DE3515803A1

DE3515803A1 - Verfahren zur bestimmung von interferon-(epsilon)

Info

Publication number: DE3515803A1
Application number: DE19853515803
Authority: DE
Inventors: Roy H. L. Medway Mass. Pang
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-05-02
Publication date: 1986-01-16
Also published as: FR2567269A1; IT1183809B; CA1244345A; GB8517164D0; NO850536L; NL8501564A; IT8567398A0; AU3857085A; IT8567398A1; DK99185D0; SE8500620L; GB2161270A; SE8500620D0; DK99185A; US4675282A; JPS6125060A; CH666285A5; BE902663A

Description

Damon Biotech, Inc. Needham Heights, MA o2194, V.St.A.

Verfahren zur Bestimmung von Interferon-e

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen bzw quantitativen Bestimmung von Interferon-e , das einen von menschlichen Epithelzellen erzeugten antiviralen Wirkstoff darstellt, auf der Basis eines Immunoassays.

Interferone sind Stoffe mit antiviralen Eigenschaften. Sie werden von bestimmten Arten von Zellen erzeugt, die durch Zusammenbringen mit einem Virus, bestimmten Nucleinsäuren oder Antigen/Mitogen-Komplexen stimuliert wurden. Interferone sind extrem wirksame Substanzen, an die sich große Erwartungen als klinisch verwendbare Antivirusmittel knüpfen.

Die Humaninterferonewerden typischerweise in drei Typklassen eingeteilt: In Interferon-oc, das

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von menschlichen Leukocyten bzw Lymphoblastoidzellen erzeugt wird, Interferon-ß, das von Fibroblasten erzeugt wird, und Interferon-τ , das in menschlichen T-Lymphocyten gebildet wird. Alle drei genannten Interferonarten werden von den betreffenden Zellen gebildet, nachdem die Zellen mit einem Virus oder auf eine analoge Weise stimuliert wurden.

Vor kurzem wurde ein neuer Typ eines Interferons, das sog. Interferon-ε , angegeben (vgl die DE-A1 33 25 131.

Interferon-e ist gegenüber menschlichen Epithel- _y zellen wirksam; Interferon-e wird daher als erfolgversprechendes Mittel zur Erhöhung der Infektions- k

abwehr auf der ersten Abwehrebene des Körpers, näm-

und

lieh auf der Hautoberfläche anderen Epitheloberflächen, gegenüber Virusangriffen angesehen. Da jedoch Interferon-6 lediglich im Epithelium wirksam ist, eignen sich herkömmliche Interferontests nicht zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Interferon- t- Es bestand daher ein erhebliches Bedürfnis nach einem einfachen, wirksamen Bestimmungsverfahren für Interferon-ε und der Ermittlung seines quantitativen Titers, das sich sowohl für Laborzwecke als auch etwa zur Qualitätskontrolle bei der Herstellung von Interferon-e für therapeutische Zwecke eignet.

Der Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß das Vorliegen von Interferon-e, aufgrund

seiner cytopathischen Wirksamkeit gegenüber Epithelzellen und insbesondere Keratinocytenzellen, die mit Proben mit einem mutmaßlichen Gehalt an Interferon- £ behandelt wurden, leicht qualitativ und quantitativ zu ermitteln ist. Interferon-e besitzt gegenüber menschlichen Epithelzellen antivirale Wirksamkeit, zeigt jedoch keine feststellbare Wirksamkeit gegenüber menschlichen Fibroblasten, und ist hinsichtlich seiner Antigenwirksamkeit von Interferon-«- , Interferon-ß und Interferon-0" verschieden. Demgemäß enthält eine Präparation, die gegenüber Zellen epithelialen Ursprungs antivirale Wirksamkeit aufweist, jedoch gegenüber Fibroblasten unwirksam ist, Interferon-ε Das erfindungsgemäße Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Interferon-e beruht auf diesen Feststellungen.

D ie erfindungsgemäße quantitative Bestimmung stellt ein auf einem Virusangriff Zellen beruhendes Testverfahren dar, das in analoger Weise wie im Stand
der Technik zur Bestimmung des Titers anderer

Interferone durchgeführt wird mit dem Unterschied,

und
daß Epithelzellen/vorzugsweise Keratinocyten und noch bevorzugter junge Keratinocyten anstelle
von Fibroblasten eingesetzt werden. Nach der erfindungsgemäßen Verfahrensweise werden Keratinocyten gezüchtet, worauf die erhaltene Kultur in
mehrere Subkulturen aufgeteilt wird, die jeweils mit einer Probe behandelt werden, die eine unbekannte Konzentration von Interferon-t , jedoch
keine kontaminierenden anderen Interferone enthält. Jede der aufeinanderfolgenden Zellsubkulturen wird

mit einem Anteil der Probe behandelt, die beispielsweise zweifach verdünnt wurde. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer von etwa 2 h bis etwa 2 d werden die behandelten Keratinocyten dem Angriff eines Virus ausgesetzt. Nach einer beispielhaften und erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform wird hierbei als Virus VSV (Vesicular Stomatitis Virus) verwendet.

Eine Einheit von Interferon-ε kann dabei erfindungsgemäß als diejenige Konzentration definiert werden, die zum Schutz von 50 S einer Population von Humankeratinocyten gegenüber dem Angriff eines Virus in einer Standardkonzentration führt. Die Anzahl Einheiten Interferon-t in einer gegebenen nichtkontaminierten Probe kann entsprechend leicht ermittelt werden.

Wenn Interferon-6 durch Stimulation von Epithelzellen mit einem Virus erzeugt wird, werden in zahlreichen Fällen zugleich auch Interferon-oc und Interferon-ß produziert. Diese beiden Interferone stören beim obigen Test. Wenn entsprechend Interferon- oc , Interferon-ß oder Interferon-^ vorliegen, sollten sie vor dem Test auf Interferon-ε entweder entfernt oder in ihrer Wirksamkeit neutralisiert werden.

Das qualitative erfindungsgemäße Verfahren wird so durchgeführt, daß zunächst kontaminierende Interferone in der Testprobe neutralisiert oder in anderer Weise entfernt werden. Wenn die Probe dann gegenüber Epithelzellen antivirale Wirksamkeit besitzt, jedoch gegenüber Kumanfibroblasten

keine feststellbare Wirksamkeit zeigt, enthält sie Interferon-L·

Die Testergebnisse müssen zur Erzielung verläßlicher Daten mit einem Standard verglichen werden. Eine Standardpräparation von Interferon-ε kann durch Stimulation von Epithelzellen, vorzugsweise Keratinocyten, mit einem Virus, beispielsweise nach dem Verfahren der DE-A1 33 25 131, Gewinnen des Überstands nach der Erzeugung und Sekretion der Interferone und anschließende Neutralisation der Präparation mit Antikörpern gegen Interferon- oc , Interferon-ß und Interferon-^¹ hergestellt werden. Die verbleibende Präparation enthält Interferon-£ . Diese Probe kann nach einer Verdünnungsreihe verdünnt und zu Mikrokulturen von Epithelzellen zugegeben werden, bis eine Verdünnung erreicht wird, bei der 50 % der Epithelzellen in der Kultur gegenüber dem Angriff eines gegebenen Virus, beispielsweise VSV, in einer Standardkonzentration, beispielsweise 1 PFU/Zelle, geschützt werden (PFU = plaque forming unit, Einheit der Viruskonzentration). Diese Verdünnung enthält dann entsprechend eine Einheit Interferon-£- Aktivität.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur qualitativen bzw quantitativen Bestimmung von Interferon-£ in Proben mit mußmaßlichem Gehalt an Interferon-6 anzugeben.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Bei der Stimulation von Zellen epithelialen Ursprungs, insbesondere Keratinocyten, nach herkömmlichen Verfahren wird ein neuer Interferontyp, das sog. Interferon-6 , gebildet. Bei der Bildung von Interferon-ε entstehen andererseits auch andere Interferone, weshalb es bisher mit außerordentlichen Schwierigkeiten verbunden war, Interferon-^ in Gegenwart dieser anderen Materialien qualitativ bzw quantitativ zu bestimmen.

Es wurde festgestellt, daß Interferon-£ , das nicht mit anderen, bekannten Interferonen kontaminiert ist, gegenüber Epithelzellen hohe antivirale Wirksamkeit aufweist, jedoch gegenüber anderen Typen von Zellen, wie sie üblicherweise in Interferontests verwendet werden, keinerlei nachweisbare Aktivität besitzt. Dementsprechend ist die Definition einer Einheit der Interferonaktivität, wie sie üblicherweise für die anderen Interferone angewandt wird, dh diejenige Konzentration, die 50 % der Zellen in einer Zellkultur menschlicher Fibroblasten vor einem Befall mit VSV-Virus (Vesicular Stomatitis Virus) in einer Standardkonzentration schützt, bei Interferon-ε sinnlos, da Interferon-ε in einer Konzentration, bei der eine signifikante antivirale Wirksamkeit gegenüber Epithelzellen vorliegt, keine nachweisbare antivirale Wirksamkeit bei Fibroblasten besitzt.

Diese ausgeprägte und zugleich selektive Wirksamkeit von Interferon-£ gegenüber Zellkulturen menschlicher Epithelzellen und insbesondere gegenüber Keratinocyten wird erfindungsgemäß als Grundlage zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Interferon-ε herangezogen. Eine Einheit Interferon-ε wird hierbei definiert als diejenige Konzentration, die 50 % der Zellen in einer Zellkultur menschlicher Keratinocyten vor einem Befall mit VSV-Virus in einer Konzentration von 1 pfu/Zelle schützt.

Wenn andererseits Interferon-ε in einer Präparation qualitativ und/oder quantitativ bestimmt werden soll, die mutmaßlich auch andere Interferone enthält, kann die Aktivität der anderen Interferone durch Neutralisation mit Antikörpern gegen Interferon-α, -ß und -γ- eliminiert werden, worauf die Präparation dann daraufhin getestet werden kann, ob sie menschliche Keratinocyten oder andere menschliche Zellen epithelialen Ursprungs vor einer Virusinfektion zu schützen vermag. Das Vorliegen von Interferon-ε wird dadurch bestätigt, daß eine Probe, die durch Abtrennung von Interferon- oc -_f Interferon-ß- und Interferon-Jf-Aktivitäten gereinigt wurde , antivirale Wirksamkeit gegenüber Epithelzellen, jedoch keine nachweisbare Aktivität gegenüber Fibroblasten ergibt.

Als Epithelzellen werden erfindungsgemäß bei den Tests vorzugsweise Keratinocyten verwendet, wobei besonders bevorzugt junge Keratinocyten eingesetzt werden, dh Kulturen, die gerade in einen zu-

sammenfließenden Zustand gekommen sind. Mit der Reifung der Zellen sammelt sich nämlich Keratin an, was offensichtlich den Test dadurch kompliziert, daß der Eintritt des Virus in die Zellen während des Tests behindert wird.

Erfindungsgemäß werden als Viren bevorzugt solche Viren eingesetzt, von denen bekannt ist, daß sie gegenüber Epithelzellen cytotoxisch sind. VSV eignet sich hierfür gut, jedoch können auch EMC-Virus (Encephalomyocarditis-Virus), Sendai-Virus und andere entsprechende Viren eingesetzt werden. Dabei ist bevorzugt, bei der Bestimmung der Standardkonzentration den gleichen Virus wie bei den Tests zu verwenden, bei denen mit dem Standard verglichen wird. Die Empfindlichkeit des Tests hängt allgemein vom jeweils ausgewählten speziellen Virus ab.

Der Test wird vorzugsweise so durchgeführt, daß zunächst die Aktivität gegebenenfalls als Verunreinigungen vorliegender Interferone abgetrennt wird, dann aus der Probe eine Verdünnungsreihe hergestellt wird, worauf dann die einzelnen Proben der Verdünnungsreihe mit Keratinocytenkulturen versetzt werden. Vorzugsweise wird ferner eine Verdünnung relativ hoher Konzentration oder eine nicht

der Testprobe verdünnte aliquote Probe/auch mit einer Fibroblastzellkultur versetzt. Die Kulturen können in herkömmlichen Mikrotitrierplatten, beispielsweise mit 96 Vertiefungen, enthalten sein. Nach der Inkubation werden die Kulturen dem Virusangriff ausgesetzt. Durch Zählen der Anzahl lebensfähiger

Zellen, die zu einem gegebenen Zeitpunkt in den entsprechenden Vertiefungen enthalten sind, beispielsweise dann, wenn die Kultur in einer Kontrollvertiefung, die nicht mit der Probe behandelt wurde, keine lebensfähigen Zellen enthält, kann der Interferon-C Titer bestimmt werden. Wenn die Vertiefung, welche Fibroblastzellen enthält, keine lebensfähigen Zellen enthält, jedoch mindestens einige der Keratinocyten geschützt wurden, wird dadurch das Vorliegen von Interferon-ε nachgewiesen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die Angaben sind jedoch lediglich beispielhaft. So kann der Test beispielsweise sowohl mit gereinigten als auch mit ungereinigten Proben durchgeführt werden. Wenn gereinigte Proben von Interferon-ε eingesetzt werden, kann die Verwendung von Glaskügelchen mit kontrollierter Porengröße (vgl die DE-A 1 33 25 131)
bei der Reinigung vorteilhaft sein.

Obgleich es ferner bevorzugt ist, Mikrotitrierplatten mit Vertiefungen zu verwenden und die visuelle Beobachtung der einzelnen Proben beim Test heranzuziehen, können im Rahmen der Erfindung selbstverständlich auch zahlreiche andere Vorrichtungen zur Zellkultivierung und andere Nachweisverfahren herangezogen werden. So ist beispielsweise die automatisierte Analyse in Verbindung mit der Herstellung von Interferon-£ in größerem Maßstab vorteilhaft. Darüber hinaus können ferner auch, obwohl junge Keratinocyten erfindungsgemäß beim Test auf Interferon-^ bevorzugte Zellen darstellen, andere Epithelzellen

vorteilhaft herangezogen werden. Daneben können auch andere Viren Verwendung finden, die zu einer Infektion menschlicher Epithelzellen in der Lage sind.

Beispiel 1

Eine Kultur von Epithelzellen epidermalen Ursprungs (Keratinocyten), (erhalten vom Labor Dr. Howard Green, Massachusetts Institute of Technology) wurde bis zu einer Zelldichte von

5 2
1 bis 2-10 Zellen/cm wachsengelassen und zur Erzeugung von Interferon-^ verwendet, wobei das Induktionsverfahren mit NDV (Newcastle Disease Virus) herangezogen wurde (vgl Baron und Issacs, British Medicals Journal f^ (1962) 18-20).

Als Virus wurde der Bankowski-Stamm von NDV herangezogen (erhalten vom Poultry Health Laboratories, Davis, Kalifornien, USA). Vier 1-ml-Proben MEM-Medium (minimum essential medium, Gibco) mit einem Gehalt von 2 Ϊ durch Erhitzen inaktiviertem Kälberfetalserum (HIFCS) und NDV in verschiedenen Viruskonzentrationen im Bereich von 0 bis 250 Viruseinheiten PFU/Zelle in den Testproben wurden hergestellt und inkubiert.

Die Zellkulturen wurden dann 24 h inkubiert. Das Medium wurde anschließend gewonnen, mit 0,1 N HCl auf pH 2 angesäuert und 5 bis 6 d bei 4 ⁰C gelagert, um das NDV zu inaktivieren. Die erhaltene rohe Interferon-Präparation wurde nach Neutralisation von Interferon- oc , Interferon-ß und Interferon-^* mit gegenüber diesen drei bekannten Interferontypen spezifischen Antikörpern auf ihre anti-

virale Wirksamkeit getestet. Die Neutralisationstitrationen jedes der Interferone (IFN) wurden
unter Verwendung von Anti-IFN-a (NIH), Anti-IFN-|i
(NIH und Y. H. Tan, Calgary University, Calgary,
Alberta, Canada), Anti-IFN-^ (S. Baron) sowie Gemischen dieser Antiseren durchgeführt. Die erhaltenen neutralisierten Präparate wurden dann an
Kulturen von Fibroblasten (Human-Fibroblasten FS-4)
und Epithelzellen (Humanzellen AR) getestet. Die
Ergebnisse zeigten, daß Interferon-ε gegenüber
Fibroblasten keine nachweisbare antivirale Wirksamkeit besaß, jedoch gegenüber Viren in Epithelzellen wirksam war.

In der nachstehenden Tabelle I sind die Ergebnisse von Neutralisationstests sowie von Tests
zur antiviralen Wirksamkeit zusammengefaßt.

Tabelle I

Antivirale Wirksamkeit von Interferon-Präparaten gegenüber Humanzellen (FS-4 und
AR-Zellen)

Probe Behandlung Interferontiter ^ (Einheiten/ml)

Anti -α Anti -8 Anti -γ FS-4-Zellen AR-Zellen

IFN-ε - 128 64

IFN-ε + 43 32

IFN-ε + - 24 32

IFN-ε + 192 32

IFN-ε + + <4 32

IFN-ε + + + <4 32

IFN-α - 64 4

IFN-S - 128 16

IFN-a/ß - 512 16

IFN-Y - 32 16

IFN-a/8/γ - 384 64

IFN-a/s/γ + - - 128 48

IFN-a/8/γ + 256 16

IFN-α/Β/γ + - 16

IFN-α/Β/γ + + - <4 <4

IFN-α/Β/γ + + + <4 <4

0 1 h Inkubation der Proben mit überschüssigem Anti· serum wie angegeben bei 37 ⁰C vor dem Test auf Interferon-Aktivität

Bestimmung des Interferontiters durch Test mit einem cytopathischen Virus.

Aus den Daten von Tabelle I geht hervor, daß Interferon-oo und Interferon-ß zusammen mit Interferon-ε gebildet wurden. Ferner ist festzustellen, daß die Neutralisation mit Interferon-c^-Antikörpern allein oder Interferon-ß-Antikörpernallein die Anzahl Einheiten der Interferon-Aktivität sowohl bei den Fibroblastkulturen als auch den Keratinocytenkulturen verringerte. Die Neutralisation mit beiden Antikörpern sowie mit einem Gemisch von Interferon-Of- Inteferon-ß- und Interferon-jjT-Antikörpern zerstörte die gesamte antivirale Wirksamkeit der Präparate gegenüber Fibroblasten, während eine Aktivität von 32 Einheiten/ml bei den Keratinocyten verblieb. Dies erweist das Vorliegen von Interferon-^ und bestätigt, daß Interferon-^ gegenüber Kulturen von Epithelzellen selektive Wirksamkeit besitzt. Die entsprechende rohe Präparation enthielt demzufolge 32 Einheiten Interferon-ε.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurden der Einfluß des Alters einer Kultur von Keratinocyten sowie der Infektionsstärke ( Viruskonzentration/Zellel des induzierenden Virus auf die Produktion von In terf eron- £· untersucht. Der Titer an Interferon-ε wurde wie oben

angegeben ermittelt. DLe erhaltenen Ergebnisse sind
in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Einfluß des Kulturalters sowie der Viruskonzentra tion _auf die Produktion von Interferon-ε

Viruskonzen-

I"terferontlter ^V (Einheiten/1O⁶-Zellen)

^trationHd21d

27 d

Q ^ ^ ^J

0.1 10 <3 <4

1 53 2 8

2 79 6 16 5 210 6 16

10 157 6 16

20 210 18 32

50 210 9 32

70 - 12 32

90 - 9 32

79

79 -

Inkubation der Interferonproben mit überschüssigen
Antiseren gegen Interferon-« und Interferon-ß vor
dem Test auf die Aktivität gegenüber Keratinocyten.

Aus den Ergebnissen der Tabelle II geht hervor,
daß, zumindest bei Epithelzellen vom Keratinocyttyp, jüngere Zellen, dh nahezu zusammenfließende,
14 Tage alte Zellen, mehr Interferon-ε produzieren
als ältere Zellen.

Beispiel 3

Entsprechend Beispiel 1 auf der Basis von Epithel-

zellen erzeugte Interferonpräparate wurden partiell gereinigt.

Die Proben wurden nach dem Verfahren von Lamelli durch SDS-Gelelektrophorese auf ihre Molekülmasse getestet. Die Proben wurden hierzu 1 h bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,0 I SDS, 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), 10 Volum-! Glycerin und 0,001 % Bromphenolblau inkubiert, dann auf 12,5 %-xge Polyacrylamidgele aufgebracht und 16 h laufengelassen. Nach der Elektrophorese wurden die Spuren, welche die Molmassenstandards enthielten, gefärbt. Interferon enthaltende Spuren wurden in 3-ml-Scheiben zerschnitten und durch Ausschütteln mit 0,5 ml PBS mit einem Gehalt von 0,5 S SDS während 20 h bei Raumtemperatur extrahiert. Diese Fraktionen wurden dann nach herkömmlichen Virusbefallstests unter Verwendung von Fibroblasten sowie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Neutralisation mit Interferon-<X-, Interferon-ß- und Interferon-^- Antikörpern getestet. Die Molekülmasse des mit Interferone zusammenhängenden Peaks mit der Hauptwirksamkeit wurde durch Vergleich seiner Lage auf dem Gel mit Molekülmassenstandards berechnet.

In der Zeichnung sind die Ergebnisse der Gelelektrophorese des aus Epithelzellen erfindungsgemäß erhaltenen Interferons dargestellt, wobei die Abhängigkeit des Titers an Interferon-ε von der Fraktionszahl für Keratinocyten (AR-Epithelzellen) dargestellt ist. Das der epithelialen Wirksamkeit entsprechende Protein besitzt eine apparente Molekülmasse von etwa

20.000. Seine Wirksamkeit wird durch Behandlung mit ß-Mercaptoethanol drastisch verringert.

In einem unabhängigen weiteren Versuch wurde festgestellt, daß Interferon-ε gegenüber Murin bzw Zellkulturen von Rinder-Fibroblasten keine antivirale Wirksamkeit besaß.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur qualitativen bzw quantitativen Bestimmung von Interferon-ε in einer Probe,

gekennzeichnet durch

(A) Inkubation von Epithelzellen mit der Probe,

(B) Zusammenbringen der inkubierten Zellen mit einem zur Infektion der Zellen befähigten Virus und

(C) Vergleich der Lebensfähigkeit der dem Virusangriff ausgesetzten Zellen mit einem
Standard.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Verwendung von Keratinocyten als Epithelzellen in Schritt (A).

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine Inkubationsdauer in Schritt (A) von etwa 2 h bis etwa 2 d.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Verwendung von VSV als Virus in Schritt (B).

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (C) als Standard-Einheit von Interferon-ε in der Probe diejenige Menge an Interferon-ε definiert wird, die zu einem Infektionsschutz bei 50 I der dem Virusangriff bei einer Standard-Viruskonzentration ausgesetzten Zellen führt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch zusätzliche

Inkubation der Probe mit Fibroblasten in Schritt (A), Zusammenbringen der inkubierten Fibroblasten mit einem zur Infektion der Fibroblasten befähigten Virus und Ermittlung der Lebensfähigkeit der Fibroblasten, wobei das Absterben der Fibroblasten in Gegenwart der Probe bei gleichzeitigem Schutz der Epithelzellen das Vorliegen von Interferon-£ anzeigt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Bestimmung von Interferon-e in mit anderen Interferonen verunreinigten Proben, gekennzeichnet durch Neutralisation der Probe vor Schritt (A) durch Zusammenbringen mit einem Überschuß artspezifischer Antikörper gegen mindestens eines der anderen Interferone.

8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch Verwendung von Antikörpern gegen Interferon-oe _y Antikörpern gegen Interferon-ß und/oder Antikörpern gegen Interferon-γ .

9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch Ver wendung eines Antiserums aus einem Gemisch von Interferon- &■ - und Interferon-ß-Antiseren.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Herstellung einer Verdünnungsreihe der Probe, Inkubation getrennter Kulturen von Epithelzellen mit den einzelnen verdünnten Proben der Verdünnungsreihe und Zusammenbringen der Kulturen mit dem Virus.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch Verwendung von jungen Keratinocyten als Epithelzellen in Schritt (A).