CN104212768A - 用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法 - Google Patents
用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法。该培养基以DMEM/F12为基础培养基，针对微囊化细胞培养特点，加入成分明确的小分子物质铁盐、锌盐、亚硒酸钠、乙酸钠、谷氨酰胺、葡萄糖。本发明培养基不影响微胶囊的稳定性，不存在传统无血清培养基中的胰岛素和转铁蛋白，减少了下游工艺和成本，并且产物表达接近价格昂贵的特定培养基培养水平，而价格不到后者十分之一。说明本发明的无蛋白培养基可以用于微囊化重组CHO细胞的培养和蛋白表达，并大幅降低培养成本。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)细胞培养的无蛋白培养基和相应的培养方法。
背景技术
微囊化细胞培养1964年由Chang TMS(文献1.Chang TMS,1964.Semipermeablemicrocapsules.Science 146,524-525)最先提出，是一种应用广泛的培养技术，已开始用于细胞大规模培养、重组蛋白生产等领域。微胶囊可以调高细胞对物理和化学环境所造成的胁迫耐受性，实现细胞的高密度培养(文献2，Rokstad AM,2002.Microencapsulation of cells producingtherapeutic proteins:Optimizing cell growth and secretion.Cell Transplant 11:313-324)，显著提高产物表达(文献3.Zhang Y，2008.Optimization of microencapsulated recombinant CHO cellgrowth,endostatin production,and stability of microcapsule in vivo.J Biomed Mater Res B ApplBiomater.84(1):79-88)。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种成纤维细胞，也是哺乳动物细胞生产重组蛋白的主要细胞系，具有准确的转录后修饰功能和重组基因的高效扩增和表达能力，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子。现在已经有多种重组蛋白药物在CHO细胞中得到高效表达并投入市场，例如促红细胞生成素(Erythropoietin)，依那西普(Enbrel)。因此，采用微囊化CHO细胞生产重组蛋白具有广阔的应用前景。
传统的微囊化培养重组CHO培养基中含有血清，通常是在DMEM/F12基础培养基中添加5-10％的小牛血清或胎牛血清。血清为细胞生长提供营养成分，并且提供了细胞增殖必须的生长因子，促使细胞DNA的合成，促进细胞增殖。但是，哺乳动物的血清不仅价格昂贵不适于大规模工业化生产，并且作为动物来源的补加物存在很多问题。无血清培养基要求找到适当的具有血清功能的因子，如胰岛素、转铁蛋白几乎是所有细胞株在无血清培养时需要的必需补充因子。但生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的。如Gibco公司生产的无蛋白培养基CD OptiCHO价格昂贵，每升1000元，用于培养重组CHO细胞时占据生产的大部分成本。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种适于微囊化培养重组CHO细胞培养和重组蛋白表达的无蛋白细胞培养基。本发明需要解决的问题是提供一种低成本的可用于重组中国仓鼠卵巢细胞微囊化培养的无蛋白培养基来有效生产重组蛋白。
本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现的：
用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于所述无蛋白培养基是在基础培养基中加入无机盐类、小分子营养物质和调控细胞生长的小分子物质，所述培养基中无蛋白成分。
如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋白培养基含有DMEM/F12培养基和铁盐及锌盐。
如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋白培养基中无机盐类是铁盐柠檬酸铁。
如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋白培养基中无机盐类是锌盐硫酸锌。
如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋白培养基添加的小分子营养物质是葡萄糖和谷氨酰胺。
如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋白培养基中含有调控细胞生长的小分子物质是乙酸钠和亚硒酸钠。
如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋白培养基中含有DMEM/F12培养基和以下基本成分：
本发明同时提供了所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基在制备根据聚电解质络合原理制备的含有重组CHO细胞的生物微胶囊，以及微囊化重组CHO细胞培养中的应用，其中所述微胶囊为海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠APA微胶囊。
还提供了所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基在制备APA微囊化重组CHO细胞中的应用：将适量细胞悬于无菌的海藻酸钠溶液，利用微囊制备仪将细胞悬液滴入CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络合反应形成微胶囊膜，成膜后的海藻酸钙凝胶珠用柠檬酸钠溶液液化微囊内的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊，用生理盐水洗去微胶囊和细胞碎屑，制备出微囊化重组CHO细胞；微囊化重组CHO细胞在37℃，5％CO2培养箱，在本发明的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
如所述的应用，是将适量细胞悬于无菌的1.5％(w/v)海藻酸钠溶液，细胞密度为2×106/ml，利用微囊制备仪将细胞悬液滴入1.1％(w/v)CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络合反应形成微胶囊膜，成膜后的海藻酸钙凝胶珠用55mmol/l的柠檬酸钠溶液液化微囊内的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊，用生理盐水洗去微胶囊和细胞碎屑，制备出实验所需的微囊化重组CHO细胞；微囊化细胞在37℃，5％CO2培养箱，在本发明的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
本发明的一种适用于培养微囊化重组CHO细胞的无蛋白培养基组成中：
硫酸锌：锌元素可以替代胰岛素刺激细胞对葡萄糖的吸收，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡。
柠檬酸铁：铁离子螯合物可以替代转铁蛋白作用，转铁蛋白能将铁离子运输至细胞内，与细胞生长密切相关，在细胞培养中起着关键作用。
谷氨酰胺：是细胞合成核酸和蛋白质的氮源，同时也是细胞的能源及碳源，随着细胞生长的不同阶段，对谷氨酰胺的需求量也不同，需要根据要求调整添加浓度。
葡萄糖：是细胞主要的能量来源，根据细胞生长阶段进行添加。
乙酸钠：对细胞生长有轻微抑制作用，同时能够提高蛋白在重组细胞中的表达，可以在细胞培养过程中添加至培养基，特别是在指数期加入到生长培养基中。
亚硒酸钠：硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害，显著支持细胞生长。
所述无蛋白培养基适于根据聚电解质络合原理制备的含有重组CHO细胞的生物微胶囊，适于微囊化重组CHO细胞的培养。所述微胶囊为海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
本发明培养基添加成分均为成分明确的小分子物质，易于透过微囊膜被细胞吸收利用。无蛋白成分，避免了胰岛素和转铁蛋白等来源于动物的的蛋白存在的潜在污染，同时减少了微囊化细胞表达蛋白的下游分离纯化难度和成本。添加的小分子物质对微囊膜无明显不利影响，不影响微囊的稳定性。价格低廉，如表达DSPA蛋白的重组CHO细胞特定需要在Gibco公司的CD OptiCHO培养基中生长，后者的价格为每升1000元，本发明培养基成本每升不到100元。
本发明培养基可以替代价格昂贵的培养基，提供一种适用于培养并表达重组蛋白的微囊化中国仓鼠卵巢细胞的方法，价格低廉，操作简便，具有重要的商业价值及应用前景。
附图说明
图1为本发明的无蛋白培养基中微胶囊的显微镜图片，显示无蛋白培养基对微胶囊稳定性无影响。
图2为本发明的无蛋白培养基中微囊化重组CHO细胞的显微镜图片。
图3为本发明实施例1与对照例(Gibco公司，CD OptiCHO培养基)的DSPA表达量对比。
具体实施方式
无蛋白培养基一般由两部分组成，即基础培养基和替代血清的补充因子。基础培养基的成分是完全已知的，在对不同的细胞株进行培养时加入替代血清的因子，如柠檬酸铁、硫酸锌、亚硒酸钠等，可更好的符合细胞株生长需求及提高目的蛋白的表达量。这种方法开发周期短，方法简单，是目前大多数无血清培养基研制采用的方法。为了解决细胞在无蛋白培养基中生长的问题，本发明提供的培养基在DMEM-F12培养基基础上添加了硫酸锌、柠檬酸铁、谷氨酰胺、乙酸钠、葡萄糖、亚硒酸钠，调整基础培养基成分适应重组CHO细胞的生长及蛋白表达需求。
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
1、配置用于微囊化重组CHO细胞的无蛋白培养基：
本发明的培养基由两部分组成：DMEM/F12培养基(购自Sigma公司，成分见表1)和以下成分：
表1 DMEM/F12培养基成分
以上所有物质均为分析纯化学试剂，用终体积90％超纯水溶解，充分搅拌半小时后，定容至所需终体积并保持10分钟。
除菌过滤，按平板过滤器标准操作进行。
2、微囊化重组CHO细胞的制备：
参照文献(文献4.Ma X J,1994.Generation of alginate-poly-Lysine alginate(APA)biomicrocapsules:the relationship between the membrane strength and the reaction conditions.ArtCells Blood Subs and Immob Biotech,22(1):43-69)制备APA微囊化重组CHO细胞。将适量细胞悬于无菌的1.5％(w/v)海藻酸钠溶液，细胞密度为2×106/ml,利用微囊制备仪将细胞悬液滴入1.1％(w/v)CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络合反应形成微胶囊膜。成膜后的海藻酸钙凝胶珠用55mmol/l的柠檬酸钠溶液液化微囊内的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊。用生理盐水洗去微胶囊和细胞碎屑，制备出实验所需的微囊化重组CHO细胞。
微囊化细胞在37℃，5％CO2培养箱，在本实施例上述步骤1所制备的培养基中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
实施例2
1、配制用于微囊化重组CHO细胞的无蛋白培养基：
本发明的培养基由两部分组成：DMEM/F12培养基(购自Sigma公司，成分见表1)和以下成分：
2、微囊化重组CHO细胞的制备(同实施例1)：
微囊化细胞在37℃，5％CO2培养箱，在本实施例上述步骤1所制备的培养基中中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
实施例3
1、配置用于微囊化重组CHO细胞的无蛋白培养基：
本发明的培养基由两部分组成：DMEM/F12培养基(购自Sigma公司，成分见表1)和以下成分：
2、空微胶囊的制备(不加细胞，其余同实施例1)：
微胶囊在37℃，5％CO2培养箱，在本实施例上述步骤1所制备的培养基中培养7天观察微胶囊稳定性。
对比例：
采用与实施例1相同的培养方法，使用培养基为Gibco公司的CD OptiCHO培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养7天，取上清测定DSPA表达量。
由实施例1和对比例培养的微囊化重组CHO细胞表达的DSPA产量对比发现，二者相差不大，考虑到价格成本，本发明的无蛋白培养基可以替代价格昂贵的CD OptiCHO培养基来进行微囊化重组CHO细胞培养和重组蛋白表达。
Claims (10)
1.用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基是在基础培养基中加入无机盐类、小分子营养物质和调控细胞生长的小分子物质，所述培养基中无蛋白成分。
2.如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基含有DMEM/F12培养基和铁盐及锌盐。
3.如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基中无机盐类是铁盐柠檬酸铁。
4.如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基中无机盐类是锌盐硫酸锌。
5.如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基添加的小分子营养物质是葡萄糖和谷氨酰胺。
6.如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基中含有调控细胞生长的小分子物质是乙酸钠和亚硒酸钠。
7.如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白培养基中含有DMEM/F12培养基和以下基本成分：
8.权利要求1-7中所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基在制备根据聚电解质络合原理制备的含有重组CHO细胞的生物微胶囊，以及微囊化重组CHO细胞培养中的应用，其中所述微胶囊为海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠APA微胶囊。
9.权利要求1-7中所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基在制备APA微囊化重组CHO细胞中的应用，其特征在于：将适量细胞悬于无菌的海藻酸钠溶液，利用微囊制备仪将细胞悬液滴入CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络合反应形成微胶囊膜，成膜后的海藻酸钙凝胶珠用柠檬酸钠溶液液化微囊内的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊，用生理盐水洗去微胶囊和细胞碎屑，制备出微囊化重组CHO细胞；微囊化重组CHO细胞在37℃，5％CO2培养箱，在本发明的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：将适量细胞悬于无菌的1.5％(w/v)海藻酸钠溶液，细胞密度为2×106/ml，利用微囊制备仪将细胞悬液滴入1.1％(w/v)CaCl2溶液形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络合反应形成微胶囊膜，成膜后的海藻酸钙凝胶珠用55mmol/l的柠檬酸钠溶液液化微囊内的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊，用生理盐水洗去微胶囊和细胞碎屑，制备出实验所需的微囊化重组CHO细胞；微囊化细胞在37℃，5％CO2培养箱，在本发明的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
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