JPS5874616A - 免疫活性物質とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、哺乳動物７９７７球由来細胞から免疫活性物
質を製造する方法に係り、特に従来１Ｔ細胞成長因子”
として知られている、インターロイキン２（工ｎｔｅｒ
ｌｅｕｋｉｎ　−２、以下、ＩＩ、−２と略記する）、
コロニー刺激因子（０ｏｌｏ−ｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　、以下、０ＥＩＩＦと略記する
）及びＴリンパ球代替因子（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｐｌａ
−ｅｉｌｌｇ　ｆａｏｔｏｒ　、以下、ＴＲＩＰと略記
する）等７９７７球の産生ずるリンホカインの製造方法
に関する・より詳細には、無血清培地中でリンホカイン
自発産生株、又はＴ細胞マイトジェン刺激によりリンホ
カインを産生する細胞株、あるいはリンホカイン産生能
を有するＴハイプリドーマを培養し、培養上清からリン
ホカインを回収することよりなるリンホカインの製造方
法に関するＯ 哺乳動物１９７７球由来の細胞にはインターフェロン、
リンホカインなどの有用物質を産生ずることが知られて
おシ、その細胞を樹立株化した）融合株となシ、それら
の細胞を培養することによって上記の有用物質を取得す
ることが検討されつつある〇 リンパ球系細胞の無血清培地による培養としては、例え
ば、ヒト白血球やヒトリンパ芽球様細胞からウィルスに
よってインターフェロンを誘導する場合とか、ヒト又は
！ウス９フフ球をレクチンやリポポリサッカライドによ
って芽球化する場合などが知られている。しかしながら
、これらは主としてＢりンパ球細胞に関するものがほと
んどであり、またこれらにおける培養時間はいずれも短
期間であって細胞増殖管はとんど伴わないものであるｏ
しかも１９７７球由来細胞の利用については、従来検討
されていない０そして、従来動物細胞を培養して増殖さ
せる九めＫは培地に血清を添加することが必須であると
されていた。血清としては一般に牛胎児血清とか仔牛血
清などが使用されており、添加量は通例１０嘔程９度で
ある０ところが、培地に大量の血清を使用する結果、細
胞を大量に培養する場合に培地に要する費用の大半を血
清が占め、その結果、例えば、ヒト細胞全培養してイン
ターフェロンを生産する場合とか、ワクチン用のウィル
スを生産する場合に製品゛が高価なものになってしまう
という問題点があった。その上、血清にはマイコプラズ
マとかウィルスによる汚染があったり、原因のわからな
いロフト差があるので、使用する血清を事前に検定しな
ければならないという繁雑さがあり、また、血清が蛋白
質など多種多様な成分を含んでいるために、培養物から
インターフェロンなどの生成物を分離する場合に分離精
製が容易でないことも問題であった。

更にリンホカイン類を生産する場合、産生能を有する’
ｌ’　ＩＪンパ球由来細胞をまず増殖させて後、培養液
を置換して新鮮培地を添加後、レクチン等の刺激剤の存
在下に再度培養を実施するという２段階の煩雑な方法が
必要であり、該方法を実用に供することには難点がある
。また、血清含有培地で細胞を増殖させると、レクチン
によるリンホカイン産生誘導に阻害効果を与える血清起
源の物質が頻頻と培地中に生成し、リンホカイン産生量
が著しく低下するという難点を伴う。このこともまた、
リンホカイン生産には培地交換を伴う２段階の工程を不
可欠にするものであり、実用的に欠点がある。

本発明者等は、前述のようなリンホカインを産生する哺
乳動物Ｔ　１７７７球由来細胞用の培地として、無血清
の培地であって細胞増殖及び継代培養が可能なものを開
発すべく鋭意検討の結果、特定の栄養培地に、血清は添
加せずに、哺乳動物血清アルブミンを添加若しくは添加
せずとも、哺乳動物Ｔ　１７７７球由来の細胞を培養し
て増殖させ、継代培養し、効率的にリンホカイすなわち
本発明は、無血清培地中で、哺乳動物’ｌ”　＋７ンパ
球由来細胞を培養し、培養上清よりリンホカインを回収
することによるリンホカインの製造方法、に関するもの
である。

本発明で使用する培地にらいて説明する。本発明で用い
る培地は、血清から分離されたｉ乳動物血清アルブミン
を含有していてもよい。

哺乳動物血清アルブミンは、例えば、ヒト血清アルブミ
ン、牛胎児血清アルブミン、仔牛血清アルブミン、馬血
清アルブミンのごときものである。これらの分離方法と
しては、エタノール分画法、硫安分画法、ゲルｒ過法等
の血清アルブミンを分離する公知の方法によって行えば
よい。結晶アルブミンやコーン（０ｏｈｎ　）　　のフ
ラクションＶなどの市販品をそのまま用いることができ
る０添加量としては、０．１〜１重量％程度が適当であ
る０ 本発明で用いる培地は、上記の啼、乳動物血清アルブミ
ンを添加しなくてもよいＯすなわち、上記血清アルブミ
ンを添加しなくても、本発明の場合、リンホカイン産生
細胞は充分増殖し、且つ刺激剤の存在又は不在下に、リ
ンホカインを充分量産生する培地であることが判明し一
７’Ｃ。

目的物であるリンホカインの分子量が哺乳動物血清アル
ブミンの分子量に近似し、引続く次の単離、精製工程が
煩雑になる場合には、上記アルブミンを添加しないこと
が望ましい０また、上記アルブミンを含まない培地を用
いる長所としては、多量の蛋白を処理するのに必要な大
きな装置が不要となると共に、用いる血清アルブミンの
多数のロットヲ使用前に検定する必要もなくなる。

本発明者等は、上記血清アルブミン添加により細胞培養
における増殖に与える正の作用、すなわち長所が、リノ
ール酸、オレイン酸の添加で代替しうろことを知り、哺
乳動物血清アルブミンを含まない培地に、これら不飽和
脂肪ＷＩを０．１〜５　ｍｙ／　ｌの濃度に“添加し、
その毒性解消のためにサイクロデキストリンを１５〜２
　ｔ／１の濃度に添加するか、あるいは不飽和脂肪醗由
来のリン脂質である、ホスファチジルコリンジｍ≠ボリ
ノＶオイル、ホスファチジルエタノールアミンジオレオ
イル、ホスファチジルコリンジオレオイル等’１１１５
〜５μｆ／−の濃度で添加すれば、前述のリンホカイン
産生細胞社、血清５〜１０チ添加の培地、又は哺乳動物
血清アルブミン添加の培地と同等の増殖を示し、且つ刺
激剤の存在又は不在下に、同程度のりンホカインが産生
ずることを見出したＯ ｉも培地成分としては、インシーリンとかヒトトランス
フェリンのごとき細胞増殖因子があり、ヒポキサンチン
、チミジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジンの
ごとき核酸前駆体を含むことが重要である。更に、グル
コースのごとき糖源、アミノ酸、ビタミン類、無機塩及
び通常の細胞増殖用の培地に含まれるその他の栄養源を
含む。

細胞増殖因子及び核酸前駆体の濃度としてはいずれも１
〜５０ｍＶ／　を程度が適当である。細胞増殖因子及び
核酸前駆体はいずれも培養する細胞の種類に応じて１種
又は２種以上を適宜組合せて用いる。

本発明で用いる培地においては上記の血清アルブミン、
細胞増殖因子及び核酸前駆体のほか、通常の細胞増殖用
培地に含まれる栄養源、すなわち、糖源、アミノ酸、ビ
タミン類、及び無機塩を含むことが必要である０ 糖源としては通常グルコースが用いられ、濃度としては
０．５〜１０　ｆ／を程度がよい。そのほか、ピルビン
殿などを適宜加える。アミノ酸は蛋白質構成成分アミノ
酸であって、例えば、アラニン、アルギニン、クルクミ
ン、シスチン、スレオニン、リジン、バリン、フェニル
アラニンのごときものである。通常の培地においては、
必須アミノ酸を中心として添加しているが本発明で用い
る培地においては必須ア°ミノ酸のみでなく非必須アミ
ノ酸も幅広く添加するのがよい。

全アミノ酸の濃度としては０．５〜ｓ　ｔ７ｔ　程度が
よい。アミノ酸の組成としては、通常の細胞増殖培地を
参考にしてこれに新たなアミノ酸を補充していくのがよ
い。ビタミン類にはアスコルビン酸、リボフラビン、チ
アミン塩酸塩、パントテン醗カルシウム、ニコチン酸ア
ミド、ピリドキサール塩酸塩、１−イノシトール、葉酸
、ＶＢｌ、、ビオチン゛など、そして無機塩としては塩
化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マ
グネシウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸亜鉛、亜セレン酸ナトリウムなどを例として挙げるこ
とができる０これらビタミン類と無機塩は通常の細胞増
殖用培地を参考にしてこれに適宜添加していくのがよい
。その他、重酒石酸コリン、グルタチオン、プトレシン
ニ塩酸塩などの代謝中間体や、重曹、β−グリセロリン
酸二ナトリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−１１１−２−エタンスルホン酸などのバッファーを適
宜添加する。

本発明で用いる培地の組成は前述のごとく、通常の細胞
増殖用培地を基礎培地として、これに血清アルブミン、
細胞増殖因子、核酸前駆体、更に必要によって糖源、ア
ミノ酸、ビタミン類、無機塩、その他を適宜補充してい
って決定するのがよい。

培地組成の決定に参考とすべき基礎培地の例としては、
ダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕｌ−ｂｅｃｃｏ５　
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　、以下
、ＤＭＥＭと略記する］が好適であるが、他にローズフ
ェル　パーク　メモリアル　インステイテユート１６４
０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａ’
ｌ　Ｉｎ５ｔｉ−ｔｕｔｅ１６４０、以下、ＲＰＭ工　
１６４０と略記するン、イーグル基礎培地（Ｅａｇｌｅ
’ｓ　ＭｉｎｔｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕ
ｍ　、以下、イーグルＭＥＭと略記する）、クリック（
Ｃ１１ｃｋ　）培地及びハム（Ｈａｍ）Ｆ−１２培地な
ど既知の細胞増殖用培地を挙げることができる。

例えば、ＤＭＦｉＭ　　又はイーグルＭＫＭに糖類、酸
、塩などを加えて、以下Ｒ工ＴＣと略記する培地を作っ
て使用した。

培地の作成方法としては、例えば血清アルブミンを除く
すべての成分を所定の濃度になるように水に溶解してか
ら、そこに血清アルブミンを添加溶解し、又は添加せず
“に、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨｆ　７．２
〜７．４に調整し、得られた溶液をメンブランフィルタ
−で加圧下にｒ過滅菌すればよい。

本発明で用いる培地で培養し、本発明の目的物であるリ
ンホカインを製造するのに用いる哺乳動物１９７７球由
来細胞としては、リンホカイン産生能力を有する’ｉ’
　ＩＪンパ腫細胞又はＴ白血病由来細胞、その株化細胞
、そのクローン化細胞やＢＷ５１４７のごときマウスＴ
細胞由来腫瘍細胞を用いた１９７７球由来のハイブリド
ーマなどを含む。

Ｔ白血病細胞の例には、ジュルカット（Ｊｕｒ−ｋａｔ
　）ヒ）Ｔ白血病細胞又はそのクローンがある。その例
には、ジュルカットーＦＨＣ！ＲＣ細胞株がある。ジュ
ルカツ）　−ＦＨＯＲＣ細胞株は下記の諸機関よフ容易
に入手し得る。

■　ンーク研究所細胞銀行（Ｂａ１に工ｎ８ｔｉｔｕｔ
ｅＣ！ｅｌｌ　Ｂａｎｋ　）　（カリフォルニア州、ラ
ジコン）；■　ピュゲ・サウンド血液銀行（Ｐｕｇｅｔ
　５ｏｕｎａＢ’１ｏｏｄ　Ｂａｎｋ　）　　（ワシン
トン州、シアトル）；■　ウニインステート大学（Ｗａ
ｙｎｅ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅ−ｒｓｉｔｙ　）　（
ミシガン州、デトロイト）；及び■　ダートマス大学（
ＤａｒｔｍＯｕｔｈ　ＣｏＣｏ１１ｅ　）にューハンフ
シャー州、ハ／　−バー　）。

本発明において、培地を用いてリンホカインを産生する
能力を有する上述の細胞を培養（増殖）させる方法は一
般に血清を添加した培地を用いて培養する場合と同様に
行えばよいが、例えば培養タンクに本発明に用いる培地
を入れて細胞を（Ｌ１〜１０Ｘ１０’　　細胞／−程度
加え、ＣＯ，を含む空気を通気しつつ、又は通気せず１
５５−５７℃で培養すればよい。培養後、増殖した細胞
の分離は常法によって行えばよいＯ本発明で用いる培地
は細胞増殖用のみならず細胞を培養して刺激剤の存在又
は不在下に目的のリンホカインを産生ずる場合にも適用
すると非常に有用である０１つには無血清のため目的の
リンホカインの単離、精製が容易であり、２つには本培
地中では他の公知の無血清培地と異なり細胞の増殖が血
清１０９６添加と同レベル又はそれ以上の細胞密度に達
し、細胞増殖とリンホカイン産生が連続的に同一のタン
クで実施できる。更には、本発明の実施例に基づけば、
細胞増殖培養液中にリンホカイン産生を阻害する生成物
が産生ぜず（血清添加培地の場合には産生する”）、り
ンホカイン産生細胞の増殖後、リンホカイン産生管実施
するにあたり培地を交換しなくても高活性のリンホカイ
ンが効率的に生産できるという実用的に非常に重要な長
所も併せ持つものである。

本発明で用いる培地による培養では、血清を大量に添加
した従来の培地による培養にほぼ匹敵する細胞増殖を得
ることができ、従来の血清培地と同様にリンホカイン産
生能を有するリンパ球由来細胞を長期間にわたって継代
培養することができるので、従来培地と比べ、極めて安
価に増殖細胞及びその産生ずる目的物であるリンホカイ
ンを取得することができる。特にヒト血清アルブミンを
用いた培地にて、リンホカイン産生ヒトリンパ球細胞を
培養した場合には、培養液中の蛋白成分がすべてヒト由
来であるところから培養液中に産生じた目的のリンホカ
インを完全に精製しなくともヒトに投与可能で本リンホ
カインを医薬用に適用しうるという利点を有する。

本発明によって実用的生産の可能となった有用物質は前
述のように哺乳動物Ｔリンパ球由来細胞（ハイプリドー
マを含む）の産生ずるリンホカイン類を含有する。

これらリンホカイン類はリンパ球の反応性や免疫担当細
胞間の相互作用を調節する生体内微量免疫活性物質であ
り過去においてその存在は知られていたが、大量生産の
困難性の故にその実用性はなかった０ 本発明方法の目的物であるリンホカインとしては、免疫
インターフェロン、（！８Ｆ’　、　ＴＳＦ　。

ＩＬ−２、マクロファージ活性化因子など、Ｔリンパ球
が産生ずることの知られて込る免疫活性を有する物質を
例示することができる。これらのリンホカインは、その
免疫活性、生物活性に基づき、免疫学的に欠陥又は異常
のある疾患に対して、あまねく有用であり、細組性免疫
及び体液性免疫の人工的制御により生体を疾患や機能異
常よシ修復させるのに非常に有効である０更には、リン
フ才力インの産生及び応答が異常であることに基づく免
疫系疾患の臨床上の診断に有用である免疫学的機能の重
要な診断方法を提供する。それと共に、生物学、医学研
究全般の研究試薬としても有用である０ 従来、これらリンホカインを上記目的に供しうる程度の
純度と量で確保する方法は見出されていない。ヒトやマ
ウスの肺臓りンパ球や末梢血のリンパ球をレクチン等の
刺激剤で活性化してリンホカインを生成させる従来の方
法では低濃度のリンホカインしか得られず、且つリンホ
カイン類を含む上記培地の大量を分画処理、精製しても
非常に少量のリンホカインしか得られない０したがって
前述の目的の達成は不可能であった。また１、２のリン
ホカインについてはリンパ球そのものでなくリンパ球由
来細胞株で生産することが知られているが公知の方法は
高濃度の血清を添加して細胞培養を行う方法であり、精
製、製造コスト、細胞培養中に生成する阻害物質の存在
など多くの問題点があり実用には程遠い０ 本発明に用いられる培地を新しくリンホカイン生産に適
用することにより初めてこれらリンホカインを実用に供
しつる有用性が確立されたと言える。

前述の培地を用いて哺乳動物Ｔリンパ球由来細胞（ハイ
プリドーマを含む）を培養増殖し、本細胞を用いてリン
ホカインを産生ずるには大別して２種の方法がある。１
つは本、細胞が自発的にリンホカインを産生ずる場合で
ありこの場合には当該培地中で細胞を培養増殖させ、そ
の培養上清より通常の方法でリンホカインを単離、精製
する方法である。他の１つは刺激剤を用いる方法であり
当該培地中で細胞を培養増殖させ一定の細胞密度に達し
たところで、Ｔ細胞マイトジェンとして作用するフィト
ヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇ’１ｕｔｉｎ
ｉｎ”、　ＰＨＡ　）、コンカナ、＃クリンＡ　（ｃｏ
ｎｃａｎａＶａ’：ｔｉｎ　　Ａ　、以下、Ｃ！ｏｎ　
Ａと略記する）、ボークウイードマイトジ血ン（ｐｏｋ
ｅｗｅｅａ　ｍｉｔｏｇｅｎ　、ＰＷＭ　）、シーティ
ンＡ、細菌菌体又は細菌菌体由来成分を添加して短期間
培養し、その培養上清より、使用した刺激剤を除去し、
又は除去しないまま通常の方法でリンホカインを単離、
精製する方法である。

第２の方法において刺激剤添加によりリンホカイン類を
生産する場合、本発明に用いられる前述の培地を用いる
と血清を高濃度又は低濃度で添加した培地を用いた場合
と同等以上のリンホカインの得られることが判明した。

また、刺激剤を用いてリンホカインを産生ずる場合に、
ホルボールエステル及び／又はヒドロキシ尿素類を添加
、共存させると、リンホカインの産生量が増大すること
も判明した。

このようにして得られたリンホカイン類を培養上清中よ
り単離、精製するには、塩析、濃縮、真空透析、ゲル濾
過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
、調製用等電点電気泳動、ゲル電気泳動法等の種種の方
法を適宜組合せて用いればよい。

このようにして精製されたり′ンホヵインは血清由来夾
雑物や他のリンホカイン及びリンホカイン作用阻害物質
を含有せず、医薬としてヒトに臨床使用することができ
る。研究試薬又は診断薬として用いる場合には培養上清
若しくは中間精製品を用いることもできる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない０ なお、添付図面は、各種培養条件下における、培養日数
（日）（横軸）と、細胞密度（ｘ　ｉ　ｏｓ個／−）（
縦軸）との関係を示すグラフであり、各図については該
当例の箇所で詳説する〇実施例１ Ｃｏｎ　Ａ刺激により工Ｌ−２ｆ産生ずるハイプリドー
マの各種培地中での増殖 （ａ）　　ハイプリドーマの製造 ミコバクテリウム・ラベルクロシス・ヒトタイプ・アオ
ヤマＢ５００μ２　で免疫した。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスから肺細胞及びリンパ節細胞を取出
し、ゲルハルト等〔ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・
イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　５巻７２０（１９７５））によ
り開示された方法に従って培地中に懸濁し、ユトク等〔
セルラー・イムノロジー（ＣｏｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎ
Ｏ１，）　２５巻１４０（１９７６））により開示され
たＢ細胞と未熟な胸腺細胞に対す□る抗体と補体で処理
し、これらの細胞を除去しＴ細胞が濃縮された細胞懸濁
液を作成した。

これを、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフ
ェラーゼの欠損し７ｙＢＷ１５４７ＡｚＧＲ・ＯｖＲな
るＡＫＲマウス由来の胸腺腫細胞とポリエチレングリコ
ール１０００’ｌ用いて融合させた０融合の１０〜２０
日後に、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（
ＨＡＴ　）選択培地中に生育したハイプリドーマが現れ
それを更に３〜７日ヒポキサンチン・チミジン（ＨＴ　
）　　培地中で培養した。こうして、３２６種類のハイ
プリドーマクローンを得た。

（（９）　ＩＬ−２産生ハイプリドーマクローンの選択
得られたハイプリドーマ’ｉ　１　Ｘ　１０’個／−の
濃度にし、１０チ牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０で調
製し、２４穴の組織培養プレートにＣｏｎ　Ａ不在下、
及び５μｔ／−存在下で２４時間培養した。２４時間後
に培養上清を採取し、この培養上清中にＣｏｎ　Ａ刺激
によりＩＬ−２が産生されるか否かを次の方法により検
定した。

（Ｃ）　　工’ｂ−２活性の検定 組織培養プレートの個個の穴にＩＬ−２活性を検定しよ
うとする検体を適当な濃度範囲で希釈し、１００μｔず
つ分注する。そこにギリス等〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ　）　　２６８巻１５４（１９７７））によって教示
された方法に従って作成した活性化’ｌ’　ＩＪンパ球
株を４Ｘ１０３／１００μｔの濃度として１００μを各
穴に添加する０２４〜４８時間後にトリチウム化チミジ
ン０．５μＣ１ヲ加え数時間培養後この分野において良
く知られた方法に従って、細胞を集め、細胞内に取込ま
れた放射線量を測定した。ＩＬ−２活性の高い培養上清
はど、活性化７９７７球内に取込まれるトリチウム化チ
ミジン量が多いことから培養上清にＩＬ−２を産生ずる
クローンを容易に選択することができる。

３２６種の培養上清を検定した結果、ＣｏｎＡ刺激なし
では工Ｌ−２ｉ産生せず、ｃｏｎ　Ａ刺激でＩＬ−２ｉ
産生ずるハイプリドーマクローンＳ−２９−Ａ８３１が
得られた。

（ｄ）　　Ｃｏｎ　Ａ刺激下でＩＬ−２’ｉｉ産生ずる
ハイプリドーマ８２９−Ａ８？ｉ１の各種培地での培養
得られ７’（８２９−Ａ８３１’ｉ初濃度ｏ、５×１０
５個／−として、各種培地に懸濁し、ファルコ／　（Ｆ
ａｌｃｏｎ　）　　３０２４フラスコ、２５−はり込み
にて、３７℃、５係炭酸ガスインキユヘーター中で、静
置培養して、上記ハイプリドーマの増殖を比較した。

使用した各種培地の組成及び調製法を以下に示す。

１）クリック／　ＲＰＭ工　１６４Ｄ培地Ｎａ０ｔ７０
００　　ｍＷ／１ ＫＣ７４００ｍＶ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４４２５ ＫＨ２ＰＯ４３０ ＭｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ１５０ Ｃ！　ａ　Ｃ！　４　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　７００ａ（ＮＯ３）２　　　　　　　　　　　　
　　　　５４．８グルコース　　　　　　　　　　　　
　　１５００フエノールレツド　　　　　　　　　　　
　　ｚ５ＮａＨＯＯ３１１７５ Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　　１７．８Ｌ
−アルギニン　　　　　　　　　　　　１００Ｌ−フル
キ＝ン−ＨＣｔ−Ｈ２Ｏ１５７，５Ｌ−アスパラギン　
　　　　　　　　　　　５１．４Ｌ−アスパラギン酸　
　　　　　　　　　３６．６Ｌ−シスチン　　　　　　
　　　　　　　　５５Ｌ−グルタミン　　　　　　　　
　　　　４４２Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　　　　
　　　３９４グリシン　　　　　　　　　　　　　　　
　２０Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　Ｚ５
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣ３１−Ｈ，Ｏ５５，３Ｌ−ヒドロ
キシプロリン　　　　　　　　　１０　　ｍＷ／ＩＬ−
インロイシン　　　　　　　　　　　　９０Ｌ−ロイシ
ン　　　　　　　　　　　　　　９０Ｌ−リジン拳ＨＯ
ｔ１１１．３ Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　　　　　２６．３Ｌ
−フェニルアラニン　　　　　　　　　　４７．５Ｌ−
プロリン　　　　　　　　　　　　　　　５５Ｌ−セリ
ン　　　　　　　　　　　　　３６Ｌ−スレオニン　　
　　　　　　　　　　７０Ｌ−トリプトファン　　　　
　　　　　　　１５Ｌ−チロシン　　　　　　　　　　
　　　　５５Ｌ−バリン　　　　　　　　　　　　６７
．５グルタチオン　　　　　　　　　　　　　　０，５
ピオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　０°１ビ
タミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
００２５Ｄ−パントテン酸カルシウム　　　　　　　　
１．１２５コリンクロリド　　　　　　　　　　　　　
　２．５葉酸　　　　　　　　　１．５ １−イノジット　　　　　　　　　　　　　　１９５ニ
コチンアミド　　　　　　　　　　　　　　　１，５ｐ
−アミノ安息香酸　　　　　　　　　　　０．５　ｍＷ
／ｌピリドキシ／・ＨＯｔｏ、５ ピリドキサール・ＨＣｔｌ リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．２チアミン・ＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　１
．５アデノシン　　　　　　　　　　　　　　１２．５
グアノシン　　　　　　　　　　　　　　１２．５ウリ
ジン　　　　　　　　　　　　　　　１２．５シトシン
　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５２）　　Ｒ
ＰＭ１１６４０（ギプコ社製）３）　　ＢＩＴＯ５５−
９培地 ＤＭＥＭ　　（日永製薬（株）製〕に下記の成分を添加
して溶解し、Ｒ工ＴＣ５５−９培地を得た〇 インシュリン　　　　　　　　　　　　　　ｊ　ＯｍＷ
／１ヒトトランスフェリン　　　　　　　　　　　５ヒ
ボキサンチン　　　　　　　　　　　　　　４チミジン
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．７デオキシシ
チジン　　　　　　　　　　　　　α０５デオキシアデ
ノシン　　　　　　　　　　　　１．０６．８−ジヒド
ロキシブリ７　　　　　　　　０．５　ｍＷ／１グルコ
ース　　　　　　　　　　　　　１０００Ｌ−アラニン
　　　　　　　　　　　　　２０Ｌ−アスパラギン（１
水和物）５６ Ｌ−アスパラギン酸　　　　　　　　　　２０Ｌ−シス
ティン塩酸塩（１水和物）４０Ｌ−グルタミン酸　　　
　　　　　　　　　２゜Ｌ−プロリン　　　　　　　　
　　　　　　　２０アスコルビン酸　　　　　　　　　
　　　　１０ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　
　０２ホリニン酸　　　　　　　　　　　　　　　　０
．０１ＶＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．１ＦｅＳＯ４＠　７　Ｈ２Ｏ０，８ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，０２ ＮａｌＳｅ０３　　　’　　　　　　　　　　　　　　
　０．００４０ａＣ！ｌ、　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００グルタチオン　　　　　　　　　　　　
　　１．０プトレシンニ塩酸塩　　　　　　　　　　　
０．１β−グリセロリン酸二ナトリウム　　　１５００
重曹　　　　　　　１３００ ４）　　ＲＩＴｏ　　５６−１培地 ＲＩＴＯ５５−９培地に下表の成分を添加して溶解し、
Ｒ工Ｔ０５６−１培地を得た。

ガラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　５００
　　ｍｆ／／１ホスファチジルコリンシリルオイル　　
　　　　２．５５）　　ＢＩＴｏ　　５６−５培地 Ｒ工ＴＣ５５−９培地に更に下表の成分を添加して溶解
し、ＲＩＴＣ！５６−５培地を得た０ 大豆精製レシチン　　　　　　　　　　　　　３　ｍＷ
／ｌガラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　
５００なお、ここで添加したα−サイクロデキストリン
（α−ＣＤ）とリノール酸及びオレイン酸との包接化合
物は次のようにしヤ調製した０すなわち、α−サイクロ
デキストリン（牛丼化学製）１１Ｆ’ｉ７−の水に溶解
してこれに１０ｍ２のリノール酸、オレイン酸をエタノ
ール７ゴに溶解した液を加え、窒素ガスを通気しつつ７
０℃まで加温した。液が透明になったら直ちに室温下で
放冷し、更に４℃で２０時間冷却した。

析出した沈殿物を遠心分離して１０−のエタノールで１
回洗浄し、減圧乾燥した。この粉末を石油エーテル１０
−で２回洗浄して減圧乾燥した０ 更にこれらの各種培地は以下のごとく調製して培養に使
用した。前記のクリック／　ＲＰＭ工１６４０培地及び
ＲＰＭ工　１６４０培地（ギプコ社製）は塩酸でｐＨ７
，１〜′１２に調製した後、メンブランフィルタ−（０
，２２μｍ）で１過滅菌し、１０　Ｖ／Ｖ％になるよう
に胎児牛血清（フロー・ラボ製）を添加した。

Ｒ工ＴＯ５５−９培地には０．５チの牛血清アルブミン
（ＢＳＡ　）　（シグマ社製）を添加、溶解させ、Ｒ工
Ｔ０５６−１及びＲＩＴＣ５６−５培地はそのままで、
戸が７．２〜ｚ５になるよう１ＮＮａＯ）！　　で調整
した後、メンブランフィルタ−（０，２２μｍ）で加圧
ｒ過滅菌した。

ツク／　ＲＰＭ工　１６４０中そしてΔ印は０．５係牛
血清アルブミン（以下ＢＢＡと略記する）含有ＲＩＴｆ
：！５５〜９中、目印はＲ工ＴＣ！５６−１培地中、・
印はＲ工Ｔ０５６−５培地中の結果ヶ示す。

実施例２ ８２９−Ａ８３１による各種培地中での工Ｌ−２の製造 実施例１の（ｄ）の方法で１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ
１１６４０中で増殖させたＳ　２９−　Ａ　８３１をフ
ァルコン５０２８フラスコに１ｘ　１ｏ’個／−になる
よう新しい培地に懸濁し、５μｆ／−の（！ｏｎ　Ａ　
ｆ添加して、１００ｍのはり込み量にて２４時間５７℃
、５％炭酸ガスインキュベーター中で静置培養し、ＩＬ
−２の製造を行った０２４時間後に培養上清を集め培地
中に産生されたＩＬ−２量を実施例１の（Ｃ）の方法に
従って測定した０（表１） ＩＬ−２産生培地　　　　　　　ＩＬ−２産生量（＝ツ
１０クリック／ＲＰＭ工１６４０　　　　　　　　　　
　１００Ｄ１００Ｄ　（ギブゴ社製）８０ ＢＳＡｏ、５％含有ＲＩＴＣ５５−９９０実施例５ ８２９−Ａ８５１増殖培地にょる工Ｌ−２産生阻害 ８２９−Ａ８３１を１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ工　１
６４０で増殖し、ここにＣｏｎ　Ａ　５　ｔｔｆ／ｍｌ
を添加しても、ＩＬ−２産生量は極めて、少ない。

表２に示すごとく、Ｂ’１９−Ａ８５１増殖培地（４日
培養）の添加度を増すと、ＩＬ−２産生は阻害を受け、
したがって、ＩＬ−２産生における培地交換の必要性を
示している。

表２　８２９−Ａ８５１増殖培地によるＩＬ−２産生阻
害ガＶ直垢演親脈力Ｉｔ（チ）　　　　　　　　　工Ｉ
、−２産生量（ユニット／−）０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１００２０　　　　　　　　　　
　　　　９０５０　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６０８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２０１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５実施例４ 自発的にリンホカインを産生する１９７７球ハイプリド
ーマの各種培地中での増殖 （ａ）　　ハイプリドーマの製造 実施例１の（ａ）の方法に準じてノ・イブリドーマを作
成した０ （ｂ）　　各種リンホカイン産生ノ・イブリド−マクロ
ーンの選択 得られたハイプリドーマを工Ｌ−２産生ノＸイフリトー
マクローンの場合は、実施例１（７）（ｂ）の方法に準
じて、Ｃ８Ｆ産生ノ１イブリド−マクローン、ＴＲＦ産
生ハイブリドーマクローンの場合は、０．２　Ｘ　１０
量個／−の初濃°度とし、５−／フラスコ（直径６創ン
の容量で１０％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４　Ｄ
ｉ用いて、３〜４日培養し、培養上清を採取した。この
培養上清中にハイプリドーマから自発的に各種リンホカ
インが産生されているか否かを次の方法に従って検定し
た。

（ｃ）　−１工Ｌ−２活性の検定 実施例１の（Ｃ）の方法に準じた。

得られたハイブリドーマの培養上清を検定した結果、自
発的にＩＬ−２ｉ産生ずるハイプリドーマクローン８３
０−Ｍ２Ｏ３が得られた０ （ｃ）　−２０ＳＦ活性の検定 Ｏ８Ｆ活性を検定しようとするハイプリドーマ培養上清
０．２　ｍｌｓ馬血清０．２　ｍｌ　、２．２係メチル
セルロース０．４　ｍｌ、５　Ｘ　１０５個／−のマウ
ス骨髄細胞浮遊液０．２ｔｄ’ｉ培地として、α−改良
イーグル培地（α−ＭＥｊＭ　）　（Ｈ用いて作成し、
直径５Ｃｒｎのシャーレに加え、７日間培養する。培養
後顕微鏡にて骨髄細胞の形成したコロニー数を測定する
。コロニー数はＣ８Ｆ活性の高いハイプリドーマの培養
上清はど多いことから、培養上清にＣ８Ｆ′を産生ずる
クローンを容易に選択することができる。

得られたハイブリドーマの培養上清を検定した結果、自
発的にＣ８Ｆ　ｉ産生ずるハイブリドーマクローンに５
−Ｐ５５が得られた。

（ｃ）　−３ＴＲＦ活性の検定 アラかじめジニトロフェニル化キ＊　−ル・リンペット
・ヘモシアニン、　（Ｉ）ＮＰ、ＫＬＨ）１００μｔ　
で免疫したＢＡＬＢ／　Ｃマウスの肺細胞を懸濁化し、
抗Ｔｈｙ　−１−２抗体と補体とで処理し、Ｔ細胞を除
去する。これｉ　ＤＮＰ化オポアルブミン（ＤＮＰ−Ｏ
ＶＡ　）　ｉ抗原として１００μ２　加え、０．７５　
Ｘ　１０ｇ個７１００μノとし、ミクロ組織培養プレー
トの個個の穴に接種した。同時に個個の穴に１００μｔ
のＴＲＦ活性を検定しようとする検体を加えておく。培
養開始後５日目に各穴から細胞を個別に回収し、この技
術分野でよく知られたヤーン（Ｊθｒｎθ〕のプラーク
法により、出現した抗体産生細胞数を判定した。加えた
検体中のＴＲＦ活性が高いほど抗体産生細胞数は増加す
る。

得られたハイプリドーマの培養上清中のＴＲＦ活性を検
定した結果、自発的にＴＲＦ　ｉ産生ずるバイブリド−
マＣ２６２−：Ｊ１６が得られた〇 （ｄ）　　各種リンホカイン産生ハイブリドーマの各種
培地中での増殖 得られたＩＬ−２産生ハイブリドーマ８５０−Ｍ２Ｏ３
及びＴＲＦ産生ハイプリドーマＣ１６２−Ｊ１６の場合
は、初濃度０、ｓ　ｘ　ｉ　ｏｓ個個７！として各種培
地中に懸濁し、ファルコン３００２シャーレ５−はり込
みにて、Ｏ８Ｆ産生ハイブリドーマに５−Ｐ５５の場合
は、初濃度０．２　Ｘ　１０Ｓ個／−として各種培地中
に懸濁シ、ファルコン５０２４フラスコ２５−はり込み
にて５７℃５係炭酸ガスインキユベーター中で静置培養
した。

これらの各結果を第２〜４図に示す０第２図は８５０−
Ｍ３０１ｉ使用した場合で、第２図中、Ｏ印は１０％牛
脂児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４０中、×印は１０チ牛
脂児血清含有ＤＭＥＭ　中、そしてΔ印はＲＩＴ（３５
６−５培地中の結果を示す。

第３図はに５−Ｐ３５細胞を使用した場合、第５図中の
Ｏ印は前図と同じ、Ｘ印は（Ｌ５％Ｂ８Ａ含有Ｒ工ＴＣ
５５−９培地、そしてΔ印はＲＩＴＣ５６−５培地中の
結果を示す。第４図はＣ２６２−Ｊ１６細胞を使用した
場合で、第４図中、Ｏ印は前図と同じ、ｘ印は１０係牛
脂児血清含有クリック／　ＲＰＭ工　１６４Ｉ培地中、
Δ印は０．５％　ＢＳＡ含有Ｒ工ＴＯ５５−９培地中、
そして目印はＲＩＴ（！５６−５培地中の結果を示す。

実施例５ 自発的にリンホカインを産生ずる。リンパ球ハイブリド
ーマによる各種培地中での各種リンホカインの自発産生 （１）　　ＩＬ−２産生ハイブリドーマ６１３０−Ｍ２
Ｏ３による各種培地中でのＩＬ−２の自発産生実施例４
の（ｄ）の方法で８３０−Ｍ２Ｏ３を培養し、培養４日
目の培養上清を採取し産生された工Ｌ−２活性を実施例
１の（ｅ）の方法にて検定した。（表３） ＩＬ−２産生培地　　　　ＩＬ−２産生量（ユニット／
−）クリック／ＲＰＭＩ　１６４０　　　　　　　　　
　１８０ＤＭＥＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１８００．５％ＢＳＡ含有Ｒ工ＴＣ
５５−９　　　　　　　　１６０ＲＩＴＣ５６−５１５
０ 対照群　　　　　　　　　　　　　　　　　〈１（ｉｉ
）　　ａｓｐ産生ハイプリドーマに５−Ｐ３３による各
種培地中でのＣ８Ｆの自発産生 実施例４の（、ｌ）の方法でに５−Ｐ３３ｉ培養し、培
養４日目の培養上清を採取し、産生されたＣ８Ｆ活性を
実施例４の（ｃ）　−２の方法にて検定した。（表４） ａｓｐ産生培地　　　　ａｓｐ産生量（コロニ（ンヤー
レ）クリック／ＲＰＭＩ　１６４　Ｄ　　　　　　　　
　　　　２８０ＤＭＩＭ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２８５０．５％ＢＳＡ含有Ｒ工ＴＣ５５−９　
　　　　　　　　２９０ＲＩＴＣ５６−５２５０ 対照群　　　　　　　　　　　　　　　５２ｏｒｂ　　
ＴＲＦ産生ハイプリドーマ０２６２−Ｊ１／ｉによる各
種培地中でのＴＲＦの自発産生実施例４の（ｄ）の方法
でＣ！２６２−Ｊ１６を培養し、培養４日目の培養上清
を採取し、産生され７！ｊ　ＴＲＦ活性を実施例４の（
ｃ）−３の方法にて検定した０　（表５） ＤＭＥＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２８５ｏ、　５　ｑｌ、　ＢＡＡ含有Ｒ工ＴＣ！
５５−９　　　　　　　　２６８ＲＩＴＣ５６−５２５
０ 対照群　　　　　　　　　　　　　　　　３５実施例６ （ｉ）　　Ｃｏｎ　Ａ刺激により工Ｌ−２’（Ｈ産生ず
る）・イブリド−マロ１２９−Ａ８３１のローラーボト
ルでの増殖 ５２９−Ａ８３１．Ｔｈ初濃度０．５　Ｘ　１０Ｓ個／
ｍｅ６００ｆｎ１．はり込みにて、ローラーボトル（フ
ァルコン５０２７）で、密栓状態３７℃回転培養（回転
数’５０　ｒｐｍ　）　Ｌ　ｆｃ　ｏその結果を第５図
に示す。第５図中、Ｏ印は前図と同じ、ｘ印は１０チ牛
脂児血清含有クリック／　ＲＰＭ１１６４０培地中、そ
してΔ印は０．５チＢＳＡ含有ＲＩＴＯ５５−９培地中
の結果を示す。

（＋１）　　Ｓ　２　ｑ　−Ａ　８　ｓ　１のスピンナ
ージャーでの増殖 ５２９−Ａ８３１を初濃度０．５　Ｘ　１０５個／ｍｅ
５００ｇｇはり込みにて１を容ベルコ製スピンナージャ
ーで、密栓状態５７℃かくはん培養（かくはん速度５０
　ｒｐｍ　）　した。

その結果を第６図に示す。第６図中、０印は前図と同じ
、Ｘ印は１０％牛脂児血清含有クリック／　ＲＰＭ工　
１６４０培地中、そしてΔ印はＢＩＴＯ５６−５培地中
の結果を示す。

（１１リ　　自発的にＴＲＩＩ’　ｉ産生するハイプリ
ドーマＣ２６２−Ｊ１６のローラーボトルでの増殖０２
６２−Ｊ１６を初濃度０．５　Ｘ　１０５個／−６００
−はり込みにてローラーボトル（ファルコン５０２７　
）で密栓状態３７℃回転培養（回転数５０　ｒｐｍ　）
　した。

その結果を第７図に示す。第７図中、Ｏ印は前図と同じ
、ｘ印はα５　％　ＢＯＡ含有ＲＩ’ｒＣ５５−９培地
中、そしてΔ印はＲ工ＴＣ５６−５培地中の結果を示す
。

（Ｉｙ）　　Ｃ２６２−Ｊ　１６のスピンナージャーで
の増殖 （！２６２−Ｊ１６ｉ初濃度０．５　Ｘ　１０Ｓ個／ｍ
ｅ５００−はり込みにて、１を容ペルコ製スピンナージ
ャーで密栓状態５７℃かくはん培養（かくはん速度５０
　ｒｐｍ　）　した。

その結果を第８図に示す。第８図中、０印は前図と同じ
、Ｘ印は０．５　％　Ｂ８１Ａ含有Ｒ工Ｔ。

５５−９培地中、そしてΔ印はＲ工ＴＣ５６−５培地中
の結果を示す。

実施例７ ヒトエＬ−２産生細胞ジュルカット−ＦＨＣＲＯの各種
培地、フラスコ、ローラーボトル、スピンナージャーで
の増殖 （１）　　フラスコでの増殖 ジュルカット−ＦＨＣＲＣを初濃度Ｉ　Ｘ　１０Ｓ個／
−として各種培地に懸濁し、ファルコン３０２４フラス
コ２５−はり込みにて３７℃、５チ炭酸ガスインキユベ
ーター中で静置培養した。その結果を第９図に示す。第
９図中、Ｏ印は前図と同じ、Ｘ印は１０％牛脂児血清含
有クリック／　ＲＰＭ工　１６４０中、Δ印ハ０、５　
％　ＢＳＡ含有ＲＩＴ（！５５−９培地中、０印はＲＩ
ＴＣ！５６−５培地中、そしてＶ印は１０％牛脂児血清
含有ＤＭＥＭ　　中の結果を示す。

（１１）　　ローラーボトルでの増殖 ジェルカット−ＦＨＯＲ（！を初濃度Ｉ　Ｘ　１０量個
／−１１０００−はり込みにてローラーボトル（ファル
コン５０２７）で密栓状態３７℃回転培養（回転数５０
　ｒｐｍ　）　した。その結果を第１０図に示す。第１
０図中、０印は前回と同じ、Ｘ印は０，５係ＢＳＡ含有
Ｒ工ＴＣ５５−９培地中、そしてΔ印はＲＩＴＣ！５６
−５培地中の結果を示す。

０＋０　　スピンナージャーでの培養 ジェルカット−ＦＨＣ！ＲＣ！を初濃度Ｉ　Ｘ　１０’
個／−１５００−はシ込みにて１を容ペルコ袈スピンナ
ージャーで加熱、加湿した５％炭酸ガス／９５係空気を
１００〜５００ｄ／分で通気させながら３７℃かくはん
培養（かくはん速度５０　ｒｐｍ　）　した。その結果
を第１１図に示す。第１１図中、Ｏ印、Ｘ印及びΔ印は
第１０図と同義であり、０印はＲ工ＴＣ５６−１培地中
の結果を示す。

実施例８ ジェルカッ）−ＦＨＯＲＯ細胞増殖細胞増殖培地液熱で
のＩＬ−２誘導 実施例、７のｌ）の方法に゛従い、１０９Ｇ牛脂児血清
含有ＲＰＭ１１６４０で増殖させたジェルカット−ＰＨ
ＣＲＯｔ−ファルコン５０２４フラスコ（垂直状態）Ｋ
そのまま（約Ｉ　Ｘ　１０’　　個／ｗｉとなっている
）及び１×１０６個／ｗｔになるように新しい培地に懸
濁し、５０μｆ／＋ｄ　のＯｏｎ　Ａを添加し、５０７
Ｆｉり込みにて２４時間５７℃５畳炭酸ガスインキュベ
ーター中靜装培養し、工Ｌ−２の産生を行った０ ２４時間後に、培養上清を集め、培地中に産生されたＩ
Ｌ−２量を実施例１の（Ｃ）の方法に従って測定した０
（°表６） ＩＬ−２産生培地　　　　　ＩＬ−２産生量（＝ツ）／
ｄ）培地替えなし　　　　　　　　　　　　　　１０培
地替え無血清ＲＰＭ工１６４０　　　　　　６０無血清
ＤＭＫＭ　　　　　　　　　　　　６０無血清クリック
／ＲＰＭ工１６４０　　　５００、５　％　ＢＳＡ含有
ＲＩＴＯ５５−９２００Ｒ工ＴＣ！５６−１．　　　　
　　　　１００Ｒ工ＴＣ５６−５１５０ 実施例９ ジェルカッ）　−ＦＨＣＲＣ細胞無血清培地液替えなし
での工Ｌ−２誘導 血清含有培地では、表６に示すごとく、培地替えをしな
いと工Ｌ−２産生量は極めて少ない。

しかし無血清培地（ＲＩＴＯ）　　においては、実施例
８と同様のＩＬ−２誘導の培養条件で培地替えをしなく
ても、十分なＩＬ−２産生が認められた。

（表７） 培地替え　　　　ＩＩ、−２産生量（＝シト／コンなし
　　　　　　　　２００ あり　　　　　　　　　２２０ 実施例１０ ジェルカッ）　−ＦＨＣＲＣによる各種培地中、ローラ
ーボトルでの工Ｌ−２産生 ジェルカット−ＦＨＣｊＲｅを初濃度Ｉ　Ｘ　１０量個
／−として、１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０ニ
懸濁し、ローラーボトル（ファルコン５０２７）１００
０−はり込みにて、５７℃密栓状態回転培養（回転速度
５０　ｒｐｍ　）する。培養細胞を遠沈にて、集め、初
濃度４　Ｘ　１０６個／−として、新しい培地に懸濁し
、ＣｏｎＡ１５０μ９／−添加し、ローラーボトルにて
、細胞培養時と同条件で、２４時間回転培養した。（表
８） エＬ−２産生培地　　　　　　　工Ｌ−２産生量（＝ッ
ト／−）無血清ＲＰＭＩ　１６４０　　　　　　　　　
　　　　　４００１％牛脂児血清含有ＲＰＭ工１６４０
　　　　　　　　７５０無血清クリック／ＲＰＭ工１６
４０　　　　　　　　　５２０無血清ＤＭＥＭ　　　　
　　　　　　　　　　　４００１チ牛脂児血清含有ＤＭ
ＥＭ　　　　　　　　　　　　　８００Ｑ、　５　％　
ＢＳＡ含有Ｒ工Ｔ（！５５−９　　　　　　　　　５０
０実施例１１ ジュルカツ）　−Ｆ’ＨＣＲ（！細胞増殖培地でのＩＬ
−２誘導阻害 ジュルカツ）　−ＦＨＣｊＲＣ＠　１Ｄ　１４牛脂児血
清含有ＲＰＭ１１６４０で増殖し、ここに（！ｏｎ　Ａ
　５０μｆ／−添加しても、表６に示したように、工Ｌ
−２産生量は極めて少ない０表９に示すごとく、工Ｌ−
２誘導においてジュルカットーＦ’ＨＯＲＯ増殖１０％
牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０（４日培養）の添加度
を増すとＩＬ−２誘導は阻害を受け、１、Ｌ−２産生に
おける培地交換の必要性を示している〇 増殖培地添加度（％）　　　　　　ＩＬ−２産生量（＝
ット／−）０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１２０２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５０５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４０８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５以上の各個の記載から明らかなように、本発明方法
によれば、細胞増殖効果が優れていると共に、免疫活性
物質、特にリンフ才力インの産生効率も大である。

したがって、本発明方法による効果は、従来法に比較し
て顕著に優れたものである０

【図面の簡単な説明】

添付図面は、各種培養条件下における、培養日数と細胞
密度との関係を示すグラフである。 第１図は５２９−Ａ８３１、第２図１ｄ　Ｂ　５０−Ｍ
３０１、第５図はに５−Ｐ３３、そして第４図は０２６
２−Ｊ１６’ｉ各種培地で培養した場合の結果を示す。 更に第５図は８２９−　Ａ　８５１のローラーボトル中
、第６図は同じくスピンナージャー中、第７図は０２６
７−、ｒ１６のローラーボトル中、そして第８図は同じ
くスピンナージャー中での培養結果を示す。第９〜１１
図は、いずれも、ジュルカットーＦ’）！ＯＲＯｌ用い
、第９図はフラスコ中、第１０図はローラーボトル中、
そして第１１図はスピンナージャー中での培養結果を示
す。 特許出願人　味の素株式会社 代理人　　　　中　本　　　　宏 代理人　　　　井　上　　　　昭 第　ｌ　図 皓）日数（日） 第２図 培養日数（日） 第　３　図 姥養日数（日） 第４図 培養日数（日） 第５図 培養日数（日） 第　６　図 第　７　図 ４４８廖（１日） 第１０図 バＬ番日教（日） 第　／ｌ　　図 婚養日敗（日）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　血清から分離された哺乳動物血清アルブミンを含
   有するか若しくは含有しない哺乳動物リンパ球由来細胞
   用無血清培地を用いて哺乳動物Ｔ　ＩＪンパ球由来細胞
   を培養し、該培地より免疫活性物質を回収することｔＷ
   徴とする免疫活性物質の製造方法。 ２、　哺乳動物Ｔ９ンパ球由来細胞が、ヒト又はマウス
   由来Ｔリンパ腫細胞又は！白血病細胞である特許請求の
   範囲第１項記載の方法〇五　哺乳動物Ｔリンパ球由来細
   胞が、ヒト又はマウスの１９７２球と、Ｔリンパ腫細胞
   又はＴ白血病細胞とを融合して得られたノーイブリドー
   マである特許請求の範囲第１項記載の方法０ ４、　　Ｉｌｌ乳動物Ｔリンパ球由来細胞が、刺激剤の
   ・存在下又は非存在下にリンホカインを産生ずる能力を
   有する細胞株又はハイプリドーマである特許請求の範囲
   第２項又は第５項記載の方法。 １　哺乳動物１９７７球由来細胞が、インターロイキン
   ２又はコロニー刺激因子又はテリンパ球代替因子を産生
   する能力を有するＴ　１７ンパ球由来の細胞株又はハイ
   プリドーマである特許請求の範囲第４項記載の方法０ ＆　哺乳動物’ｆ９ンパ球由来細胞が、ヒトインターロ
   イキン２を産生する能力を有するジュルカットＴ白血病
   細胞又はそのクローンである特許請求の範囲第５項記載
   の方法０ ７、　哺乳動物１９７７球由来細胞を、Ｔ細胞マイトジ
   ェンを含有するか又は含有しない培地中で培養し、当該
   培地中よりリンホカインを特徴とする特許請求の範囲第
   １項〜第６項のいずれかに記載の方法。 ａ　培地中のＴ細胞マイトジェンが、フィトヘマグルチ
   ニン、コンカナバリンＡ、ポークウイード！イトジエン
   、プロティンＡ、細菌菌体及び同菌体由来成分からなる
   群より選択され良化合物である特許請求の範囲第７項記
   載の方法。 訊　培地がホルボールエステルを含んでいる特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 １１無血清培地中でヒト又はマウス由来Ｔ細胞株を培養
   する方法によって生成し九りンホカインを含有する培養
   上清。 １１、リンホカインが、インターロイキン２、コロニー
   刺激因子及びＴりンバ球代替因子からなる群より°選択
   されたものである特許請求の範囲第１０項記載の培養上
   清。 １２、無血清培地中でヒト又はマウス由来Ｔ細胞株若し
   く祉ハイブリドーマを培養する方法により生成した培養
   上清より精製工程を経て製造されるインターロイキン２
   、コロニー刺激因子又はテリンパ球代替因子。