WO1995002039A1 - Stromale zellinien aus menschlichem knochenmark - Google Patents

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Karin Thalmeier
Peter Dörmer
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Gsf - Forschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit, Gmbh
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    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the invention relates to stromal cell lines according to the preamble of patent claim 1.
  • Human bone marrow can be cultivated in vitro for a maximum of 20 weeks. It depends on the function of feeder cells, which are also obtained from the bone marrow. The interaction between bone marrow cells and feeder cells is largely unexplored, but it is very likely the key to successful long-term cultivation. Both the extraction and the analysis of primary feeder cells from bone marrow represent a considerable technical problem, because these cells
  • the DNA is known from Singer JW, Charbord P, Keating A, Nemunitis J, Raugi G, Wight TN, Lopez JA, Roth GJ, Dow LW, Fialkow PJ: Blood 70: 464-474, 1987 of a wild type SV-40 virus by infection into the cellular genome of the bone marrow cells.
  • no permanent cell lines can be derived from the cells modified in this way.
  • the object of the invention is to cell lines of the e. G. Provide species, whereby spontaneous changes in the cell lines due to virus production are excluded.
  • their growth must be arrested and at the same time remain attached to the cell culture dish.
  • SV-40-imalized lines described so far detach themselves from their base after irradiation, while the claimed cell lines both cease to grow and remain adherent;
  • Feeder cells for hemopoietic progenitor cells control their growth and differentiation u. a. through the production of growth factors.
  • the claimed cell lines are able to produce large amounts of these growth factors, the factor production being able to be influenced both by radiation and by stimulation with interleukin 1.
  • FIGS. 1 and 2 show the clone charts of the SV-40 plasmid vectors used.
  • vectors which contain at least the Simian Virus 40 viral DNA sequences which code for the T antigen and for which the origin of replication of the SV-40 virus is defective can also be used. Such vectors are also suitable, in which the late genes of the SV-40 virus which code for the coat proteins are additionally deleted.
  • Primary adherent cells from human bone marrow were transfected using such an SV-40 plasmid vector. The transfection was carried out with liposomes. The DNA transfected in the course of lipofection reaches the cell nucleus of the bone marrow cells and integrates there into the chromosomal DNA. The integration point of the vector is not predictable here, so it happens randomly.
  • the expression of the SV-40 T antigen integrated into the cellular genome brings about an immunization of these cells.
  • the lines established in this way are immortalized, show very short doubling times and form a homogeneous cell population.
  • Fig. 1 shows a used transfection vector (pSV IN-1), as it from Cohen et al., 1984 J. Virol. 51 p.91-96 is known.
  • FIG. 2 shows a second vector that can be derived therefrom (pUC IN-1 wt).
  • SV40 DNA was cut from pSVIN-1 at the Bam / Pst interfaces and the nucleotide sequences of bp 1988-2533 were removed. Then the deleted SV40 DNA was cloned into pUC 12 Bam / Pst interface.
  • the vectors pUC 12 and pBR 322 used as well as the viral DNA sequences of the Simian Virus 40 are commercially available.
  • the procedure for transfecting the bone marrow cells was as follows:
  • Bone marrow cells were enriched for 2 to 3 weeks in long-term culture medium [McCoy's 5a with 12.5% fetal calf serum, 12.5% horse serum, 1% sodium bicarbonate, 1% MEM non-essential amino acid solution, 1% L-glutamine (200 mM) , 1% penicillin / streptomycin solution - all solutions from Gibco - 10 "M ⁇ -thiogloycerol, 10 ⁇ 6 M hydrocortisone] grown (5% C0 2 ; 37 ° C) until the stromal layer was subconfluent.
  • the adherent stromal cells were detached by trypsin treatment and plated in 25 cm 2 culture bottles with a cell density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the transfection was carried out with cesium chloride-purified plasmid DNA [pSV-INl and pUCIN-lwt].
  • the transfection was carried out as follows according to the transfection protocol from Serva [IBF instruction sheet No. 2942 10].
  • the semi-confluent cells were washed once with PBS, once with McCoy's 5a medium and incubated for five to 18 hours with a freshly prepared plas id / transfectam mixture in 8 ml long-term culture medium in 25 cm 2 culture bottles. After the transfection, the cells were washed twice with PBS / 10% FCS and cultivated in LTC medium until they were confluent. The transfected cells were selected by repeatedly passing the stromal layer in a 1: 2 ratio. After approx. 25 - 30 passages, the immortalized cells reached a so-called growth crisis. This crisis was overcome by removing cells that were dividing very slowly or not at all from their base by trypsin treatment and transferring them to a new culture bottle. Cells treated in this way spontaneously recovered from the crisis and showed an immortalized phenotype.
  • the culture with the registration number DSM ACC2055 has the internal number L87 / 4 and the culture with the registration number DSM ACC2056 has the internal number L88 / 5.
  • the stored stromal cell lines L87 / 4 and L88 / 5 differ in the following properties: Expression of the T antigen:
  • G-CSF and IL-6 can be induced in both cell lines by radiation.
  • the stromal cell lines L87 / 4 and L88 / 5 can be used for all experiments in which cells are to be grown that grow as a function of a feeder layer. These are all hemopoietic progenitor or stem cells as progenitor cells for bone formation (osteoclasts). Positive experimental results are already available for the growth of feeder-dependent B tumor cells (BL70) on line L88 / 5 and line L87 / 4.
  • BL70 feeder-dependent B tumor cells
  • lines L87 / 4 and L88 / 5 can also be used for the analysis of malignant concha marrow cells from leukemia patients (CML, AML, ALL) under the influence of medication, which is particularly important with regard to autologous bone marrow transplantation ⁇ interpretation.
  • Experimental fluctuations that previously occurred due to the use of primary feeder cells from different subjects can be excluded.
  • the L87 / 4 and L88 / 5 lines can be used as producer lines for a number of growth factors. gates can be used.
  • COS cells can also be used as an expression cell line for genes cloned in vectors which replicate under the control of the large T-Ag of SV40.
  • COS cells may be mentioned here as an example.

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Abstract

Die Erfindung betrifft stromale Zellinien aus menschlichem Knochenmark, welche in ihrem Genom virale DNA Sequenzen des Simian Virus 40 (SV 40) enthalten. Aufgabe der Erfindung ist es, Zellinien bereitzustellen, wobei spontane Veränderungen der Zellinien durch Virusproduktion ausgeschlossen sind. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß der Replikationsursprung des SV-40-Virus defekt ist.

Description

Stromale Zellinien aus menschlichem Knochenmark
Die Erfindung betrifft stromale Zellinien nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
Menschliches Knochenmark kann in vitro maximal 20 Wochen kul¬ tiviert werden. Es ist dabei auf die Funktion von Feederzellen angewiesen, die gleichfalls aus dem Knochenmark gewonnen wer¬ den. Die Interaktion zwischen Knochenmarkzellen und Feederzel¬ len ist weitgehend unerforscht, stellt aber mit großer Wahr¬ scheinlichkeit den Schlüssel zu einer erfolgreichen Langzeit¬ kultivierung dar. Sowohl die Gewinnung als auch die Analyse primärer Feederzellen aus Knochenmark stellt hierbei ein be¬ trächtliches technisches Problem dar, da diese Zellen
- aufgrund ihrer langen Verdoppelungszeit und des folglich extrem langsamen Wachstums nur in begrenzter Menge zur Ver¬ fügung stehen;
aufgrund ihrer begrenzten Lebensdauer (Zelltod nach ca. 30 Zellteilungen) für Langzeitversuche und Versuchsreihen un¬ tauglich sind;
- ein Gemisch aus unterschiedlichen Zelltypen darstellen, so daß eine Einzelkomponentenanalyse nicht durchgeführt werden kann;
- keine Kontaktinhibition zeigen, also zum Wachstumsarrest bestrahlt werden müssen.
Aus Harigaya K, Hiroshi H: Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82: 3477 - 3480, 1985 ist bekannt die Transfektion von menschli¬ chen Knochenmarkzellen mit einem Replikationskompetenten SV-40 Konstrukt mit Hilfe der Ca-Phosphat-Präzipitation durchzufüh¬ ren.
Wegen des intakten Replikationsursprungs und der intakten spä¬ ten Gene besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit störender spontaner Virusproduktion.
Des weiteren ist aus Singer JW, Charbord P, Keating A, Nemu- naitis J, Raugi G, Wight TN, Lopez JA, Roth GJ, Dow LW, Fial- kow PJ: Blood 70: 464 - 474, 1987, bekannt die DNA eines Wild¬ typ SV-40-Virus durch Infektion in das Zelluläre Genom der Knochenmarkzellen einzuschleusen. Aus den so veränderten Zel¬ len lassen sich jedoch keine permanenten Zellinien ableiten.
Aufgabe der Erfindung ist es, Zellinien der e. g. Art bereit¬ zustellen, wobei spontane Veränderungen der Zellinien durch Virusproduktion ausgeschlossen sind.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Pa¬ tentanspruchs 1.
Die Unteransprüche 2 bis 5 beschreiben vorteilhafte Ausgestal¬ tungen der Erfindung .Die übrigen Ansprüche zeigen wichtige Verwendungen der beanspruchten Zellinien auf.
Die beanspruchten Zellinien weisen im Gegensatz zu allen bis¬ her beschriebenen humanen Knochenmarkstromazellinien folgende Vorteile auf.
a) Homogenität:
Die Zellinien bestehen im Unterschied zu primärem Stroma aus einer genau definierten einheitlichen Zellpopulation. Expe¬ rimentelle Schwankungen, die bei Verwendung von primären Zellen aus wechselnden Probanden auftreten, sind somit aus¬ geschlossen; b) Permanenz :
Primäre stromale Zellen und die meisten SV-40-immortali- sierten Zellinien sterben nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen ab. Die beanspruchten stromalen Linien sind unbe¬ grenzt teilungsfähig;
c) Wachstumsarrest durch Bestrahlung:
Für Experimente, in denen die stromalen Zellen als "Feeder- Layer" (=Fütterzellen) für hämopoetische Progenitoren ver¬ wendet werden, müssen sie in ihrem Wachstum arretiert werden und gleichzeitig an der Zellkulturschale haften bleiben. Bislang beschriebene SV-40-imnιortalisierte Linien lösen sich nach Bestrahlung von ihrer Unterlage ab, während die bean¬ spruchten Zellinien sowohl das Wachstum einstellen als auch adhärent bleiben;
d) Produktion von hämopoetischen Wachstumsfakturen: Feederzellen für hämopoetische Vorläuferzellen steuern deren Wachstum und Differenzierung u. a. durch die Produktion von Wachstumsfaktoren. Die beanspruchten Zellinien sind in der Lage, große Mengen dieser Wachstumsfaktoren zu produzieren, wobei die Faktorproduktion sowohl durch Bestrahlung als auch durch Stimulation mit Interleukin 1 beeinflußt werden kann.
Die Erfindung wird im folgenden anhand zweier Ausführungsbei- spiele mit Hilfe der Figuren 1 und 2 näher erläutert. Dabei zeigen die beiden Figuren die Clone Charts der verwendeten SV- 40 Plasmidvektoren.
Andere Vektoren, welche mindestens die viralen DNA Sequenzen des Simian Virus 40 enthalten, die für das T Antigen kodieren und für die der Replikationsursprung des SV-40 Virus defekt ist, können ebenfalls benutzt werden. Geeignet sind auch sol¬ che Vektoren, bei denen zusätzlich die späte Gene des SV-40 Virus, welche für die Hüllproteine kodieren deletiert sind. Primäre adhärente Zellen aus menschlichem Knochenmark wurden mit Hilfe eines solchen SV-40-Plasmidvektors transfiziert. Die Transfektion erfolgte mit Liposomen. Die im Verlauf der Lipofektion transfizierte DNA gelangt in den Zellkern der Kno¬ chenmarkzellen und integriert dort in die chromosomale DNA. Die Integrationsstelle des Vektors ist hierbei nicht vorher¬ sehbar, geschieht also zufällig. Die Expression des in das zelluläre Genom integrierten SV-40 T Antigens bewirkt eine Im- motalisierung dieser Zellen.
Die so etablierten Linien sind immortalisiert, zeigen sehr kurze VerdoppelungsZeiten und bilden eine homogene Zellpopula¬ tion.
Die Fig. 1 zeigt einen benutzten Transfektionsvektor (pSV IN- 1), wie er aus Cohen et al., 1984 J. Virol. 51 S.91-96 bekannt ist.
Die Fig 2 zeigt einen daraus ableitbaren zweiten Vektor (pUC IN-1 wt) . Dabei wurde SV40-DNA aus pSVIN-1 an den Schnittstel¬ len Bam/Pst geschnitten und die Nukleotidsequenzen von bp 1988-2533 entfernt. Dann die deletierte SV40-DNA in pUC 12 Bam/Pst Schnittstelle einkloniert.
Die benutzten Vektoren pUC 12 und pBR 322 sowie die viralen DNA Sequenzen des Simian Virus 40 sind kommerziell erhältlich.
Bei der Transfektion der Knochenmarkszellen wurde wie folgt verfahren:
Knochenmarkzellen wurden für 2 - 3 Wochen in Langzeitkulturme¬ dium [McCoy's 5a angereichert mit 12,5 % fötalem Kälberserum, 12, 5 % Pferdeserum, 1 % Natriumbicarbonat, 1 % MEM nicht¬ essentielle Aminosäurelösung, 1 % L-Glutamin (200 mM) , 1 % Penicillin/Streptomycinlösung - alle Lösungen von Gibco - 10" M α-Thiogloycerol, 10~6M Hydrocortison] gezüchtet ( 5 % C02; 37° C) bis der stromale Layer subkonfluent war. Einen Tag vor der Transfektion wurden die adhärenten stromalen Zellen durch Trypsinbehandlung abgelöst und in 25 cm2 Kulturflaschen mit einer Zelldichte von 5 x 105 Zellen/ml ausplattiert. Die Transfektion wurde mit cäsiumchloridgereinigter Plasmid DNA [pSV-INl und pUCIN-lwt] durchgeführt.
Die Transfektion wurde wie folgt entsprechend dem Transfekti- onsprotokoll der Firma Serva [IBF instruction sheet No. 2942 10] durchgeführt.
Die semikonfluenten Zellen wurden einmal mit PBS, einmal mit McCoy's 5a-Medium gewaschen und fünf bis 18 Stunden mit einer frisch hergestellten Plas id/Transfectam-Mischung in 8 ml se¬ rumfreiem Langzeitkultur-Medium in 25 cm2 Kulturflaschen inku¬ biert. Nach der Transfektion wurden die Zellen 2x mit PBS/10 % FCS gewaschen und in LTC-Medium kultiviert bis sie konfluent waren. Die transfizierten Zellen wurden durch wiederholtes Passagieren des stromalen Layers im Verhältnis 1:2 selektio- niert. Nach ca. 25 - 30 Passagen erreichten die immortalisier- ten Zellen eine sog. Wachstumskrise. Diese Krise wurde über¬ wunden indem Zellen, die sich sehr langsam bzw. gar nicht teilten, von ihrer Unterlage durch Trypsinbehandlung abgelöst und in eine neue Kulturflasche überführt wurden. Derart behan¬ delte Zellen erholten sich spontan aus der Krise und zeigten einen immortalisierten Phänotyp.
Zwei der so erhaltenen Zellinien wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt. Dabei hat die Kultur mit der Eintragungsnummer DSM ACC2055 die interne Nummer L87/4 und die Kultur mit der Eintragungsnummer DSM ACC2056 die interne Nummer L88/5.
Die hinterlegten stromalen Zellinien L87/4 und L88/5 unter¬ scheiden sich in folgenden Eigenschaften: • Expression des T-Antigens:
L87/4: geringe Expression (Passage 14) L88/5: starke Expression (Passage 14)
• Integrationsort der viralen DNA: unterschiedliche Integrationsstellen im Genom
• Konstitutive Faktorproduktion:
L88/4: konstitutive Produktion von G-CSF und IL-
L88/5: geringe konstitutive Produktion von G-CSF und IL-6
Die Produktion von G-CSF und IL-6 ist in beiden Zellinien durch Bestrahlung induzierbar.
Im folgenden werden einige wichtige Anwendungsbeispiele für die Verwendung der Zellinien genannt.
Die stromalen Zellinien L87/4 und L88/5 können für alle Expe¬ rimente verwendet werden, in denen Zellen gezüchtet werden sollen, die in Abhängigkeit von einem Feeder-Layer wachsen. Dies sind sowohl alle hämopoetischen Vorläufer- bzw. Stammzel¬ len als Vorläuferzellen der Knochenbildung (Osteoklasten) . Po¬ sitive experimentelle Ergebnisse liegen bereits für das Wachs¬ tum früher feeder-abhängiger B-Tumorzellen (BL70) auf der Li¬ nie L88/5 sowie der Linie L87/4 vor.
Neben der Kulativierung normaler hämopoetischer Vorläuferzel¬ len können die Linien L87/4 und L88/5 auch für die Analyse ma¬ ligner Konchenmarkzellen aus Leukämiepatienten (CML, AML, ALL) unter Medikamenteneinfluß verwendet werden, was im Hinblick auf die autologe Knochenmarktransplantation von besonderer Be¬ deutung ist. Experimentelle Schwankungen, die bislang aufgrund der Verwendung primärer Feederzellen aus unterschiedlichen Probanden auftraten, sind hierbei auszuschließen.
Neben ihrer Eignung als Feederzellen können die Linien L87/4 und L88/5 als Producerlinien für eine Reihe von Wachstumsfak- toren verwendet werden. Bedeutung könnte hierbei die extrem hohe konstitutive Produktion von G-CSF der Linie L87/4 bzw. IL-6 der Linie L88/5 erlangen. Gezeigt werden konnte ferner eine bislang nicht definierte stark stimulierende Aktivität auf das Zellwachstum von 7TD1- bzw. NFS60-Zellen im konditio- nierten Medium (= Zellkulturüberstand) von L88/5-Zellen.
Die Verwendung als Expressionszellinie für Gene die in Vekto¬ ren kloniert sind die unter Kontrolle des großen T-Ag von SV40 replizieren ist ebenfalls möglich. Als Beispiel seien hier COS-Zellen genannt.

Claims

Patentansprüche:
1. Stromale Zellinie aus menschlichem Knochenmark, welche in ihrem Genom virale DNA Sequenzen des Simian Virus 40 (SV-40) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikations- ursprung des SV-40-Virus defekt ist.
2. Stromale Zellinie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der späten SV-40-Gene, welche für die Hüllpro¬ teine kodieren deletiert ist.
3. Stromale Zellinie nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die viralen DNA Sequenzen des Simian Virus 40 mindestens die Bereiche enthalten, die für das T Antigen ko¬ dieren.
4. Stromale Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wie sie unter der Eintragungsnummer DSM ACC2055 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinter¬ legt ist.
5. Stromale Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wie sie unter der Eintragungsnummer DSM ACC2056 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinter¬ legt ist.
6. Verwendung einer stromalen Zellinie nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 5 als Feeder Layer für hämopoetische Zellen oder Osteoklastenvorläufer.
7. Verwendung einer stromalen Zellinie nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 5 zur Produktion von Wachstumsfaktoren.
8. Verwendung einer stromalen Zellinie nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 5 als Expressionszellinie für Gene, die in Vekto¬ ren kloniert sind, die unter Kontrolle des großen T-Antigens von SV-40 replizieren.
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