SK15492000A3 - Ľudská keratínocytová bunková línia, spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom - Google Patents
Ľudská keratínocytová bunková línia, spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom Download PDFInfo
- Publication number
- SK15492000A3 SK15492000A3 SK1549-2000A SK15492000A SK15492000A3 SK 15492000 A3 SK15492000 A3 SK 15492000A3 SK 15492000 A SK15492000 A SK 15492000A SK 15492000 A3 SK15492000 A3 SK 15492000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- keratinocytes
- immortalized
- medium
- serum
- skin
- Prior art date
Links
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 102
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 claims abstract description 5
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 30
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 101100148654 Arabidopsis thaliana SAB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 3
- 102100040119 SH3 domain-binding protein 5 Human genes 0.000 claims description 3
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002649 leather substitute Substances 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 3
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 7
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 5
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000007648 Glutathione S-Transferase pi Human genes 0.000 description 3
- 108010007355 Glutathione S-Transferase pi Proteins 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102100031784 Loricrin Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- -1 for example Substances 0.000 description 2
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 108010079309 loricrin Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 2
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 2
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 2
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005124 DNA Adducts Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000516 activation analysis Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 239000002973 irritant agent Substances 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000005501 phase interface Effects 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000130 skin irritation / corrosion testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000438 stratum basale Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
- C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Woven Fabrics (AREA)
Description
Vynález sa týka nových imortalizovaných bunkových línií, odvodených od normálnych ľudských kožných tkanív a ktoré majú zlepšené diferenciačné vlastnosti; ďalej sa týka nového spôsobu prípravy týchto bunkových línií a ich rôzneho použitia, najmä v oblasti vytvárania umelej kože.
Doterajší stav techniky
Príprava imortalizovaných (zvečnených) bunkových línií, odvodených z normálnych ľudských kožných tkanív už bola opísaná. Spôsoby používané na tento účel všeobecne zahŕňajú transformáciu ľudských kožných buniek, napríklad keratínocytov a melanocytov, ktoré sa kultivujú in vitro s látkami vnášajúcimi bunkám imortalizovanosť. Imortalizácia sa týka prípravy buniek, ktoré možno kultivovať dlhší čas in vitro, teoreticky po nekonečnú dobu. Tieto bunky sa tiež označujú ako pokračujúce alebo večné bunkové línie. Na rozdiel od uvedeného nie imortalizované bunky sú schopné proliferácie počas iba určitého počtu bunkových delení in vitro. Imortalizované bunky sú mimoriadne výhodné, pretože poskytujú stály, potenciálne neobmedzený zdroj buniek, ktoré majú určité vlastnosti. Typické látky na prípravu imortalizovaných bunkových línií a imortalizovaných ľudských kožných bunkových línií zahŕňajú najmä, napríklad, rekombinantné vírusy a plazmidy, ktoré obsahujú DNA sekvencie, vnášajúce vlastnosť imortalizácie.
Najbežnejší spôsob prípravy imortalizovaných ľudských bunkových línií zahŕňa pravdepodobne použitie sekvencií vírusu Simian Vírus 40 (SV40), bližšie, zahŕňa použitie DNA T- antigénu (T-Ag) SV 40 ako imortalizačné činidlo. O použití SV 40 vektorov a vektorov obsahujúcich sekvenciu T - antigénu SV 40 na prípravu imortalizovaných ľudských bunkových línií referujú napríklad Steinberg et al., J. Celí Phys. 123, 117 až 125 (1985); patent USA 4 885 238 (Reddel eŕ a/.); patent USA 4 707 448 (Major); Stoner eŕ al., Cancer Res. 51, 365 až 371 (1991); Chopra eŕ al.,
-2In vitro Celí Dev. Biol. 30A. 539 až 546 (1994); Chopra etal., In vitro Celí Dev. Biol. 27A. 763 až 765 (1991); Christian eŕ al., Cancer Res. 47, 6066 až 6073 (1987); Rhim eŕ al., Science 227,1250 až 1252 (1985); a Grubman eŕ al., Gastrointest. Liver Physiol. 29, G1060 až G1070 (1994). Vloženie uvedených sekvencií sa vo všeobecnosti vykoná infekciou s SV 40 vírusom alebo s 12/SV 40 hybridným adenovírusom, alebo transfekciou buniek s rekombinantným plazmidom, obsahujúcim dlhé terminálne opakovania Rousovho nádorového vírusu a regulačnú SV40 ori-oblasť koprecipitáciou v prítomnosti fosforečnanu strontnatého (pozri Brash eŕ al., Mol. Celí Biol. 7, 2031 až 2034 (1987).
Ďalší známy spôsob prípravy imortalizovaných bunkových línií najmä imortalizovaných ľudských keratinocytov zahŕňa transfekciu alebo infekciu buniek s DNA sekvenciami ľudskéhu vírusu papilloma (HPV). Napríklad, v patente USA 5 375 542 (Schlegel) sa opisuje spôsob dosiahnutia imortalizovaných ľudských epitelových buniek E6 a E7 génmi, izolovanými z HPV-16, 18, 31, 33 alebo 36, alebo E7 génmi samotnými, na prípravu nie nádorotvorných imortalizovaných ľudských bunkových línií. Ďalej, Barbosa etal., Oncogene 4, 1529 až 1532 (1989), Míinger eŕ al., J. Virol. 63(10), 4417 až 4421 (1989) opisuje použitie E6 a E7 génov z HPV-16 a HPV-18 na prípravu imortalizovaných ľudských keratinocytov. Diirst eŕ al., Oncogene 1, 251 až 256 (1987) opisuje spôsob dosiahnutia imortalizovanosti keratinocytov vírusom papilóma, typu 16.
Hoci imortalizované keratinocytové bunkové línie a ich použitie v pokusoch in vitro opisujú mnohé skupiny odborníkov, predsa línie imortalizovaných keratinocytových buniek podľa doteraz známeho stavu v odbore majú jednu alebo dve vlastnosti, ktoré obmedzujú ich využitie. Už uvedené imortalizované keratinocyty majú napríklad jednu alebo viac z nasledujúcich nevýhodných vlastností: (a) majú zníženú alebo celkom chýbajúcu expresiu diferenciačných markerov, napríklad proteínov, ktoré sú exprimované normálnymi diferencovanými keratínocytmi; (b) je im vlastný modifikovaný rast v tkanivovej kultúre a (c) tvoria stratifikovaný a polarizovaný epitél s para-keratinocytovým stratum comeum.
Aby sa vylúčili uvedené nevýhody navrhuje sa v EP 780 496 (Société des Produits Nestlé) nový spôsob dosiahnutia imortalizácie keratinocytov alebo ľudských melanocytov, v ktorom sa používa en sus nové kultivačné prostredie,
-3vektor pLXSHD+SV40(#328), ktorý je odvodený od vírusu SV40, alebo rovnako vektor pLXSHD+E6/E7, ktorý je odvodený od ľudského papiloma vírusu 16 (HPV16). Imortalizované bunky získané týmto spôsobom si zachovávajú schopnosť diferenciácie a expresie proteínov a enzýmov, aké sú exprimované normálnymi diferencovanými keratínocytmi a melanocytmi aj po väčšom počte kultivačných pasáži.
Napriek doteraz uvedenému stále sa v praktickej oblasti pociťuje významná potreba ľudských imortalizovaných keratínocytov, ktoré by mali ešte lepšie vlastnosti. Uvedené zlepšené bunky by boli mimoriadne výhodné v značnom počte aplikácií, najmä na analýzy, ktoré vyžadujú vysoko diferencované kožné bunky.
Podstata vynálezu
Ľudská imortaiizovaná keratínocytová bunková línia s najmenej jedným tumorogénnym funkčným génom retrovírusového pôvodu, ktorá (1) nie je tumorogénna, (2) zachováva si schopnosť diferencovať a exprimovať proteíny a enzýmy exprimované normálnymi diferencovanými keratínocytmi aj po zvýšenom počte pasáži v tkaninovej kultúre, a (3) tvorí stratifikovaný a polarizovaný epitel s orto-keratínocytovým stratum comeum ak sa kultivuje v organo-typovej kultúre v bezsérovom prostredí a bez vrstvy výživných buniek.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy imortalizovaných keratínocytových bunkových línií, odvodených z normálnych kožných tkanív.
Vynález sa ešte ďalej týka spôsobu použitia keratínocytových bunkových línií pripravených podľa tohto vynálezu, napríklad na imunologické, farmakologické, fotoa chemicko-toxikologické analýzy reakcie kože a na expresiu heterológnych génov.
Vynález poskytuje nie tumorogénne, imortalizované keratínocytové bunkové línie, to znamená bunkové línie, ktoré napríklad po injekčnom podkožnom podaní netvoria nádory u zvierat pri použití najmenej 2 x 106 buniek v každej injekcii.
Tieto bunkové línie si tiež zachovávajú schopnosť diferencovať a exprimovať proteíny diferenciácie, exprimované normálnymi keratínocytmi, ešte aj po zvýšenom
-4počte pasáží. Výraz zvýšený počet pasáži znamená najmenej 10 pasáži v kultúre, výhodne najmenej 20 až 30 pasáži, výhodnejšie najmenej 50 pasáži a teoreticky neobmedzený počet pasáži. Imortalizované keratínocyty, pripravené podľa tohto vynálezu napríklad exprimujú diferenciačné proteíny obsahujúce keratín K1/10, keratín K14, involukrín, fifagrín a lorikrín ešte aj po zvýšenom počte pasáži v tkaninových kultúrach.
Imortalizované keratínocyty podľa tohto vynálezu majú profil cytochrómu p450 (CYP450) podobný, ale nie zhodný, s profilom normálnych keratínocytov. Bunky podľa tohto vynálezu napríklad exprimujú CYP450 1A1, 2E1, 2C18 a 3A5. Imortalizované keratínocyty podľa tohto vynálezu ďalej exprimujú enzýmy fázy II, napríklad glutatión-S-transferázu π (GSTn) spôsobom, porovnateľným s normálnymi, nie imortalizovanými keratínocytmi.
Uvedené imortalizované keratínocyty podľa tohto vynálezu ďalej exprimujú proteíny a enzýmy, zúčastňujúce sa oxidačných pochodov v bunkách a zápalových odoziev, napríklad superoxydismutázy (SOD) a kolagenázy typu I a nádorového nekrotického faktora a (TNFa) po ošetrení forbolovými estermi, podobným alebo rovnakým spôsobom, ako normálne diferencované keratínocyty. Týmito vlastnosťami predstavujú bunkové línie podľa tohto vynálezu mimoriadne zaujímavý, reprodukovateľný zdroj pre imunologické, farmakologické, zápalové, foto- a chemicko-toxikologické štúdiá kožných reakcií.
Ak sú línie imortalizovaných keratínocytov podľa tohto vynálezu kultivované v organotypových kultúrach v bezsérovom prostredí (napríklad prostredie NR2 firmy Biofluids Inc. USA, obohatené s EGF (5 ng.mľ1), vitamínom C (38 pg.mľ1) a CaCI2 (1,5 mmolu)) a bez vrstvy výživných buniek (bez fibroblastov) naviac vytvárajú stratifikovaný a polarizovaný epitel s povrchovými keratínovanými vrstvami, bežne označované ako tak zvané stratum comeum, ktoré má orto-keratinocytovú morfológiu, čo znamená, že stratum comeum je zbavené jadrových buniek, t.zn. buniek obsahujúcich jadro.
Príprava stratifíkovaného a polarizovaného epitelu s imortalizovanými keratínocytmi sa doteraz dosahovala v podmienkach tradičnej kultivácie, to znamená technikou, využívajúcou teľacie sérum a vrstvu výživných buniek (Lechner eŕ al., Virology 185, 536 až 571 (1991)). Uvedené imortalizované bunky ale netvoria
-5normálne povrchové keratínované vrstvy. Napríklad bunkové línie, imortalizované vírusom papiloma 16 alebo 18, alebo E6/E7 sú známe tým, že tvoria veľmi neusporiadaný epitel (Blanton etal., Am. J. Pathol. 138, 673 až 685 (1991; Hudson etal., J. Virol. 64, 519 až 526 (1990); McCane etal., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 7169 až 7173 (1988); Woodworth etal., Oncogene 7, 619 až 626 (1992)).
Na rozdiel od uvedeného, línie opísané v EP 780 496 (Société des Produits
Nestlé), ak sú kultivované v organo-typovej kultúre v bezsérovom prostredí a bez vrstvy výživných buniek vytvárajú stratifikovaný a polarizovaný epitel s normálnymi povrchovými keratínovanými vrstvami, ale majú para-keratínocytovú morfológiu, to znamená, že stratum comeum ešte stále obsahuje bunky s jadrom.
Imortalizované keratínocyty podľa tohto vynálezu tiež pohlcujú exogénne esenciálne mastné kyseliny (AGE) a predstavujú nenasýtený stav; predĺženie reťazca uvedenej AGE dokonale zodpovedá nenasýtenému stavu a predĺženiu reťazca normálnych keratínocytov.
Imortalizované keratínocyty podľa tohto vynálezu možno vo všeobecnosti pripraviť spôsobom zahrnujúcim:
(a) získanie vzorky ľudskej kože;
(b) prípravu vzorky kože na získanie primárnych keratínocytov schopných kultivácie;
(c) kultiváciu uvedených primárnych keratínocytov v bezsérovom prostredí, výhodne v prostredí NR-3 (opísané v EP 780 496) na kultivačných platniach s povlakom, uľahčujúcim fixáciu a rast buniek; uvedený povlak obsahuje fibronektín, SAB a kolagén ľ typu;
(d) nahradenie bezsérového prostredia takým spôsobom, aby sa na kultivačných platniach dosiahol optimálny splývavý (konfluentný) nárast keratínocytov; povlak platne sa nepretržite udržiava;
(e) oddelenie keratínocytov v kultúre od melanocytov a prenos oddelených keratínocytov do infekčného prostredia, výhodne do prostredia NR-3 a výhodne po ošetrení buniek podobným spôsobom kompozíciou, obsahujúcou trypsín a EDTA s použitím kultivačných platní s povlakom;
(f) infikovanie buniek funkčnými tumorogénnymi génmi z najmenej dvoch retrovírusov, ako sú vírus SV40 a vírus ľudského papilómu;
-6(g) prenos imortalizovaných keratínocytov do proliferačného prostredia bez séra na kultivačné platne, vopred podobným spôsobom pokryté, výhodne do prostredia NR-2 alebo NR-3 (prostredia sú opísané v EP 780 496); uvedené prostredia sa týmto odkazom zahŕňajú do tejto prihlášky; a (h) prenos imortalizovaných keratínocytov po proliferácii do bežného diferenciačného prostredia, ktoré má vysoký obsah vápnika (1,5 mM), výhodne do prostredie NR-2, obohateného s EGF (5 ng.mľ1) a vitamínom C (38 pg.mľ1).
Podrobný opis; krok (a) prípravy zvyčajne zahŕňa získanie vzoriek ľudského kožného tkaniva od normálneho ľudského darcu, napríklad získanie vzoriek počas chirurgického alebo pediatrického zákroku. Imortalizácia jednotlivej vzorky kožných buniek, to znamená autológnej vzorky kožných buniek, umožňuje produkciu imortalizovaných keratínocytových bunkových línií s určitými vlastnosťami, napríklad profil niektorého receptora je charakteristický pre určitého darcu.
Vzorka kožného tkaniva sa ďalej spracuje v kroku (b) tak, že je vhodná na kultiváciu in vitro. Toto spracovanie sa výhodne uskutoční počiatočným premývaním vzorky kožného tkaniva, napríklad premývaním prostredím použitým na kultiváciu. Tento pracovný úkon sa výhodne uskutoční v prostredí NR-2, ktoré je bezsérové a jeho presné zloženie sa uvádza EP 780 496; ukázalo sa, že na kultiváciu normálnych keratínocytov je toto prostredie výhodné. Je výhodné, ak sa vzorka kožného tkaniva po premytí oholí, napríklad pomocou dermatomu a následne sa rozreže na malé kúsky.
Je výhodné, ak sa výsledné rezy kože potom rozdelia na zamšu (dermis) a pokožku (epidermis). Rozdelenie možno uskutočniť fyzikálne a/alebo enzymaticky. Rozdelenie sa môže napríklad uskutočniť účinkom trypsínu, napríklad flotáciou vzoriek kožného tkaniva v roztoku trypsínu (napríklad v približne 0,5 % roztoku) obsahujúcom EDTA (napríklad 0,1 %) po dobu, ktorá postačuje na oddelenie buniek, napríklad po dobu približne 30 až 60 minút pri teplote 37 °C, alebo napríklad cez noc pri 4 °C.
Zamša sa oddelí a pokožka sa potom vloží do prostredia v ktorom sa disperguje na suspenziu. Je výhodné ak suspenzné prostredie obsahuje roztok inhibítora sójového trypsínu (SBTI) a ak sa prostredie privedie do styku s bunkami dostatočný čas, zvyčajne 5 minút, na inaktiváciu trypsínu a na vyvolanie
-7 uvoľňovania buniek. Aby sa získali vyžadované bunky, to znamená keratínocyty, pridá sa potom tkanivové kultivačné prostredie, výhodne prostredie NR-2, zbavené séra (opísané v EP 780 496) a filtrované (napríklad filtrom s pórmi 100 nm).
Výsledné primárne keratínocyty, pripravené v kroku (b) sa potom použijú ako zárodky do bezsérového prostredia, výhodne do prostredia NR-3 (je opísané v EP 780 496); použijú sa vo vhodnej koncentrácii, výhodne v koncentrácii približne 1,2x104 buniek na 1 cm2 vopred pokrytých platní. Túto koncentráciu buniek možno ale v širokom rozmedzí meniť. Kultivačné platne sa výhodne pokryjú povlakom, obsahujúcim kompozíciu, ktorá zlepšuje fixáciu a rast keratínocytov, bližšie roztokom fibronektínu, SAB a kolagénu I. typu.
V kroku (d) sa kultivačné prostredie nahrádza tak často, ako je potrebné na dosiahnutie optimálneho rastu buniek. Je výhodné, ak sa prostredie nahrádza vždy po približne dvoch dňoch. Tento interval ale môže byť rôzny v závislosti od príslušnej vzorky kožného tkaniva. Po dosiahnutí takmer úplného pokrytia, napríklad pokrytia približne 90%, ktoré sa dosiahne po približne 10 až 14 dňoch, sa keratínocyty oddelia od melanocytov. Delenie sa môže uskutočniť ktorýmkoľvek zvoleným spôsobom, ktorý umožňuje delenie bez škodlivého účinku na melanocyty a/alebo keratínocyty. Delenie sa môže napríklad vykonať diferenciačným ošetrením trypsínom. Je výhodné, ak melanocyty a keratínocyty sa ošetria roztokom trypsínu/EDTA a následne prenesú do selekčného prostredia. V prípade keratínocytov sa bunky výhodne ošetria počas približne 5 až 10 minút roztokom trypsínu/EDTA (0,025 % / 0,01 %) a potom sa použijú v kroku (e) ako zárodky do prostredia NR-3 na vopred pokryté platne.
Keratínocyty sa následne spracujú s imortalizačným činidlom. Kým sa uskutoční imortalizácia bunky možno zmraziť. Zmrazenie možno vykonať napríklad v tekutom dusíku. Infekcia a imortalizácia sa výhodne uskutočnia použitím funkčných tumorogénnych génov z najmenej dvoch retrovírusov, ako sú napríklad T-Ag vírusu SV40 a E6/E7 HIV16. Každý z týchto génov môže byť prítomný v nezávislom retrovírusovom konštrukte, napríklad v retrovírusovom vektore pLXSHD+SV40(#328), znázornenom na Obr. 1 a opísanom Stockshlaederom et al. (GeneBank, prístupové číslo M64753; Human Gene Therapy 2, 33 až 39 (1991) a v retroví rusovom vektore pLXSHD+E6/E7, ktorý je znázornený na Obr. 2.
-8Retrovírusový vektor pl_XSHD+SV40(#328) obsahuje okrem iných sekvencii sekvenciu T-Ag z SV40, dlhé 5' a 3' sekvencie, terminálne opakovania z SV40, sekvencie pBR322, ktoré umožňujú replikáciu E. coli, cyklus násobného klonovania, polyadenylačnú sekvenciu z SV40.
Vektor pLXSHD+E6/E7 obsahuje v polohe génu kódujúceho pre T antigén Ncol/Cfol fragment z E6/E7 génu, odvodený od vírusu 16 ľudského papilómu.
Po imortalizácii sa následne bunky počas kultivácie podrobia potrebnému počtu pasáži a výsledné imortalizované bunky sa potom prenesú do proliferačného prostredia v kroku (g). Tento prenos sa výhodne vykoná počas druhej pasáže. Ako uvedené proliferačné prostredie možno použiť bezsérové prostredie, výhodne prostredie NR-2 alebo NR-3. Imortalizované bunky sa kultivujú na kultivačných platniach, vopred spojito pokrytých povlakom, obsahujúcim opäť roztok fibronektínu, SAB a I. typ kolagénu.
Po multiplikácii imortalizovaných buniek v proliferačnom prostredí (výhodne v NR-2) sa keratínocyty prenesú v kroku (h) do prostredia podnecujúceho diferenciáciu normálnych a imortalizovaných buniek, výhodne do prostredia simulujúceho podmienky prevládajúce v koži; tak sa vytvára organizácia keratínocytov v stratifikovanom a polarizovanom epiteli s normálnymi povrchovo keratínizovanými vrstvami. Bunky sa nakoniec môžu kultivovať v bezsérom prostredí s vysokým obsahom vápnika, napríklad v prostredí NR-2, obsahujúcom približne 1,5 mM vápnika, približne 5 ng.mľ1 EGF a približne 38 pg.mľ1 vitamínu C; kultivácia sa vykoná na platniach v priebehu 2 až 3 týždňov na fázovom rozhraní tekutina-vzduch, napríklad na platniach s 12 jamkami Falcon No.3043, každá jamka má vložený Falcon No.3180, pričom keratínocyty sa vyvíjajú na rozhraní vzduch/kvapalina. Vzduch pozostáva z atmosféry, obsiahnutej vo vnútornom priestore vložky a je bez výživného prostredia. Kvapalina je výživné prostredie a je v jamke; prostredie prechádza membránou vložky Falcon No.3180, na ktorej sa vyvíjajú keratínocyty.
Čo sa týka vlastností imortalizovaných keratínocytov podľa tohto vynálezu, tieto sú bezvýhradne vhodné na imunologické, farmakologické, foto- a chemickotoxikologické analýzy reakcií kože. Imortalizované línie keratínocytových buniek podľa tohto vynálezu možno napríklad použiť na analýzy vyžadujúce diferenciáciu
-9kožných buniek, napríklad v štúdiách bariérovej funkcie (keratinizácie) rekonštruovaného kožného tkaniva, v štúdiách metabolizmu diferencovaných keratínocytov (metabolizmus mastných kyselín, metabolizmus antioxidantov), v štúdiách vplyvu UV žiarenia na kožné bunky, v štúdiách vplyvov látok s potenciálnym dráždivým účinkom na kožné bunky a látok spôsobujúcich precitlivelosť buniek pokožky, v štúdiách metabolizmu lipidov, na miestne ošetrenia a/alebo v štúdiách vplyvu prostredia s xenobiotickými látkami (napríklad kozmetických olejov pri výbere prípustných ochranných kompozícií, napríklad foto-ochranných látok), v štúdiách zápalov a dráždenia kože a v ďalších.
Keratínocytové bunkové línie, pripravené podľa tohto vynálezu možno ďalej použiť na výber potenciálne protirakovinových látok a zlúčenín, potenciálne použiteľných na liečbu kožných chorôb. Liečba vo všeobecnosti zahŕňa uvedenie bunkovej línie do styku po zvolenú dobu so skúšanými látkami a stanovenie potenciálnej indukcie akýchkoľvek škodlivých účinkov, napríklad genotoxických účinkov, tvorby DNA-aduktov, mutagenity, bunkovej transformácie alebo cytotoxických účinkov.
Línie imortalizovaných keratínocytov podľa tohto vynálezu možno ďalej použiť pri skúškach mutagenity DNA, pri skúškach selekcie látok spôsobujúcich mutagenitu kože, pri analýzach a identifikácii látok ovplyvňujúcich zmeny chromozómov, v štúdiách malignantných transformácií, v štúdiách bunkovej biochémie (napríklad analýzy aktivácie CYP450), pri výbere zlúčenín a kompozícií, napríklad zmesí esenciálnych mastných kyselín zapájajúcich sa v zápalových a alergických reakciách, v analýzach aktivácie kolagenázy (v spojení so zápalom), zahŕňajúcej TNFa a detekciu interleukínu.
Vzhľadom na skutočnosť, že bunkové línie podľa tohto vynálezu tvoria ortokeratínicytové stratum comeum, sú veľmi dobre prispôsobené na použitie pri príprave umelej kože, vhodnej na štúdiá mutagenity, na imunologické, farmakologické, foto- a chemicko- toxikologické štúdiá, uvedené hore. Táto koža môže pozostávať iba z epitelu keratínocytov podľa tohto vynálezu, ale výhodne obsahuje tiež kolagén, fibroblasty, aj melanocyty, napríklad preto, aby sa dosiahla lepšia podobnosť s normálnou ľudskou kožou.
-10Keratínocytové bunkové línie podľa tohto vynálezu sú ďalej schopné exprimovať rekombinantná proteíny, napríklad ľudské polypetidy a proteíny a sú schopné produkovať aj RNA a DNA.
Medzi imortalizovanými keratínocytovými bunkovými líniami podľa tohto vynálezu je iba jediná bunková línia DK-7NR, ktorá je ako príklad od 19. marca 1998 uložená podľa Budapeštianskej dohody v Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M.) [Adresa: 25 rue de Docteur Roux, 75 724 Paris, France] a má pridelené úložné číslo CNCM 1-1996. Uloženie sa vykonalo podľa Budapeštianskej dohody. Všetky obmedzenia, ktoré sa týkajú dostupnosti tejto bunkovej línie budú zrušené po priznaní patentu, príslušnému tejto patentovej prihláške alebo inej prihláške, nárokujúcej prioritu tejto prihlášky.
Ďalšie znaky tohto vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho opisu príkladov, ktoré sa uvádzajú na objasnenie tohto vynálezu a v žiadnom prípade nie na jeho obmedzenie. Pokiaľ sa neuvádza inak, manipulácie s bunkami, príprava vektorov, transformácia buniek a všetky ďalšie technické postupy sa vykonávajú v súlade s protokolmi, opísanými v publikácii Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1989).
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje konštrukciu podľa tohto vynálezu, odvodeného retrovírusu SV40, menovite plazmidu pLXSHD+SV40((#328), použitého na dosiahnutie imortalizovanosti keratínocytov.
Obr. 2 predstavuje konštrukciu podľa tohto vynálezu, odvodenú od retrovírusu vírusu papilóma 16, menovite plazmidu pLXSHD+E6/E7, použitú na dosiahnutie imortalizácie keratínocytov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava a vlastnosti bunkových línií
-11 Vzorky kožného tkaniva sa odobrali z oblasti pŕs. Po oddelení dermálnej a epidermálnej časti sa zamša upravila rezom na malé kúsky 0,2 x 0,2 mm a kúsky sa fixovali sérom na 6 cm kultivačnú platňu. Po 2 až 4 hodinách sa pridalo Dulbeccovo minimálne prostredie (DMEM, 10 % fetálne teľacie sérum). Kultúra explantov sa potom inkubovala až do zreteľného intenzívneho rastu fibroblastov. Kultúry súvislo rozložených fibroblastov sa oddelili a multiplikovali, aby sa získali rezervné zmrazené kultúry.
Primárnymi bunkami sa očkovali kultivačné komory, ktoré mali súvislý povlak kokteilu; tento povlak bol opísaný pre bronchiálne bunky (Lechner et al., J. Tiss. Cult. Meth. 9, 43 až 49 (1985)). Po dosiahnutí takmer úplného pokrytia, napríklad po dosiahnutí 90 % pokrytia, čo trvalo zvyčajne približne 10 až 14 dní sa keratínocyty a melanocyty oddelili. Kultúra sa nakoniec po dobu 5 minút ošetrila roztokom trypsínu/EDTA (0,025 % / 0,01 %) a prv samy odseparované melanocyty sa následne oddelili od keratínocytov. Primárne keratínocyty sa následne kultivovali s použitím opísaných kultivačných komôr v prostredí NR-3 bez séra až do vyžadovanej koncentrácie buniek (prostredie NR-3 uprednostňuje rast keratínocytov v porovnaní s rastom melanocytov).
Bunky sa potom transfektovali plazmidmi pLXSHD+SV40(#328) a pLXSHD+E6/E7 podľa protokolu Pfeifera etal. (Meth. Celí. Sci. 17, 83 až 89 (1995)) s výnimkou, že vírus bol odobratý po enkapsulácii v bunkovej línii, ktorá rástla v prostredí DMEM s 10 % fetálneho bovinného séra. Na dosiahnutie imortalizácie sa keratínocyty potom infektovali vírusom. Počas infekcie sa tiež použilo prostredie bez séra PC-1, ktoré sa opisuje v hore uvedenej publikácii Pfeifera et al.
Po imortalizácii sa imortalizované keratínocyty preniesli do proliferačného prostredia NR-2 alebo NR-3, pričom sa použili kultivačné komôrky s vopred pripraveným povlakom. Po proliferácii buniek na vyžadovaný počet buniek sa bunky preniesli do diferenciačného prostredia, vhodného na kultiváciu normálnych aj imortalizovaných keratínocytov (NR-2).
Možno preukázať, že imortalizované keratínocyty lepšie rastú aj pri zvýšenom počte kultivačných pasáži, čo možno porovnávať s rastom, opísanom pre bunkové línie podľa EP 780 496.
- 12V kožných bunkách, obsahujúcich normálne alebo imortalizované keratínocyty sa hodnotila expresia CYP450, 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 a 2D6 pomocou
DNA polymerázovej reťazovej reakcie pri teplote miestnosti (expresia mRNA). Profil imortalizovanými keratínocytmi exprimovaného CYP450 je pri najmenšom podobný ak nie rovnaký, ako uvedený profil normálnych keratínocytov.
Uvedené bunkové línie reagujú na indukčnú látku CYP450, obsahujúcu benz(a)pyrén rovnakým spôsobom ako neimortalizované bunky a to aj pri zvýšenom počte pasáži.
Diferenciačné markery sa analyzovali pomocou špecifických protilátok proti T-Ag, involukrínu, filagrínu, lorikrínu, vimentínu a keratínom K4, K7, K8, K10/1, K13, K14, K17, K18 a K19. Najlepšiu schopnosť diferenciácie možno pripísať bunkovej línii DK-7-NR.
Spôsobmi Western-blot a Northern-blot sa analyzovala glutatión-S-transferáza (GST). Všetky línie keratínocytov silne exprimovali mesengerovú RNA pre GSTk. Profil expozície k GSTa, GSTg a GSTn v uvedených bunkových líniách je podobný profilu normálnych keratínocytov.
Na analýzu a porovnanie desaturácie a predĺženia ku keratínocytom pridanej AGE sa imortalizované keratínocyty (a tiež normálne keratínocyty) ošetrili kyselinou linolovou (LA, 15 gmolov) a kyselinou linolénovou (LN, 15 μιτιοίον). V týchto pokusoch sa použilo prostredie NR-2 (Biofluids Inc.), nedostatočné na AEG. Po dosiahnutí konfluencie sa bunkové kultúry ošetrili a preniesli sa z uvedeného prostredia do prostredia NR-2 s vysokým obsahom vápnika (1,5 mM). Bunky sa ošetrovali AEG počas 4 dní (po dvoch dňoch sa AEG obnovilo). Analýza AEG sa vykonala extrakciou a separáciou fosfolipidov pomocou CCM (chromatografia v tenkej vrstve) a kvantitatívne stanovenie metylesterov mastných kyselín sa vykonalo pomocou GCL (chromatografia plyn/kvapalina). Zaznamenala sa desaturácia a elongácia LA (20:4n-6 a 22:4n-6) a LN (20:5n-3, 22:5n-3, a 22:6n-3). Metabolický profil bol zhodný s profilom, pozorovaným u normálnych keratínocytov.
Všetky bunkové línie boli hypodiploidné s najväčším počtom chromozómov v intervale diploidných buniek. Okrem analyzovaných buniek neboli v kultúrach prítomné iné bunky. Tento výsledok potvrdzuje čistotu uvedených bunkových línií a žiadne znečistenie z iných zdrojov.
-13Schopnosť imortalizovaných buniek vyvolávať nádory sa stanovovala subkutánnou injekciou (1 až 2 x 106 kyratínocytov) myší. Línie skúšaných keratínocytov a najmä línia DK-7-NR neboli voči myšiam tumorogénne.
Príklad 2
Príprava epitelu
Pripravilo sa prostredie NR-2 s obsahom 750 000 buniek z bunkovej línie z príkladu 1; do vložiek Falcon No.3180 sa odmeralo po 0,5 ml pripraveného prostredia, vložky sa umiestnili do jamiek platní Falcon No.3043, ktoré už obsahovali 2 ml čerstvého prostredia NR-2; keratínocyty sa kultivovali 2 dni v podmienkach, priaznivých pre rast keratínocytov. Tretí deň sa prostredie z vložiek odstránilo a bunky sa nechali voľne na vzduchu. Prostredie v jamkách sa pravidelne každé dva dni vymieňalo za prostredie NR-2 doplnené s EGF (5 ng.mľ1), vitamínom C (38 pg.mľ1) a CaCb (1,5 mM). Týmto spôsobom sa v kultúre po dvoch až troch týždňoch na rozhraní vzduchu a kvapaliny vytvoril epitel, ktorý sa oddelil a fixoval kyselinou pikrovou; po fixácii sa zhodnotila morfológia.
Výsledky ukázali, že keratínocytové bunkové línie, najmä línia DK-7-NR vytvárajú stratifikovaný a polarizovaný epitel, bežne označovaný ako tak zvaný stratum basale, obsahujúci bunky s kuboidálnou morfológiou, identickou s normálnymi bunkami. Stratum comeum má morfológiu orto-keratínocytov, to znamená, že je zbavené buniek obsahujúcich jadro. Vznik orto-keratínocytovej bunkovej vrstvy u iných známych imortalizovaných bunkových línií nebol doteraz možný. Napríklad bunková línia DK-2-NR (EP 780 496) v rovnakých podmienkach tvorí stratum comeum para-keratínocytov, to znamená že vrstva zrohovatených buniek stále obsahuje bunky s jadrom. Normálnu situáciu ľudskej kože ale reflektuje iba orto-keratínocytová morfológia. Para-keratínocytové stratum comeum sa v skutočnosti vyznačuje anomálnou hypertrofiou epitelu, vedúcou k poruchám, ako je napríklad psoriáza alebo neoplazia.
Príklad 3
Skúška dráždivosti
- 14Bunkové línie získané v Príklade 1, najmä línia DK-7-NR sa kultivovali v prostredí NR-2. Northernovým prenosom a biologickými analýzami sa po vystavení pokožky účinkom dráždivých činidiel, obsahujúcich PMA (forbol-12-myristát-13acetát) a UV-B (ultrafialové žiarenie B) hodnotila indukcia stresového génu TNFa (nádorový nekrotický faktor a). Výsledky preukázali, že uvedené bunkové línie, najmä bunková línia DK-7-NR poskytujú odozvu na PMA a na UV-B a exprimujú proteín TNFa aj po zvýšenom počte pasáži.
Príklad 4
Vo vložke Falcon No.3180 sa nahradila membrána vrstvou benzylesteru kyseliny hyalurónovej (Hyaff 11). Dno vložky sa očkovalo primárnymi ľudskými fibroblastmi (0,1 x 106 buniek v 0,2 ml prostredia); po 30 minútach odozvy sa vložka naplnila prostredím DMEM, obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra; inkubovalo sa niekoľko dní pri 37 °C v atmosfére s obsahom 5 % CO2; vložka sa potom vyprázdnila a pridalo sa 0,5 ml prostredia NR-2, obsahujúceho 750 000 buniek bunkovej línie DK-7-NR; vložky sa vložili do jamiek platní Falcon No.3043 v ktorých už boli po 2 ml čerstvého prostredia NR-2; bunky sa kultivovali 2 dni v podmienkach priaznivých pre rast keratínocytov. Tretí deň sa prostredie z vložiek odstránilo a bunky sa nechali voľne na vzduchu. Prostredie v jamkách sa pravidelne každé dva dni vymieňalo za prostredie NR-2 doplnené s EGF (5 ng.mľ1), vitamínom C (38 pg.mľ1) a CaCI2 (1,5 mM). Po dvoch až troch týždňoch sa týmto spôsobom v kultúre na rozhraní vzduchu a kvapaliny vytvorila umelá koža, ktorá podľa hodnotenia mala vlastnosti význačné pre normálnu kožu.
Claims (14)
1. Ľudská keratínocytová bunková línia, imortalizovaná najmenej jedným funkčným nádorovým génom retrovírusového pôvodu, ktorá:
(1) nie je tumorogénna, (2) zachováva si schopnosť diferencovať a exprimovať proteíny a enzýmy, exprimované normálnymi diferencovanými keratínocytmi, aj po zvýšenom počte kultivačných pasáži, a (3) tvorí stratifikovaný a polarizovaný epitel s orto-keratínocytovým stratum comeum ak sa kultivuje v organo-typovej kultúre v bezsérovom prostredí a bez vrstvy výživných buniek.
2. Ľudská keratínocytová bunková línia podľa nároku 1, imortalizovaná funkčnými nádorovými génmi retrovírusového pôvodu z najmenej dvoch rozdielnych retrovírusov.
3. Ľudská keratínocytová bunková línia podľa nároku 2, kde funkčné nádorové gény sú odvodené od vírusu SV40 a od ľudského papilóma vírusu 16.
4. Ľudská keratínocytová bunková línia podľa nároku 3, kde každý funkčný nádorový gén je obsiahnutý v nezávislom retrovírusom konštrukte.
5. Ľudská keratínocytová bunková línia podľa nároku 1, ktorou je bunková línia DK-7-NR s úložným číslom podľa Budapeštianskej dohody CNCM 1-1996.
6. Spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek na získanie imortalizovaných keratínocytov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:
(a) izoláciu vzorky ľudskej kože;
(b) prípravu vzorky kože na kultiváciu in vitro;
(c) získanie keratínocytov z uvedenej pripravenej vzorky kožného tkaniva a očkovanie rastového bezsérového prostredia na kultivačných platniach s
-16povlakom fibronektínu, SAB a kolagén I. typu, ktoré uľahčujú fixáciu a rast buniek;
(d) nahradenie bezsérového prostredia takým spôsobom, aby sa na kultivačných platniach dosiahol optimálny súvislý (konfluentný) nárast keratínocytov ; povlak platne sa nepretržite udržiava;
(e) prenos keratínocytov do selekčného bezsérového prostredia na kultivačné platne, vopred pokryté povlakom podobne ako hore;
(f) infikovanie keratínocytov funkčnými nádorovými génmi z najmenej dvoch retrovírusov;
(g) prenos výsledných imortalizovaných keratínocytov do proliferačného prostredia bez séra, vhodného na proliferáciu imortalizovaných keratínocytov, na kultivačné platne, vopred pokryté podobným spôsobom ako hore;
(h) prenos výsledných proliferovaných imortalizovaných keratínocytov do diferenciačného prostredia bez séra, ktoré má vysoký obsah vápnika, do kultivačných komôr, vopred pokrytých povlakom ako hore.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že funkčné nádorové gény sú odvodené od vírusu SV40 a od vírusu 16 ľudského papilómu.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že každý funkčný nádorový gén je obsiahnutý v nezávislom retrovírusovom konštrukte.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že použité retrovírusové konštrukty sú vektory pl_XSHD+SV40(# 328) a pLXSHD+E6/E7.
10. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že bezsérové prostredie v krokoch (c), (e) alebo (g) je prostredie NR-3.
11. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že diferenciačné prostredie v kroku (h) je upravené prostredie NR-2 s obsahom vápnika najmenej 1,5 mM.
-1712. Použitie keratínocytov podľa nároku 1 na imunologické, farmakologické, foto- a chemicko-toxikologické analýzy reakcií kože a na expresiu heterológnych génov.
13. Použitie podľa nároku 12, v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že sa použije línia DK-7-NR s úložným číslom podľa Budapeštianskej dohody CNCM 1-1996.
14. Umelá koža, v y z n a č u j ú c a sa t ý m, že obsahuje keratínocytovú bunkovú líniu podľa nároku 1.
15. Umelá koža podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že obsahuje bunkovú líniu DK-7-NR, ktorá má úložné číslo podľa Budapeštianskej dohody CNCM 1-1996.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98201247 | 1998-04-17 | ||
| PCT/EP1999/002347 WO1999054435A2 (fr) | 1998-04-17 | 1999-04-07 | Lignee de cellules immortalisees derivees de tissus cutanes humains normaux |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK15492000A3 true SK15492000A3 (sk) | 2001-03-12 |
| SK286870B6 SK286870B6 (sk) | 2009-06-05 |
Family
ID=8233616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1549-2000A SK286870B6 (sk) | 1998-04-17 | 1999-04-07 | Ľudská keratinocytová bunková línia, in vitro spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6566136B2 (sk) |
| EP (1) | EP1071747B1 (sk) |
| JP (1) | JP4671504B2 (sk) |
| KR (1) | KR20010074488A (sk) |
| CN (1) | CN1299409A (sk) |
| AT (1) | ATE274050T1 (sk) |
| AU (1) | AU756151B2 (sk) |
| BR (1) | BR9909699A (sk) |
| CA (1) | CA2324479C (sk) |
| CZ (1) | CZ20003842A3 (sk) |
| DE (1) | DE69919531T2 (sk) |
| DK (1) | DK1071747T3 (sk) |
| ES (1) | ES2226383T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0101913A3 (sk) |
| IL (1) | IL138417A0 (sk) |
| NO (1) | NO325588B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ506944A (sk) |
| PL (1) | PL201401B1 (sk) |
| PT (1) | PT1071747E (sk) |
| RU (1) | RU2244005C2 (sk) |
| SK (1) | SK286870B6 (sk) |
| WO (1) | WO1999054435A2 (sk) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6368815B1 (en) * | 1999-03-29 | 2002-04-09 | Warner-Lambert Company | Screening of molecules that inhibit human phosphodiesterase 4A produced by non-recombinant cell lines |
| EP1130086A1 (en) * | 2000-02-18 | 2001-09-05 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Genetically engineered keratinocytes and toxicity assay using said keratinocytes |
| IT1316995B1 (it) * | 2000-02-25 | 2003-05-26 | Idi Irccs | Procedimento per ottenere da colture primarie di cheratinociti umanilinee cellulari immortalizzate. |
| AU2002342613A1 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-25 | Geron Corporation | Treatment for wounds |
| DE10255285A1 (de) * | 2002-11-26 | 2004-06-03 | Mcs Micro Carrier Systems Gmbh | Selbst formende Phospholipid-Gele |
| US8669109B2 (en) | 2003-08-19 | 2014-03-11 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Methods of producing proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells |
| DE10338531A1 (de) | 2003-08-19 | 2005-04-07 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Reklonierung von Produktionszellen |
| EP1557085A1 (en) | 2004-01-21 | 2005-07-27 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Mouse model for human psoriasis |
| WO2006047426A2 (en) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions, methods and systems for preparation of a stem cell-enriched cell population |
| KR101323459B1 (ko) * | 2004-12-23 | 2013-10-29 | 메디뮨 엘엘씨 | 바이러스의 증식을 위한 비종양형성성 ｍｄｃｋ 세포주 |
| EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| CN105219697A (zh) * | 2014-07-04 | 2016-01-06 | 赫柏慧康生物科技无锡有限公司 | 一种人原代角质细胞分离制备的方法 |
| RU2573940C1 (ru) * | 2014-12-11 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Клеточная линия рака почки человека ibgvat r 6 |
| RU2573938C1 (ru) * | 2014-12-11 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Клеточная линия рака почки человека ibgvat r 27 |
| WO2023123299A1 (en) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | Beijing Theraxyte Bioscience Co., Ltd. | Compositions and methods for culturing stem cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2203630A1 (en) * | 1994-11-08 | 1996-05-17 | Bradley Michael John Stringer | Human cell-lines |
| CZ297289B6 (cs) * | 1995-12-21 | 2006-10-11 | Societe Des Produits Nestle S. A. | Imortalizované bunecné linie a zivné médium |
| US5811297A (en) * | 1996-03-07 | 1998-09-22 | Amba Biosciences, Llc | Immortalized hematopoietic cell lines, cell system thereof with stromal cells, in vitro, ex vivo and in vivo uses, & in vitro generation of dendritic cells and macrophages |
-
1999
- 1999-04-07 DK DK99920605T patent/DK1071747T3/da active
- 1999-04-07 ES ES99920605T patent/ES2226383T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-07 BR BR9909699-4A patent/BR9909699A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-04-07 RU RU2000129131/13A patent/RU2244005C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 AT AT99920605T patent/ATE274050T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 IL IL13841799A patent/IL138417A0/xx unknown
- 1999-04-07 SK SK1549-2000A patent/SK286870B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 CN CN99805127A patent/CN1299409A/zh active Pending
- 1999-04-07 HU HU0101913A patent/HUP0101913A3/hu unknown
- 1999-04-07 PT PT99920605T patent/PT1071747E/pt unknown
- 1999-04-07 EP EP99920605A patent/EP1071747B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-07 CZ CZ20003842A patent/CZ20003842A3/cs unknown
- 1999-04-07 WO PCT/EP1999/002347 patent/WO1999054435A2/fr active IP Right Grant
- 1999-04-07 PL PL364980A patent/PL201401B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 CA CA002324479A patent/CA2324479C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 NZ NZ506944A patent/NZ506944A/en unknown
- 1999-04-07 DE DE69919531T patent/DE69919531T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-07 KR KR1020007011556A patent/KR20010074488A/ko active IP Right Grant
- 1999-04-07 JP JP2000544768A patent/JP4671504B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 AU AU38135/99A patent/AU756151B2/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-09-18 US US09/663,645 patent/US6566136B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-06 NO NO20005053A patent/NO325588B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2324479A1 (en) | 1999-10-28 |
| RU2244005C2 (ru) | 2005-01-10 |
| PL364980A1 (en) | 2004-12-27 |
| CA2324479C (en) | 2007-12-04 |
| CN1299409A (zh) | 2001-06-13 |
| CZ20003842A3 (cs) | 2001-08-15 |
| US20020042133A1 (en) | 2002-04-11 |
| ATE274050T1 (de) | 2004-09-15 |
| KR20010074488A (ko) | 2001-08-04 |
| PL201401B1 (pl) | 2009-04-30 |
| AU3813599A (en) | 1999-11-08 |
| NO20005053L (no) | 2000-11-29 |
| BR9909699A (pt) | 2002-04-30 |
| ES2226383T3 (es) | 2005-03-16 |
| DE69919531T2 (de) | 2005-09-15 |
| DE69919531D1 (de) | 2004-09-23 |
| NO20005053D0 (no) | 2000-10-06 |
| NZ506944A (en) | 2003-10-31 |
| EP1071747A2 (fr) | 2001-01-31 |
| JP2003516711A (ja) | 2003-05-20 |
| HUP0101913A2 (hu) | 2001-09-28 |
| PT1071747E (pt) | 2004-12-31 |
| NO325588B1 (no) | 2008-06-23 |
| IL138417A0 (en) | 2001-10-31 |
| WO1999054435A3 (fr) | 1999-12-09 |
| EP1071747B1 (fr) | 2004-08-18 |
| HUP0101913A3 (en) | 2002-06-28 |
| JP4671504B2 (ja) | 2011-04-20 |
| SK286870B6 (sk) | 2009-06-05 |
| WO1999054435A2 (fr) | 1999-10-28 |
| US6566136B2 (en) | 2003-05-20 |
| AU756151B2 (en) | 2003-01-02 |
| DK1071747T3 (da) | 2004-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6423540B2 (en) | Immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof | |
| SK15492000A3 (sk) | Ľudská keratínocytová bunková línia, spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom | |
| EP1303589B1 (en) | Pre-adipose cell lines | |
| JP2000506374A5 (sk) | ||
| EP0929661A1 (en) | Novel method of culturing human epithelial cells for the identification of cancer therapeutics and diagnostics | |
| Négrel et al. | Cultures of adipose precursor cells and cells of clonal lines from animal white adipose tissue | |
| Price et al. | Approaches to enhance proliferation of human epidermal keratinocytes in mass culture | |
| MXPA00009558A (en) | Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20090428 |