CN1299409A - 由正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及经由至少一种逆病毒衍生的功能性致瘤基因无限增殖化的人角质细胞细胞系,该细胞系具有如下特点(1)非致瘤的,(2)即使在组织培养中高速率传代之后仍保留分化及表达正常分化的角质细胞表达的蛋白和酶的特性,以及(3)在无血清培养基和无饲养细胞层时进行器官型培养,形成包括正常角质角质层(Stratum Corneum)的复层极化上皮。本发明还涉及无限增殖化人皮肤细胞获得无限增殖的角质细胞的改进方法,该方法的特点在于它包括用至少两种不同逆病毒的功能性致瘤基因感染角质细胞的步骤。本发明进一步涉及所述角质细胞应用于免疫的,药理学的。光毒理学和化学毒理学皮肤反应,表达异源基因及构建人造皮肤的应用。
Description
本发明涉及由正常人皮肤组织衍生的新的无限增殖的细胞系,该细胞系具有改善的分化特性,涉及制备这些细胞系的新方法及其应用,尤其在创造人工皮肤的领域。技术状况
从正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系的制备已有过描述。一般地,为此目的方法包括人皮肤细胞的转化,例如角质细胞和黑色素细胞,在体外培养加入传送无限增殖化的试剂。无限增殖化涉及细胞的生产,细胞可在体外长期培养,理论上为无限时期。这些细胞也命名为传代细胞系(连续细胞系)。与之对照,非无限增殖的细胞体外仅能在有限次数细胞分裂过程中增殖。无限增殖化细胞非常有益,因其提供具有一定特性的稳定的,假定无限的细胞来源,无限增殖化细胞系和无限增殖化人皮肤细胞系的制备用的典型药剂特别包括,例如病毒、重组病毒和包含传送无限增殖化特性的DNA序列的质粒。
无限增殖的人细胞系制备的最普通方法包括猿猴病毒40(SV40)的序列和更具体的SV40的大T抗原(T-Ag)的DNA作为无限增殖化试剂的应用。例如,Steinberg等,细胞生理学,123,117-125(1985);US4885238(Reddel等);US4707448(Major);stoner等.,癌症研究.,51,365-371(1991);Chopra等.,体外细胞发育生物学.,30A,539-546(1994);Chopra等.,体外细胞发育生物学,27A,763-765(1991);Christian等.,癌症研究47,6066-6073(1987);Rhim等.,科学,227,1250-1252(1985);和Grubman等.,胃肠,肝脏生理病理学,29,G1060-G1070(1994)报道了SV40载体及含SV40大T抗原的序列的载体在制备无限增殖的人细胞系中的应用。这些序列的引入一般通过SV40病毒或12/SV40杂交腺病毒感染或包括劳斯肉瘤病毒的长末端重复和调节SV40起始区的重组质粒经磷酸锶存在下的共沉淀进行细胞转化而实现。(见Brash等.,分子细胞生物学,7,2031-2034,1987)
另一个已知的无限增殖化细胞系,特别是无限增殖的人角质细胞的制备方法包括以人乳头瘤病毒(HPV)的DNA序列对细胞的转化或感染。例如,US5376542(Schlegel)描述了采用HPV-16,18,31,33或35分离的E6和E7基因或仅E7基因对人上皮细胞无限增殖化,制备非致瘤的无限增殖的人细胞系。此外,Barbosa等,癌基因,4,1529-1532(1989);和Münger等,病毒学杂志,63(10):4417-4421(1989)报道了HPV-16和HPV-18的E6和E7基因制备无限增殖的人角质细胞的应用。此外,Dürst等.,癌基因,1,251,256(1987)描述使用乳头状瘤病毒型16进行的角质细胞的无限增殖化。
尽管如此,众多的小组描述了无限增殖的角质细胞系及它们在体外试验中的应用,本领域确定的无限增殖的角质细胞系通常呈现它们利用不便之外的一或更多特性。例如,以往描述的无限增殖的角质细胞呈现以下特性的一或更多种:(ⅰ)分化标志物的表达的减少或丢失,例如由正常分化角质细胞表达的蛋白,(ⅱ)组织培养中生长特性的改变和(ⅲ)形成具有角化不全角质层的复层极化上皮。
为消除这些缺陷,EP 780496(Société des Produits Nestlé)提出无限增殖化角质细胞或人黑色素细胞的新方法,使用en sus新培养基,从SV40病毒衍生的载体PLXSHD+SV40(#328),或从人乳头状瘤病毒16(HPV-16)衍生的同等载体PLXSHD+E6/E7。由此方式获得的无限增殖的细胞保留分化的能力以及表达正常分化的角质细胞和黑色素细胞表达的蛋白和酶的能力,即便在培养中多次传代之后。
但是,除以上描述之外,在应用领域还需要具更多改良特性的无限增殖的角度细胞。这样的细胞对许多应用非常有益,尤其是对需要高度分化皮肤细胞的分析。
发明概述
本发明涉及人无限增殖化角质细胞系,该细胞系通过至少一种逆病毒来源的致瘤性功能基因而无限增殖化,具有如下特点:
(1)非致瘤性
(2)组织培养中多次传代后仍保持分化和表达正常分化角质细
胞表达的蛋白和酶的能力,和
(3)在无血清培养基中且无饲养细胞层中进行器官型培养时,
形成具有角质层正常角质细胞的复层极化上皮。
本发明的另一目的在于提供制备来源于正常皮肤组织无限增殖化的角质细胞系的新方法。
而且,本发明的另一目的在于提供根据本发明的应用这些角质细胞系的方法,例如对皮肤反应的免疫学的,药理学的,和化学毒理分析,以及异源基因的表达。
附图简述
图1示由逆病毒SV40衍生的,称为质粒PLXSHD+SV40(#328)的结构,该质粒运用于无限增殖化本发明的角质细胞。
图2表示由乳头状瘤病毒16的逆病毒衍生的,称为质粒PLXSHD+E6/E7的结构,该质粒用于无限增殖化本发明的角质细胞。
发明详述
本发明提供非致瘤性的,无限增殖的角质细胞系,即当对一种动物皮下注射至少2×106细胞时不形成肿瘤的细胞系。
该细胞系在多次传代后仍保持分化和表达正常角质细胞表达的分化蛋白的能力。词句“多次传代”意味着培养中至少10次传代,优选至少20至30次传代,更优选至少50次传代,理论上无限次数传代。例如,根据本发明制备的无限增殖的角质细胞在组织培养中多次传代后表达包括角蛋白K1/10,角蛋白K14外皮蛋白(involucrine),filaggrine和兜甲蛋白。
本发明的无限增殖的角质细胞具有与正常角质细胞相似的,如果不是完全相同,细胞色素p450的分布图。例如,本发明的细胞表达CYP450 1A1,2E1,2C18和3A5。此外,本发明的无限增殖角质蛋白表达Ⅱ期的酶,例如谷胱甘肽-S转移酶π(GSTπ),方式与正常,非无限增殖的角质细胞相当。
此外,本发明的无限增殖的角质细胞表达在细胞氧化和炎症反应时表达的蛋白和酶,例如,佛波酯处理后的超氧化物歧化酶(SOD)和Ⅰ型胶原酶和肿瘤坏死因子(TNFα),以与正常分化角质细胞相似或相同的方式表达。由于具备了上述特征,该细胞系代表对皮肤反应免疫学,药理学,炎症,光和化学毒理学研究的非常有趣的,能复制的来源。
此外,本发明的无限增殖角质细胞系,如果在无血清培养基[例如Biofluids Inc.,U.S.的NR2培养基,补充有EGF(5ng/ml),维生素C(38μg/ml)和CaCl2(1.5mM)]且无滋养层细胞(无成纤维细胞)时进行器官型培养,复层和极化的上皮具有表面角化层,一般所谓的角质层具有正常角质细胞形态学,说明角质层丧失有核细胞,即包含核的细胞。
使用无限增殖角质细胞制备复层和极化上皮,以往都在标准培养条件下进行,即通过使用含小牛血清的培养基和滋养细胞层的技术(Lechner等,病毒学,185,536-571,1991)。尽管如此,无限增殖的细胞不形成正常表面角化层。例如,乳头状瘤病毒16或18,或E6/E7无限增殖化的细胞系,形成非常杂乱的上皮(Blanto等.,美国病理学杂志.,138,673-685,1991;Hudson等.,病毒学杂志.,64,519-526,1990;McCane等.,美国国家科学院进展85,7169-7173,1988,Woodworth等.,癌基因7,619-626,1992)
与之对照,EP780496(Société des Produits Nestlé)描述的细胞系,如果在无血清且无滋养细胞层条件下进行器官型培养,形成具有正常表面角质层的复层极化上皮,尽管具有角化不全角质细胞形态学,该角质层细胞仍具核。
本发明的无限增殖角质细胞还吸收外源的必需脂肪酸(AGE),呈现出和正常角质细胞的不饱和状态和链的延长极其对应的不饱和状态和AGE链的延长。
一般地,本发明的无限增殖细胞可根据如下方法获得:
(ⅰ)获取人皮肤样本;
(ⅱ)制备皮肤样本从而获得能培养的原代角质细胞;
(ⅲ)在无血清培养基中培养原代角质细胞,优选在培养基NR
-3(EP780496中描述)中,在具有促进细胞固定和生长的
一层包被的培养板中,所述的包被包括纤连蛋白,SAB和Ⅰ
型胶原蛋白;
(ⅳ)置换无血清培养基,在培养板上获得角质细胞的最佳汇合生
长,以重复方式保持培养板的包被;
(ⅴ)在培养物将角质细胞与黑色素细胞分离,转移分离的角质细
胞到侵染培养基,优选转入培养基NR-3,并优选在对细胞进
行胰酶和EDTA的混合物处理后,转到以相同方式包被的培养
板;
(ⅵ)用至少两种不同逆病毒,如SV40病毒和人乳头状瘤病毒的
功能性致瘤基因感染细胞;
(ⅶ)转移无限增殖的角质细胞到无血清增殖培养基,在以上
述相同方式包被的培养板中,优选培养基NR-2或NR-3
(EP780496中描述的培养基,EP780496的著作在此纳入参考
文献);
(ⅷ)培殖后将无限增殖的角质细胞转移到适当分化培养基,
该培养基具高含量钙(1.5mM),优选补充有EGF(5ng/ml)
和维生素C(38μg/ml)的培养基NR-2。
具体操作中,步骤(ⅰ)通常包括获取正常人供体的人皮肤组织,例如在外科插入或儿科插入过程中获得样品。皮肤细胞的独特样本的无限增殖化,即皮肤细胞的自体移植的样本的无限增殖化,使呈现一定特性的无限增殖的角质细胞系的制备成为可能,所谓一定特性例如特殊受体对外形特异的供体特有。
皮肤组织的样品随后在步骤(ⅱ)中制备。以便使皮肤组织样本可在体外培养。制备开始先冲洗皮肤组织样品,例如使用培养用的培养基。优选地,操作在培养基NR-2中进行,NR-2为无血清培养基,具体组分见EP780496所述,该组分有利于正常角质细胞的培养。洗后,优选将皮肤组织的样品切成薄片,例如用皮刀,切为小片。
得到的皮肤切片优选分离为真皮和表皮。这一步可用物理的或酶(促)方法做到。例如,可通过胰酶处理实现,例如将皮肤样本浮在含EDTA(例约0.1%)的胰酶溶液(例约0.5%)中经过足以引起细胞分离的时间,例如37℃30到60分钟,或4℃过夜。
除去真皮,将表皮置于培养基中悬浮。优选地,悬浮用培养基包括大豆胰酶抑制剂(SBTI),培养基与细胞接触足够长时间,通常约5分钟,使胰酶钝化并引起细胞释放。组织培养培养基,优选培养基NR-2,血清剥夺(EP780496描述),加滤膜(例如100nm)以获得期待的细胞,即角质细胞。
步骤(ⅱ)中获得的原代角质细胞用于接种无血清培养基,优选培养基NR-3(EP780496中所述),以适当的细胞密度,优选约1.2×104细胞/平方厘米,接种在已包被的培养板上。不过细胞密度可在很大范围内变动。培养板优选具有含增强角质细胞固定和生长组分的包被,更明确地,此组分为纤连蛋白,SAB和Ⅰ型胶原蛋白的溶液。
在步骤(ⅳ)中,经常根据需要更换培养基以获得最佳细胞生长。优选地,培养基约2天更换一次。不过更换间隔取决于皮肤组织的具体样本。当细胞生长至接近完全汇合,例如90%汇合,一般在10到14天后,分离角质细胞和黑色素细胞。分离可通过任何对单核细胞和角质细胞无有害作用的方法进行。例如,可通过胰蛋白酶差别处理而作用。优选地,黑色素细胞或角质细胞用胰蛋白酶/EDTA溶液处理,然后转移到选择培养基中。角质细胞优选用胰酶/EDTA(0.025%/0.01%)溶液处理5到10分钟,随后在步骤(ⅴ)中散到前述的包被的培养板上的培养基NR-3中。
角质细胞后来用试剂处理以进行无限增殖化。细胞可一直冷冻直到无限增殖化作用,例如在液氮中。感染和无限增殖化优选通过使用至少两种不同逆病毒的功能致瘤基因作用,如SV40病毒的T-Ag和HPV16的E6/E7。每种基因都位于独立的逆病毒结构中,例如在逆病毒载体PLXSHD+SV40(#328),如图1所示,Stockshlaeder等描述(GeneBank,登记号M64753;人类基因治疗,2,33-39,1991)和逆病毒载体PLXSHD+E6/E7,如图2所示。
逆病毒载体PLXSHD+SV40(#328)还包括SV40的T-Ag序列之外的其它序列,SV40的5’和3’长末端重复序列,pBR322序列,pBR322序列是考虑到大肠杆菌的复制,多克隆的环,SV40的聚腺苷酸化序列。
在为T抗原基因编码的位置,载体pLXSHD+E6/E7包括从人乳头状瘤病毒16衍生的E6/E7基因的NcoI/CfoI片断。
无限增殖化之后,细胞在培养过程中经过必要次数的传代,所得无限增殖的细胞随后在步骤(ⅶ)转入增殖培养基。此转移优选在第2次传代过程中进行。增殖培养基可为无血清培养基,优选培养基NR-2和NR-3。无限增殖的细胞在预先以连续方式包被的培养板上培养,该包被包括纤连蛋白,SAB和Ⅰ型胶原蛋白的溶液。
无限增殖细胞在增殖培养基(优选NR-2)增殖后,角质细胞在步骤(ⅷ)中转移到促进正常和无限增殖的角质细胞分化的环境中,优选模拟皮肤中盛行的条件的环境,如此产生在具正常,表面角质化层的复层极化表皮中的角质细胞的组织。为此目的,细胞可在具高含量钙的无血清培养基中培养,如培养基NR-2包括约1.5mM钙,约5ng/ml EGF和约38μg/ml维生素C,培养物于液气界面作用在培养板上2到3周,例如在具有12孔Falcon No.3043的平板上,每孔具有嵌入物Falcon 3180,其中角质细胞在气/液界面生长。气相包括在嵌入物的内部空间的大气,大气丧失了营养培养基,液相为包含在孔中的营养培养基,培养基横贯角质细胞生长的插入物的膜。
考虑到本发明的无限增殖角质细胞的特性,这些特性完全适于皮肤反应的免疫学,药理学,光和化学分析。例如,本发明的无限增殖的角质细胞系可用于需要分化皮肤细胞的分析,例如关于重组皮肤组织的屏障功能(角化)的研究,关于分化的角质细胞的新陈代谢(脂肪酸的代谢,抗氧化剂代谢)的研究,并于UV辐射对皮肤细胞的作用的研究,关于潜在皮肤刺激和皮肤过敏剂对皮肤细胞作用的研究,关于液体代谢,局部处理和/或异生素试剂的培养基处理(例如化妆油,通过选择适当的保护化合物,例如光保护剂),关于发炎和皮肤刺激,等。
此外,根据本发明的角质细胞还用于选择治疗皮肤病的潜在化合物和潜在的抗癌化合物。通常将细胞系与这些化合物接触一段时间,判断是否存在任何潜在的有害作用,例如基因毒性,DNA加合物的形成,诱变性,细胞转化或细胞毒性。
此外,本发明的无限增殖的角质细胞系可用于DNA诱变分析,皮肤诱变剂的选择分析,染色体改变剂的鉴定分析,恶性转化的研究,细胞生化的研究(例如GYP450活化的分析),对化合物和组合物的选择,例如对参与炎症和过敏反应的必需脂肪酸的混合物的选择,胶原酶的活化(与炎症有关)分析,包括TNFα,以及对白细胞介素的检测。
事实上,根据本发明的细胞系形成角质层正常角质细胞,它们特别适应于人工皮肤的制备,诱变的研究,以及上述的免疫,药理,光和化学毒理研究。根据本发明,该皮肤仅有角质细胞的上皮组成,但优选包括胶原,成纤维细胞,甚至黑色素细胞,以便得到与正常人皮肤更相似的外表。
此外,本发明的角质细胞系能表达重组蛋白,例如人多肽和蛋白,还可产生RNA和DNA。
在根据本发明制备的无限增殖的角质细胞系中,仅有细胞系DK7-NR根据布达佩斯条约的规定保藏,例如,在1998年3月19日,法国巴黎75724 rue de Docteur Roux,25的国立微生物保藏中心保藏保藏号CNCMI-1996。此保藏物在布达佩斯条约限制条件下使用。在本申请或其它要求本申请的优先权的申请被授权之后,所有有关获得本细胞系的限制仍不能被解除。
本发明的其它特性从下列实例描述中可逐渐体现,以下实例仅用于说明本发明,而不作为限制。其它未提到的细胞的操作,载体的制备,细胞的转化和所有其它技术过程根据Sambrook等的出版物(分子克隆,实验指南,冷泉港实验室出版社,美国,1989)中描述的方法实施。实施例1.细胞系的制备及鉴定
取乳房皮肤细胞。分离真皮和表皮部分之后,表皮切为0.2×0.2mm的小片,置于6cm培养皿上,加血清。极限必需培养基(DMEM,10%胎牛血清)在2到4小时后加入。此外植块的培养物孵育直至可见成纤维细胞的过度生长。分离并增殖汇合的成纤维细胞的培养物从而获得冻存培养物。
培养盒接种原代细胞,并以连续方式用“混合物”包被,如以往针对支气管细胞所描述的(Lechner等.,组织培养方法杂志,9:43-49(1985))。在达到近乎完全汇合后,例如约90%汇合,一般10到14天后出现,分离角质细胞和黑色素细胞。将培养物用胰酶/EDTA(0.025%/0.01%)处理5分钟,随后从角质细胞中首先收获黑色素细胞。原代角质细胞然后在无血清的NR-3培养基中在所述包被培养瓶中培养到期待的细胞数(NR-3培养基更合适角质细胞生长,与黑色素细胞比较。)
然后,被囊化的细胞“包装细胞系3T3-成纤维细胞”以质粒pLXSHD+SV40(#328)和pLXSHD+E6/E7,转染,根据Pfeifer等(细胞科学方法,17,83-89,1995)的方法,附带限制性条件,病毒在细胞系被囊化后收集,在加有10%胎牛血清的DMEM培养基中生长。随后,角质细胞用此病毒感染以无限增殖化。感染过程中,也可用无血清培养基PC-1如pfeifer等的出版物所述。
无限增殖化后,无限增殖的角质细胞转移到增殖培养基NR-2或NR-3,使用预包被培养瓶。细胞增殖到期望数量后,细胞转移到适合正常和无限增殖角质细胞的分化培养基(NR-2)。
无限增殖的角质细胞在培养中多次传代后呈现改善的细胞生长,可与EP780496的细胞系描述的细胞生长做比较。
CYP450,1A1,1A2,3A5,2E1,2B6,2A6和2D6的表达在包括正常和无限增殖的角质细胞的皮肤细胞中通过室温下(mRNA表达)的DNA聚合酶链式反应分析。无限增殖的角质细胞表达的CYP450的分布图与正常角质细胞的相比特别相似,甚至相同。
此细胞系在多次传代后也以与非无限增殖的细胞相同的方式对包括苯并芘的CYP450的诱导剂作出反应。
通过抗T-Ag,involucrine,filaggrine,兜甲蛋白,波形蛋白和角蛋白K4,K7,K8,K10/1,K13,K14,K17,K18,K19的特异性抗体分析分化标记。在细胞系DK7-NR中能最好地证明分化的能力。谷胱甘肽S-转移酶(GST)通过Western印迹和Northern印迹分析。角质细胞的所有细胞系强烈表达GSTπ的信使RNA。细胞系中GSTα,GSTμ和GSTπ的分布与正常角质细胞相似。
为分析和比较外加AGE在角质细胞中的去饱和和延长无限增殖的角质细胞(和正常角质细胞)用亚油酸(LA,15μmole)和亚麻酸(LN,15μmole)处理。这些实验使用培养基NR-2(Biofluids Inc.),AEG缺损。细胞培养物在达到汇合后处理,从培养基中转移到具高含量钙(1.5mM)的NR-2培养基,细胞用AGES处理4天(2天后更换一次)。AGE的分析通过以下方法实现,CCM(薄层层析)对磷脂抽提和分离以及对脂肪酸甲基酯通过CGL(气-液相层析)进行数量测定可显示LA(20:4n-6和22:4n-6)和LN(20:5n-3,22:5n-3和22:6n-3)的去饱和和延伸。代谢分布图与正常角质细胞中观察到的一致。
所有细胞系为亚二倍体,计数染色体的大部分位于二倍体细胞的间期。除所分析细胞之外,未检测到培养物中其它细胞,此结果确认细胞系的纯度以及无其它来源产生的污染。
无限增殖的角质细胞的肿瘤发生能力通过向裸鼠皮下注射(1-2106角质细胞)确定。检测的角质细胞细胞系,尤其是细胞系DK-7-NR在裸鼠中无致瘤性。
实施例2上皮的制备
实施例1制备的包括一个细胞系的750,000细胞的NR2培养基,加0.5ml该培养基到嵌入物Falcon No.3180,它们置于平板FalconNo.3043的空穴中。Falcon No.3043包括2ml新鲜培养基NR-2,角质细胞在适宜生长条件下培养2天。第3天移去嵌入物中的培养基,细胞与空气接触。空中的培养基每2天用补充有EGF(5ng/ml),维生素C(38μg/ml)和CaCl2(1.5mM)的NR-2培养基更换。在气-液界面培养2-3周,收集以此方式形成的上皮,苦味酸固定,分析形态学。
结果显示角质细胞细胞系,尤其细胞系DK7-NR,形成复层极化上皮,普通所说的(表皮)基底层,具有与正常细胞相同的似立方形形态的细胞。角质层呈现正常角质细胞形态学,即它丧失了有核细胞。至今正常角质细胞层的形成不能用其它已知无限增殖的细胞系进行。例如,在相同条件下,细胞系DK2-NR(EP780496)形成角质层角质不全角质细胞,即角质化细胞层仍包括有核细胞。仅角质层的正常角质细胞形态学反映人皮肤的正常状态。事实上,角质层前角质细胞具有上皮异常肥大特征,导致致病,如牛皮癣或瘤形成。
实施例3刺激检测
实施例1获得的细胞系,尤其细胞系DK7-NR,在培养基NR-2中培养。“应激基因”TNFα(肿瘤坏死因子α)的诱导在皮肤过敏剂处理之后,通过Northern方法和生物鉴定分析,皮肤过敏剂包括PMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯)和UV-B(紫外B照射)。结果显示这些细胞系尤其细胞系DK7-NR应激PMA和UV-B,甚至在多次传代后仍表达蛋白TNFα。实施例4人造皮肤的构建
嵌入物Falcon No.3180的膜用一片透明质酸(Hyaffll)苄基酯替代。嵌入物的底部接种原代人成纤维细胞(0.2ml培养基中0.1×106细胞),反应30分钟,在嵌入物中加满含10%胎牛血清的DMEM,37℃,5%CO2一个大气压下孵育数天,清空嵌入物,补充0.5ml含750,000个DK7-NR细胞的新鲜NR-2培养基,嵌入物置于已包括2ml新鲜NR-2培养基Falcon-No.3043皿的穴中,细胞在适宜角质细胞生长的条件下培养2天。第3天,移去嵌入物中的培养基,留下细胞与空气接触,穴中的培养基每2天更换一次补充有EGF(50ng/ml),维生素C(38μg/ml)和CaCl2(1.5mM)的NR-2培养基。在气-液界面培养2-3周后,可观察到人造皮肤构造呈现正常皮肤的特征。
Claims (15)
1.一种由至少一种逆病毒来源的功能性肿瘤基因无限增殖化的人角质细胞系,具有如下特点:
(ⅰ)非致瘤性的;
(ⅱ)即使在多次传代后仍保有分化能力和表达正常分化的角质
细胞表达的酶和蛋白质的能力;以及
(ⅲ)当在无血清培养基中且无滋养层细胞进行器官型培养
时,形成具角质层正常角质细胞的复层极化上皮。
2.权利要求1的人角质细胞系,由至少两种不同的逆病毒的逆病毒来源的功能性肿瘤基因无限增殖化。
3.权利要求2的人角质细胞细胞系,其特征在于该功能性肿瘤基因衍生自SV40病毒和人乳头状瘤病毒16。
4.权利要求3的人角质细胞细胞系,其特征在于每种功能性肿瘤基因包括在独立的逆病毒结构中。
5.权利要求4的人角质细胞细胞系,其特征在于该细胞系是具有根据布达佩斯条约保藏的保藏号CNCMI-1996的细胞系DK7-NR。
6.一种改进的无限增殖化人皮肤细胞从而获得无限增殖的角质细胞的方法,包括下列步骤:
(ⅰ)分离人皮肤样本;
(ⅱ)制备体外培养的皮肤样品;
(ⅲ)从人皮肤制备的样品获得角质细胞,将该角质细胞接种
于无血清的生长培养基中,培养板被促进细胞固定和生长的
纤连蛋白,Ⅰ型胶原蛋白和SAB包被;
(ⅳ)以足以获得培养中细胞最佳汇合生长的方式替换培养基;
(ⅴ)将角质细胞转移到预先以相同方式包被的培养板上的无血清
选择培养基中;
(ⅵ)用至少两种不同逆病毒的功能性肿瘤基因感染角质细胞;
(ⅶ)转移所得的无限增殖的角质细胞到以相同方式包被的培
养板上的适合无限增殖的角质细胞增殖的培养基中;
(ⅷ)转移所得的增殖的角质细胞到以相同方式包被的培养瓶
中具高含量钙的分化培养基中。
7.权利要求6的方法,其特征在于功能性肿瘤基因衍生自SV40病毒和人乳头状瘤病毒16。
8.权利要求7的方法,其特征在于每个功能性肿瘤基因包括在独立的逆病毒结构中。
9.权利要求8的方法,其特征在于所用逆病毒结构为载体pLXSHD+SV40(#328)和pLXSHD+E6/E7。
10.权利要求6的方法,其特征在于在步骤(ⅲ),(ⅴ)或(ⅶ)中无血清培养基为NR-3培养基。
11.权利要求6的方法,其特征在于步骤(ⅷ)中的分化培养基为具有至少1.5mM含量钙的改良的NR-2培养基。
12.权利要求1的角质细胞在皮肤反应的免疫学、药理学、光和化学毒理学分析及异源基因表达方面的应用。
13.权利要求12的应用,其特征在于使用了细胞系DK7-NR,它具有根据布达佩斯条约保藏的保藏号CNCMI-1996。
14.人造皮肤,其特征在于包括权利要求1的角质细胞细胞系。
15.权利要求14的人造皮肤,其特征在于包括具有根据布达佩斯条约进行保藏的CNCMI-1996细胞系DK7-NR。
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