CN112795531A - 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途 - Google Patents

一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112795531A
CN112795531A CN202110385870.5A CN202110385870A CN112795531A CN 112795531 A CN112795531 A CN 112795531A CN 202110385870 A CN202110385870 A CN 202110385870A CN 112795531 A CN112795531 A CN 112795531A
Authority
CN
China
Prior art keywords
free
sodium
acid
protein
follows
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110385870.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112795531B (zh
Inventor
俞锦锋
陈旭
陈刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Ecosai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Excell Biology Taicang Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Excell Biology Taicang Co ltd filed Critical Excell Biology Taicang Co ltd
Priority to CN202110385870.5A priority Critical patent/CN112795531B/zh
Publication of CN112795531A publication Critical patent/CN112795531A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112795531B publication Critical patent/CN112795531B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/22—Zinc; Zn chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Abstract

本发明公开了一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其用途。CHO细胞无血清无蛋白培养基由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、碳水化合物、脂肪酸及其他功能性化合物组成。本发明的新型无血清无蛋白培养基通用性强，能同时支持CHO‑K1、CHO‑DG44、CHO‑S、CHO‑K1‑GS‑/‑等主流CHO细胞株的高密度悬浮培养，培养基无血清、无蛋白质，无任何动物源组分、化学成分限定、组分精简且理化性质稳定；一方面可有效降低生产成本，提升培养基性能稳定性，另一方面适用于大规模生产，有利于后期产品的纯化；本发明提供的CHO细胞无血清无蛋白培养基解决了无血清无蛋白培养基通用性差、组分复杂和稳定性差等不足。

Description

一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其用途
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其用途。
背景技术
目前，哺乳动物细胞的大规模培养与表达已成为生物药生产特别是抗体药生产的基石技术。与酵母等其它真核细胞系相比，哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势在于可表达含有复杂二硫键或翻译后修饰的靶蛋白，且蛋白可分泌到培养液中，其产物蛋白的糖基化程度高且均一，有效提高药效，同时减少药物副作用。中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前重组蛋白生产领域最具代表性的工程细胞，其具有高效扩增和表达的特点，在流加培养中单抗产量最高可超过10g/L。据统计，使用CHO细胞系作为表达载体开发的抗体药物超过60%，使用CHO细胞生产的药物已获批上市29种。与此同时，针对CHO细胞培养的无血清开发平台在经历了含血清提取物的无血清培养基、无蛋白培养基、无动物源成分培养基，以及目前主流的化学成分限定培养基等几个阶段后产业化发展已初具规模。
化学成分限定培养基无血清，无蛋白，无动物源成分带来的病毒等安全风险，且培养基各组分种类和浓度明确，能保证最终成品良好的稳定性和一致性，批间差异小，易于规模化生产和放大，同时有利于下游分离和纯化。
Murakami等人以DF12为基础培养基，通过添加5mg/L胰岛素、2-35mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亚硒酸钠等组分，开发出经典的DF12-ITES配方。
中国专利CN 201310106385.5公开了一种支持CHO高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基，其中含有类固醇激素，而不含有转铁蛋白和胰岛素。
中国专利CN 201410513086.8公开了一种适于动物细胞表达产品大规模生产的化学成分明确培养基，其成分至少包括14种氨基酸、8种维生素、10种无机盐、2种核酸类化合物、1种激素及生长因子、2种抗氧化剂、1种螯合剂和2种其他营养物。
中国专利CN 201911347064 .8公开了一种CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途，其化学成分明确，成本低廉，能支持CHO细胞更好的生长和更短的细胞倍增时间，但同时其配方中也含有很多功能并不明确的微量元素，如、硝酸银、氯化钴、醋酸钡、硫酸铬、氟化钠等。
美国专利US 8198084B2公开了一种适用于哺乳动物细胞，尤其是上皮细胞和成纤维细胞体外悬浮培养的无血清无蛋白化学成分限定培养基配方，其中含铁螯合剂、锌离子和硫酸葡聚糖等组分。
美国专利US10138467B2公开了一种可显著提高哺乳动物细胞流加培养性能的无血清无蛋白培养基及其配方设计开发方法。
鉴于无血清无蛋白化学成分限定培养基快速发展与壮大，国内早期以培养基DF12或IMDM为骨架基础，通过添加各种营养物质、生长因子、细胞因子、蛋白水解物等来开发无血清培养基配方的策略已远远无法满足现代生物制品产业对于安全、质量和规模化的需求，同时早期培养基配方中脂肪酸、微量元素、核苷类以及生长因子类化合物的冗余添加造成的配方复杂性和不稳定性，对于工业化生产来说提出了更严峻的挑战。针对上述缺陷，发明开发了一种适用于CHO细胞高密度悬浮培养的新型无血清无蛋白培养基，通过精简培养基配方组分和实施新型化合物的替代，保证了终产品的最终稳定性和安全性，且生产易于规模化放大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其用途，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，所述培养基由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、碳水化合物、脂肪酸及其他功能性化合物组成；
所述氨基酸均为L-氨基酸，具体如下：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸盐酸盐、天冬酰胺、天冬氨酸、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物、谷氨酸、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、磷酸-L-酪氨酸二钠盐、缬氨酸；
所述维生素各组分具体如下：生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇、硫辛酸；
所述微量元素各组分具体如下：七水硫酸锌、五水硫酸铜、柠檬酸铁铵、亚硒酸钠、硫酸镍、偏硅酸钠、六水氯化铝；
所述无机盐各组分具体如下：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钠，磷酸氢二钠；
所述脂肪酸各组分具体如下：亚油酸、亚麻酸、胆固醇、β-甘油磷酸酯；
所述功能性化合物具体如下：葡萄糖、还原型谷胱甘肽、丙酮酸钠、腐胺、乙醇胺、Kolliphor P 188、硫酸葡聚糖、盐酸甜菜碱、氢化可的松。
进一步的，所述氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸15-150 mg/L、丙氨酸5-100 mg/L、精氨酸盐酸盐100-1000 mg/L、天冬酰胺50-1000 mg/L、天冬氨酸50-800 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物20-500 mg/L、谷氨酸10-150 mg/L、组氨酸盐酸盐100-1500 mg/L、异亮氨酸100-800 mg/L、亮氨酸100-800 mg/L、赖氨酸盐酸盐100-1000 mg/L、甲硫氨酸20-200 mg/L、苯丙氨酸30-300 mg/L、脯氨酸25-500 mg/L、丝氨酸75-750 mg/L、苏氨酸50-500 mg/L、色氨酸20-300 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐60-600 mg/L、缬氨酸30-500 mg/L；
进一步的，所述维生素各组分终浓度分别为：生物素0.0035-0.35mg/L、氯化胆碱5-100 mg/L、泛酸钙2-20 mg/L、叶酸2-20 mg/L、烟酰胺2-20 mg/L、吡哆醇1-10 mg/L、核黄素0.2-5 mg/L、盐酸硫胺素1-10 mg/L、维生素B12 0.05-10 mg/L、肌醇10-100 mg/L、硫辛酸0.1-5 mg/L；
进一步的，所述微量元素各组分终浓度分别为：七水硫酸锌0.2-5mg/L、五水硫酸铜0.0013-0.13 mg/L、柠檬酸铁铵0.5-50 mg/L、亚硒酸钠0.005-0.045 mg/L、硫酸镍0.0001-0.005 mg/L、偏硅酸钠0.005-0.5 mg/L、六水氯化铝0.0003-0.005 mg/L；
进一步的，所述无机盐各组分终浓度分别为：氯化镁20-150 mg/L、硫酸镁20-150mg/L、氯化钙60-200 mg/L、氯化钾300-800 mg/L、碳酸氢钠1200-4000 mg/L、氯化钠1000-6000 mg/L、磷酸二氢钠50-200 mg/L，磷酸氢二钠50-250 mg/L；
进一步的，所述脂肪酸各组分终浓度分别为：亚油酸0.02-2 mg/L、亚麻酸0.02-1mg/L、β-甘油磷酸酯0.02-2 mg/L；
进一步的，所述功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖4000-9000mg/L、还原型谷胱甘肽0.5-5mg/L、丙酮酸钠50-400 mg/L、腐胺0.08-1 mg/L、乙醇胺2-20 mg/L、Kolliphor P 188 500-2000 mg/L、硫酸葡聚糖20-100 mg/L、盐酸甜菜碱1000-4000 mg/L、氢化可的松0.02-0.4 mg/L；
进一步的，所述氨基酸各组分终浓度分别为：甘氨酸15-150 mg/L、丙氨酸5-30mg/L、精氨酸盐酸盐200-800 mg/L、天冬酰胺150-1000 mg/L、天冬氨酸100-800 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物20-300 mg/L、谷氨酸10-75 mg/L、组氨酸盐酸盐300-1500mg/L、异亮氨酸100-600 mg/L、亮氨酸100-500 mg/L、赖氨酸盐酸盐100-1000 mg/L、甲硫氨酸50-150 mg/L、苯丙氨酸30-250 mg/L、脯氨酸50-400 mg/L、丝氨酸100-550 mg/L、苏氨酸100-300 mg/L、色氨酸20-200 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐100-400 mg/L、缬氨酸50-450mg/L；
进一步的，所述维生素各组分终浓度分别为：生物素0.0035-0.35mg/L、氯化胆碱8-99 mg/L、泛酸钙2-10mg/L、叶酸2-10 mg/L、烟酰胺2-10 mg/L、吡哆醇2-10 mg/L、核黄素0.2-2.5 mg/L、盐酸硫胺素2-10 mg/L、维生素B12 0.5-5mg/L、肌醇10-80 mg/L、硫辛酸0.1-2.5 mg/L。
进一步的，所述微量元素各组分终浓度分别为：七水硫酸锌0.5-3mg/L、五水硫酸铜0.013-0.13 mg/L、柠檬酸铁铵10-50 mg/L、亚硒酸钠0.01-0.04 mg/L、硫酸镍0.0005-0.005 mg/L、偏硅酸钠0.01-0.5 mg/L、六水氯化铝0.0005-0.005 mg/L；
进一步的，所述无机盐各组分终浓度分别为：氯化镁50-150 mg/L、硫酸镁50-150mg/L、氯化钙100-200 mg/L、氯化钾300-650mg/L、碳酸氢钠1200-3700 mg/L、氯化钠1500-5000 mg/L、磷酸二氢钠50-150 mg/L，磷酸氢二钠50-150 mg/L；
进一步的，所述脂肪酸各组分终浓度分别为：亚油酸0.02-1 mg/L、亚麻酸0.02-0.5 mg/L、β-甘油磷酸酯0.02-1 mg/L；
进一步的，所述功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖4500-8000mg/L、还原型谷胱甘肽0.5-2.5mg/L、丙酮酸钠50-250 mg/L、腐胺0.08-0.8 mg/L、乙醇胺5-20 mg/L、Kolliphor P 188 1000-2000 mg/L、硫酸葡聚糖25-100 mg/L、盐酸甜菜碱1000-3000 mg/L、氢化可的松0.02-0.2 mg/L。
较为优选的，所述氨基酸各组分终浓度为：甘氨酸65 mg/L、丙氨酸10.8 mg/L、精氨酸盐酸盐438.5 mg/L、天冬酰胺170 mg/L、天冬氨酸133 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物25 mg/L、谷氨酸48.9 mg/L、组氨酸盐酸盐1400.5 mg/L、异亮氨酸118.8 mg/L、亮氨酸190 mg/L、赖氨酸盐酸盐135.4 mg/L、甲硫氨酸66.7 mg/L、苯丙氨酸30 mg/L、脯氨酸54.6 mg/L、丝氨酸304 mg/L、苏氨酸187 mg/L、色氨酸20 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐184.5 mg/L、缬氨酸52.9 mg/L；
较为优选的，所述维生素各组分终浓度分别为：生物素0.0035 mg/L、氯化胆碱8.98 mg/L、泛酸钙2.24 mg/L、叶酸2.5 mg/L、烟酰胺2.02 mg/L、吡哆醇2 mg/L、核黄素0.219 mg/L、盐酸硫胺素2.17 mg/L、维生素B12 4 mg/L、肌醇12.6 mg/L、硫辛酸0.105 mg/L；
较为优选的，所述微量元素各组分终浓度分别为：七水硫酸锌1.13 mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.02 mg/L、硫酸镍0.00167 mg/L、偏硅酸钠0.047 mg/L、六水氯化铝0.0007 mg/L；
较为优选的，所述无机盐各组分终浓度分别为：氯化镁61 mg/L、硫酸镁69.76 mg/L、氯化钙116.6 mg/L、氯化钾311.8 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠2000 mg/L、磷酸二氢钠62.5 mg/L，磷酸氢二钠71.02 mg/L；
较为优选的，所述脂肪酸各组分终浓度分别为：亚油酸0.04 mg/L、亚麻酸0.02mg/L、β-甘油磷酸酯0.02 mg/L；
较为优选的，所述功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖7000 mg/L、还原型谷胱甘肽1mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.405 mg/L、乙醇胺10 mg/L、Kolliphor P 1881500 mg/L、硫酸葡聚糖50 mg/L、盐酸甜菜碱1200 mg/L、氢化可的松0.036 mg/L。
进一步的，所述CHO细胞无血清无蛋白培养基的用途为，用于CHO细胞的培养。
进一步的，所述CHO细胞为CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1-GS-/-中的任意一种。
进一步的，所述CHO细胞无血清无蛋白培养的CHO细胞，用于单抗、双抗、融合蛋白、重组蛋白类生物药的制备。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
1、本发明的新型无血清无蛋白培养基通用性强，能同时支持CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1-GS-/-等主流CHO细胞株的高密度悬浮培养，具有广泛的应用前景和价值。
2、本发明的培养基无血清、无蛋白质，无任何动物源组分、化学成分限定、组分精简且理化性质稳定。一方面可有效降低生产成本，提升培养基性能的稳定性，另一方面适用于大规模生产，有利于后期产品的纯化。
3、本发明的培养基弥补了国内无血清无蛋白培养基通用性差、组分复杂和稳定性差等不足，为国内化学成分限定培养基的优化提供了新的思路。
附图说明
图1是本发明实验例一中，测试培养基和替代培养基培养CHO-K1细胞的活细胞密度。
图2是本发明实验例一中，测试培养基和替代培养基培养CHO-K1细胞的细胞活率。
图3是通过将表达曲妥珠单抗的CHO-K1细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的活细胞密度。
图4是通过将表达曲妥珠单抗的CHO-K1细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的细胞活率。
图5是通过将表达融合蛋白Enbrel的CHO-DG44细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的活细胞密度。
图6是通过将表达融合蛋白Enbrel的CHO-DG44细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的细胞活率。
图7是通过将表达阿瓦斯汀单抗的CHO-S细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的活细胞密度。
图8是通过将表达阿瓦斯汀单抗的CHO-S细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的细胞活率。
图9是通过将表达PD-1/TGFβ双抗的CHO-K1-GS-/-细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的活细胞密度。
图10是通过将表达PD-1/TGFβ双抗的CHO-K1-GS-/-细胞接种至不同培养基（对照为Gibco的dynamis）中培养后的细胞活率。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂肪酸、功能性化合物组成。
其中，氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸65 mg/L、丙氨酸10.8 mg/L、精氨酸盐酸盐438.5 mg/L、天冬酰胺170 mg/L、天冬氨酸133 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物25 mg/L、谷氨酸48.9 mg/L、组氨酸盐酸盐1400.5 mg/L、异亮氨酸118.8 mg/L、亮氨酸190mg/L、赖氨酸盐酸盐135.4 mg/L、甲硫氨酸66.7 mg/L、苯丙氨酸30 mg/L、脯氨酸54.6 mg/L、丝氨酸304 mg/L、苏氨酸187 mg/L、色氨酸20 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐184.5 mg/L、缬氨酸52.9 mg/L。
维生素各组分终浓度如下：生物素0.0035 mg/L、氯化胆碱8.98 mg/L、泛酸钙2.24mg/L、叶酸2.5 mg/L、烟酰胺2.02 mg/L、吡哆醇2 mg/L、核黄素0.219 mg/L、盐酸硫胺素2.17 mg/L、维生素B12 4 mg/L、肌醇12.6 mg/L、硫辛酸0.105 mg/L。
微量元素各组分终浓度如下：七水硫酸锌1.13 mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.02 mg/L、硫酸镍0.00167 mg/L、偏硅酸钠0.047 mg/L、六水氯化铝0.0007 mg/L。
无机盐各组分终浓度如下：氯化镁61 mg/L、硫酸镁69.76 mg/L、氯化钙116.6 mg/L、氯化钾311.8 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠2000 mg/L、磷酸二氢钠62.5 mg/L，磷酸氢二钠71.02 mg/L。
脂肪酸各组分终浓度如下：亚油酸0.04 mg/L、亚麻酸0.02 mg/L、β-甘油磷酸酯0.02 mg/L。
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖7000 mg/L、还原型谷胱甘肽1mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.405 mg/L、乙醇胺10 mg/L、Kolliphor P 188 1500 mg/L、硫酸葡聚糖50 mg/L、盐酸甜菜碱1200 mg/L、氢化可的松0.036 mg/L。
实施例2
一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂肪酸、功能性化合物组成。
其中，氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸37.5mg/L、丙氨酸17.5 mg/L、精氨酸盐酸盐525 mg/L、天冬酰胺475 mg/L、天冬氨酸390 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物137.5 mg/L、谷氨酸42.5 mg/L、组氨酸盐酸盐300 mg/L、异亮氨酸225 mg/L、亮氨酸300mg/L、赖氨酸盐酸盐575 mg/L、甲硫氨酸100 mg/L、苯丙氨酸150 mg/L、脯氨酸275 mg/L、丝氨酸325 mg/L、苏氨酸200 mg/L、色氨酸110 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐175 mg/L、缬氨酸250 mg/L。
维生素各组分终浓度如下：生物素0.19 mg/L、氯化胆碱49.5 mg/L、泛酸钙6.72mg/L、叶酸6.25 mg/L、烟酰胺6.06 mg/L、吡哆醇4 mg/L、核黄素1.2 mg/L、盐酸硫胺素5.4mg/L、维生素B12 2.4 mg/L、肌醇39.8 mg/L、硫辛酸1.1 mg/L。
微量元素各组分终浓度如下：七水硫酸锌1.7mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.02 mg/L、硫酸镍0.002 mg/L、偏硅酸钠0.05 mg/L、六水氯化铝0.001 mg/L。
无机盐各组分终浓度如下：氯化镁61 mg/L、硫酸镁69.76 mg/L、氯化钙116.6 mg/L、氯化钾467.7 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠1700 mg/L、磷酸二氢钠62.5 mg/L，磷酸氢二钠71.02 mg/L。
脂肪酸各组分终浓度如下：亚油酸0.126 mg/L、亚麻酸0.06 mg/L、β-甘油磷酸酯0.05 mg/L。
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖7000 mg/L、还原型谷胱甘肽1.5 mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.243 mg/L、乙醇胺12.5 mg/L、Kolliphor P 188 1500 mg/L、硫酸葡聚糖45 mg/L、盐酸甜菜碱3072 mg/L、氢化可的松0.036 mg/L。
实施例3
一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂肪酸、功能性化合物组成。
其中，氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸15 mg/L、丙氨酸5 mg/L、精氨酸盐酸盐275 mg/L、天冬酰胺150 mg/L、天冬氨酸130 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物35mg/L、谷氨酸10 mg/L、组氨酸盐酸盐100 mg/L、异亮氨酸100 mg/L、亮氨酸100 mg/L、赖氨酸盐酸盐150mg/L、甲硫氨酸50mg/L、苯丙氨酸50 mg/L、脯氨酸50 mg/L、丝氨酸100 mg/L、苏氨酸100 mg/L、色氨酸20 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐80 mg/L、缬氨酸50 mg/L。
维生素各组分终浓度如下：生物素0.035 mg/L、氯化胆碱8.98 mg/L、泛酸钙2.24mg/L、叶酸2.5 mg/L、烟酰胺2.02 mg/L、吡哆醇2 mg/L、核黄素0.219 mg/L、盐酸硫胺素2.17 mg/L、维生素B12 0.8 mg/L、肌醇12.6 mg/L、硫辛酸0.105 mg/L。
微量元素各组分终浓度如下：七水硫酸锌1.13 mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.02 mg/L、硫酸镍0.0011 mg/L、偏硅酸钠0.036 mg/L、六水氯化铝0.0003 mg/L。
无机盐各组分终浓度如下：氯化镁61 mg/L、硫酸镁69.76 mg/L、氯化钙116.6 mg/L、氯化钾311.8 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠2401 mg/L、磷酸二氢钠62.5 mg/L，磷酸氢二钠71.02 mg/L。
脂肪酸各组分终浓度如下：亚油酸0.042 mg/L、亚麻酸0.03 mg/L、β-甘油磷酸酯0.04 mg/L。
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖6000 mg/L、还原型谷胱甘肽1mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.081 mg/L、乙醇胺10 mg/L、Kolliphor P 188 1000 mg/L、硫酸葡聚糖25 mg/L、盐酸甜菜碱2036 mg/L、氢化可的松0.036 mg/L。
实施例4
一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂肪酸、功能性化合物组成。
其中，氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸66.25 mg/L、丙氨酸10.8 mg/L、精氨酸盐酸盐650 mg/L、天冬酰胺350 mg/L、天冬氨酸270 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物175 mg/L、谷氨酸150 mg/L、组氨酸盐酸盐130 mg/L、异亮氨酸212.5 mg/L、亮氨酸255 mg/L、赖氨酸盐酸盐465 mg/L、甲硫氨酸52.5 mg/L、苯丙氨酸80 mg/L、脯氨酸100 mg/L、丝氨酸165mg/L、苏氨酸165 mg/L、色氨酸52.5 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐165 mg/L、缬氨酸110 mg/L。
维生素各组分终浓度如下：生物素0. 35 mg/L、氯化胆碱20 mg/L、泛酸钙2.24mg/L、叶酸10 mg/L、烟酰胺6.06 mg/L、吡哆醇1 mg/L、核黄素0.219 mg/L、盐酸硫胺素2.17mg/L、维生素B12 4 mg/L、肌醇42.5 mg/L、硫辛酸0.525 mg/L。
微量元素各组分终浓度如下：七水硫酸锌2.26 mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.01 mg/L、硫酸镍0.00167 mg/L、偏硅酸钠0.08 mg/L、六水氯化铝0.001mg/L。
无机盐各组分终浓度如下：氯化镁122 mg/L、硫酸镁139.52 mg/L、氯化钙144 mg/L、氯化钾311.8 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠2448 mg/L、磷酸二氢钠62.5 mg/L，磷酸氢二钠71.02 mg/L。
脂肪酸各组分终浓度如下：亚油酸0.1 mg/L、亚麻酸0.2 mg/L、β-甘油磷酸酯0.04mg/L。
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖7000 mg/L、还原型谷胱甘肽1mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.5 mg/L、乙醇胺15 mg/L、Kolliphor P 188 1500 mg/L、硫酸葡聚糖25 mg/L、盐酸甜菜碱1700 mg/L、氢化可的松0.05 mg/L。
实施例5
一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂肪酸、功能性化合物组成。
其中，氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸50 mg/L、丙氨酸8.9 mg/L、精氨酸盐酸盐1209.3 mg/L、天冬酰胺250 mg/L、天冬氨酸130 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物182 mg/L、谷氨酸100 mg/L、组氨酸盐酸盐125 mg/L、异亮氨酸250 mg/L、亮氨酸250 mg/L、赖氨酸盐酸盐200 mg/L、甲硫氨酸75 mg/L、苯丙氨酸75 mg/L、脯氨酸100 mg/L、丝氨酸150mg/L、苏氨酸100 mg/L、色氨酸25 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐100 mg/L、缬氨酸100 mg/L。
维生素各组分终浓度如下：生物素0.7 mg/L、氯化胆碱15 mg/L、泛酸钙1.12 mg/L、叶酸5 mg/L、烟酰胺6.06 mg/L、吡哆醇4 mg/L、核黄素1.095 mg/L、盐酸硫胺素4.34 mg/L、维生素B12 0.08 mg/L、肌醇175 mg/L、硫辛酸0.105 mg/L。
微量元素各组分终浓度如下：七水硫酸锌0.57 mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.02 mg/L、硫酸镍0.0013 mg/L、偏硅酸钠0.075 mg/L、六水氯化铝0.0012mg/L。
无机盐各组分终浓度如下：氯化镁61 mg/L、硫酸镁69.76 mg/L、氯化钙47 mg/L、氯化钾400 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠2337 mg/L、磷酸氢二钠800 mg/L。
脂肪酸各组分终浓度如下：亚油酸0.05 mg/L、亚麻酸0.02 mg/L、β-甘油磷酸酯0.03 mg/L。
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖3150 mg/L、还原型谷胱甘肽1mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.08 mg/L、乙醇胺15 mg/L、Kolliphor P 188 1500 mg/L、硫酸葡聚糖25 mg/L、盐酸甜菜碱3072 mg/L、氢化可的松0.072 mg/L。
实验例一 培养基组分精简与关键组分替代
1.培养基添加组分Plackett-Burman筛选
本发明通过大量的实验与验证，确定了腐胺、维生素E、维生素C、还原型谷胱甘肽、核苷、磷酸二氢钾、微量元素混合物、表皮生长因子、乙醇胺、氢化可的松、脂类混合物等组分适宜的添加量范围，再针对每个组分分别设置低水平（-1）和高水平（+1），并以最高活细胞密度为响应值进行Plackett-Burman实验设计，评估结果见表1；
组分 评估系数 离差平方和 排名
Intercept 2.23
腐胺 0.11 0.15 2
维生素E -0.17 0.34 9
维生素C 0.022 5.63E-03 7
还原型谷胱甘肽 0.14 0.22 1
核苷 -0.064 0.05 8
磷酸二氢钾 0.036 0.016 6
微量元素混合物 -0.27 0.87 10
氢化可的松 0.058 0.041 4
乙醇胺 0.068 0.055 3
表皮生长因子 0.036 0.015 5
脂类混合物 -0.39 1.84 11
表1
由表1可知，还原型谷胱甘肽、腐胺、乙醇胺、氢化可的松对细胞生长有明显的促进作用，而表皮生长因子、维生素C、维生素E、磷酸二氢钾、微量元素混合物、核苷、脂类混合物等则无显著促进作用，可针对性进行精简去除；一方面可降低配方复杂性、降低原材料成本，另一方面能提升配方稳定性，利于后期的大规模生产。
另外，需要说明的是；
上述微量元素混合物包括且不仅限于硝酸银、溴化钾、氯化镉、氯化钴、氯化镉、氟化钠、碘化钾、氯化铷、二氧化锗、氧氯化锆、四氯化钛、硫酸锰、氯化锂、乙酸钡等；核苷主要包括胸苷、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷等；脂类混合物包括且不仅限于胆固醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈烯酸、花生四烯酸等。
2.关键组分的替代
称量适宜浓度的硫酸锌、柠檬酸铁铵、磷酸-L-酪氨酸二钠盐和L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物替代测试培养基的胰岛素、转铁蛋白、半胱氨酸和酪氨酸，配制成新的培养基，命名为替代培养基。将表达曲妥珠单抗的CHO-K1细胞以0.5×106cells/ml的密度分别接种至含10ml测试培养基和替代培养基的50ml Tubespin培养管中，置于5％CO2，37℃，190rpm的摇床中培养。每三天传代一次，连续传5代，传代前取样计数，监测活细胞密度和细胞活率，监测数据见图1和图2；传代接种密度始终为0.5×106 cells/ml。
组分替代实验结果显示，在连续五次传代的稳定性评估中，替代培养基表现出与测试培养基相当的细胞培养性能，在细胞倍增时间和活率方面均无显著性差异，即本发明所选的组分可完美替代胰岛素、转铁蛋白、酪氨酸和半胱氨酸；一方面可以实现真正意义上的无血清无蛋白培养基，另一方面也解决了配方中关键组分酪氨酸和半胱氨酸溶解性差、稳定性差的瓶颈问题。
实验例二效果例
1.细胞培养基的制备：
先将培养基各组分按照酸性、中性、碱性的理化特性进行分组，分别按1L用量称取实施例1-5所述终浓度的各组分，依次加入到800ml注射水中，待粉末完全溶解后调节用盐酸或氢氧化钠调节PH至6.9～7.3，0.22μm无菌膜过滤后，4℃长期保存备用，分别命名为培养基一、培养基二、培养基三、培养基四、培养基五。
2.细胞培养：
2.1取上述采用实施例1-5的组分制成的细胞培养基，与对照培养基dynamis，分别培养CHO-S细胞、CHO-DG44细胞、CHO-K1-GS-/-细胞。
2.2细胞基培养方法如下：将（表达阿瓦斯汀单抗的CHO-S细胞、表达融合蛋白Enbrel的CHO-DG44细胞、表达PD-1/TGFβ双抗的CHO-K1-GS-/-细胞）分别以0.5×106 cells/ml的密度接种至10ml的不同培养基的50ml Tubespin培养管中，置于5％CO2，37℃，190rpm的摇床中培养，稳定传代2代后按相同密度接种进行批次培养，每隔48小时取样计数。
注：所有实施例及对实验例、对比例中涉及的氨基酸均为L-氨基酸。
结果与分析
细胞培养基一至五和对照培养基dynamis培养CHO-K1细胞，每隔48小时取样计数，结果显示细胞培养至第6天达到密度峰值，培养基五表现最好，最高活细胞密度10.58×106 cells/ml，活率大于90％；如图3和图4。
培养基一至五和对照培养基dynamis培养CHO-DG44细胞，每隔48小时取样计数，结果显示细胞培养至第8天达到密度峰值，培养基四表现最好，最高活细胞密度9.12×106 cells/ml，活率大于90％；如图5和图6。
培养基一至五和对照培养基dynamis培养CHO-S细胞，每隔48小时取样计数，结果显示细胞培养至第6天达到密度峰值，培养基一表现最好，最高活细胞密度12.7×106cells/ml，活率大于90％；如图7和图8。
培养基一至五和对照培养基dynamis培养CHO-K1-GS-/-细胞，每隔48小时取样计数，结果显示细胞培养至第6天达到密度峰值，培养基一表现最好，最高活细胞密度10.7×106 cells/ml，活率大于90％；如图9和图10。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；所述培养基由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂肪酸、功能性化合物组成；
所述氨基酸为L-氨基酸，各组分具体如下：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸盐酸盐、天冬酰胺、天冬氨酸、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物、谷氨酸、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、磷酸-L-酪氨酸二钠盐、缬氨酸。
2.根据权利要求1所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；所述功能性化合物组分具体如下：葡萄糖、还原型谷胱甘肽、丙酮酸钠、腐胺、乙醇胺、Kolliphor P 188、硫酸葡聚糖、盐酸甜菜碱、氢化可的松。
3.根据权利要求2所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；
所述维生素各组分具体如下：生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇、硫辛酸；
所述微量元素各组分具体如下：七水硫酸锌、五水硫酸铜、柠檬酸铁铵、亚硒酸钠、硫酸镍、偏硅酸钠、六水氯化铝；
所述无机盐各组分具体如下：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钠，磷酸氢二钠；
所述脂肪酸各组分具体如下：亚油酸、亚麻酸、胆固醇、β-甘油磷酸酯。
4.根据权利要求3所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；所述氨基酸各组分终浓度如下：甘氨酸15-150 mg/L、丙氨酸5-100 mg/L、精氨酸盐酸盐100-1000 mg/L、天冬酰胺50-1000 mg/L、天冬氨酸50-800 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物20-500mg/L、谷氨酸10-150 mg/L、组氨酸盐酸盐100-1500 mg/L、异亮氨酸100-800 mg/L、亮氨酸100-800 mg/L、赖氨酸盐酸盐100-1000 mg/L、甲硫氨酸20-200 mg/L、苯丙氨酸30-300 mg/L、脯氨酸25-500 mg/L、丝氨酸75-750 mg/L、苏氨酸50-500 mg/L、色氨酸20-300 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐60-600 mg/L、缬氨酸30-500 mg/L；
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖4000-9000mg/L、还原型谷胱甘肽0.5-5mg/L、丙酮酸钠50-400 mg/L、腐胺0.08-1 mg/L、乙醇胺2-20 mg/L、Kolliphor P 188 500-2000 mg/L、硫酸葡聚糖20-100 mg/L、盐酸甜菜碱1000-4000 mg/L、氢化可的松0.02-0.4mg/L。
5.根据权利要求3所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；
维生素各组分终浓度分别为：生物素0.0035-0.35mg/L、氯化胆碱5-100 mg/L、泛酸钙2-20 mg/L、叶酸2-20 mg/L、烟酰胺2-20 mg/L、吡哆醇1-10 mg/L、核黄素0.2-5 mg/L、盐酸硫胺素1-10 mg/L、维生素B12 0.05-10 mg/L、肌醇10-100 mg/L、硫辛酸0.1-5 mg/L；
微量元素各组分终浓度分别为：七水硫酸锌0.2-5mg/L、五水硫酸铜0.0013-0.13 mg/L、柠檬酸铁铵0.5-50 mg/L、亚硒酸钠0.005-0.045 mg/L、硫酸镍0.0001-0.005 mg/L、偏硅酸钠0.005-0.5 mg/L、六水氯化铝0.0003-0.005 mg/L；
无机盐各组分终浓度分别为：氯化镁20-150 mg/L、硫酸镁20-150 mg/L、氯化钙60-200mg/L、氯化钾300-800 mg/L、碳酸氢钠1200-4000 mg/L、氯化钠1000-6000 mg/L、磷酸二氢钠50-200 mg/L，磷酸氢二钠50-250 mg/L；
脂肪酸各组分终浓度分别为：亚油酸0.02-2 mg/L、亚麻酸0.02-1 mg/L、β-甘油磷酸酯0.02-2 mg/L。
6.根据权利要求5所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；所述氨基酸各组分终浓度分别为：甘氨酸15-150 mg/L、丙氨酸5-30 mg/L、精氨酸盐酸盐200-800 mg/L、天冬酰胺150-1000 mg/L、天冬氨酸100-800 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物20-300 mg/L、谷氨酸10-75 mg/L、组氨酸盐酸盐300-1500 mg/L、异亮氨酸100-600 mg/L、亮氨酸100-500 mg/L、赖氨酸盐酸盐100-1000 mg/L、甲硫氨酸50-150 mg/L、苯丙氨酸30-250mg/L、脯氨酸50-400 mg/L、丝氨酸100-550 mg/L、苏氨酸100-300 mg/L、色氨酸20-200 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐100-400 mg/L、缬氨酸50-450 mg/L；
维生素各组分终浓度分别为：生物素0.0035-0.35mg/L、氯化胆碱8-99 mg/L、泛酸钙2-10mg/L、叶酸2-10 mg/L、烟酰胺2-10 mg/L、吡哆醇2-10 mg/L、核黄素0.2-2.5 mg/L、盐酸硫胺素2-10 mg/L、维生素B12 0.5-5mg/L、肌醇10-80 mg/L、硫辛酸0.1-2.5 mg/L；
微量元素各组分终浓度分别为：七水硫酸锌0.5-3mg/L、五水硫酸铜0.013-0.13 mg/L、柠檬酸铁铵10-50 mg/L、亚硒酸钠0.01-0.04 mg/L、硫酸镍0.0005-0.005 mg/L、偏硅酸钠0.01-0.5 mg/L、六水氯化铝0.0005-0.005 mg/L；
无机盐各组分终浓度分别为：氯化镁50-150 mg/L、硫酸镁50-150 mg/L、氯化钙100-200 mg/L、氯化钾300-650mg/L、碳酸氢钠1200-3700 mg/L、氯化钠1500-5000 mg/L、磷酸二氢钠50-150 mg/L，磷酸氢二钠50-150 mg/L；
脂肪酸各组分终浓度分别为：亚油酸0.02-1 mg/L、亚麻酸0.02-0.5 mg/L、β-甘油磷酸酯0.02-1 mg/L；
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖4500-8000mg/L、还原型谷胱甘肽0.5-2.5mg/L、丙酮酸钠50-250 mg/L、腐胺0.08-0.8 mg/L、乙醇胺5-20 mg/L、Kolliphor P 1881000-2000 mg/L、硫酸葡聚糖25-100 mg/L、盐酸甜菜碱1000-3000 mg/L、氢化可的松0.02-0.2 mg/L。
7.根据权利要求6所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于；所述氨基酸各组分终浓度为：甘氨酸65 mg/L、丙氨酸10.8 mg/L、精氨酸盐酸盐438.5 mg/L、天冬酰胺170mg/L、天冬氨酸133 mg/L、L-半胱氨酸S-硫酸钠钠倍半水合物25 mg/L、谷氨酸48.9 mg/L、组氨酸盐酸盐1400.5 mg/L、异亮氨酸118.8 mg/L、亮氨酸190 mg/L、赖氨酸盐酸盐135.4mg/L、甲硫氨酸66.7 mg/L、苯丙氨酸30 mg/L、脯氨酸54.6 mg/L、丝氨酸304 mg/L、苏氨酸187 mg/L、色氨酸20 mg/L、磷酸-L-酪氨酸二钠盐184.5 mg/L、缬氨酸52.9 mg/L；
维生素各组分终浓度分别为：生物素0.0035 mg/L、氯化胆碱8.98 mg/L、泛酸钙2.24mg/L、叶酸2.5 mg/L、烟酰胺2.02 mg/L、吡哆醇2 mg/L、核黄素0.219 mg/L、盐酸硫胺素2.17 mg/L、维生素B12 4 mg/L、肌醇12.6 mg/L、硫辛酸0.105 mg/L；
微量元素各组分终浓度分别为：七水硫酸锌1.13 mg/L、五水硫酸铜0.013 mg/L、柠檬酸铁铵16 mg/L、亚硒酸钠0.02 mg/L、硫酸镍0.00167 mg/L、偏硅酸钠0.047 mg/L、六水氯化铝0.0007 mg/L；
无机盐各组分终浓度分别为：氯化镁61 mg/L、硫酸镁69.76 mg/L、氯化钙116.6 mg/L、氯化钾311.8 mg/L、碳酸氢钠2438 mg/L、氯化钠2000 mg/L、磷酸二氢钠62.5 mg/L，磷酸氢二钠71.02 mg/L；
脂肪酸各组分终浓度分别为：亚油酸0.04 mg/L、亚麻酸0.02 mg/L、β-甘油磷酸酯0.02mg/L；
功能性化合物各组分终浓度分别为：葡萄糖7000 mg/L、还原型谷胱甘肽1mg/L、丙酮酸钠110 mg/L、腐胺0.405 mg/L、乙醇胺10 mg/L、Kolliphor P 188 1500 mg/L、硫酸葡聚糖50 mg/L、盐酸甜菜碱1200 mg/L、氢化可的松0.036 mg/L。
8.如权利要求1-7任意一项所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基的用途，其特征在于；所述CHO细胞无血清无蛋白培养基用于CHO细胞的培养。
9.根据权利要求8所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基的用途，其特征在于；所述CHO细胞为CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1-GS-/-中的任意一种。
10.如权利要求8所述一种CHO细胞无血清无蛋白培养基的用途，其特征在于；所述CHO细胞无血清无蛋白培养基培养的CHO细胞，可用于单抗、双抗、融合蛋白、重组蛋白类生物药的制备。
CN202110385870.5A 2021-04-11 2021-04-11 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途 Active CN112795531B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110385870.5A CN112795531B (zh) 2021-04-11 2021-04-11 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110385870.5A CN112795531B (zh) 2021-04-11 2021-04-11 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112795531A true CN112795531A (zh) 2021-05-14
CN112795531B CN112795531B (zh) 2021-08-06

Family

ID=75816716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110385870.5A Active CN112795531B (zh) 2021-04-11 2021-04-11 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112795531B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113846051A (zh) * 2021-09-28 2021-12-28 无锡多宁生物科技有限公司 一种通用型化学成分限定cho细胞传代培养基及其应用
CN115029296A (zh) * 2022-05-31 2022-09-09 常州大学 一种快速自崩解无菌培养基及其制备方法
CN115305208A (zh) * 2022-09-16 2022-11-08 苏州星寰生物科技有限公司 一种米根霉固态发酵培养基及其制备方法
FR3124706A1 (fr) * 2021-06-30 2023-01-06 L'oreal Composition comprenant au moins une alcanolamine, un (méta)silicate, la glycine et un acide gras.
CN116478903A (zh) * 2023-05-08 2023-07-25 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种昆虫细胞无血清培养基及其应用
CN116515737A (zh) * 2023-06-28 2023-08-01 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种hek293细胞和cho细胞通用培养基及应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8198084B2 (en) * 1996-08-30 2012-06-12 Life Technologies Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
CN104073463A (zh) * 2013-03-29 2014-10-01 上海中信国健药业股份有限公司 一种支持cho高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基
CN104212768A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 中国科学院大连化学物理研究所 用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法
WO2015055324A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Ares Trading S.A New medium for high performance mammalian fed-batch cultures
CN105779375A (zh) * 2014-12-26 2016-07-20 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种新型无血清培养基
CN107567495A (zh) * 2014-12-22 2018-01-09 建新公司 培养哺乳动物细胞的方法
CN111019883A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 依科赛生物科技（太仓）有限公司 Cho细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途
CN111996161A (zh) * 2020-09-08 2020-11-27 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8198084B2 (en) * 1996-08-30 2012-06-12 Life Technologies Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
CN104073463A (zh) * 2013-03-29 2014-10-01 上海中信国健药业股份有限公司 一种支持cho高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基
WO2015055324A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Ares Trading S.A New medium for high performance mammalian fed-batch cultures
CN104212768A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 中国科学院大连化学物理研究所 用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法
CN107567495A (zh) * 2014-12-22 2018-01-09 建新公司 培养哺乳动物细胞的方法
CN105779375A (zh) * 2014-12-26 2016-07-20 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种新型无血清培养基
CN111019883A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 依科赛生物科技（太仓）有限公司 Cho细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途
CN111996161A (zh) * 2020-09-08 2020-11-27 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张大鹤等: "适于重组CHO细胞培养的无血清培养基的制备", 《中国生物制品学杂志》 *
郑立恒等: "CHO细胞无血清培养研究", 《四川生理科学杂志》 *
默克公司: "http://www.sinospectroscopy.org.cn/readnews.php?nid=81348", 《光谱网》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3124706A1 (fr) * 2021-06-30 2023-01-06 L'oreal Composition comprenant au moins une alcanolamine, un (méta)silicate, la glycine et un acide gras.
CN113846051A (zh) * 2021-09-28 2021-12-28 无锡多宁生物科技有限公司 一种通用型化学成分限定cho细胞传代培养基及其应用
CN113846051B (zh) * 2021-09-28 2023-12-01 无锡多宁生物科技有限公司 一种通用型化学成分限定cho细胞传代培养基及其应用
CN115029296A (zh) * 2022-05-31 2022-09-09 常州大学 一种快速自崩解无菌培养基及其制备方法
CN115305208A (zh) * 2022-09-16 2022-11-08 苏州星寰生物科技有限公司 一种米根霉固态发酵培养基及其制备方法
CN116478903A (zh) * 2023-05-08 2023-07-25 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种昆虫细胞无血清培养基及其应用
CN116478903B (zh) * 2023-05-08 2023-10-24 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种昆虫细胞无血清培养基及其应用
CN116515737A (zh) * 2023-06-28 2023-08-01 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种hek293细胞和cho细胞通用培养基及应用
CN116515737B (zh) * 2023-06-28 2023-09-22 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种hek293细胞和cho细胞通用培养基及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112795531B (zh) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112795531B (zh) 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途
US5122469A (en) Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
CN100362098C (zh) 适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基
USRE39792E1 (en) Method for culturing Chinese hamster ovary cells
Eagle The specific amino acid requirements of a human carcinoma cell (strain HeLa) in tissue culture
AU632065B2 (en) Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
EP0610474B1 (en) Animal cell culture
JP6113653B2 (ja) 改良型細胞培養培地
US20200172606A1 (en) Methods of replicating a large scale eculizumab production cell culture
CN110343666B (zh) 一种cho细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用
CN1962857A (zh) 一种哺乳动物细胞无血清培养基
CN113088480B (zh) 一种用于cho细胞的培养基及其用途
CN106190950A (zh) 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其制备方法
CN108925137A (zh) 细胞培养基
CN111996161B (zh) 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途
EP0659880B1 (en) Medium for culturing animal cells or antibody-producing cells
CN105861415A (zh) 用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基及其应用
CN112442486B (zh) 一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用
CN113913368A (zh) 适合cho细胞大规模悬浮扩增培养的无血清培养基及其制备和应用
CN112322577A (zh) 一种用于cho细胞大规模培养的无血清培养基及应用
CN110835622B (zh) 用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用
JP6108170B2 (ja) 細胞培養用培地
Spens et al. Defined protein‐free NS0 myeloma cell cultures: Stimulation of proliferation by conditioned medium factors
CN114621909A (zh) 用于快速表达蛋白质的培养基及其应用
CN116515737B (zh) 一种hek293细胞和cho细胞通用培养基及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 215434 No. 66, Anjiang Road, Fuqiao Town, Taicang City, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: EXCELL BIOLOGY (TAICANG) CO.,LTD.

Address before: 215434 Room 101 and 102, building 4, No. 52, Yingang Road, taicanggang economic and Technological Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: EXCELL BIOLOGY (TAICANG) CO.,LTD.

CP02 Change in the address of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 215434 No. 66, Anjiang Road, Fuqiao Town, Taicang City, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: Suzhou Ecosai Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 215434 No. 66, Anjiang Road, Fuqiao Town, Taicang City, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: EXCELL BIOLOGY (TAICANG) CO.,LTD.

CP01 Change in the name or title of a patent holder