-
Es
ist allgemein anerkannt, dass In-vitro-Zellmodelle, die in In-vivo-Bedingungen
simulieren, von Vorteil wären.
Im Idealfall sollten die Zellmodelle in der Lage sein, sich in Kultur
zu vermehren, spezialisierte Gewebefunktionen zu exprimieren und die
Lösung
grundlegender biologischer Probleme durch eine einfache Manipulation
der Kulturbedingungen zu ermöglichen.
Es ist daher nicht überraschend,
dass Forscher seit vielen Jahren an der Perfektion von In-vitro-Zellmodellen
arbeiten, wobei sie entdeckt haben, dass normale differenzierte
Zellen in Kultur im Allgemeinen nicht proliferieren und oftmals aufhören, ihre
spezialisierte Funktion zu exprimieren. Tatsächlich berichtete Leonard Hayflick
bereits 1965, dass bei der Beobachtung humaner Lungenfibroblasten
in Gewebekultur die Anzahl der Teilungen, die diese Zellen durchlaufen
können,
begrenzt ist. Ähnliche
Beobachtungen wurden für
eine Vielzahl von Gewebetypen gemacht, wobei in der Tat festgestellt wurde,
dass jeder Typ von Gewebe oder Zelle eine charakteristische Anzahl
von Teilungen durchläuft, bevor
es zur Zellseneszenz oder -apoptose kommt. Um den scheinbar altersbedingten
Zelltod oder die Seneszenz zu umgehen, haben Forscher abnorme Tumorzelllinien
untersucht, die in Kultur weit über
das normale Wachstumsniveau, das bei einer normalen Zelle des gleichen
Gewebetyps vorliegt, wachsen können,
d.h. die Zellen werden immortalisiert. Vorteilhafterweise können diese
immortalisierten Zellen die Fähigkeit
beibehalten, gewebsspezifische Funktionen zu exprimieren. Es hat
daher den Anschein, dass immortalisierte Zellen vorteilhafte Instrumente
für In-vitro-Untersuchungen
sein können.
-
Historisch
betrachtet wurde die Erzeugung von Zelllinien tatsächlich auf
die Beobachtung gestützt,
dass Tumorzellen keine Apoptose aufweisen. Folglich wurden frühe Zelllinien
nur als Tumorzellen oder spontan immortalisierte Varianten von Zellen
erhalten, die ohne weiteres in Gewebekultur wuchsen. Anschließend führte die
Entdeckung, dass bestimmte virale Onkogene die Fähigkeit hatten, unbegrenztes
Wachstum auf verschiedene normale Zelltypen zu übertragen, zur raschen Erzeugung
nichthumaner Zelllinien durch In-vitro-Transfektion dieser Immortalisierungsgene
direkt in die gewünschten
normalen Zelltypen. Immortalisierende Gene können anhand einer Vielfalt
von Strategien in Zellen eingeführt
werden, wie z.B. durch Transfektion und retroviral vermittelte Geninsertionen.
Folglich hat die Verwendung von Immortalisierungsgenen die Bereitstellung
einer großen
Auswahl nichthumaner Zelllinien von verschiedenen Geweben erleichtert.
-
Während der
vergangenen fünfzehn
Jahre ist es möglich
gewesen, nichthumane Zelllinien zu produzieren, die differenzierte
Funktionen beibehalten, indem normale Zellen mit chemischen Karzinogenen
(1), Onkogenen (3) und Tumorviren (4,5) tansformiert wurden. Man
hat außerdem
den Versuch unternommen, humane Zelllinien, die differenzierte Funktionen
beibehalten, unter Verwendung von Onkogenen (2) und Tumorviren (6)
zu produzieren. Es ist zwar möglich,
humane Zelllinien zu produzieren, die einige differenzierte Funktionen
beibehalten, allerdings gehen diese humanen Zelllinien nicht über ein
paar Replikationen hinaus, bevor es zur Apoptose oder Seneszenz
kommt. Aus diesem Grund sind solche Zelllinien für In-vitro-Untersuchungen von
geringem Nutzen.
-
Angesichts
der beträchtlichen
Erfolge bei der Produktion nichthumaner Zelllinien ist es sowohl
rätselhaft
als auch frustrierend, dass es bisher nicht möglich gewesen ist, die gleichen
Techniken zur erfolgreichen Produktion humaner Zelllinien zu nutzen; der
Begriff „erfolgreich" bezieht sich auf
immortalisierte Zelllinien, die ihre gewebsspezifischen Charakteristiken
beibehalten. Es ist offensichtlich, dass erzeugte Zelllinien ohne
Immortalisierung und gewebsspezifische Charakteristiken nicht zuverlässig als In-vitro-Zellmodelle
verwendet werden können.
-
Es
ist interessant, dass die Produktion immortalisierter Mauszelllinien
mit beliebigen der oben genannten Techniken erreicht werden kann,
wohingegen es nicht möglich
ist, immortalisierte humane Zelllinien zu produzieren. Der Unterschied
kann zum Teil mit der Lebenserwartung des Organismus zusammenhängen, von
dem die Zellen abstammen. Die Lebenserwartung einer Maus beträgt zum Beispiel
etwa 2 Jahre, wohingegen die eines Menschen bei etwa 70–80 Jahren
liegt; folglich ist es möglich, dass
aufgrund dieses wesentlichen Unterschieds bei der Lebenserwartung
eine stringentere Regulierung der humanen Zellreplikation vorliegt,
und diese stringente Regulierung kann zum Teil für den tief greifenden allgemeinen
Erfolgsmangel bei der Produktion differenzierter humaner Zelllinien
verantwortlich sein.
-
Unsere
Erfindung basiert auf einer überraschenden
Entdeckung. Wir haben gefunden, dass es entgegen den Erwartungen
möglich
ist, eine immortalisierte humane Zelllinie zu produzieren, die gewebsspezifische
Funktionen exprimiert, wenn das erfindungsgemäße Verfahren praktiziert wird,
das die Verwendung von unreifen, undifferenzierten oder Vorläuferzellen
einschließt.
Obwohl solche Zellen bereits zuvor für die Untersuchung der Differenzierung verwendet
wurden, hat zuvor niemand bemerkt, dass solche Zellen routinemäßig eingesetzt
werden können,
um immortalisierte humane Zelllinien zu erzeugen, die die gewebsspezifischen
Funktionen exprimieren, die im reifen differenzierten Phänotyp vorliegen.
-
Es
ist daher wichtig zu bemerken, dass, obwohl undifferenzierte Zellen
verwendet werden, um Zelllinien zum Zwecke der Untersuchung des
Differenzierungsprozesses zu erzeugen, wo man erwartet, dass mit
einer undifferenzierten Zelle begonnen wird, wenn der Prozess untersucht
werden soll, der zur Differenzierung führt, niemand daran gedacht hat,
undifferenzierte Zellen als Quelle zur Erzeugung einer Zelllinie
zu verwenden, wenn nur die differenzierte Zelle untersucht werden
soll. Es ist eher üblich, eine
differenzierte Zelle zu nehmen und diese dann zu immortalisieren,
um eine humane Zelllinie zu produzieren. Es ist folglich interessant
zu bemerken, dass das erfindungsgemäße Verfahren der konventionellen
Lehre entgegensteht.
-
Es
ist auch interessant zu bemerken, dass, wenn undifferenzierte Zellen
zur Produktion humaner Zelllinien für Studienzwecke des Differenzierungsprozesses
verwendet werden und wenn ein kontrollierbares Immortalisierungsmittel
wie das SV40 Large Tumour T-Antigen verwendet wird, das Verfahren stets
das Ein- und Ausschalten des Immortalisierungsmittels in zuvor ausgewählten Intervallen
entlang dem Differenzierungsweg einschließt, so dass in diesen vorbestimmten
Intervallen die Differenzierungsprodukte im Hinblick auf die Bildung
von Markern zum Kartieren des Differenzierungswegs identifiziert
werden können.
Im Gegensatz dazu betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung
einer undifferenzierten Zelle, die man kontinuierlich in Richtung
einer terminalen Differenzierung weiterentwickeln lässt, um
die differenzierte Zelle zu untersuchen, so dass wieder erkennbar
ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren
der konventionellen Lehre entgegensteht.
-
Es
ist folglich klar, dass es einen Bedarf an der Bereitstellung immortalisierter
humaner Zelllinien gibt, die als In-vitro-Zellmodelle verwendet
werden können,
und es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
mit dem solche Zelllinien produziert werden.
-
Stand der Technik
-
Die
WO 97/10329 betrifft die Korrektur von Verhaltens- und/oder psychologischen
Defiziten durch intrazerebrale Transplantation von Nervenzellen,
sowie Zellen und Medikamente dafür.
Die beanspruchten Verfahren, Anwendungen und Zellen schließen pluripotente
Neuroepithelzellen ein. Die WO 97/10329 beansprucht das Prioritätsdatum
vom 12. September 1995 als ihr effektives internationales Einreichungsdatum
aufgrund der UK-Anmeldung GB9518606.0, die „isolierte, pluripotente Neuroepithelstammzellen" betrifft; insbesondere „konditional unsterbliche,
pluripotente Neuroepithelstammzellen". Die Offenbarungen der Anmeldungen
erwähnen
humane und nichthumane tierische Zellen, und die Beispiele betreffen
klonierte, immortalisierte, murine Neuroepithelzellen und ihre Verwendung
zur Behandlung von Versuchsratten.
-
Die
WO95/02687 betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner Zelllinien,
umfassend das Immortalisieren einer humanen undifferenzierten Fötuszelle,
die mit einer temperaturempfindlichen Mutante des Simian-Virus 40
Large T-Antigen (SV40T Ag) osteoplastisch differenziert werden kann,
Kultivieren der Zelle, um eine homogene Population zu erzeugen,
Kultivieren von Zellen bei der nichtpermissiven Temperatur, um die
Immortalisierung zu beenden und die Differenzierung zu aktivieren,
und Ermöglichen
der Differenzierung der Zellen, um vollständig differenzierte Zellen
des osteoplastischen Phänotyps zu
produzieren. Die Zellen waren zur Verwendung in der Untersuchung
von Knochendegeneration und Osteoporose vorgesehen.
-
Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung
einer humanen Nervenzelllinie bereitgestellt, umfassend die folgenden
Schritte:
-
- (a) Immortalisieren einer humanen undifferenzierten
Nervenzelle (die keine Stammzelle ist) unter Verwendung eines Immortalisierungsgens,
das ein Kontrollmittel beinhaltet oder mit einem solchen assoziiert
ist, wobei durch die Aktivierung des Kontrollmittels die Immortalisierung
beendet und eine Differenzierung der undifferenzierten Zelle ermöglicht wird,
- (b) Kultivieren der genannten immortalisierten Zelle, um eine
homogene Population humaner Nervenzellen zu erzeugen,
- (c) Aktivieren des Kontrollmittels, um die Immortalisierung
zu beenden und die Differenzierung zu aktivieren; und
- (d) Ermöglichen
einer Differenzierung der genannten Zellen, um voll differenzierte
humane Nervenzellen zu produzieren; wobei das Verfahren zum Ermöglichen
der Differenzierung der genannten Zellen das Inkontaktbringen mit
einem Differenzierungsmittel umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus einem ciliären neurotrophen
Faktor, einem neurotrophen Gliazell-Faktor, einem hirnabstammenden
neurotrophen Faktor, einem Nervenwachstumsfaktor, einem Fibroblastenwachstumsfaktor,
einem epidermalen Wachstumsfaktor, einem aus Blutplättchen gewonnenen
Wachstumsfaktor, Retinoinsäure und
Seren.
-
Anhand
des oben Gesagten ist erkennbar, dass das Verfahren durch die Verwendung
undifferenzierter Nichtstammzellen gekennzeichnet ist, um eine gewünschte voll
differenzierte humane Zelllinie zu erzeugen.
-
Wir
haben überraschenderweise
gefunden, dass durch die Verwendung undifferenzierter Zellen in
dem erfindungsgemäßen Verfahren
eine immortalisierte humane Zelllinie erzeugt wird, die die funktionellen
Eigenschaften in Verbindung mit dem Zelltyp beibehält, von
dem die Zelllinie abstammt. Wir sind daher als Einzige in der Lage,
humane Zelllinien zur Verwendung als In-vitro-Zellmodelle zu erzeugen. Unsere
Zelllinien sind unsterblich und zuverlässig.
-
In
einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird eine Immortalisierung
durch die Anwendung konventioneller Transfektionstechniken erreicht und
vorzugsweise ist das Immortalisierungsgen ein Onkogen; noch bevorzugter
ist das Immortalisierungsgen ein virales Onkogen, das stabil in
das Wirtszellgenom integriert werden kann.
-
Im
Idealfall ist das Immortalisierungsgen ein Konstrukt, vorzugsweise
ein retrovirales Konstrukt, einschließlich eines Onkogens, das viral
abgeleitet wird, oder ein Onkogen humaner Abstammung. Es kann jedes
beliebige bekannte Onkogen, wie myc, ras, src usw. verwendet werden.
-
In
einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das Kontrollmittel
für Umweltbedingungen wie
Temperatur, pH-Wert oder ionische Konzentrationen verantwortlich.
-
In
noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind
das Immortalisierungsgen und das Kontrollmittel integriert, d.h.
das Immortalisierungsgen ist selbst kontrollierbar. Folglich können das
Immortalisierungsgen und das Kontrollmittel zum Beispiel eine einzelne
Einheit wie ein temperaturempfindliches Onkogen umfassen. Alternativ
können
das Immortalisierungsgen und das Kontrollmittel zwei selbstständige Einheiten
sein, allerdings hat die Aktivierung/Deaktivierung des Kontrollmittels
in jedem Fall einen direkten Effekt auf das Immortalisierungsgen.
Wenn das Kontrollmittel aktiviert wird, wird das Immortalisierungsgen
deaktiviert. Umgekehrt wird das Immortalisierungsgen aktiviert,
wenn das Kontrollmittel deaktiviert wird. Idealerweise kann eine Kontrolle
mit Bezug auf Kultur- oder Umweltbedingungen erreicht werden; in
der bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das Immortalisierungsgen zum
Beispiel temperaturempfindlich und die Kontrolle wird somit durch
einen temperaturempfindlichen Schalter repräsentiert, so dass in etwa bei, über oder unter
einer ersten bestimmten Temperatur das Immortalisierungsgen aktiviert
wird, um den selektierten Zelltyp zu immortalisieren, aber bei,
in etwa bei oder über
einer zweiten Temperatur das Immortalisierungsgen deaktiviert wird
und in diesem Fall die Immortalisierung endet und die Differenzierung
vonstatten gehen kann, um eine homogene Population von Zellen eines
bestimmten Zelltyps zu erzeugen.
-
Vorzugsweise
ist das Immortalisierungsgen das SV40 T Antigen, das bei 33°C permissiv
ist, d.h. das virale Gen wird in einer aktiven Form exprimiert, und
bei 39°C
nichtpermissiv ist, d.h. das virale Gen wird in einer inaktiven
Form exprimiert. Zellen, die mit diesem Mittel immortalisiert werden,
sind somit temperaturempfindlich in Bezug auf eine Differenzierung.
-
Bei
einer Transformation mit SV40 T Antigen differenzierten unsere Zellen
bei der nichtpermissiven Temperatur und überlebten die Krise in einzigartiger
Weise, die ein Zustand ist, dem gewöhnlich eine Apoptose folgt.
Durch das Überleben
der Krise wurden unsere Zellen immortalisiert. Wir sind der Ansicht,
dass das Merkmal der Immortalisierung in der Verwendung der undifferenzierten
oder Vorläuferzelle
im erfindungsgemäßen Verfahren
begründet
ist.
-
In
noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung beinhaltet
die genannte humane Zelllinie außerdem ein Sicherheitsmerkmal,
das eine selektive Deaktivierung oder Zerstörung der genannten Zelllinie
ermöglicht.
Dieses Sicherheitsmerkmal ist von Vorteil, wenn die Zelllinie zur
Transplantation verwendet oder anderweitig, ob dauerhaft oder vorübergehend,
an einem Individuum angebracht, ihm verabreicht oder in ihm aufbewahrt
werden soll. Mit dem Sicherheitsmerkmal kann die Zelllinie in solchen
Fällen
selektiv deaktiviert, d.h. harmlos gemacht werden, oder zerstört werden,
bei denen davon ausgegangen oder nachgewiesen wird, dass die Zelllinie
in vivo potenziell tumorbildend ist oder in irgendeiner Weise für ein Individuum
als schädlich angesehen
wird.
-
Vorzugsweise
umfasst das Sicherheitsmerkmal ein Gen, dessen Produkt entweder
direkt oder indirekt wirkt und die Zelllinie entschärft oder
zerstört. Das
Gen kann zum Beispiel ein Gen sein, das in Anwesenheit bestimmter
Mittel wie zum Beispiel antiviraler Mittel ein zytotoxisches Produkt
produziert. Ein Beispiel für
ein solches Gen wäre
das Gen, das virale Thymidinkinase (vTK) kodiert. Dieses Gen wandelt verordnete
antivirale Arzneimittel eifrig in zytotoxische Intermediate um.
Ein weiteres Beispiel für
ein Gen, das als ein Sicherheitsmerkmal verwendet werden könnte, ist
das Cytosindeaminase-(CD)-Gen. Das Produkt dieses Gens macht Zellen
für die
Wirkungen von 5-Fluorcytosin
anfällig
und führt
zum Zelltod.
-
In
einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das Sicherheitsmerkmal
zusammen mit dem immortalisierenden Onkogen exprimiert. Diese Anordnung
wird bevorzugt, da sie bedeutet, dass das Immortalisierungsgen in
Abwesenheit des Sicherheitsmerkmals und umgekehrt wahrscheinlich
nicht exprimiert wird. Unsere mitanhängige Patentanmeldung WO96/14401
lehrt, wie ein Vektor produziert werden kann, der eine Coexpression
des Sicherheitsmerkmals erbringt, das mit dem immortalisierenden
Onkogen verbunden werden könnte.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das Sicherheitsmerkmal-Gen stromabwärts des
immortalisierenden Onkogens und im Idealfall zum Beispiel neben,
aber in 3'-Richtung zu
einer von einem Poliovirus abstammenden IRES-(interne ribosomale
Eintrittstelle)-Sequenz platziert.
Diese Anordnung gewährleistet,
dass das/die Promotor/Enhancer-Element(e), das/die die Transkription
des immortalisierenden Onkogens kontrolliert/kontrollieren, gleichermaßen die
Transkription des Sicherheitsmerkmals kontrolliert/kontrollieren.
-
Der
fachkundigen Person wird klar sein, dass andere Anordnungen bereitgestellt
werden können, um
die Coexpression des immortalisierenden Onkogens und des Sicherheitsmerkmals
zu ermöglichen, und
es ist nicht beabsichtigt, dass das obige Beispiel in einer Weise
ausgelegt wird, die den Umfang des von der Anmeldung gewährten Schutzes
begrenzt.
-
Die
Erfindung wird nachfolgend, jedoch nur beispielhaft, unter Bezugnahme
auf eine humane Knochenzelllinie und unter Bezugnahme auf die folgende
Figur beschrieben.
-
1 zeigt eine immunohistochemische Analyse
von Zellen in einer Kultur eines humanen kortikalen Vorläufers, der
mit temperaturempfindlichem SV40T Onkogen immortalisiert wurde.
-
Bereitstellung humaner Zelllinien,
einschließlich
eines selektiv kontrollierbaren Sicherheitsmerkmals
-
Eine
Ausgestaltung der Erfindung ist die Präparation homogener Populationen
von Zellen durch retrovirale Transduktion, aber auch der Einbau
eines Sicherheitsmerkmals, durch das Zellen bei Bedarf selektiv
zerstört
werden können.
Dies würde
bei der Verwendung solcher Zellen zur Transplantation in Patienten,
um Symptome von beispielsweise neurodegenerativen Störungen zu
lindern, als Vorteil angesehen.
-
Das
Sicherheitsmerkmal würde
zum Beispiel die selektive Zerstörung
des Transplantats in Situationen ermöglichen, in denen das transplantierte
Material in-vivo tumorbildend werden könnte. Es gibt zahlreiche Methoden,
um dies zu erreichen, die der fachkundigen Person allgemein bekannt
sind. Die Zugabe des viralen Thymidin-Kinase-(vTK)-Gens unter der Kontrolle
eines angemessenen Promotors zu den ts-SV40-T-transduzierten Zellen
würde zum
Beispiel bedeuten, dass Zellen, die SV40-T exprimieren, auch das
vTK-Gen exprimieren würden.
Dieses Gen wandelt verordnete antivirale Arzneimittel wie Gancyclovir
oder Acyclovir eifrig in zytotoxische Intermediate um, die die Zelle
töten,
in der es exprimiert wird. Ein solches Suizidgen wäre bei Bedarf
zur Transplantateradikation besonders von Vorteil.
-
Ein
weiteres Beispiel für
einen solchen molekularen Schutzschalter ist das Cytosin-Deaminase-(CD)-Gen.
Zellen, die CD exprimieren, werden gegenüber 5-Fluorcytosin empfindlich
und sterben in seiner Anwesenheit, wohingegen Zellen, die das CD-Gen
nicht exprimieren, unbeeinträchtigt
bleiben. Die bevorzugte Erfindung sollte nicht auf vTK und CD als
negative Selektionsmarker begrenzt angesehen werden, da die fachkundige
Person diese ohne weiteres durch Alternativen ersetzen könnte.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung, nach dem ein Sicherheitsmechanismus
in die Zellen eingebaut wird, um als negative Selektionskomponente
zu dienen, würde
die Schutzkomponente zusammen mit dem immortalisierenden Onkogen exprimiert.
Dies würde
besonders bevorzugt, da es bedeuten würde, dass das Immortalisierungsgen wahrscheinlich
nicht in Abwesenheit des negativen Selektionssicherheitsmechanismus
und umgekehrt exprimiert wird. Die auf dem Gebiet der Vektorkonstruktion
fachkundige Person wäre
völlig
in der Lage, eine solche Konstruktion zu schaffen; wir verweisen den
Leser diesbezüglich
auf eine unserer anderen Patentanmeldungen, WO 96/14401. Das negative Selektionsgen
(z.B. CD oder vTK) könnte
zum Beispiel stromabwärts
des Immortalisierungsgens und z.B. neben, aber in 3'-Richtung zu einer
von einem Poliovirus abstammenden IRES-(interne ribosomale Eintrittstelle)-Sequenz platziert
werden. Auf diese Weise würde(n)
das/die gleichen Promotor-/Enhancer-Element(e), das/die die Transkription
des Immortalisierungsgens kontrolliert/kontrollieren, gleichermaßen die
Transkription des Schutzelements kontrollieren. Dies liegt daran,
dass sie als eine komplette Einheit transkribiert würden, einschließlich der IRES-Sequenz,
die dazwischen sitzen würde.
Die IRES-Sequenz ermöglicht
die Translation von Sequenzen stromabwärts von sich, die ein separates Protein
der Sequenz in 5'-Richtung
zu ihr kodieren. Die Fähigkeit
zur Bereitstellung eines solchen Vektors, nachdem einmal die Anregung
dazu gegeben wurde, liegt wohl innerhalb des Kompetenzbereiches der
fachkundigen Person.
-
Nervenzelllinien
-
Nervengewebe
wurde zur Immortalisierung von humanem Fötusmaterial in der B. bis 12. Schwangerschaftswoche
dissektiert; dies kommt dem optimalen Alter für eine Immortalisierung (über retrovirale
Transduktion) von Vorderhirnzellen wie striäre Neuronen und einige kortikale
Neuronen nahe, da sie in vivo noch nicht ihre letzte Replikation durchlaufen
haben. Sie sind daher noch immer in der Lage, das retrovirale Onkogen
in ihrem Genom zu integrieren und es stabil zu exprimieren.
-
Sieben
Regionen wurden von dem 8–12
Wochen alten fötalen
ZNS dissektiert – Kortex,
Striatum, Hypothalamus, rostroventrales Mesenzephalon, caudoventrales Mesenzephalon,
medullärer
Hirnstamm und das Hinter- und Vorderhorn des Rückenmarks. Dissoziierte Zellen
von diesen Regionen wurden auf eine Reihe verschiedener Substrate
(Gelatine/Polylysin, Fibronektin, unbeschichteter Kunststoff) plattiert und
in einem definierten Medium (Stringer et al., 1994) inkubiert. Die
Zellen wurden mit unserem üblichen
Verfahren (Stringer et al., 1994) mit einem amphotropen Virus (PA317-CMV48T)
(von P. Gallimore, University of Birmingham, UK) transduziert, das
das kontrollierbar exprimierte Onkogen (ts-SV40T) kodiert, das mit
einem Geneticin-Resistenzmarker (GA18r)
verbunden war.
-
Da
humane ZNS-Nervenvorläufer
in Fibroblastenwachstumsfaktor-(FGF)-haltigem Medium ein Maß an intrinsisch
angetriebenem Replikationspotenzial aufweisen, wurde es als vorteilhaft
angesehen, sowohl transduzierte als auch nichttransduzierte Zellen
gleichermaßen
in denselben Kulturkolben expandieren zu lassen. Auf diese Weise
wäre es
möglich,
sofern weitere Proben von frischem humanem Material nicht mehr verfügbar wären, die
existierenden Zellen einfach erneut zu transfizieren, um mehr Klone
zu erzeugen. Nachdem die vermischten Zellen Konfluenz erreicht hatten,
wurden die Kulturen folglich übertragen
und ein Teil für
den möglichen
späteren
Gebrauch eingefroren.
-
Die übertragenen
Zellen wurden mit Geneticin behandelt, um nichtransduzierte Zellen
zu vernichten, und nach 10–12
Tagen waren kleine Klone erkennbar. Einzelne G418-resistente, transduzierte Zellen
wurden jedem Klon zur Expansion entnommen. Um dies zu erreichen,
haben wir ein Verfahren zur Steuerung der Zellen entwickelt, damit
sie während
der frühen,
kritischen Stufen der Expansion besser überleben und schneller replizieren,
indem sie mit Stützzellen
co-kultiviert werden, die als Feeder-Lagen in Zell-Well-Inserts
(Corning) gehalten werden. Sobald die klonale Zellzahl ein- oder
zweihundert erreicht hat, können
sie sich selbst tragen, wobei die mitotische Geschwindigkeit merklich
zunimmt. In dieser Stufe wurden die die Stützzellen enthaltenden Inserts
nicht mehr benötigt
und konnten entfernt werden. Wir haben jetzt mehrere homogene Klone
in dieser Weise isoliert, allerdings haben wir noch immer viele
Hunderte von heterogenen, gemischten Klonen, die entweder eingefroren
sind oder weiterhin expandieren. Die von einzelnen Zellen expandierten
Klone sind seit ihrer anfänglichen
Kultivierung im Mai 1994 ständig
gewachsen.
-
Die
Differenzierung eines Klons von der menschlichen Hirnrinde wurde
sehr ausführlich
analysiert. Zellen von diesem Klon wurden auf 24-Well-Platten plattiert
und bei der permissiven Temperatur des Onkogens von 33°C 2–3 Tage
lang expandiert. Die Zellen wurden dann bei der nichtpermissiven
Temperatur von 39°C
in Anwesenheit einer Vielfalt von Agenzien und anderen Zelltypen
wachsen gelassen. Dazu gehörten
der Nervenwachstumsfaktor, der ciliäre neurotrophe Faktor (CNTF),
der hirnabstammende neurotrophe Faktor, der von einer Gliazelllinie
abstammende neurotrophe Faktor (GDNF), FGF, der epidermale Wachstumsfaktor,
der aus Blutplättchen
gewonnene Wachstumsfaktor, Retinoinsäure und verschiedene Seren.
Nach 14 Tagen unter diesen Bedingungen wurden die Zellen fixiert und
immunohistochemisch mit einer Reihe von zelltypspezifischen Antikörpern wie
Neurofilament, neuronenspezifische Enolase, gliales fibrilläres saures Protein,
Myelin-Oligodendrozytglykoprotein, Nestin, Vimentin und CD11b (markierende
Mikroglia) gescreent. Wir stellten fest, dass ein Nervenzellphänotyp sowohl
morphologisch als auch immunochemisch erkennbar war, nachdem der
Vorläuferklon
in Anwesenheit von neurotrophen Gliazell-Faktoren inkubiert worden
waren (s. 1). Eine Inkubation
mit CNTF führte
stattdessen zu einem astrozytenartigen Phänotyp. Obwohl die von einer
einzelnen Zelle expandierten Vorläuferzellen homogen sind, hat
es interessanterweise den Anschein, dass sie wenigstens zwei verschiedene
Phänotypen
unter jedem vorgegebenen Bedingungssatz hervorrufen können. Diese
Art der Multipotenzialität
steht im Gegensatz zur Multipotenzialität, die bei unseren von Ratten
stammenden Raphe-Klonen erkennbar ist, bei denen ein Bedingungssatz
dazu führt,
dass ein homogener Nervenzellphänotyp
exprimiert wird (Stinger et al., 1994). Die multiplen Phänotypen
des kortikalen Klons reflektieren vermutlich das frühe Stadium
der kortikalen Entwicklung, in dem die Vorläufer isoliert wurden und in
dem die Zellen eine weniger beschränkte Festlegung auf individuelle
Differenzierungswege haben. Nestin und Vimentin wurden ebenfalls
von diesem Klon identifiziert.
-
In 1A wurden die homogenen
Vorläuferzellen
bei der nichtpermissiven Temperatur des Onkogens (39°C) in Anwesenheit
eines neurotrophen Glia-Faktors inkubiert und differenzieren gelassen. Einige
der Vorläufer
(mit Pfeilen gekennzeichnet) entwickelten eine „phase-bright"-Morphologie und wiesen eine neuronenspezifische
Enolase-Immunoreaktivität auf, einen
charakteristischen Marker von Neuronen. Eine stärkere Vergrößerung ist in 1B dargestellt. Andere Zellen nahmen
jedoch einen anderen Phänotyp
an. Eine Inkubation mit CNTF führte stattdessen
zu einem astrozytenartigen Phänotyp. Die
gleichen Vorläufer
wurden stattdessen mit ciliärem
neurotrophem Faktor inkubiert (s. 1C).
Sie wiesen nun keine NSE-Immunopositivität mehr auf. Allerdings
traten Netzwerke von GFAP-immunoreaktiven Fasern (Marker für Astrozyten)
auf, wobei die meisten Zellen positiv waren.
-
Quellen
-
- 1. Stampfer MR, Bartley JC 1985. Induction of transformation
and continuous cell-lines from normal mammary epithelial cells after
exposure to benzo[a]pyrene. Proc Natl Acad Sci USA 82:2394-2398.
- 2. Yoakum GH, Lechner JF, Gabrielson EW, Korba BE, Malan-Shibley L, Willwy
JC, Valerio MG, Shamsuddin AM, Trump BF, Harris CC 1985. Transformation
of human bronchial epithelial cells transfected by Harvey'ras oncogene. Science 227:1174-1179.
- 3. Amsterdam A, Zauberman A, Meir G, Pinhasi-Kimhi 0, Suh BS,
Oren M 1988. Contransformation of granulosa cells with simian virus
40 and Ha-RAS oncogene generates stable lines capable of induced steroiogenesis.
Proc Natl Acad Sci USA 85:7582-7586.
- 4. Vitry F, Carnier M, Czernichow P, Benda P, Cohen P, Tixier-Vidal
A 1974. Establishment of a clone of mouse hypothalamic neurosecretory
cells synthesising neurophysin and vasopressin. Proc Natl Acad Sci
USA 71:3575-3579.
- 5. Isom HC, Tevethia J, Taylor JM 1980. Transformation of isolated
rat hepatocytes with simian virus 40. J Cell Biol 85:651-659.
- 6. Rhim JS, Jay G, Arnstein P, Price FM, Sanford KK, Aaronson
SA 1985. Neoplastic transformation of human epiermal keratinocytes
by AD12-SV40 and Kirrten sarcoma viruses. Science 227:1250-1252.
- 7. Stringer B. M. J., et al., Raphé neural cell immortalized
with a temperature-sensitive oncogene, Developmental Brain Research
79:267-274, 1994.