DE3019621C2

DE3019621C2 - Verfahren zur Herstellung von Interferon II.

Info

Publication number: DE3019621C2
Application number: DE3019621A
Authority: DE
Inventors: Holger Prof. Dr. Kirchner; Peter Dr. Krammer; Fabrizio Dr. 6900 Heidelberg Marcucci
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1980-05-22
Filing date: 1980-05-22
Publication date: 1982-08-19
Also published as: DE3019621A1; JPS5758891A; ZA813268B

Description

naheliegend, sondern eine wesentliche Neuerung.

Es ist srfindungsgemäß gelungen, durch Stimulation solcher Klone mit verschiedenen T-Zellmitogenen die herauszuselektionieren, die hohe Titer von Typ II Interferon produzieren. Dabei ist einmal von Bedeutung, daß Monierte Zellen in der Lage sind, Interferon Typ II zu sezernieren, zum anderen übertrifft die Menge des sezernierten Typ II Interferons die Quantität, die aus einer normalen Lymphozytenpopulation bereitgestellt wird, um ein Vielfaches. Dieses neue Verfahren erlaubt unabhängig von Speziesschranken a) die Definition von Typ II Interferon produzierenden Zellen und b) die Anreicherung von großen Mengen von Zellen, die Typ II Interferon produzieren als Basis für die biochemische Reindarstellung für einen weiteren experimentellen und therapeutischen Einsatz.

Dieses Verfahren gestattet es, hohe Mengen an Interferon vom Typ II herzustellen; zusätzlich kann die Konzentration an Typ II Interferon in den gewonnenen Lösung auf mehr als das lOfache gegenüber Massenkulturen von gemischten Zellen erhöht werden, was nicht nur für die gewonnene absolute Menge, sondern auch eine Reindarstellung oder Gewinnung von konzentrierten Präparaten von Bedeutung ist.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel 1

AKR/] Mäuse wurden, wie beschrieben, Krammer et al., J. Exp. Med. 151: 1166, 1980, mit 2χ10μ1 30% Trinitrochlorbenzol in Aceton auf der Abdominalhaut sensibilisiert. 5 Tage nach der Sensibiliserung wurden die Lymphozyten der drainierenden axillaren und inguinalen Lymphknoten in Kultur gebracht (5xl0^b Zellen/ml; 4 ml Kulturen; l'alconflaschen No. 3013, aufrecht) und für 4 bis 5 Tage in einem 95%-Luft-5%-COrGemisch inkubiert. Dabei kommt es ohne Antigenrestimulierung /u einer T-Zellproliferation mit maximaler Aktivität am Tag 4 bis 5.

Die überlebenden Zellen wurden dann wie beschrieben (P. H. Krammer, J. Exp. Med. 147: 25, 1978) durch eine Ficolldichtezentrifugation (Ficoll-I Iypaque 1077 g/ cm') gereinigt und kloniert. Bei der Klonierung wurde im statistischen Mittel wie beschrieben (Eichmann et al., gutachtlich, J. Exp. Med. 152: 477, 1980) eine Zelle/Loch von 96 Loch-Platten (Falcon No. 3040) auf einem Rasen von 5xlO⁴ Fütterzellen (Peritonealexudatzellen der AKR/) Maus) ausgesät. Die Klonierung erfolgte in Gegenwart von 10% T-Zellwachstumsfaktor-haltigem Vollmedium.

Der Wachstumsfaktorhaltige Überstand wurde gewonnen von Rattenmilzlymphozyten, stimuliert in Gewebekultur für 24 Stunden mit Concanavalin A C>x 10^b/ml; 50 ml; 5 μg Con A/ml; Falconflaschen No. 3024 F, liegend) (Eichmann et al., gutachtlich, [. Exp. Med. 152:477,1980).

Die Zellen in den 96-Loch-Platten wurden 2mal/ Woche mit frischem Medium gefüttert. Nach ca. 3 Wochen zeigten sich makroskopisch sichtbare T-ZeII-klone, die in großen Flaschen (Falcon No. 3024 F) in demselben Medium weitergezüchtet wurden.

Jeweils 6 χ 10⁵ Zellen in 0,2 ml Medium der einzelnen Klone werden dann nach Waschen in die Löcher einer 96-Loch-Platte gebracht und mit verschiedenen Konzentrationen von Concanavalin A stimuliert. 24 Stunden später werden die zellfreien Überstände dieser Kulturen geerntet und in üblicher Weise auf Interferonaktivität getestet (Maus !Zellen, Vesikular Stomatitis Virus,Test der Hemmung der Virusneubildung). Es ist so gelungen, Klone von T Lymphozyten zu finden, die bis ?u 10 000 ΙΕ/ml von Interferon produzieren. Nach akzeptierten physiokochemischen Kriterien handelte es sich hierbei um Typ II Interferon.

ίο Nach dieser Arbeitsweise ist es möglich, aus diesen Klonen Typ II Interferon in großer Menge zu erzeugen.

Beispiel 2 (nachgereicht)

Dieses Beispiel ist ein Anwendungsbeispiel beim Menschen.

Aus dem periphercn Blut wurden Lymphozyten durch eine Ficolldichtezentrifrgation getrennt. Die somit gewonnenen Zellen wurden mit Phylhämagglutinin (PHA, 1%) aktiviert, nach 2 Tagen Kultur über Ficoll gereinigt und dann kloniert, indem im statistischen Mittel 1 bis 50 Zellen/Loch von 96-Loch-Platten (Falcon Nr. 3040) auf einem Rasen von 2xlO⁴ bestrahlten Fütterzellen (Mausperitonealexudalzellen) und menschlichen periphercfi Blutzellen (3x10⁴) ausgesät wurde.

Die Klonierung srfolgte in Gegenwart von 20% T-Zellwachslumsfaktor und 1% PHA-haltigem Vollmedium. Der Wachstumsfaktor-hallige Überstand wunie gewonnen von menschlichen Lymphozyten stimuliert in GewebeKullur für 24 Stunden mit Phytohemagglutinin (5xlG^b/ml, 50 ml; 1% PHA/ml; Falconflaschen Nr. 3024 F. liegend). Die Zellen in den 96-Loch-Plattcn wurden 1 mal/Woche mit frischem Medium und Fütterzellen gefüttert. Nach ca. 3 Wochen zeigten sich makroskopisch sichibare T-Zellklone.

j5 Zellen der einzelnen Klone in 0,2 ml wachstumsfaktor-freiem Medium wurden dann mit 20μg/m! PHA stimuliert. Dieser Schritt kann auch in serumfreiem Medium durchgeführt werden. 24 Stunden später wurden die /ellfreien Überstände dieser Kulturen geerntet und in üblicher Weise auf Interferonaktivität getestet. Die Kulturen mit hohem Inierferontiter wurden dünn in Wachstumsfaktor- und PHA-haltigem Vollniedium unter Anwesenheit von bestrahlten menschlichen Fütterzcllen /u Makrokulluren hochgczüchtet.

Es ergaben sich Interferontitcr von mehreren hunderi IC/ml.

Die große Menge an Typ Il Interferon produzierenden Zellen gestattet es aber auch, die Interferon liefernden Gene bzw. das zur Interferonproduklion benutzte genetische Material der selektionierten Klone in an sich bekannter Weise in Bakterien oder Tumorzellen (in Gewebekultur) zur Gewinnung von Interferon zu benutzen, was ein zusätzliches Verfahren zur großtechnischen Produktion von Typ II Interferon ermöglicht. Nachdem die Isolierung von Genen und der Einbau in Bakterien bzw. Tumorzellen bzw. die Verwendung von genetischem Material zur entsprechenden Veränderung von Bakterien oder Zellen als solche bekannt sind (erstere Arbeitsweise ist schon für Typ I Interferon erfolgreich versucht worden) bedarf diese spezielle Ausführungsform keinerlei weiteren Erläuterung.

Claims

Patentansprüche:

I.Verfahren zur Herstellung von Typ II Interferon aus T-Lymphozyten durch Sensibilisierung und Selektionierung von Klonen aus heterogenen T-Lymphozyten Populationen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Zeliklone einer mitogenen Stimulation unterworfen werden und nach Weiterzüchtung der stimulierten Klone Typ II Interferon geerntet wird.
2. Typ II Interferon produzierende Zeliklone zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1. die aus T-Lymphozyten durch Sensibilisierung und Selektionierung von Kolinien aus heterogenen T-Lymphozyten Populationen erhalten worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß diese Zeliklone danach einer mitogenen Stimulation unterworfen worden sind.

Die Erfindung betrifft sowohl das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren wie auch das mit dem Palentanspruch 2 definierte Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1.

Interferon wird von körpereigenen Zellen produziert und hat in der letzten Zeit erhöhte Aufmerksamkeit gewonnen, da es die Neusynthese von Viren hemmt. Es wird auch diskutiert, ob Interferon nicht nur bei Virus-, sondern auch bei Tumorerkrankungen eine therapeutische Wirkung erzielt, und es gibt Gründe, dies zu bejahen.

Anhand biologischer und biochemischer Parameter unterscheidet man zwei Typen von Interferon, Typ I und Typ II. Typ I w'rd in Zellen unter anderem nach Virusinfektionen produziert, z. B. aus Leukozyten und Fibroblasten sowie Lymphoblasten (Kirchner et al., Pharmacie in unserer Zeit, 8,113.1979).

Es gibt Grund /ur Annahme, daß Typ II Interferon aus Imniunozyten erhältlich ist (Kirchner et al., Immunobiology 156, 65, 1979 und Kirchner et al, Eur. J. Immunol. 10:224,1980).

In Tiermodellen gibt es Hinweise dafür, daß Typ II Interferon gegen Tumoren erheblich wirksamer ist als Typ I Interferon.

Obwohl die erste Arbeit über Interferon 1957 veröffentlicht wurde, ist die Herstellung immer noch ein Problem: Eine wesentliche Voraussetzung für den experimenliellen und klinischen Einsatz von Interferon jedoch ist seine Reindarstellung, basierend auf der Produktion in ausreichender Quantität. Dafür gab es bisher für Typ 11 Interferon keine zufriedenstellende Möglichkeit.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu finden, das die Basis für eine industrielle Großproduktion von Typ II Interferon darstellen kann.

Wichtig bei diesem Verfahren ist, daß es sich im Gegensatz zu verschiedenen bei Typ I angewandten Verfahren bei den Interferon produzierenden Zellen um normale Zellen und nicht um Tumorzellen handelt.

Die Lösung der gestellten Aufgabe besteht in den Maßnahmen des Anspruchs 1.

Es ist überraschend, daß man auf diese Art einen Erfolg erzielt, da man annahm, daß diese Zeliklone nicht mehr stimulierbar wären.

Zweckmäßig werden aus den Einzelklonen homogene Massenkulturen gezüchtet und diese T-Zellklone einer mitogenen Stimulation unterworfen, erfolgt die mitogene Stimulation der T-Zellklone mit verschiedenen T-Zellmitogenen oder verschiedenen Konzentrationen des mitogenen Stimulationsmiuels, werden die nach der Stimulation erhaltenen Zeilklone separat weitergezüchtet oder wiH das zur Interferon-Produktion benötigte genetische Material der selektionierten Klone in an sich bekannter Weise in Bakterien oder Tumorzellen zur Gewinnung von Interfer - benutzt.

T-Lymphozyten (Thymus abh. Lympi.ozyten) aus

lymphoiden Organen (Lymphknoten oder Milz) oder dem Blut werden in Gewebekulcir sensibilisiert. Diese Sensibilisierung kann z. B. durch Antigene oder T-Zellmitogene, wie Concanavalin A oder Phytohämagglutinin erfolgen. Als günstig hat sich vor allem Concanavalin A in der Konzentration von 5 μg/m! bei einer Aussaal von 5 χ 10^b Lymphknolenzellen/ml (4 ml Kulturen) erwiesen.

Die sensibilisierten T-Lymphnzyten werden nach einer zwei bis drei Tage dauernden Kultur gereinigt und mit Wachstumsfaktoren versetzt. Diese Wachstumsfaktoren werden aus dem Kulturüberstand von /um Beispiel mit 5 ng Concanavalin A/ml sensibilisierten Rattenmilzlymphozyten (5x10" Zellen/ml, 50 ml Kulturen) gewonnen. Dieses Verfahren führt dazu, daß einige T-Lymphozyten als normale Zellen kontinuierlich zu wachsen beginnen. Das kontinuierliche Wachstum der T-Lyniphozyten ist abhängig von der Präsenz und der Menge der Wachstumsfaktoren in der Kultur. Solche T-Lymphozytenzellinien werden dann in Mikrotiterplatten unter Zugabe von bestrahlten Fi; icr/ellen (z. B. so Peritonealexudatzellen der Maus) kloniert. Aus den Einzelklonen werden homogene Massenkulturen als Nachkommen von Einzelzellen erhalten, die in größeren Flaschen weiterkultiviert werden können und kontinuierlich wachsen. Diese Klone repräsentieren ein Spektrum von funktionell heterogenen normalen T-Lymphozyten in permanenter Gewebekultur.

Bisher wurden solche T-Zellklone entweder funktionell inaktiv gefunden, oder sie behielten die primär induzierte spezifische Aktivität, die z. B. durch Antigenstimulation induziert worden war, bei. Es war nicht bekannt, daß die T-Zellklone durch mitogene Stimulation zur Expression von funktionellen Aktivitäten gebracht werden konnten. Insbesondere sind Versuche negativ verlaufen, die zum Ziel hatten, in diesen T-Zellklonen durch Inkubation mit Mitogenen ein verstärkt proliferatives Wachstum zu erzeugen. Deswegen ist die Idee, durch Mitogenstimulation der T-Zellklone Interferon Typ Il zu produzieren, nicht