CZ20003842A3 - Buněčná linie lidských keratinocytů - Google Patents

Buněčná linie lidských keratinocytů Download PDF

Info

Publication number
CZ20003842A3
CZ20003842A3 CZ20003842A CZ20003842A CZ20003842A3 CZ 20003842 A3 CZ20003842 A3 CZ 20003842A3 CZ 20003842 A CZ20003842 A CZ 20003842A CZ 20003842 A CZ20003842 A CZ 20003842A CZ 20003842 A3 CZ20003842 A3 CZ 20003842A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
keratinocytes
cell line
immortalized
medium
human
Prior art date
Application number
CZ20003842A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Baur
Original Assignee
Société des Produits Nestlé S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Société des Produits Nestlé S. A. filed Critical Société des Produits Nestlé S. A.
Publication of CZ20003842A3 publication Critical patent/CZ20003842A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Woven Fabrics (AREA)

Description

Buněčná linie lidských keratinocytů
Oblast techniky
JÁ
Vynález se týká nové immortalizované buněčné linie, odvozené od normální lidské kožní tkáně a mající zlepšené diferenciační vlastnosti. Vynález se rovněž týká způsobu výroby těchto buněčných linií a jejich použití, zvláště při vytváření umělé pokožky.
Dosavadní stav techniky
Získávání immortalizovaných buněčných linií, odvozených od normální lidské kožní tkáně, již bylo popsáno. Postupuje se obecně tak, že se transformují lidské kožní buňky, například keratinocyty nebo melanocyty, pěstované v živném prostředí in vitro, působením činidel, vyvolávájících immortalizaci. Po dosažení immortalizace je možno buňky pěstovat in vitro po dlouhé časové období, teoreticky po nekonečnou dobu. Tyto buňky bývají také označovány jako kontinuální buněčné linie. Na rozdíl od takových buněk jsou neimmortalizované buňky schopny proliferace in vitro pouze po definovaný počet buněčných dělení.
Immortalizované buňky jsou velmi výhodné vzhledem k tomu, že představují stálý, potenciálně neomezený zdroj buněk s definovanými vlastnostmi. Typickými činidly pro produkci immortalizovaných buněčných linií včetně buněčných linií lidské pokožky, jsou například viry, rekombinantní viry a plasmidy, které obsahují sekvence DNA, vedoucí k immortalizaci buněk.
* t · · I» í• » · « e • · · ·· · · ·«·
Nejběžnějším způsobem pro získání immortalizovaných lidských buněčných linií je pravděpodobně použití sekvencí opičího viru 40, SV 40 a zvláště DNA z velkého antigenu T, T-Ag viru SV 40 jako činidla pro dosažení imortalizace. V publikacích Steinberg a další, J. Cell Phys., 123, 117-125, 1985; US 4885238 (Reddel a další);
US 4707448 (Major); Stoner a další, Cancer Res., 51, 365371 (199); Chopra a další, In vitro Cell Dev. Biol., 30A, 539-546 (1994); Chopra a další, In vitro Cell Dev. Biol., 27A, 763-765 (1991); Christian a další, Cancer Res., 47, 6066-6073 (1987); Rhim a další, Science, 227, 1250-1252 (1985); a Grubman a další, Gastrointest. Liver Physiol., 29, G1060-G1070 (1994) se uvádějí zprávy o použití vektorů SV40 a vektorů, obsahujících sekvenci velkého antigenu T viru SV40 pro získání immortalizovaných lidských buněčných linií. Zavedení takových sekvencí se obvykle uskuteční infekcí virem SV40 nebo hybridním adenovirem 12/SV40 nebo transfekcí buněk rekombinantním plasmidem, obsahujícím opakování dlouhého terminálního úseku viru Rousova sarkomu a řídící ori-oblast viru SV40 společným srážením v přítomnosti fosfátu stroncia, jak bylo popsáno v Brash a další, Mol. Cell Biol., 7, 20312034, 1987.
Dalším známým postupem pro získávání imortalizovaných buněčných linií, zvláště linií lidských keratinocytů, je postup, při němž se provádí transfekce nebo infekce buněk sekvencemi DNA lidského papillomaviru, HPV. Například v US 5376542 (Schlegel) se popisuje immortalizace lidských epitheliálních buněk geny E6 a E7, izolovanými z HPV-16, 18, 31, 33 nebo 35 nebo samotným genem E7 za získání imortalizovaných lidských buněčných linií, které nevyvolávají nádorové bujení. Mimo to se v publikacích Barbosa a další, Oncogene, 4, 1529-1532 (1989) a Munger a další J. Virol., 63(10), 4417-4421 (1989) popisuje použití E6 a E7 viru HPV-16 a HPV-18 pro získání immortalizovaných lidských keratinocytů. Dále se v publikaci Durst a další, Oncogene 1, 251-256 (1987) popisuje immortalizace keratinocytů působením papillomaviru typu 16.
Přestože se popisují skupiny immortalizovaných buněčných linií keratinocytů a jejich použití při zkouškách in vitro, mají tyto buněčné linie keratinocytů obvykle 1 nebo větší počet vlastností, které jsou nevýhodné. Například popsané immortalizované keratinocyty mají některé z následujících vlastností: (i) zeslabení nebo ztráta exprese diferenciačních markérů, například bílkovin, k jejichž expresi dochází normálními diferencovanými keratinocyty, (ii) modifikovaný růst ve tkáňové kultuře a (iii) tvorba stratifikovaného nebo polarizovaného epitelu s para-keratinocyty ve stratům corneum.
Aby bylo možno tyto nevýhody odstranit, navrhuje se v EP780496 (Société des Produits Nestlé) nový postup pro získání immortalizovaných lidských keratinocytů nebo melanocytů s použitím nového živného prostředí, užívá se vektor pLXSHD+SV40 (#328), odvozený od viru SV40 nebo také vektor pLXSHD+E6/E7, odvozený od lidského papillomaviru 16, HPV-16. Immortalizované buňky, získané uvedeným způsobem, si uchovávají svou schopnost diferenciace a exprese bílkovin a enzymů, k jejichž expresi dochází u normálních diferencovaných keratinocytů a melanocytů, a to i po mnohočetném pasážování v kultuře.
• »
Je však zřejmé, že stále ještě existuje značná potřeba mít k dispozici lidské immortalisované keratinocyty se zlepšenými vlastnostmi. Takové buňky by byly velmi výhodné pro řadu použití, zvláště pro analýzy, při nichž je zapotřebí použít vysoce diferencované kožní buňky.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří buněčná linie lidských keratinocytů, immortalizovaná působením alespoň jednoho tumorigenního funkčního genu retrovirového původu, přičemž tato linie (1) nevyvolává tvorbu nádorů, (2) uchovává si svou schopnost diferenciace a exprese bílkovin a enzymů, k jejichž expresi dochází u normálních diferencovaných keratinocytů, a to i po mnonočetném pasážování ve tkáňové kultuře a (3) vytváří stratifikovaný a polarizovaný epithel s ortho-keratinocyty ve stratům corneum při kultivaci v typické tkáňové kultuře v prostředí, prostém séra a bez vrstvy živných buněk.
Vynález se rovněž týká nového způsobu výroby immortalizovaných buněčných linií keratinocytů, odvozených od normální kožní tkáně.
Součást vynálezu tvoří rovněř způsoby použití těchto buněčných linií keratinocytů podle vynálezu, například pro immunologické, farmakologické, foto- a chemickotoxikologické analýzy kožních reakcí a také pro expresi heterologních genů.
• · · • · · • · ·
Vynález bude dále podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna konstrukce derivátu retroviru SV40, jde o plasmid pLXSHD+SV40(#328), použitého pro immortalizaci keratinocytů podle vynálezu.
Na obr. 2 je znázorněna konstrukce, odvozená od papillomaviru 16, jde o plasmid pLXSHD+E6/E7, použitý pro immortalizaci keratinocytů podle vynálezu.
Vynález se tedy týká immortalizovaných buněčných linií keratinocytů, nevyvolávajících tvorbu nádorů, to znamená takových buněčných linií, které nevedou ke tvorbě nádorů v případě, že jsou vstřiknuty pod kůži živočicha při použití alespoň 2 x 10s buněk pro každou injekci.
Tyto buněčné linie si rovněž uchovávají svou schopnost diferenciace a exprese bílkovin, odpovídající normálním keratinocytům, a to i po značném množství pasáží. Pod výrazem „značné množství pasáží se rozumí nejméně 10 pasáží v kultuře, s výhodou nejméně 20 až 30 pasáží, zvláště nejméně 50 pasáží a teoreticky neomezené množství pasáží. Například immortalizované keratinocyty, získané způsobem podle vynálezu, exprimují diferenciační bílkoviny, a to keratin Kl/10, keratin K14, involucrin, filagrin a loricrin i po značném množství pasáží ve tkáňové kultuře.
• · · • · ·
Immortalizované keratinocyty podle vynálezu mají profil cytochromu p450, CYP450, který je podobný nebo dokonce identický s profilem normálních keratinocytů. U buněk podle vynálezu například dochází k expresi CYP450 1A1, 2E1, 1C18 a 3A5. Mimo to u immortalizovaných keratinocytů podle vynálezu dochází k expresi enzymů fáze II, například glutathion-S-transferázy pí, GSTpí v množství, srovnatelném s normálními neimortalizovanými keratinocyty.
Navíc dochází u immortalizovaných keratinocytů podle vynálezu k expresi bílkoviny a enzymů, odpovídajících buněčné oxidaci a zánětlivé odpovědi, jde například o superoxiddismutázu SOD a kolagenázu typu I a také faktor nekrózy nádorů alfa, TNFalfa po působení forbolesterů tak, jak k tomu také dochází u normálních diferencovaných keratinocytů. Při zachování těchto vlastností představují uvedené buněčné linie velmi zajímavý reprodukovatelný zdroj pro sledování immunologických, farmakologických, zánětlivých, foto- a chemickotoxikologických kožních reakcí.
Mimo to v případě pěstování v typické buněčné kultuře v prostředí, prostém séra, například v prostředí NR2 (Biofluids lne. US), obohaceném EGF 5 ng/ml, vitaminem C 38 mikrogramů/ml a chloridem vápenatým 1,5 mM bez vrstvy živných buněk, to znamená bez fibroblastů produkují tyto immortalizované buněčné linie keratinocytů podle vynálezu stratifikovaný a polarizovaný epitel s povrchovou keratinizovanou vrstvou, tak zvaným stratům corneum, které obsahuje ortho-keratinocyty, to znamená, že je prosté buněk, obsahujících buněčná jádra.
Příprava stratifikovaného a polarizovaného epitelu při použití ímmortalizovaných keratinocytů byla dříve prováděna za klasických podmínek pěstování tkáňových kultur, to znamená při použití živného prostředí, které obsahovalo telecí sérum a vrstvu živných buněk, například podle publikace Lechner a další, Virology, 185, 536-571, 1991. Takto immortalizované buňky však nevytvářely normální povrchové keratinizované vrstvy. Je známo, že například buněčné linie, immortalizované působením papillomaviru 16 nebo 18 nebo E6/E7 vytvářejí deorganizované vrstvy epitelu, jak je popsáno v publikacích Blanton a další, Am. J. Pathol., 138, 673685, 1991; Hudson a další, J. Virol., 64, 519-526, 1990; McCane a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 85, 7169-7173, 1988; Woodworth a další, Oncogene, 7, 619-626, 1992.
Na rozdíl od tohoto pozorování vytvářely buněčné linie, popsané v EP 780496 (Société des Produits Nestlé) při pěstování v běžné kultuře v prostředí, prostém séra a bez použití vrstvy živných buněk vrstvu stratifikovaného a polarizovaného epithelu s normální povrchovou keratinizovanou vrstvou, tato vrstva však obsahovala para-keratinocyty, to znamená, že stratům corneum stále ještě obsahovalo buňky s jádry.
Immortalizované keratinocyty podle vynálezu také absorbují exogenní esenciální mastné kyseliny, AGE přičemž prodloužení řetězce těchto kyselin odpovídá stupni nasycení a prodloužení řetězce u normálních keratinocytů.
Obecně je možno immortalizované keratinocyty podle vynálezu získat následujícím způsobem:
(i) získá se vzorek lidské pokožky, (ii) tento vzorek se zpracuje k získání primárních keratinocytů, schopných pěstování v kultuře, (iii) primární keratinocyty se pěstují v prostředí, prostém séra, s výhodou v prostředí NR-3, popsaném v EP780496 na plotnách pro pěstování kultur s povlakem, usnadňujícím fixaci a růst buněk, povlak je tvořen fibronectinem, SAB a kolagenem typu I, (ív) prostředí, prosté séra se mění tak, aby bylo možno dosáhnout optimálního souvislého růstu keratinocytů na plotně, přičemž povlak na plotně se udržuje neporušený, (v) keratinocyty v kultuře se oddělí od melanocytů a přenesou se do infekčního prostředí, s výhodou do prostředí NR-3, s výhodou po zpracování buněk prostředkem s obsahem trypsinu a EDTA při použití ploten pro pěstování kultur, opatřených povlakem obdobným způsobem, (ví) buňky se infikují funkčními tumorygenními geny nejméně dvou od sebe odlišných retrovirů, například viru SV40 a lidského papillomaviru, (vii) immortalizované keratinocyty se přenesou do proliferačního prostředí bez séra na plotny pro pěstování kultur, opatřené povlakem, s výhodou do prostředí NR-2 nebo NR-3, popsaných v EP780496 a (viii) po proliferaci se immortalizované keratinocyty přenesou do vhodného diferenciačního prostředí s vysokým obsahem vápníku, 1,5 mM, s výhodou do prostředí NR-2, obohaceném 5 ng/ml EGF a 38 mikrogramů/ml vitaminu C.
Ve stupni (i) se odebírá vzorek lidské pokožky od normálních dárců, může jít například o vzorek, odebraný při chirurgickém nebo pediatrickém zákroku. Immortalizace ’ · · fc i. <* · e * · · · «' · • · · · · * # · · · takového vzorku kožních buněk, to znamená autologního vzorku, dovoluje produkci immortalizovaných buněčných linií keratinocytů s definovanými vlastnostmi, například s profilem určitého příjemce, charakteristickým pro určitého dárce.
Vzorek kožní tkáně, dále zpracovaný ve stupni (ii), je pak vhodný pro pěstování v kultuře in vitro. Vzorek se obvykle zpracovává tak, že se omyje, například prostředím, používaným pro tkáňovou kulturu. S výhodou jde o prostředí NR-2, které je prosté séra a jehož složení je popsáno v EP780496, jde o výhodné prostředí pro normální keratinocyty. Po omytí se vzorek s výhodou oholí, například pomocí dermatomu a pak se rozřeže na malé části.
Výsledné části pokožky se pak s výhodou rozdělí na dermis a epidermis. Toho je možno dosáhnout fyzikálním a/nebo enzymatickým způsobem. Je například možno zpracovávat vzorek působením rrypsinu, například flotací vzorků tkáně na trypsinovém roztoku s koncentrací například 0,5 %, mimo to roztok obsahuje například 0,1 % EDTA, v průběhu flotace dochází k oddělení buněk, například v průběhu 30 až 60 minut při teplotě 37 °C, například přes noc při teplotě 4 °C.
Dermis se oddělí a epidermis se uloží do prostředí, v němž je možno uvést buňky do suspenze. Prostředí pro vytvoření suspenze s výhodou obsahuje roztok sojového inhibitoru trypsinu SBTI. Roztok se uvede do styku s buňkami po dostatečnou dobu, obvykle 5 minut pro inaktivaci trypsinu a oddělení buněk. Pak se přidá prostředí pro pěstování kultury, s výhodou prostředí NR-2 bez séra, popsané v EP780496 a filtr, například s průměrem otvorů 100 nm tak, aby bylo možno získat požadované keratinocyty.
Výsledné primární keratinocyty, získané ve stupni (ii) se použijí k naočkování prostředí, prostého séra, s výhodou jde o prostředí NR-3, popsané v EP780496 při vhodné koncentraci buněk, s výhodou přibližně 1,2 x 104 buněk/cm2, buňky se nanášejí na plotny, předem opatřené povlakem. Koncentraci buněk je však možno měnit v širokém rozmezí. Plotny pro pěstování kultur jsou s výhodou opatřeny povlakem, který zlepšuje fixaci a růst keratinocytů, s výhodou jde o směs fibronectinu, SAB a kolagenu typu I.
Ve stupni (iv) se živné prostředí mění tak často, jak je zapotřebí k získání optimálního buněčného růstu. S výhodou se živné prostředí mění obden. Je však možno použít i jiné intervaly v závislosti na odebraném vzorku kožní tkáně. Po dosažení téměř spojité vrstvy, například 90% spojité vrstvy po přibližně 10 až 14 dnech se od sebe oddělí keratinocyty a melanocyty. To je možno uskutečnit jakýmkoliv vhodným způsobem, který dovoluje oddělení buněk bez poškození melanocytů a keratinocytů. Může jít například o diferenciaci působením tripsynu. S výhodou se užívá směs trypsinu a EDTA ve formě rozteku, pak se směs přenese do selekčního prostředí. Postupuje se tak, že se na buněčný materiál působí 5 až 10 minut roztokem, obsahujícím 0,025 % trypsinu a 0,01 % EDTA, buněčný materiál se pak přenese ve stupni (v) do prostředí NR-3 na plotnách, předem opatřených povlakem.
• · ·
Pak se keratinocyty zpracovávají působením činidla, vyvolávajícího immortalizaci. Buňky je také možno zmrazit na tak dlouho, až se vyvolá immortalizace, například v kapalném dusíku. Infekce a immortalizace se obvykle uskuteční při použití funkčních tumorigenní genů nejméně dvou od sebe odlišných retrovirů, například T-Ag viru SV40 a E6/E7 viru HPV16. Každý z těchto genů může být přítomen v nezávislé konstrukci, například v retrovirovém vektoru pLXSHD+SV40(#328), znázorněném na obr. 1 a popsaném v publikaci Stockshlaeder a další, Human Gen. Therapy, 2, 33-39, 1991 a uloženém v GeneBank pod přístupovým číslem M64753, nebo v retrovirovém vektoru pLXSHD+E6/E7, znázorněném na obr. 2.
Retrovirový vektor pLXSHD+SV40(#328) obsahuje mimo jiné sekvenci T-Ag viru SV40, dále sekvence 5' a 3' dlouhých koncových opakování viru SV40, sekvenci pBR322, dovolující replikaci E. coli, cyklus pro mnohočetné klonování a polyadenylační sekvenci viru SV40.
V místě kodového genu pro T-antigen obsahuje vektor pLXSHD+E6/E7 fragment Ncol/Cfol genu E6/E7, odvozený od lidského papillomaviru 16.
Po immortalizaci se buňky podrobí potřebnému počtu pasáží v průběhu pěstování a výsledné immortalizované buňky se přenesou ve stupni (vii) do proliferačního prostředí. Tento přenos se s výhodou uskuteční v průběhu druhé pasáže. Toto proliferační prostředí může být prostředí, prosté séra, s výhodou prostředí NR-2 nebo NR3. Immortalizované buňky se pěstují na plotnách, předem opatřených povlakem kontinuálním způsobem. Povlak ploten je opět tvořen směsí fibronectinu, SAB a kolagenu typu I.
Po pomnožení immortalizovaných buněk v proliferačním prostředí, s výhodou v prostředí NR-2, se keratinocyty ve stupni (viii) přenesou do prostředí, které vyvolá diferenciaci normálních a immortalizovaných keratinocytů, s výhodou do prostředí, které napodobuje podmínky v normální pokožce, čímž dojde k organizaci keratinocytů na stratifikovaný a polarizovaný epitel s normální povrchovou keratinizovanou vrstvou. K tomuto účelu je možno buňky pěstovat v prostředí, prostém séra, s vysokým obsahem vápníku, je například možno použít prostředí NR2, obsahující 1,5 mM vápníku, přibližně 5 ng/ml EGF a přibližně 38 mikrogramů/ml vitaminu C, kultura se pěstuje na plotnách 2 až 3 týdny na rozhraní kapaliny a vzduchu, například na plotnách s 12 vyhloubeními (Falcon č. 3043), každé vyhloubení obsahuje vložku (Falcon č. 3180), na níž se vyvíjejí keratinocyty na rozhraní vzduchu a kapaliny. Vzduch se nachází ve vnitřním prostoru vložky, která neobsahuje živné prostředí. Kapalinou je živné prostředí ve vyhloubení, prostředí se dostává i na membránu vložky, na níž se keratinocyty vyvíjejí.
Pokud jde o vlastnosti immortalizovaných keratinocytů podle vynálezu, jsou tyto keratinocyty velmi vhodné pro immunologickou, farmakologickou, foto- a chemickotoxikologickou analýzu kožních reakcí.
Immortalizované buněčné linie keratinocytů podle vynálezu je například možno použít pro analýzy, vyžadující použití diferencovaných kožních buněk, jde například o studie bariérové funkce (keratinizace) rekonstruované kožní tkáně, studie metabolismu diferencovaných keratinocytů, zejména metabolismus mastných kyselin a antioxidačních činidel, dále může jít o studie, sledující účinky • * * 4 » · « • · · » • » · · · ·· ·<· ultrafialového ozáření kožních buněk, o studie, sledující účinky podráždění pokožky a senzibilizace různými činidly, o studie metabolismu lipidů, místní působení xenobiotických činidel, například kosmetických olejů, fotoprotektivních látek, studie zánětlivých reakcí a podobně.
Mimo to je možno buněčné linie keratinocytů, získané způsobem podle vynálezu použít pro selekci potenciálních protinádorových látek a potenciálních látek pro léčení kožních onemocnění. Při těchto zkouškách se obvykle buněčná linie uvádí do styku s takovými sloučeninami a stanoví se potenciální škodlivé účinky, například toxicita pro geny, tvorba adduktů DNA, vyvolání mutací, transformace buněk nebo cytotoxicita.
Mimo to je možno immortalizované buněčné linie keratinocytů podle vynálezu použít při zkouškách na mutace DNA, v průběhu zkoušek pro selekci mutageních činidel, účinných na pokožku, k identifikaci látek, působících změny chromosomů, ke studiím zhoubné transformace, ke studiím buněčné biochemie, například aktivace CYP450, k selekci sloučenin a prostředků, například směsí esenciálních mastných kyselin, účastnících se zánětlivých a alergických reakcí, může také jít o studie aktivace kolagenázy v souvislosti se zánětem, o studie TNFalfa a detekci interleukinu.
Vzhledem k tomu, že buněčné linie podle vynálezu vytvářejí stratům corneum, které obsahuje ortho-keratinocyty, jde o linie, zvláště dobře ataptované k přípravě umělé pokožky, pro studie mutagenity a pro immunologické, farmakologické, foto- a ·» * chemickotoxikologické studie tak, jak byly uvedeny svrchu. Umělá pokožka může být tvořena pouze epitelem keratinocytů podle vynálezu, s výhodou je však tvořena také kolagenem, fibroblasty i melanocyty tak, aby došlo k lepšímu napodobení normální lidské pokožky.
U buněčných linií keratinocyrů podle vynálezu dochází k expresi rekombinantních bílkovin, například lidských polypeptidů a bílkovin a také k produkci RNA a DNA.
Z immortalizovaných buněčných linií keratinocytů podle vynálezu byla podle budapešťské úmluvy uložena pouze buněčná linie DK7-NR dne 19. března 1998 do veřejné sbírky Collection Nationale de Culture de Microorganisme, C.N.C.M ulice Docteur Roux 25, 75724 Paříž, Francie, pod přístupovým číslem CNCM 1-1996. Všechna omezení dostupnosti této buněčné linie budou definitivně zrušena po udělení patentu, týkajícího se předmětné přihlášky nebo jakékoliv jiné přihlášky s právem přednosti této předmětné přihlášky.
Další vlastnosti vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů, které jsou uvedeny pouze pro ilustraci vynálezu, neměly by však sloužit k omezení jeho rozsahu. Není-li výslovně uvedeno jinak, byly všechny známé manipulace s buněčným materiálem, příprava vektorů, transformace buněk a další technické postupy provedeny podle souhrnné publikace Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989.
• · · * · ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava a charakterizace buněčných linií
Vzorky kožní tkáně byly odebrány z prsu. Po oddělení dermis a epidermis byla dermis rozřezána na malé kousky velikosti 0,2 x 0,2 mm a fixována na plotnu s průměrem 6 cm s obsahem séra. Po 2 až 4 hodinách bylo přidáno minimální esenciální prostředí podle Dulbecco, DMEM s 10 % fetálního telecího séra. Tato kultura explantátu se inkubuje tak dlouho, až je možno viditelně pozorovat bohatý růst fibroblastů. Kultury fibroblastů, vytvářející souvislou vrstvu, se oddělí a pomnoží k získání zmrazených rezervních kultur.
Krabičky pro pěstování kultur se naočkují primárními buňkami, krabičky jsou opatřeny kontinuálním povlakem, popsaným pro bronchiální buňky v publikaci Lechner a další, J. Tiss, Cult. Meth., 9: 43-49, 1985. Po dosažení téměř úplné souvislé vrstvy, například přibližně na 90 %, což trvá přibližně 10 až 14 dnů, se oddělí keratinocyty a melanocyty. K tomuto účelu se ke kultuře na 5 minut přidá roztok, obsahující 0,025 % trypsinu a 0,01 % EDTA a melanocyty se oddělí vzhledem k tomu, že tyto buňky se jako první oddělí od keratinocytů. Pak se primární keratinocyty dále pěstují až do požadovaného počtu buněk v prostředí NR-3 bez séra ve stejných krabičkách pro pěstování tkáňových kultur. Prostředí NR-3 selektivně podporuje růst keratinocytů ve srovnání s růstem melanocytů.
Pak se uskuteční transfekce „buněčné linie fibroblastů 3T3 působením plasmidů pLXSHD+SV40(#328) a • · • · pLXSHD+E6/E7 podle publikace Pfeifer a další, Meth. Cell Sci., 17, 83-89, 1995 za předpokladu, že virus se oddělí po zapouzdření v buněčné linii, pěstované v prostředí DMEM s 10 % fetálního telecího séra. Keratinocyty se infikují virem k dosažení imortalizace. V průběhu infekce se užívá prostředí bez séra, PC-1, rovněž popsané ve svrchu uvedené publikaci Pfeifera a dalších.
Po immortalizaci se immortalizované keratinocyty přenesou do proliferačního prostředí NR-2 nebo NR-3 při použití krabiček pro pěstování kultur, předem opatřených povlakem. Po proliferaci buněk až do požadovaného počtu buněk se buňky přenesou do diferenciačního prostředí, vhodného pro pěstování normálních a immortalizovaných keratinocytů, NR-2.
Je zřejmé, že immortalizované keratinocyty mají zlepšený buněčný růst při zvýšeném množství pasáží v kultuře, srovnatelný s růstem, který byl popsán pro buněčné linie v EP780496.
Exprese CYP450, 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 a 2D6 byla analyzována na kožních buňkách, a to na normálních i immortalizovaných keratinocytech pomocí PCR, reakce DNA při teplotě místnosti (exprese mRNA). Profil CYP450 po expresi immortalizovanými keratinocyty je velmi podobný nebo totožný s profilem u normálních keratinocytů.
Buněčné linie odpovídají na indukující činidlo pro CYP450, tvořené benz(a)pyrenem stejným způsobem jako neimmortalizované buňky, a to i po zvýšeném počtu pasáží.
• ·
Diferenciační markéry byly analyzovány pomocí specifických protilátek proti T~Ag, pomocí involucrinu, filaggrinu, loricrinu, vimentinu a pomocí keratinů K4,
K7, K8, K10/1, K13, K14, K17, K18 a K19. Nejlepší schopnost diferenciace bylo možno prokázat pro buněčnou linii DK7-NR.
Glutathion-S-transferáza, GST byla analyzována metodou Western-blot a Northern-blot. U všech linií keratinocytů dochází k silné expresi mRNA pro GSTpí. Profil expozice GSTalfa, GSTmí a GSTpí v buněčných liniích je obdobný profilu u normálních keratinocytů.
Aby bylo možno analyzovat a srovnat stupeň nenasycení a prodloužení AGE, přidaných ke keratinocytům, byla k immortalizovaným i normálním keratinocytům přidána kyselina linolová LA v množství 15 mikromol a kyselina linolenová LN v množství 15 mikromol. Pro tyto pokusy bylo použito živné prostředí NR-2 (Biofluids lne.), které neobsahuje AEG. Kyseliny byly k buněčným kulturám přidány po dosažení spojité vrstvy, pak byla buněčná kultura přenesena do prostředí NR-2 s vysokým obsahem 1,5 nM vápníku. Kyseliny byly ponechány v prostředí 4 dny, přičemž po dvou dnech byly přidány čerstvé kyseliny v roztoku. Analýza AGE byla uskutečněna extrakcí a oddělením fosfolipidů pomocí chromatografie na tenké vrstsvě, CCM, kvantitativně byly stanoveny methylestery mastných kyselin plynověkapalinovou chromatografií. Bylo možno prokázat desaturaci a prodloužení LA (20:4n-6 a 22:4n-6) a LN (20:5n-3, 22:5n-3 a 22:6n-3). Metabolický profil byl v souladu s profilem, pozorovaným u normálních keratinocytů.
• · ·
Všechny buněčné linie byly hypodiploidní s počtem chromozomů v intervalu diploidních buněk. Kromě analyzovaných buněk nebyly v kulturách prokázány žádné jiné buňky. Tento výsledek potvrzuje čistotu buněčných linií a nepřítomnost jakékoliv kontaminace z jiných zdrojů.
Schopnost immortalizovaných keratinocytů vyvolat tvorbu nádorového bujení byla stanovena podkožní injekcí 1 až 2 x 106 keratinocytů bezsrstným myším. Bylo prokázáno, že linie zkoušených keratinocytů, zvláště linie DK-7-NR nevyvolávají u bezsrstých myší tvorbu nádorů.
Příklad 2: Příprava epithelu
Připraví se prostředí NR-2 s obsahem 750.000 buněk buněčné linie z příkladu 1 a 0,5 ml tohoto prostředí se vloží do vložek Falcon č. 3180, které se pak uloží do vyhloubení ploten Falcon č. 3043, která již obsahují 2 ml čersvého prostředí NR-2, načež se keratinocyty pěstují 2 dny za příznivých podmínek pro růst keratinocytů. Třetí den se prostředí, obsažené ve vložce odstraní a buňky se ponechají na volném vzduchu. Prostředí v dutině se obden nahrazuje čerstvým prostředím NR-2, doplněným 5 ng/ml EGF, 38 mikrogramů/ml vitaminu C a 1,5 mM chloridu vápenatého. Po 2 až 3 týdnech v kultuře na rozhraní vzduchu a kapaliny se epithel, vytvořený tímto způsobem oddělí, fixuje se kyselinou pikrovou a analyzuje se jeho morfologie.
Výsledky prokazují, že buněčné linie keratinocytů a zvláště buněčná linie DK7-NR vytváří stratífikovaný a polarizovaný epitel, označovaný jako stratům basale, obsahující buňky krychlovitého tvaru, totožné s normálními buňkami. Stratům corneum obsahuje ortho-keratinocyty, to znamená, že neobsahuje buňky s jádry. Tvorba buněčné vrstvy ortho-keratinocytů až dosud nebyla uskutečnitelná s použitím jiných immortalizovaných buněčných linií. Například za identických podmínek vytváří buněčná linie DK2-NR podle EP780496 stratům corneum s obsahem para-keratinocytů, to znamená, že tato vrstva stále ještě obsahuje buňky s jádry. Avšak pouze morfologie stratům corneum, které obsahuje ortho-keratinocyty, odpovídá normální situaci v lidské pokožce. Stratům corneum, obsahující para-keratinocyty odpovídá abnormální hypertrofii epithelu, která vede k poruchám, například v případě lupenky nebo nádoru.
Příklad 3: Zkouška na podráždění
Buněčné linie, získané podle příkladu 1, zvláště linie DK7-NR byly pěstovány v prostředí NR-2. Indukce tvorby „stresového genu TNFalfa po působení látek, dráždících pokožku, jako PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetát) a po působení UV záření B byla analyzována metodou Northern-blot a biologickými zkouškami. Výsledky prokazují, že buněčné linie a zvláště buněčná linie DK7-NR odpovídají na působení PMA i na UV-B expresí bílkoviny TNFalfa i po značném počtu pasáží.
• · · · ··«· • · · >
Příklad 4: Konstrukce umělé pokožky
Membrána vložky Falcon č. 3180 se nahradí folií z benzylesteru kyseliny hyaluronové (Hyaff 11). Spodní část vložky se naočkuje primárními lidskými fibroblasty v množství 0,1 x 106 buněk v 0,2 ml prostředí, po 30 minutách se vložka naplní prostředím DMEM, které obsahuje 10 % fetálního telecího séra, inkubace se provádí při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % oxidu uhličitého několik dnů, pak se vložka vyprázdní a přidá se 0,5 ml čerstvého prostředí NR-2 s obsahem 750.000 buněk buněčné linie DK7-NR a vložky se uloží do vyhloubení ploten Falcon č. 3043, již obsahujících 2 ml čerstvého prostředí NR-2, načež se buňky pěstují 2 dny za podmínek, příznivých pro pěstování keratinocytů. 3. den se prostředí ve vložkách odstraní a buňky jsou ponechány na volném vzduchu. Prostředí ve vyhloubeních se mění vždy obden a nahrazuje se prostředím NR-2, doplněným 5 ng/ml EGF, 38 mikrogramů/ml vitaminu C a 1,5 mM chloridu vápenatého. Po pěstování 2 až 3 týdny na rozhraní vzduchu a kapaliny je možno pozorovat tvorbu umělé pokožky, která má vlastnosti normální pokožky.

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Buněčná linie lidských keratinocytů, immortalizovaná působením alespoň jednoho tumorigenního funkčního genu retrovirového původu, vyznačující se tím, že (1) nevyvolává tvorbu nádorů, (2) uchovává si svou schopnost diferenciace a exprese bílkovin a enzymů, k jejichž expresi dochází u normálních diferencovaných keratinocytů, a to i po mnonočetném pasážování ve tkáňové kultuře a (3) vytváří stratifikovaný a polarizovaný epithel s ortho-keratinocyty ve stratům corneum pří kultivaci v typické tkáňové kultuře v prostředí, prostém séra a bez vrstvy živných buněk.
  2. 2. Buněčná linie lidských keratinocytů podle nároku 1, vyznačující se tím, že je immortalizována působením funkčních tumorigenních genů retrovirového původu z nejméně dvou odlišných retrovirů.
  3. 3. Buněčná linie lidských keratinocytů podle nároku 2, vyznačující se tím, že funkční tumorigenní geny jsou odvozeny od viru SV40 a od lidského papillomaviru 16.
  4. 4. Buněčná linie lidských keratinocytů podle nároku 3, vyznačující se tím, že každý z funkčních tumorigenních genů je uložen do nezávislého retrovirového konstruktu.
  5. 5. Buněčná linie lidských keratinocytů podle nároku 1, vyznačuj ící tím, že jde o buněčnou linii DK7-NR, uloženou pod číslem CNCM 1-1996.
  6. 6. Způsob výroby buněčné linie immortalizovaných lidských keratinocytů, vyznačující se tím, že se (i) izoluje vzorek lidské pokožky, (ii) vzorek se zpracuje pro pěstování in vitro, (iii) ze vzorku se získají keratinocyty, které se naočkují do růstového prostředí bez séra na plotny pro pěstování kultur, opatřené povlakem, obsahujícím fibronectin, kolagen typu I a SAB pro usnadnění fixace a růstu buněk, (iv) prostředí se mění dostatečným způsobem pro dosažení optimálního souvislého růstu buněk ve vrstvě, kontinuálně povlékající plotnu, (v) keratinocyty se přenesou do selekčního prostředí bez séra na plotnách, povlečených předem obdobným způsobem, (vi) keratinocyty se infikují funkčními zumorígenními geny nejméně dvou od sebe odlišných retrovirů, (vii) výsledné immortalizované keratinocyty se přenesou do proliferačního prostředí bez séra, vhodného k proliferaci immortalizovaných keratinocyrů na plotnách, opatřených svrchu uvedeným povlakem, (viii) výsledné keratinocyty po proliferaci se přenesou do diferenciačního prostředí bez séra s vysokým obsahem vápníku v krabičkách pro pěstování kultur, předem opatřených svrchu uvedeným povlakem.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že funkční tumorigenní geny jsou odvozeny od viru SV40 a od lidského papilomaviru 16.
    « « • · pod číslem CNCM 1-1996.
    23 ··· ·· ·· ···*
  8. 8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že každý z funkčních tumorigenní genů je uložen do nezávislého retrovirového konstruktu.
  9. 9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že se jako retrovirové konstrukty užijí vektory pLXSHD+SV40(#328) a pLXSHD+E6/E7.
  10. 10. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že prostředí bez séra ve stupních (iii), (v) nebo (vii) je prostředí NR-3.
  11. 11. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako diferenciační prostředí ve stupni (viii) užije modifikované prostředí NR-2 s obsahem vápníku nejméně 1,5 mM.
  12. 12. Použití keratinocytů podle nároku 1 pro imunologické, farmakologické, foto- a chemickotoxikologické analýzy kožních reakcí a pro expresi heterologních genů.
  13. 13. Použití podle nároku 1, při němž se užije buněčná linie DK7-NR, uložená pod číslem CNCM 1-1996.
  14. 14. Umělá pokožka, vyznačující se tím, že obsahuje buněčnou linii keratinocytů podle nároku 1.
  15. 15. Umělá pokožka podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje buněčnou linii DK7-NR, uloženou
CZ20003842A 1998-04-17 1999-04-07 Buněčná linie lidských keratinocytů CZ20003842A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98201247 1998-04-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20003842A3 true CZ20003842A3 (cs) 2001-08-15

Family

ID=8233616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003842A CZ20003842A3 (cs) 1998-04-17 1999-04-07 Buněčná linie lidských keratinocytů

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6566136B2 (cs)
EP (1) EP1071747B1 (cs)
JP (1) JP4671504B2 (cs)
KR (1) KR20010074488A (cs)
CN (1) CN1299409A (cs)
AT (1) ATE274050T1 (cs)
AU (1) AU756151B2 (cs)
BR (1) BR9909699A (cs)
CA (1) CA2324479C (cs)
CZ (1) CZ20003842A3 (cs)
DE (1) DE69919531T2 (cs)
DK (1) DK1071747T3 (cs)
ES (1) ES2226383T3 (cs)
HU (1) HUP0101913A3 (cs)
IL (1) IL138417A0 (cs)
NO (1) NO325588B1 (cs)
NZ (1) NZ506944A (cs)
PL (1) PL201401B1 (cs)
PT (1) PT1071747E (cs)
RU (1) RU2244005C2 (cs)
SK (1) SK286870B6 (cs)
WO (1) WO1999054435A2 (cs)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6368815B1 (en) * 1999-03-29 2002-04-09 Warner-Lambert Company Screening of molecules that inhibit human phosphodiesterase 4A produced by non-recombinant cell lines
EP1130086A1 (en) * 2000-02-18 2001-09-05 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Genetically engineered keratinocytes and toxicity assay using said keratinocytes
IT1316995B1 (it) * 2000-02-25 2003-05-26 Idi Irccs Procedimento per ottenere da colture primarie di cheratinociti umanilinee cellulari immortalizzate.
AU2002342613A1 (en) 2001-05-09 2002-11-25 Geron Corporation Treatment for wounds
DE10255285A1 (de) * 2002-11-26 2004-06-03 Mcs Micro Carrier Systems Gmbh Selbst formende Phospholipid-Gele
DE10338531A1 (de) 2003-08-19 2005-04-07 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Reklonierung von Produktionszellen
US8669109B2 (en) 2003-08-19 2014-03-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Methods of producing proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells
EP1557085A1 (en) 2004-01-21 2005-07-27 Boehringer Ingelheim International GmbH Mouse model for human psoriasis
US8835169B2 (en) * 2004-10-22 2014-09-16 The Regents Of The University Of Michigan Compositions, methods and systems for preparation of a stem cell-enriched cell population
DK2368975T3 (en) * 2004-12-23 2015-01-05 Medimmune Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for the propagation of viruses
EP1739179A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
CN105219697A (zh) * 2014-07-04 2016-01-06 赫柏慧康生物科技无锡有限公司 一种人原代角质细胞分离制备的方法
RU2573938C1 (ru) * 2014-12-11 2016-01-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук Клеточная линия рака почки человека ibgvat r 27
RU2573940C1 (ru) * 2014-12-11 2016-01-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук Клеточная линия рака почки человека ibgvat r 6
WO2023123299A1 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Beijing Theraxyte Bioscience Co., Ltd. Compositions and methods for culturing stem cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0792351B1 (en) * 1994-11-08 2004-03-10 Cellfactors PLC Method for producing a human neural cell line
KR100455006B1 (ko) * 1995-12-21 2005-01-13 소시에떼 데 프로듀이 네슬레 소시에떼아노님 향상된불사화사람피부세포계및이의제조에유용한신규한무혈청배지
US5811297A (en) * 1996-03-07 1998-09-22 Amba Biosciences, Llc Immortalized hematopoietic cell lines, cell system thereof with stromal cells, in vitro, ex vivo and in vivo uses, & in vitro generation of dendritic cells and macrophages

Also Published As

Publication number Publication date
PT1071747E (pt) 2004-12-31
RU2244005C2 (ru) 2005-01-10
PL364980A1 (en) 2004-12-27
US6566136B2 (en) 2003-05-20
CA2324479C (en) 2007-12-04
DE69919531T2 (de) 2005-09-15
ATE274050T1 (de) 2004-09-15
JP2003516711A (ja) 2003-05-20
WO1999054435A3 (fr) 1999-12-09
AU3813599A (en) 1999-11-08
US20020042133A1 (en) 2002-04-11
NO325588B1 (no) 2008-06-23
SK286870B6 (sk) 2009-06-05
ES2226383T3 (es) 2005-03-16
SK15492000A3 (sk) 2001-03-12
KR20010074488A (ko) 2001-08-04
IL138417A0 (en) 2001-10-31
HUP0101913A3 (en) 2002-06-28
NO20005053L (no) 2000-11-29
PL201401B1 (pl) 2009-04-30
NO20005053D0 (no) 2000-10-06
JP4671504B2 (ja) 2011-04-20
HUP0101913A2 (hu) 2001-09-28
DK1071747T3 (da) 2004-11-29
EP1071747A2 (fr) 2001-01-31
CN1299409A (zh) 2001-06-13
NZ506944A (en) 2003-10-31
AU756151B2 (en) 2003-01-02
CA2324479A1 (en) 1999-10-28
WO1999054435A2 (fr) 1999-10-28
DE69919531D1 (de) 2004-09-23
EP1071747B1 (fr) 2004-08-18
BR9909699A (pt) 2002-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6423540B2 (en) Immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof
Peehl et al. Growth and differentiation of human keratinocytes without a feeder layer or conditioned medium
CZ20003842A3 (cs) Buněčná linie lidských keratinocytů
EP1303589B1 (en) Pre-adipose cell lines
JP2000506374A5 (cs)
Price et al. Approaches to enhance proliferation of human epidermal keratinocytes in mass culture
KATAYAMA et al. Primary culture of human esophageal epithelial cells
MXPA00009558A (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues
Malan-Shibley et al. A serum-free medium for clonal growth and serial subculture of diploid rat liver epithelial cells
Lee Cell culture systems for the study of human skin and skin glands