FR2567269A1 - Procede d'examen immunologique pour la detection qualitative et quantitative de l'interferon epsilon - Google Patents

Abstract

PROCEDE D'EXAMEN IMMUNOLOGIQUE POUR LA DETECTION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DE L'INTERFERON EPSILON. ON FAIT INCUBER UNE PREPARATION, SUPPOSEE CONTENIR DE L'INTERFERON EPSILON (SUBSTANCE AYANT UNE ACTIVITE ANTIVIRALE SELECTIVE SUR DES CELLULES EPITHELIALES) AVEC DES KERATINOCYTES HUMAINS ET AVEC DES FIBROBLASTES HUMAINS, PUIS ON MET LES CELLULES AU CONTACT D'UN VIRUS CAPABLE DE LES INFECTER. IL Y A PRESENCE DE L'INTERFERON EPSILON SI LA PREPARATION A UNE ACTIVITE ANTIVIRALE SUR LES KERATINOCYTES MAIS PAS D'ACTIVITE DECELABLE SUR LES FIBROBLASTES. ON PEUT DETERMINER LE TITRE DE LA PREPARATION PAR DILUTION EN SERIE, INCUBATION DE LA DILUTION AVEC DES SOUS-CULTURES DE KERATINOCYTES, MISE DES SOUS-CULTURES AU CONTACT D'UN VIRUS, OBSERVATION DE LA VIABILITE DES CELLULES DES CULTURES ET COMPARAISON DES RESULTATS AVEC UN ETALON NORMALISE. APPLICATION : CONTROLE DE LA FABRICATION ET DE L'ACTIVITE DE MEDICAMENTS ANTIVIRAUX.

Description

i 2567269 La présente invention concerne des modes opératoires d'examens

et titrages immunologiques et, en particulier, elle concerne un examen destiné à déceler l'interféron epsiloi

qui est un agent antivSral produit par des cellules épithélia-

les humaines.

Les interférons sont des matières douées de proprié-

tés antivirales. Ces matières sont produites par certains types de cellules qui ont été stimulées par leur exposition à un virus, à certains acides nucléiques ou à des complexes

antigène/mitogène. Les interférons sont des substances médi-

cinales extrêmement puissantes qui offrent de grands espoirs

à titre d'agents antiviraux cliniques.

On divise les interférons humains en trois types: l'interféron alpha, produit par des leucocytes humains ou des cellules analogues à des lymphoblastes; l'interféron bêta, produit par des fibroblastes; et l'interféron gamma, produit par des lymphocytes T humains. Les trois types sont tous secrétés par les cellules respectives après que celles-ci

aient- été stimulées par un virus ou par une exposition analo-

gue. Un nouveau type d'interféron, appelé interféron

epsilon, a été récemment découvert.

L'interféron epsilon est actif sur des cellules épi-

théliales humaines et, donc, il offre des espoirs d'augmenta-

tion de la première ligne de défense de l'organisme, par exemple la peau et autres surfaces épithéliales, contre une attaque virale. Cependant, puisque l'interféron epsilon n'est actif que dans l'épithélium, des essais classiques concernant les interférons ne sont pas capables de le déceler et d'en quantifier la présence. On a donc besoin d'un mode opératoire simple et efficace d'examen en vue de déceler la présence de l'interféron epsilon et d'en quantifier le titre. Un tel

examen serait utile dans les réglages et montages de labora-

toire ainsi que dans les modes opératoires de contrôles de qualité lors de la fabrication de l'interféron epsilon destiné

à une application thérapeutique.

Il a été découvert que l'on peut facilement quanti-

fier la présence de l'interféron epsilon en en observant les effets cytopathiques sur les cellules épithéliales, en part:,:uilir les kératinocytes, traitées par des échantillons supposés le contenir. L'interféron epsilon a une activité antivirale sur les cellules épithéliales humaines, mais pas d'activité décelable sur des fibroblastes humains, et il est antigénétiquement distinct des interférons alpha, bêta et gamma. Donc, une préparation qui présente une activité antivirale sur des cellules d'origine épithéliale, mais pas d'activité sur des fibroblastes, contient de l'interféron epsilon. Ces observations forment la base d'une recherche qualitative et aussi d'une détermination quantitative de

l'interféron epsilon.

La détermination quantitative est un dosage, avec compétition ou provocation, conduit par des étapes analogues à celles utilisées dans l'art antérieur pour mesurer le titre d'autres interférons, sauf que l'on utilise des cellules épithéliales, de préférence des kératinocytes, et encore

mieux de jeunes kératinocytes, à la place des fibroblastes.

Ainsi, on fait croître des kératinocytes, on les divise en plusieurs souscultures et on les traite par un échantillon contenant une concentration inconnue de l'interféron epsilon et ne contenant pas des interférons qui constitueraient des

impuretés. On traite chaque sous-culture successive des cel-

lules par une partie de l'échantillon qui a subi, par

exemple, une dilution de deux fois. Après une période d'incu-

bation appropriée (deux heures à deux jours environ), on expose les kératinocytes ainsi traités- à un contact de provocation par un virus. Dans la forme de réalisation décrite à titre d'exemple, le virus à râle provocateur est

un Virus de Stomatite Vésiculaire (VSV).

Uine unité d'interféron epsilon peut se définir comme étant la concentration nécessaire pour protéger la moitié d'une population de kératinocytes humains contre une attaque

de provocation par une concentration normalisée de virus.

On peut donc facilement déterminer le nombre des unités

présentes dans un échantillon donné, non contaminé.

3:

Quand l'interféron epsilon est produit- par stimula-

tion de cellules épithéliales par un virus, il y a souvent aussi!roduction de l'interféron-alpha et de l'interféron bêta. Ces substances vont gêner la recherche ou le dosa.ja ci-dessus. Donc, quand il y a présence d'interféron alpha, bêta ou gamma, il convient de le ou les enlever ou d'eh neutraliser

l'activité avant de conduire la recherche ou le dosage.

On effectue la recherche qualitative en neutralisant tout d'abord ou en enlevant d'une autre manière tous les interférons contaminateurs éventuellement présents dans l'échantillon d'essai. Si l'échantillon présente alors de l'activité antivirale sur des cellules épithéliales mais pas d'activité décelable sur des fibroblastes humains, il

contient de l'interféron epsilon.

Les résultats des essais ou dosages doivent, bien entendu, être comparés à un étalon pour obtenir des données significatives. On peut réaliser une préparation normalisée d'interféron epsilon en stimulant des cellules épithéliales, de préférence des kératinocytes, par un virus, de façon connue et publiée, en récoltant le liquide surnageant après production et sécrétion des interféron5 puis en-neutralisant la préparation par des anticorps alpha, bêta et gamma. Le

reste de la préparation va contenir de l'interféron>epsilon.

On peut soumettre cette préparation restante à une dilution en série ou successive et à une microculture de cellules épithéliales jusqu'à atteindre une dilution qui va protéger la moitié des cellules épithéliales de la culture contre

un contact d'attaque provocatrice par une concentration norma-

lisée (par exemple une unité de formation de plaques/cellule)

d'un virus donné, par exemple le virus de la stomatite vési-

culaire. Cette dilution va contenir une unité'd'activité

de l'interféron epsilon.

Un objet de l'invention consiste à proposer des

procédés pour déterminer la présence et la quantité d'inter-

féron epsilon dans des préparations soupçonnées de le con-

tenir. Cet objet et des caractéristiques de l'invention

et d'autres encore,- ressortiront de la description détaillée

suivante, présentée à titre illustratif et nullement limita-

tif, er regard de la figure unique annexée qui est un gra-

phique montrant l'électrophorèse de l'interféron épithélial de l'invention (ordonnées: titre de l'interféron (unités/ml);

abscisses: numéro de fraction).

Il y a production d'un nouveau-type d'interféron quand des cellules d'origine épithéliale, notamment-des

kératinocytes, subissent une stimulation par un virus appli-

qué selon des techniques classiques. Quand la nouvelle matière, appelée interféron epsilon, est produite, il y a également production d'autres interférons, et il a été difficile de déceler et de quantifier l'interféron-epsilon

en présence de ces autres matières.

Il vient d'être découvert que l'interféron epsilon, quand il n'est pas contaminé par d'autres interférons connus, exerce une grande activité antivirale sur des cellules épithéliales et n'a pas d'activité décelable sur d'autres types de cellules utilisées normalement dans les recherches d'interféron par mise en contact avec une substance ou organisme provocateur. En fait, la définition d'une unité

d'activité utilisée de façon classique pour d'autres inter-

férons, à savoir la concentration qui protège la moitié des

cellules d'une culture de fibroblastes humains contre l'atta-

que de provocation par une concentration normalisée du virus de lastomatite vésiculaire, n'a pas de sens quand il s'agit

de l'interféron epsilon. En effet, une concentration d'inter-

féron epsilon ayant une forte activité antivirale sur des cellules épithéliales n'a pas d'activité antivirale dans

des fibroblastes.

On peut utiliser ce pouvoir sélectif et marqué de

l'interf6iron epsilon dans des cultures de cellules épithé-

liales humaines, et en particulier des kératinocytes, comme base pour déceler et quantifier cet interféron. Une unité

d'interféron epsilon peut se définir comme étant la concen-

tration qui protège la moitié des cellules d'une culture de kératinocytes humains contre une attaque par une unité

de formation de plaques/cellule de virus de stomatite vési-

culaire.

Q!-and on désire déterminer la présence de l'inter-

féron epsilon, ou en quantifier la proportion, dans une préparation supposée contenir d'autres interférons, on peut éliminer l'activité des autres interférons en effectuant une neutralisation à l'aide d'anticorps de l'interféron gamma, bêta ou alpha, et l'on peut ensuite soumettre la préparation à des essais de détermination de son aptitude à protéger des kératinocytes humains, ou d'autres cellules

humaines d'origine épithéliale contre une infection virale.

La présence de l'interféron epsilon est confirmée si l'on trouve qu'un échantillon, purifié pour en enlever l'activité de l'interféron alpha, bêta et gamma, présente une activité antivirale sur des cellules d'origine épithéliale mais n'a

pas d'activité décelable sur des fibroblastes.

Les cellules épithéliales que l'on préfère utiliser dans cette recherche sont des kératinocytes et encore mieux de jeunes kératinocytes, par exemple une culture venant juste

d'atteindre la confluence. A mesure que les cellules mûris-

sent, elles accumulent de la kératine, et cela complique apparemment la recherche en empêchant le virus de pénétrer

dans les cellules pendant le contact provocateur.

Les virus que l'on préfère utiliser pour le contact provocateur sont ceux dont on connait la cytotoxicité à l'égard de cellules épithéliales. Le VSV fonctionne bien, mais l'on peut utiliser le virus de l'Encéphalo Myocardite (EMC), le virus de Sendai ou d'autres virus. On préfère utiliser pour déterminer une concentration normalisée le même virus que celui utilisé dans les recherches et dosages de comparaison avec l'étalon normalisé. Généralement, la sensibilité de la recherche ou du dosage va dépendre du virus

particulier choisi.

On conduit de préférence la recherche en enlevant

tout d'abord l'activité de tous les interférons contamina-

teurs éventuellement présents, puis en soumettant l'échan-

tillon à des dilutions successives ou en série et en ajoutant

la dilution ainsi obtenue à plusieurs cultures de kératino-

cytes. De préférence, on ajoute aussi une dilution à concen-

trutinn relativement élevée ou une partie aliquote non -

diluée, de l'échantillon d'essai à une culture de fibro-

blastes. Les cultures peuvent être contenues dans des plaques classiques pour microtitrage, par exemple celles comprenant 96 creux. Après incubation, on met les cultures en contact avec le virus. En comptant le nombre de cellules viables contenues dans les creux à un moment donné, par exemple,

quand un creux témoin non traité par l'échantillon ne con-

tient pas de cellules viables, on peut déterminer le titre

de l'interféron epsilon. Si le creux contenant des fibro-

blastes contient des cellules non viables mais si au moins certains des kératinocytes ont été protégés, la présence

de l'interféron epsilon est confirmée.

L'invention va maintenant être décrite à propos de certains exemples de mise en oeuvre. Cependant, on doit clairement indiquer qu'il est possible à l'homme de l'art d'effectuer diverses modifications et variations sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention. Par exemple, la

recherche ou le dosage peuvent être conduits avec des échan-

tillons purifiés ou non purifiés. Si l'on doit utiliser des échantillons purifiés contenant de l'interféron epsilon,

il peut être utile dans le processus de purification d'uti-

liser des perles de verre à pores de dimension réglée.

De plus, bien que l'on ait décrit des plaques com-

portant des creux et une observation visuellecomme consti-

tuant l'appareil et le procédé préférés pour la mise en oeuvre de la recherche, il doit être bien clair que l'on 3.0 peut utiliser divers autres dispositifs de culture de cellules et divers autres procédés de détection. On peut, par exemple, préférer une analyse automatisée dans le cas

d'une production à grande échelle de l'interféron epsilon.

En outre, si de jeune kératinocytes sont identifiés comme constituant les cellules préférées pour la recherche et le

dosage de l'interféron epsilon, d'autres cellules épithélia-

les peuvent aussi s'avérer utilisables. On peut aussi utili-

ser d'autres virus, qui sont capables d'infecter des cellules épithéliales humaines.:

Exemple:.

On a fait croître, jusqu'à une densité de I à 2 x 105 cellules par cm2, une culture de. cellules épithéliales d'origine épidermique (kératinocytes),que l'on a obtenues du laboratoire du Docteur Howard Green au Massachusetts Institute of Technology (Etats-Unis d'Amérique), et l'on

a utilisé cette culture pour produire de l'interféron epsi-

ion en utilisant la méthode d'induction par la virus de la maladie ou conjonctivite de Newcastle (VCN). Le virus utilisé a été la souche de Bankowski de iVGN que l'on a pu obtenir

chez Poultry Health Laboratories, Davis, Californie (Etats-

Unis d'Amérique). On a préparé et Tait incuber quatre échan=g tillons d'1 ml d'un milieu essentiel minimal (MEM, Gibco) contenant 2 % de sérum de foetus de veau inactivé par la chaleur ("SFVIC") et VCN pour parvenir à de multiples infections allant de O à 250 unités de formation de plaques:par les virus/ cellule dans les échantillons d'essai. On a fait incuber les cultures de cellules durant 24 heures. On a ensuite récolté le milieu, on l'a acidifié jusqu'à pH 2 à l'aide de HCl 0,1 N et conservé à 4 C durant cinq à six jours pour inactiver le VCN. Après neutralisation de l'interféron alpha,

de l'interféron bâta et de l'interféron gamma par des anti-

corps spécifiques de chacun des trois types connus d'inter-

féron, on a soumis la préparation d'interféron brut à-des essais de détection d'une activité antivirale. On a effectué

des titrages de neutralisation de chaque interféron en utili-

sant de l'antisérum anti-IFN alpha (NIH), anti-IFN-bêta (NIH et Y.H. Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada),

anti-IFN qamma (S. Baron) et des mélanges de ces anti-

dru,,. On a ensuite soumis les préparations neutralisées restantes,à des essais sur des cultures de fibroblastes ("Humani FS-4") et épithéliales ("Human AR").,Les résultats

obtenus ont indiqué que l'interféron epsilon n'a pas d'acti-

vité antivirale décelable sur des fibroblastes mais montre

* de l'activité contre des virus dans des cellules épithéliales.

Le tableau I ci-après résume une batterie complète

d'essais d'activité antivirale et de neutralisation -

Tableau I

Activité antivirale de préparations d'interféron sur des cellules "FS-4" et "AR" humains Traitement1 Titre d'interféron2 -Echantillon (unités/ml) anti- a anti-e anti- y Human"FS-4" l'AR" humain

IFN- - - - 128 64

IFN- e + - - 48 32 -

IFN- e - + - 24 32 IFN- e - - + 192 32

IFN- + + - <4 32

IFN- + + + + < 4 32

IFN- a - - 64 4

IFN- B - - - 128 16

IFN-a/B - - - 512 16 IFN-y - - - 32 16 IFN- a// y - - 384 64 IFN- a/e/y + - - 128 48 IFN-ea//y - + - 256 16 IFN-a/B/y - - + N.D. 16 IFN-a/X/ y + + <4 <4 IFN-a/e/y + + + <4 <4

On a fait incuber les échantillons avec un excès d'anti-

sérum, comme indiqué, à 37 0C durant I heure avant d'effec-

tuer une recherche de-dosage d'activité d'interféron.

2 On a déterminé le titre de l'interféron par une recherche

de cytopathie virale.

3 N.D. non déterminé (pas de résultats) Il ressort de ces résultats qu'il y a eu coproduction de l'interféron alpha et de l'interféron bêta en même temps que de l'interféron epsilon. On note que la neutralisation par de l'anticorps alpha seul ou par de l'anticorps bêta seul a diminué les unités d'activité de l'interféron dans

les cultures de fibroblastes comme dans celles des kératino-

cytes. Une neutralisation par les deux anticorps ou par un mélange d'anticorps alpha, bêta et gamma a détruit la totalité

de l'activité antivirale de la préparation sur des fibro-

blastes, cependant que 32 unités d'activité par ml sont demeurées dans les cellules de kératinocytes. Cela montre la présence de l'interféron epsilon et confirme qu'il exerce

une activité sélective sur des cultures de cellules épithé-

liales. Cette préparation brute a contenu 32 unités d'inter-

féron epsilon.

Exemple 2

On a étudié l'effet de l'âge de culture des kérati-

nocytes et de la multiplicité d'infection par le. virus induc-

teur sur la production de l'interféron epsilon. On a effectué

comme décrit ci-dessus la détermination des titres d'inter-

féron epsilon. Les résultats obtenus sont résumés ci-après au tableau II:

Tableau II

L'effet de l'âge de la culture et de la multiplicité d'infection sur la production de l'interféron E MDII Titre d'interféron2 (unités/106 cellules) 14 jours 21 jours 27 jours

O <6 (3 <"4

0,1 10 3 <4

1 53 2 8

2 79 6 16

210 6 16

157 6 16

20 210 18 32

210 9 32

ND 12 32

ND 9 32

79 ND ND

35250 - 79 ND ND

1 MDI: multiplicité d'infection 2 On a fait incuber des échantillons d'interféron avec des 1 0 excès d'antisérum d'interféron alpha et bêta avant

d'effectuer des recherches d'activité sur des kératinocytes.

3 N.D: non déterminé (pas de résultats).

Le tableau II montre que, au moins pour les cellules épithéliales du type kératinocytes, les cellules plus jeunes, c'est-à-dire les cellules presque confluentes âgées de 14 jours, produisent plus d'interféron epsilon que de vieilles cellules.

Exemple 3

On a partiellement purifié des interférons d'origine épithéliale produits selon l'exemple 1. On a soumis les échantillons à une analyse des poids moléculaires en une électrophorèse sur du gel contenant du dodécyl sulfate de sodium (SDS) selon la méthode de Lamelli. On a fait incuber les échantillons à la température ambiante durant I heure en présence de 1,0 % de SDS, d'un tampon tris-HC1 0,05 M (pH 6,8), de 10 % (en volume/volume) de glycéroI et de 0,001 % de bleu de bromophénol, chargés sur des gels à 12,5 % de polyacrylamide, et l'on a effectué les électrophorèses durant 16 heures environ. Après l'électrophorèse, on a coloré les bandes contenant les, étalons de poids moléculaire. On a découpé en des tranches de 3 mm les bandes contenant de l'interféron et l'on a extrait par secousses avec 0,5 -ml de solution saline tamponnée par du phosphate et contenant

0,5 % de SDS, durant 20 heures à la température ambiante.

On a effectué des examens sur ces fractions en utilisant

la recherche classique avec contact de provocation, en uti-

lisant des fibroblastes et par l'examen selon l'invention effectué après neutralisation par des anticorps alpha, bêta et gamma. On a calculé le poids moléculaire du principal pic d'activité associé à l'interféron epsilon, par comparaison

de sa position sur le gel avec les étalons de poids molécu-

laire. Sur la figure unique annexée, on voit qu'une activité d'interféron epsilon se manifeste nettement dans des cellules

épithéliales (kératinocytes) "AR" (servant de réactif analy-

tique). La protéine correspondant à l'activité épithéliale présente un poids moléculaire apparent d'environ 20 000, et elle subit aussi une très forte diminution d'activité

par traitement avec du bêta-mercaptoéthanol.

Dans une expérimentation séparée, il a été déterminé que l'interféron epsilon ne possède pas d'activité antivirale

sur des cultures de fibroblastes de souris ou de bovins.

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative d'interféron, décrit

ci-dessus.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour analyser un échantillon en vue de rechercher la présence de l'interféron epsilon, procédé caractérisé en ce qu'il camprend les étapes consistant à faire incuber des cellules épithéliales avec l'échantillon, à soumettLre les cellules incubées à la provocation de la présence d'un virus capable de les infecter, et à comparer, par rapport à un. témoin,

la viabilité des cellules ayant subi cette épreuve de contact -

provocateur.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que les cellules épithéliales sont des kératinocytes.

3. Procédé selon -la revendication 2, caractérisé en ce que la période d'incubation se situe entre environ

2 heures et environ 2 jours.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que l'on fait subir aux cellules résultant de l!incuba-

tion une épreuve de contact avec un virus de stomatite vési-

culaire.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape consistant à comparer la viabilité des

cellules par rapport à un témoin comprend en outre la défini-

tion, dans ledit procédé d'analyse, d'une unité normale ou témoin d'interféron comme étant la quantité d'interféron

epsilon nécessaire pour protéger la moitié des cellules sou-

mises à l'épreuve du contact contre une infection par une

concentration normalisée de virus.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire consistant à faire incuber l'échantillon avec des fibroblastes; à mettre les fibroblastes, résultant de cette incubation, en contact avec un virus capable d'infecter ces fibroblastes, et à observer la viabilité des fibroblastes, la mort de ces fibroblastes en présence dudit échantillon, associée à la

protection des cellules épithéliales, constituant une indi-

-cation de la présence de l'interféron epsilon.

7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon contient un interféron jouant le rôle d'une impureté, procédé caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire consistant, avant d'effectuer l'incubation des fl1u!es, i neutraliser l'échantillon en l'expo? un excès d'anticorps spécifique contre au moins un type d'interferon 'connu.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé

en ce que l'anticorps est choisi parmi de l'anticorps spéci-

fique de l'interféron alpha, de l'anticorps spécifique de l'interféron bêta, de l'anticorps spécifique de l'interféron

gamma et leurs mélanges.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps est constitué-par de l'antisérum et

l'on utilise un mélange d'antisérums spécifiques des inter-

férons alpha et bêta.

10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire consistant à soumettre l'échantillon à une dilution en série, à faire incuber des cultures, séparées, des cellules épithéliales avec cet échantillon dilué en série et à soumettre chacune

de ces cultures à l'épreuve d'un contact avec ledit virus.

11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que les cellules épithéliales sont de jeunes kératino-

cytes.