bis 200 NDV-Viruspartikeln/Zelle induzierte Probe ent-

hielt etwa 500 bis 1000 IFN-£ /ml. Die mit der 25 bis 50 Viruspartikel/ZeHe enthaltenden NDV-Präparation induzierte Kultur enthielt zwischen 170 und 330 Einheiten IFN-C/ml. Die mit der 1 bis 16 Viruspartikel/Zelle enthaltenden NDV-Präparation induzierte Kultur enthielt schließlich 50 bis 170 Einheiten IFN- £/ml.

Aus diesen Versuchen geht hervor, daß eine Zellkultur mit 1 bis 2 · 10 Zellen/ml etwa 500 bis 1000 Einheiten IFN- £/ml produzieren kann. Diese Ausbeate entspricht größenordnungsmäßig etwa 1 Einheit IFN- £ , die von 100 bis 500 Zellen in der Kultur produziert wird.

Beispiel 4

Es wurde wie in Beispiel 3 verfahren mit dem Unterschied, daß als Inducer anstelle von NDV Parainfluenza-1-Virus (Sendai-Virus) (vgl. oben Gresser) in verschiedenen Konzentrationen verwendet wurden. Das handelsübliche Sendai-Virus-Präparat (Flow Laboratories) enthielt 10 000 bis 40 000 Hämaglutinationseinheiten/ml.

In einer Kultur, in der die handelsübliche Viruspräparation 1:3' verdünnt war, wurden 1000 Einheiten IFN- £ /ml erzeugt. Eine 1:10-Verdünnung führte zu 200 Einheiten IFN- ε /ml, während eine 1:33-Verdünnung 100 Einheiten IFN-ε/ml ergab. In der Kontrollkultur, bei der das Virus weggelassen worden war, konnte keine antivirale Wirksamkeit festgestellt werden.

In der nachstehenden Tabelle II sind die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 4 unter Verwendung von Zellkulturen menschlicher Bindehaut und menschlicher Epidermiszellen unter Anwendung verschiedener Induktionsverfahren zusammengestellt.

Tabelle II

Ergebnisse von Interferon-Experimenten

Ze11typ	Induktions	Einheiten	Einheiten
	verfahren	IFN-£/ml	IFN-£/Zelle
Bindehaut	PoIy-I-C*	33	3,3
Il	PoIy-I-C+	330	3,3 ■
Il	(ohne, Kon-
	trollversuch)	O
Epidermis	PoIy-I-C*	O
Il	Sendai++	330	3,3 ■
II	NDV**	1,000	1,0 ·
Il	(ohne, Kon
	trollversuch )	O
. 10"5
■ ΙΟ"4
O
O
• 10"4
■ 10~3
O

Induktionsverfahren von Beispiel 1 mit 100 ,ug Poly-1-C/ml + Induktionsverfahren von Beispiel 2 mit 100 ,ug Poly-1·C/ml Induktionsverfahren von Beispiel 3 mit 1:3 verdünntem NDV-Präparat (100 bis 200 Viruspartikel/Zelle) ++ Induktionsverfahren von Beispiel 4 mit 1:3 verdünnter Stammlösung.

Beispiel 5

Da bekannt ist, daß Interferone per definitionem Proteine sind, wurden Proben von IFN-£ untersucht, um festzustellen, ob die in den Proben vorliegende antivirale Wirksamkeit einer Proteinkomponente zuzuschreiben ist. Die Versuche wurden so durchgeführt, daß Proben von IFN-<* (NIH-Standard), IFN-ß (NIH-Standard) und IFN-6 (abgeleitet von NDV-induzierten epithelialen Keratinocyten) in Gegenwart bekannter proteolytischer Enzyme inkubiert wurden, worauf das behandelte Material auf seine verbliebene antivirale Restaktivität analysiert wurde. Proben von

IFN-oc (16 Einheiten/ml), IFN-ß (16 Einheiten/ml) und IFN-£ (32 Einheiten/ml) in MEM-Medium wurden 1 h bei 37 C in Gegenwart von Trypsin oder Pronase bei Konzentrationen von 3,3 bis 100 ,ug/ml inkubiert. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die verbliebene proteolytisehe Aktivität der Proben durch Zusatz von HIFCS zu einer Endkonzentration von 33 Vol.-% neutralisiert. Die Proben wurden dann auf ihre IFN-induzierte antivirale Wirksamkeit durch Mikrotiträtion mit GM-2 767-Zellen getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III Proteolytische Empfindlichkeit von IFN-G

Proteolyti-	Enzymkonzen	Restliche	antivirale	IFN-Wirksam-
sches Enzym	tration		keit
	( ug/ml)	IFN-a	IFN-ß	IFN-€
Trypsin	100	0	0	0
	33	0	0	0
	10	1	2	4
	3,3	8	8	16
	0	16	16	32
Pronase	10	0	0	0
	3,3	0	0	0
	0	16	16	32

Aus den Ergebnissen von Tabelle III ist ersichtlich, daß die bei den Proben von IFN- € festgestellte antivirale Wirksamkeit durch das Vorliegen einer oder mehrerer Proteinkomponenten bedingt ist, da durch Behandlung mit proteolytischen Enzymen diese Wirksamkeit vollständig verlorengeht. Der Proteincharakter von IFN-£ geht ferner aus dem Umstand hervor, daß RNA und Proteinsyntheseinhibitoren die Produktion von IFN-C blockieren.

Beispiel 6

Das Beispiel bezieht sich auf die Ermittlung der Stabilität von IFN-£ bei sauren pH-Werten.

IFN-£ wurde durch Induktion menschlicher Epidermiszellen mit NDV gemäß Beispiel 3 hergestellt. Das gewonnene Medium wurde in drei Teilmengen aufgeteilt. Das Virus wurde in der ersten Teilmenge wie in Beispiel 3 inaktiviert, indem mit HCl auf pH 2 angesäuert wurde. Die zweite Teilmenge wurde nach 5 d durch ein Virusfilter (Millipore-Filter 01310, Molekulargewichtsgrenze 100 000) filtriert, um das Virus abzutrennen. Die dritte Teilmenge wurde durch ein Millipore-Filter PTMK01310 filtriert (Molekulargewichtsgrenze 100 000), das zuvor 4 h in einer 1-%-igen BSA-Lösung eingeweicht worden war.

In allen Fällen wurde das resultierende Medium auf IFN sowie das Vorliegen von restlichem Virus geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV Stabilität von IFN-ε bei sauren pH-Werten

Behandlung anfänglicher resultierender IFN-Titer von IFN-e Virus-Titer Virus-Titer (Einheiten/ml) (PFU/ml) (PFU/ml)

128 128

128

	pH 2, 5 d	1	,1 ·	108	0
durch	Filtration PTHKO1310	1	,1 ·	108	0
durch	Filtration PSVP01310	1	,1 ·	108	0

Keine der Proben zeigte irgendeine Virusaktivität, wobei jede Probe die gleiche IFN-ί -Aktivität enthielt. Daraus geht hervor, daß die IFN- £-Aktivität bei sauren pH-Werten stabil ist.

Beispiel 7

Die immunologischen Eigenschaften von IFN-£ (erhalten durch NDV-Induktion von menschlichen Epidermiszellen gemäß Beispiel 3), IFN-«, IFN-ß (MIH) und IFN-J¹ (erhalten von S. Baron, University of Texas Medical School, Galveston, Texas, USA) wurden miteinander verglichen. Die Neutralisationstitrationen der entsprechenden Interferone wurden mit Anti-IFN-oc (NIH) , Anti-IFN-ß (NIH) und Y.H. Tan, Calgary University, Calgery, Alberta, Ganada), Anti-IFN-/ (S. Baron) sowie von Gemischen dieser Antiseren durchgeführt. Schrittweise zweifache Verdünnungen der entsprechenden Antiseren wurden in MEM-Medium hergestellt, wobei eine Mikrotitrierplatte mit 96 Vertiefungen verwendet wurde. Die entsprechenden Verdünnungen im Bereich von 32 IU/ml bis 2 IU/ml von jeder IFN-Präparation wurden auf die Platten gegeben, die dann zuerst 1 h bei 37 ⁰C und dann 1 h bei 4 ⁰C zur Bildung der Antikörper- IFN- Komplexe inkubiert wurden. Danach wurden menschliche Fibroblastzellen (GM-2767, Human Mutant Cell Repository) in einer Menge von 2 * 10" Zellen pro Vertiefung eingebracht; nach 20 bis 24 h Inkubation bei 37 ⁰C wurden die Zellen mit einer Standarddosis von Vesicular Stomatitis-Virus (1 PFU/Zelle) infiziert. Nach 24 bis 48 h bei 37 ⁰C wurden die einzelnen Verdünnungspräparate mikroskopisch auf eine interferonabhängige Inhibierung der virusinduzierten cytopathisehen Wirkung (CPE) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

Zur Neutralisation von IFN erforderliche Menge Antiserum (Neutralisationseinheiten/ml)

IFN-Probe	IFN-Konzen- tration (Einheiten/ml)	Anti-cx ei	Anti-ß^ Cl	Anti-rt und Anti-ß el
IFN- * (NIH- Standard)	16 8 4	62	> 3.000 >3.000 > 3.000	125
IFN-ß (NIH- Standard)	8 4 2	> 3.000 > 3.000 >3.000	375 188 188	750 750 47
IFN- ( AR-IV, b	8 4 2	> 3.000 >3.000 >3.000	> 3.000 375 375	188 188 47
IFN- C AOBc	16 8 2	> 3.000 >3.000 >3.000	> 3.000 > 3.000 1 .500	375 375 94

In einem Kontrollversuch besaß Schafserum bei Fibroblast-IFN keine Neutralisationswirksamkeit.

- = nicht bestimmt

a: gegen die entsprechenden IFN-Arten bei Schafen hergestellte Antiseren

b: von epidermalen Keratinocyten abgeleitet, nicht notwendig fibroblastfrei (NDV-induziert)

c: von fibroblastfreien epidermalen Keratinocyten abgeleitet (NDV-induziert).

Aus den Ergebnissen von Tabelle V ist folgendes ersichtlich:

a) IFN-ot wird durch Anti-oi-Antiserum und ein Gemisch von Anti-«- und Anti-ß-Antiserum neutralisiert. Wie erwartet, ist die doppelte Menge des Gemischs Anti- <χ /ß erforderlich als im Fall von Anti-oe, um die gleiche Menge IFN-<* zu neutralisieren (gleiche Mengen Antiserum neutralisieren gleiche Mengen IFN- <x );

b) IFN-ß wird durch Anti-ß-Antiserum und ein Gemisch von Anti-oc- und Anti-ß-Antiserum neutralisiert. Auch hier ist die doppelte Menge Anti-ix/ß-Antiserumgemisch gegenüber Anti-ß-Antiserum erforderlich, um die gleiche Menge IFN-ß zu neutralisieren;

c) zur Neutralisation der gleichen Menge IFN- £ ist weniger als halb so viel Anti- oc/Anti-ß-Antiserumgemisch als Anti-ß-Antiserum erforderlich. IFN-£ reagiert nicht mit gegen IFN-^f gerichteten Antiseren.

Das Beispiel erweist, daß IFN- £ immunologisch von IFN-öf, IFN-ß und IFN-fr verschieden ist und folglich chemisch von diesen bekannten Interferonen verschieden ist.

Beispiel 8

Neben den in Beispiel 7 angeführten serologischen Untersuchungen wurde IFN- B , das hierfür immunopräzipitiert worden war, in einem Neutralisationsversuch eingesetzt. Zwei Proben dieses Interferonpräparats wurden mit Anti-ß-IFN (polyklonal, erhalten von MIH, oder monoklonal, erhalten von Y.H. Tan) versetzt. Das Gemisch wurde 1 h bei 37 ⁰C und anschließend 1 h bei 4 °C zur Erzeugung des Antikörper-IFN-Komplexes inkubiert; anschließend wurde der Komplex zu-

sammen mit eventuell vorhandenem überschüssigem Antikörper durch Inkubation der komplexierten und unkomnlexierten Antiseren in Gegenwart von Protein-A-Sepharose (Sigma) in einer Menge von 30 ,ul bis 1,5 ,ul des Reaktionsgemisches entfernt. Das zurückbleibende nicht-komplexierte IFN wurde einer nochmaligen Immunpräzipitation unterzogen; die Proben wurden wie oben beschrieben mit Hilfe des CPE-Inhibitionstests auf ihre IFN-Wirksamkeit untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt.

	Ursprüngl. IFN-Titer (Einheiten/ml)	Tabelle VI	IFN-Titer nach der 1.Fällung	2. Antikörper- IFN-Titer fällung mit: nach der 2.Fällung	ι ι » » 1 V ) » I J
IFN-Probe	1024	1. AntikörOer- fallung mit:	256	Anti-ß-Antiserum 256 polyklonal I	to ! ' . I
AOB-IFN-i	1024	Anti-ß-Antiserum polyklonal	1024	Anti-ß-Antiserum1024 monoklonal j
AOB-IFN-£	1024	Anti-ß-Antiserum monoklonal	1024	Anti-ß-Antiserum 102 4 polyklonal
AOB-IFN-€	1024	Anti-ß-Antiserum monoklonal	256	Anti-ß-Antiserum 256 monoklonal
AOB-IFN-i	Anti-ß-Antiserum polyklonal

Wenn das vorpräzipitierte A0B-IFN-£ in dem Neutralisationstest eingesetzt wurde, der genau wie in Beispiel 7 durchgeführt wurde, wurden die in Tabelle VII aufgeführten Ergebnisse erhalten.

Tabelle VII

Zur Neutralisation von IFN erforderliche Menge Antiserum

(Neutralisationseinheiten)

IFN-Probe	(	AOB-IFN-£	IFN-Kon	8	Anti-ß-	.000	Gemisch von
		absorbiert	zentration	4	Antiserum	.000	Anti-«- und
mit Anti-ß-	!Einh./ml)	1		.000	Anti-ß-Anti-
Antiserum		16			serum
AOB-IFN-i	16	8	>3	.000	1.500
absorbiert	8	4	>3	.000	375
4	>3	.500	94
16	>3	.000	1.500
8	>3	375	188
mit Kontroll- 4	1	12	94
Antiserum		750
AOB-IFN-ί	>3	188	1 .500
nicht		94	94
absorbiert		24
NIH-IFN-ß		750
		375
		188

In einem Kontrollversuch besaß Schafserum bei Fibroblast-IFN keine Neutralisationswirksamkeit.

Aus den obigen Versuchsergebnissen geht hervor, daß ein Teil des IFN- ξ -Präparats auch dann, wenn zwei verschiedene Anti-ß-Antikörper verwendet werden, nicht mit Anti-ß-Antiserum neutralisiert werden kann. Auch nach gründlicher

Fällung mit Anti-ß-Antiseren kann allerdings ein zusätzlicher Anteil IFN-£ mit gemischtem Anti- οί /ß-Antiserum gefällt werden. Diese Versuchsergebnisse sind ein zusätzlicher Nachweis dafür, daß IFN-£ immunologisch und chemisch von anderen bekannten Humaninterferonen verschieden ist.

Beispiel 9

Durch Induktion menschlicher Epidermiszellen mit NDV nach Beispiel 3 hergestelltes IFN-£ kann durch Affinitätschromatographie an einer Reihe immobilisierter Liganden gereinigt und aufkonzentriert werden. Hierzu gehören Reaktivrot-Agarose, Phenylsepharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) , Procion Red Agarose, Phenyl-Agarose (BRL, Gaithersburg, USA), Glycogel-B, N-(3-Carboxyproprionyl)-aminodecan (CPAD)-Agarose und N-Pyromellitylaminodecan (PMAD)-Agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, USA).

8 ml IFN-£ in MEM-Medium mit einem Gehalt von 900 Einheiten IFN-£ wurden auf eine 0,5-ml-Reaktivrot-Agarose-Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 10 ml 20 mil Phosphat puff er (pH 7,4) gewaschen. Anschließend wurde das IFN mit 3 χ 2 ml 50-%-iger Ethylenglycollösung in 20 itiM Phosphatpuffer mit 1 M Natriumchlorid eluiert. Jede der Fraktionen wurde im gleichen Volumen 20 mM Phosphatpuffer gesammelt, um das Ethylenglycol zu verdünnen. Die Säule wurde schließlich mit weiteren 5 ml 20 mM Phosphatpuffer gewaschen. Die Proteinkonzentrationen wurden anhand der Absorption bei 2 80 nm (OD-280) gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VIII aufgeführt.

Säulenfraktion

OD

280

Tabelle VIII

IFN-Titer Volumen Gesamt- Reinheits- Gesamt-(Einheiten/ (ml) OD grad IFN-ml) (Einheiten) (-fach) Einhei

ten

Prozent tuale Ausbeute an IFN

Ursprungliches Material	2,95	128	7	20,65	0
Säulendurch- lauf	1 ,995	8	7	13,97	-
1.Waschen mit 2OmM Phosphat puffer	0,911	4	5	4,6
2.Waschen mit 2OmM Phosphat puffer	0,088	2	5	0,44
erste 2 ml Ethylenglycol	0,721	128	4	2,88	7
zweite 2 ml Ethylenglycol	0, 123	256	4	0,49	43
dritte 2 ml Ethylenglycol	0,021	16	4	0,084	250
Waschen mit 2OmM Phosphat puffer	—	0	5	—	—

896	100	,5
56	0	,02
20	0

10

512

1024

64

0,01

114

0,7

CaJ CaJ

Die ersten beiden Ethylenglycolfraktionen wurden vereinigt; öie resultierende Fraktion enthielt das gesamte auf die Säule aufgegebene IFN- £ und ergab eine 6-fache Reinigung gegenüber dem eingesetzten Material.

In anderen ähnlichen Versuchen wurden bis zu 68 ml IFN-£ auf die Säule aufgegeben und das IFN in einem Endvolumen von 8 ml wiedergewonnen. Dies entspricht einer 8,5-fachen Aufkonzentrierung des Materials. Wenn das IFN-έ nacheinander mit zwei oder mehr dieser immobilisierten Liganden hintereinander in Kontakt gebracht wird, kann eine noch stärkere Reinigung erzielt werden. So wurde beispielsweise eine IFN-fc-Probe auf eine CPAD-Säule aufgegeben und wie oben beschrieben eluiert. Die vereinigten IFN enthaltenden Fraktionen ergaben eine etwa 9-fache Reinigung; sie wurden zur Entfernung des Ethylenglycols gegen 20 niM Phosphatpuffer dialysiert. Die Probe wurde dann auf eine PMAD-Agarosesäule aufgegeben, die in gleicher Weise entwickelt wurde. Das IFN-£ wurde in einer Ausbeute von 70 bis 100 % mit einer weiteren 5-fachen Reinigung, bezogen auf das Gesamtprotein, gewonnen.

Aus diesem Beispiel geht hervor, daß IFN-6 durch immobilisierte Liganden einzeln oder in Kombination gereinigt werden kann.

Beispiel 10

Unfraktioniertes IFN-£ wurde zunächst bei 300 g 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde nacheinander mit einem Mischgerät (Fisher Rotarack) mit Porenglas (controlled pore glass C.P.G., Electronucleonics, Inc.) bei 4 ⁰C gemischt, wobei 0,28 g Porenglas auf 30 ml des Kultur-Überstands einaesetzt wurden. Nach 3 h wurde der

332513Ί

überstand abgetrennt; die Porenglaskugeln wurden in eine Säule (2,5 χ 3,1 cm) gepackt. Die so erhaltene Säule wurde zuerst mit dem vierfachen Säulenvolumen PBS und anschließend mit dem vierfachen Säulenvolumen 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen. Das IFN-€ wurde dann mit dem vierfachen Säulenvolumen an 50 Vol.-% Ethylengly^ ' col - 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen und in einem gleichen Volumen 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer gesammelt, wobei eine Endkonzentration an Ethylenglycol von 25 % erhalten wurde. Die IFN-6 enthaltende Fraktion wurde durch Ultrafiltration auf 1,0 bis 1,6 ml aufkonzentriert und auf eine Polyacrylamid-Agarose-Säule (Ultragel AcA54, 1,6 · 85 cm) aufgegeben, die mit 25 Vol.-% Ethylenglycol - 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer 7,4 äquilibriert worden war. Das IFN-S wurde anschließend mit dem Äquilibrierungspuffer bei einem Durchsatz von 6,0 ml/h eluiert. Dabei wurden 2,0-ml-Fraktionen gesammelt und auf ihren IFN- und Proteingehalt getestet (Loury-Test). Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IX aufgeführt.

	Reinigung von	Tabelle IX	Ultragel	AcA 5 4
	Protein- IFN-	IFN-& mit Porenglas und	Gesamt	Spezifi
Säulen	gehalt Titer	Volumen Gesamt-	gehalt	sche Ak
fraktion	(mg/ml) (Einh./ml)	(ml) gehalt an	an Pro	tivität
		IFN	tein (mg)	(x 104)
	(Einheiten)

Reini- Ausbeugung te an (-fach) IFN

Eingesetz- 0,034 2,560 tes Material (nach Zentrifugieren)

CPG-Überstand -

1.Waschen mit PBS

2.Waschen mit 1 M NaCl-20 mM Phosphatpuffer 7,4

50 % Ethylen- 0,09 4 7.776 glycol

1 M NaC1-20 mM Phosphatpuffer

420 1.075.200

405
55

56
112

12.960 1 .760

896 870.912

14,28

10,53

7,53

Fraktion mit konzentriertem 50-%-igem EthylengIycol

Ultragel AcA-Pool

0,05

512.000

25.600

1,6 819.200

31,0 793.500

1,55

51,2

7,0

100

,20
0,16

0,08
8,27 1,10 81,0

76,2

73,8

OO CO K)

Beispiel 11

Präparationen von IFN-ε, IFN- oc und IFN-ß, zum Teil als Rohprodukt, zum Teil nach Beispiel 10 gereinigt (p-IFN-£) und Antimäuseinterferon-absorbiertes p-IFN-£ wurden durch Gelelektrophorese an SDS-GeI nach dem Verfahren von Lamelli der Molekulargewichtsbestimmung unterzogen. Die Proben wurden 1 h bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,0 % SDS, 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), 10 Vol.-% Glycerin und 0,001 % Bromphenolblau inkubiert, auf 12,5 % PoIy-■acrylamidgel aufgebracht und etwa 16 h laufengelassen. Nach der Elektrophorese wurden die Zonen mit den Molekulargewichtsstandards gefärbt. Die IFN-enthaltenden Zonen wurden in 3-mm-Scheiben geschnitten und unter Schütteln 20 h bei Raumtemperatur mit 0,5 ml PBS extrahiert, das 0,5 % SDS enthielt. Die Analyse dieser Fraktionen wurde in GM-2767-Zellen vorgenommen, wobei das Molekulargewicht jedes Aktivitäts-Peaks durch Vergleich mit seiner Position auf dem Gel mit den der Molekulargewichtsstandards berechnet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengestellt.

Tabelle X

Molekulargewichte von IFN-Präparaten

Molekulargewicht der Aktivitäts-Peaks (% der gewonnenen
Aktivität)

Qf	I	I	7,5K	:1,83)
ß	-	7,5K	(41,0)
ί (roh)	1	7,5K	(35,4)
ρ-IFN-C	1	7,5K	( 9,2)
nicht gebun denes p-IFN-fc	1		(68,0)
gebundenes p-IFN-(£	1

19,7K (44,8)

20,OK ( 7,4)

20,OK (2,53)

20,OK 0

20,OK (15,3)

22,5K . (27,6)

22,OK (98,2)

22,OK (51,6)

22,OK (62,0)

22,OK (90,8)

22,OK (16,8)

Alle drei mit IFN- €-Proben erhaltenen Fraktionen zeigten bei GM-2767-Zellen antivirale Wirksamkeit. Die von IFN-fc erhaltene Fraktion mit einem Molekulargewicht von 22,0 · 10 zeigte gegenüber Rindernierenzellen (MDBK) keine Wirksamkeit. Die anderen beiden IFN- £ -Fraktionen (17,5K, 20,OK) besaßen eine Wirksamkeit von etwa 25 % gegenüber MDBK-ZeIlen, bezogen auf ihre Wirksamkeit gegenüber GM-2767-Zellen.

Beispiel 12

Die antivirale Wirksamkeit von IFN-€ , das durch NDV-Induktion aus menschlichen Epidermiszellen nach Beispiel 3 erhalten worden war, IFN-ot (vom National Institute of Health, NIH) und IFN-ß (NIH) wurde bei Kulturen normaler menschlicher Epidermiszellen gegen normale menschliche diploide Fibroblastzellen miteinander verglichen. Serielle Verdünnungen der drei IFN-Präparationen wurden in die Vertiefungen einer Mikrotitrationsplatte zusammen mit Standardkulturen menschlicher Epidermiszellen und normaler menschlicher Fibroblastzellen gegeben. Nach 18 bis 24 h Inkubation bei 37 ⁰C wurden die Zellen in jeder Vertiefung mit einer Standarddosis von Stomatitisvirus (Vesicular Stomatitis Virus, 1 PFü/Zelle) infiziert. Nach 36 bis 96 h, wenn die Kontrollversuche 100 % abgestorbene Zellen ergaben, wurde der Inhalt jeder Vertiefung der Mikrotitrierplatten mikroskopisch auf Resistenz gegenüber dem Virus untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengefaßt.

Tabelle XI
Interferon Aktivitätseinheiten/ml von IFN gegenüber:

Fibroblasten (FS-4)

ΕόϊtheIzeilen

IFN-£	32-64
IFN-oC	128-512
IFN-ß	32-256

512-2048 64
8-32

a - normale menschliche diploide Fibroblastzellen (erhalten von J. Vilcek, New York University, New York, USA).

Aus den Ergebnissen von Tabelle XI geht hervor, daß das durch den DNA-Code von Epithelzellen erzeugte IFN-6 signifikant (bis zu etwa 16-fach) wirksamer als antivirales Mittel bei Epithelzellen als bei Fibroblasten ist. Andererseits ist IFN-iX, das über den DNA-Code von menschlichen Leukocyten und Lymphoblastoidzellen abgeleitet wurde, (bis zu 8-fach) wirksamer gegenüber Fibroblasten als gegenüber Epithelzellen, und IFN-ß, das über den DNA-Code aus Fibroblasten abgeleitet ist, (bis zu 32-fach) wirksamer gegenüber Fibroblastzellen als gegenüber Epithelzellen.

Beispiel 13

Die relative antivirale Wirksamkeit von IFN-ä, IFN-ß, IFN-^ und IFN- £ gegenüber Rindernierenzellen (MDBK-Zellen ATCC CCL22) wurde wie in Beispiel 11 gegenüber menschlichen trisomalen Fibroblasten (dreifaches Chromosom 21 - GM-2 767, Human mutant cell repository 47, XX, t21) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XII zusammengefaßt.

Tabelle XII

IFN-Typ Aktivitätseinheit/ml IFN gegenüber MDBK GM-2767

512 128 128 32

OC	> 512
β	0
1	0
£	8-16

Die Ercrebnisse von Tabelle XII zu IFN-α, IFN-ß und IFN-Y stimmen mit den früher veröffentlichten Daten überein. Die Resultate für IFN-6 zeigen an, daß dieses neue Interferon gegenüber GM-2 767-Zellen 2- bis 4-fach wirksamer ist als gegenüber Rindernierenzellen.

Beispiel 14

Das erfindungsgemäße Interferon besitzt ferner Antiproliferationswirksamkeit, wie aus der Inhibierung der Vermehrung menschlicher Lymphoblastoidzellen (Daudi-Zellen) hervorgeht. Etwa 10 000 menschliche Lymphoblastoidzellen wurden zusammen mit 200 ,ul Medium auf eine Mikrotitrationsplatte aufgebracht. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen von IFN- <\, IFN-ß und IFN- £ in die einzelnen Vertiefungen zugegeben, worauf die Anzahl lebender Zellen nach 1,2 bzw 4 Tagen gezählt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XIII zusammengestellt.

- 41 Tabelle XIII

Versuche an Daudi-Zellen Anzahl lebender Zellen/Viertiefung (χ 10 )

IFN-Typ und nach 1 d nach 2 d nach 4 d Konzentration

- 100 Einh. 6,0 4,8 6,0

10 Einh. 4,8 5,2 6,0

ß - 100 Einh. 7,2 9,6 6,4

10 Einh. 5,2 9,6 18,4

- 100 Einh. 6,0 5,2 4,8

10 Einh. 5,6 5,2 6,0

Kontroll- 8,0 21,5 67

versuch

(ohne IFN)

Aus den Ergebnissen von Tabelle XIII ist ersichtlich, daß 10 Einheiten INF-£ das Wachstum von Daudi-Zellen zu mehr als 90 % unterdrücken.

Beispiel 15

Proben von IFN-λ , IFN-ß und IFN-C wurden jeweils mit Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), Natriumdodecvlsulfat (SDS) sowie einem Gemisch von SDS und ß-Mercaptoethanol (BME) und Harnstoff bei 100 °C äguilibriert. Von dem grenzflächenaktiven Mittel SDS ist bekannt, daß es Proteine durch Änderung ihrer Konformation denaturiert, während BME Disulfidbindungen reduziert. Bei diesen Versuchen wurde festgestellt, daß IFN- O., IFN-ß und IFN- £ hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber diesen Reagentien merklich verschieden sind. Insbesondere IFN-« erwies sich als gegenüber SDS allein stabil, wurde jedoch in Gegenwart eines Gemischs von SDS,

Harnstoff und BME im wesentlichen inaktiviert; IFN-ß wurde überwiegend durch SDS allein inaktiviert, war jedoch in einem Gemisch von SDS, Harnstoff und BME stabil; IFN-£ erwies sich schließlich gegenüber SDS allein als auch gegenüber Gemischen von SDS, Harnstoff und BME als relativ stabil. In PBS bei 100 °C bleibt bei allen drei Interferon-Typen eine Restaktivität von weniger als 5 %.

In ähnlichen Versuchen wurde festgestellt, daß IFN- \K, das zuvor mit einem Gemisch von SDS und BME inaktiviert worden war, durch Äquilibrierung bei 100 °C mit einem Gemisch von SDS und PBS reaktiviert werden konnte, und IFN-ß, das zuvor in SDS allein inaktiviert worden war, in einem Gemisch von SDS, BME, Harnstoff und PBS reaktiviert werden konnte, während IFN-6 , das zuvor in PBS inaktiviert worden war, durch Äquilibrierung bei 100 ⁰C in Gegenwart von PBS und.SDS mit oder ohne BME/Harnstoff reaktiviert werden konnte. Diese Feststellungen sind ein weiterer unabhängiger Beweis dafür, daß es sich beim erfindungsgemäßen IFN- £. um eine Präparation eines völlig neuartigen IFN-Typs handelt.

Beispiel 16

Bei diesem Versuch . wurden die Bindungs- und Elutionseigenschaften von IFN-£ und IFN-ß an einer Sepharose-Säule (Blue Sepharose, Pharmacia) untersucht. Die Säulen wurden nach den Herstellerangaben hergestellt, worauf bei Raumtemperatur die IFN-ß-Probe in PBS bzw die IFN- ε Probe in PBS aufgegeben wurde. Die Elution erfolgte mit 1 M NaCl in PBS und 50 Vol.-% Ethylenglycol in 20 mM Natriumphosphatpuffer. Die beiden Interferon-Präparationen

wurden durch zwei Säulen durchlaufen gelassen, die unterschiedliche Chargen der oben angegebenen Sepharose enthielten. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle XIV hervor.

Tabelle XIV Bindung von IFN-Präparaten an Sepharose

Fraktion Prozentuale wiedergewonnene Aktivität

mit

IFN-ß IFN- β

Säulendurchlauf 44,0-44,2 2,5-10,2 +20 mM Phosphatpuffer

Elution mit 2,7-4,3 19,3-30

1 M NaCl

Elution mit 50 % 51,9-52,3 60,0-78,2 Ethylenglycol/

1 M NaCl in 20 mM

Phosphatpuffer

Aus den Ergebnissen von Tabelle XIV geht hervor, daß IFN-ε und IFN-ß gegenüber Blue Sepharose unterschiedliche Affinität und unterschiedliches Elutionsverhalten besitzen. Das Adsorbens Blue Sepharose bindet etwa 90 bis 9 7 % der INF-£ -Aktivität, während unter den gleichen Bedingungen lediglich etwa 60 % des IFN-ß gebunden werden. Ferner konnten 20 bis 30 % des IFN-£ mit 1 M NaCl wiedergewonnen werden, während unter gleichen Bedingungen lediglich 3 bis 4 % der IFN-ß-Aktivität wiedergewonnen werden konnten. Schließlich werden etwa 80 % der IFN-£ -Aktivität mit einer Kombination von 50 % Ethylenglycol/1 M NaCl eluiert, während unter gleichen Bedingungen lediglich etwa 50 % der IFN-ß-Aktivität wiedergewonnen werden.

Claims (18)

« Ansprüche

1. Interferon-Präparat mit antiviraler Wirksamkeit, erhältlich durch

(A) Erzeugung einer Kultur lebender Zellen, die zumindest einen Teil des DNA-Codes menschlicher Epithelialzellen enthalten,

(B) Inkubation der Zellen in einem Medium unter Bedingungen, unter denen die Synthese von Interferon gefördert wird, und

(C) Gewinnung einer interferonreichen Fraktion aus diesen Zellen.

2. Interferon-Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- es bei pH 2 stabil ist,

- seine antivirale Wirksamkeit durch proteolytische Enzyme zerstört wird,

- es keine Kreuzreaktivität mit Antikörpern zu Interferon-oi oder Interferon-^ aufweist

und

- seine antivirale Wirksamkeit gegenüber MDBK-Rinder-

nierenzellen ein Viertel bis die Hälfte seiner Wirksamkeit gegenüber menschlichen trisomalen Fibroblasten (GM-2767) beträgt.

O192-(DBH-422)-SF-Sl

3. Interferon-Präparat nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich unter Verwendung einer Zellkultur menschlicher Epithelialzellen.

4. Interferon-Präparat nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich unter Verwendung einer Zellkultur transformierter eukaryotischer Zellen.

5. Interferon-Präparat nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich unter Verwendung einer Zellkultur mit Zellen, bei denen der Teil des DNA-Codes durch DNA-Rekombinationsverfahren in die Zellen eingefügt ist.

6. Interferon-Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch ein derartiges Profil der Kreuzreaktivität gegenüber einem Gemisch von Anti-oc- und Anti-ß-Antiseren, daß durch das Gemisch die doppelte

Menge des Interferons neutralisiert wird, die durch

_tneutralisxert wird,
Anti-ß-Antiseren allein*', bezogen auf gleiche Einheiten

der Neutralisationswirksamkeit.

7. Verfahren zur Herstellung des Interferon-Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch

(A) Erzeugung einer Kultur lebender Zellen, die zumindest einen Teil des DNA-Codes menschlicher Epithelialzellen enthalten,

(B) Inkubation der Zellen in einem Medium unter Bedingungen, unter denen die Synthese von Interferon gefördert wird,

und

(C) Gewinnung einer interferonreichen Fraktion aus diesen Zellen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,

daß in Schritt (A) als Zellkultur eine Kultur menschlicher Epithelialzellen verwendet wird und in Schritt (B) ein Virus zur Induktion der Interferonproduktion in den Zellen herangezogen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,

daß in Schritt (A) eine Zellkultur transformierter eukariotischer Zellen verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,

daß in Schritt (A) eine Zellkultur von Zellen verwendet wird, bei denen der Teil des DNA-Codes durch DNA-Rekombinationsverfahren in die Zellen eingeführt ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet,

daß als Virus Newcastle Disease-Virus oder Sendai-Virus verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,

daß der Bankowski-Stamm des Newcastle Disease-Virus verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 8, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet,

daß in Schritt (A) die Zellkultur aus Zellen von menschlichem Epithelialgewebe hergestellt wird, das von Epidermis, Conjunctiva, Vagina oder Oesophagus stammt.

-A-

14. Pharmazeutische Zusammensetzungen,

gekennzeichnet durch ein Interferon-Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als Wirkstoff.

15. Verfahren zur Behandlung lebender Zellen zur Inhibierung von Virusinfektionen,

gekennzeichnet durch Inkontaktbringen der zu behandelnden Zellen mit einer wirksamen Menge des Interferon-Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

16. Verfahren nach Anspruch 15,

gekennzeichnet durch Behandlung menschlicher Epithelialzellen.

17. Verfahren zur Behandlung neoplastischer lebender Zellen zur Inhibierung der Zellproliferation, gekennzeichnet durch Inkontaktbringen der zu behandelnden Zellen mit einer wirksamen Menge des Interferon-Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

18. Verfahren nach Anspruch 17,

gekennzeichnet durch Behandlung neoplastischer menschlicher Epithelialzellen.