CN101720355A - 使用g-csf分化诱导成心肌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

一种将ES细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其包括使与ES细胞针对G-CSF受体的激动剂接触。

Description

使用G-CSF分化诱导成心肌细胞的方法

技术领域

本发明提供一种将ES细胞分化诱导成心肌细胞的方法，以及通过该方法获得的心肌细胞和分化诱导成心肌细胞的分化诱导剂等。

背景技术

心肌细胞尽管在出生前一边自律搏动一边活跃地进行细胞分裂，但出生后就丧失了分裂能力，而且由于不具有未分化的前体细胞，因此如果心肌细胞由于处于心肌梗塞或心肌炎等各种压力下而死亡，则丧失的心肌细胞无法获得补充。其结果是，残存的心肌细胞由于代偿性肥大而保持心脏功能，但如果各种压力持续，超过其允许范围，则进一步诱发心肌细胞的疲惫、死亡，从而呈现心肌功能的降低(即心力衰竭)。

因此，可以认为补充性移植衰弱或丧失的心肌细胞的方法对于心力衰竭的治疗极为有用。事实上，已知在使用动物的实验中，一旦从胎儿中获得未成熟的心肌细胞，将其移植到成体心脏组织中，移植细胞就作为心肌细胞有效发挥作用(参照非专利文献1)。但是，该方法难以获得大量的心肌细胞，从伦理的观点考虑，也难以应用于临床医疗。

因此，由未分化的干细胞分化诱导成心肌细胞，将其作为移植用细胞使用的方法近年来尤为受到关注。现在，由于在成体心脏组织中没有发现可以明确鉴定为可以产生心肌细胞的前体细胞或干细胞的细胞群，因此为了实施上述方法，可以考虑使用未分化的具有更多分化能力的多能性干细胞。

所谓多能性干细胞(pluripotent stem cells)，被定义为通过试管内培养仍然保持未分化状态，基本可以持续地或长期地进行细胞增殖，呈现正常的核(染色体)型，具有在适当的条件下分化成所有三个胚层(外胚层、中胚层、和内胚层)谱系的细胞的能力的细胞。现在，作为多能性干细胞，最熟知的是分离自早期胚胎的胚胎干细胞(embryonic stem cells：ES细胞)和分离自胎儿期的原始生殖细胞的胚胚胎发育殖细胞(embryonic germ cells：EG细胞)、从成体骨髓中分离的成人型多能干细胞(multipotent adult progenitorcells：MAPC细胞)这3种。

从以前就知道，尤其是ES细胞，通过试管内培养，可以分化诱导成心肌细胞。初期的研究基本都是使用小鼠来源的ES细胞进行。若ES细胞在单一细胞状态(通过实施酶处理等使细胞之间不粘着，各个细胞分散的状态)下，不存在白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor：LIF)等分化抑制因子下进行悬浮培养，则ES细胞之间粘着、凝集，形成被称为胚状体(embryoid body：EB)的早期胚胎类似的结构体。已知，这之后，通过在浮游状态或粘着状态下培养EB，出现具有自律搏动性的心肌细胞。

按上述方式制备的来源于ES细胞的心肌细胞呈现出与来源于胎儿心脏的未成熟的心肌细胞极为相似的性状(参照非专利文献2、3)。而且，实际上，在将来源于ES细胞的心肌细胞移植到成体心脏组织中的动物实验例中，与移植了胎儿心肌的例子相比基本没有变化，因此确认其也具有极高有效性(参照专利文献1、非专利文献4)。

1995年，Thomson等人首次从灵长类中建立ES细胞，将使用来源于多能干细胞的心肌细胞的心肌再生治疗法实用化，这带来了现实意义(参照专利文献2、非专利文献5)。接着，他们从人早期胚胎中成功地分离并建立了人ES细胞株(参照非专利文献6)。而且，Gearhart等人由人原始生殖细胞建立了hEG细胞株(参照专利文献7、专利文献3)。

Kehat等人(参照非专利文献8)和Chunhui等人(参照专利文献4、非专利文献9)报道了，与小鼠ES细胞相同，也可以由人ES细胞分化诱导成心肌细胞。若根据这些报道，由人ES细胞分化诱导的心肌细胞不仅具有自律搏动能力，还随着表达产生肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、心房性利尿肽(atrial natriureticpeptide；ANP)等心肌特异性蛋白质、GATA-4或Nkx2.5、MEF-2c等心肌特异性转录因子，而且根据细微解剖学观察和电生理学分析，从而可以期待胚胎发育期的未成熟的心肌细胞的性状维持，并可应用于再生医疗。

另一方面，来源于多能性干细胞的心肌细胞在用于细胞移植治疗和其它目的使用时的重要问题，可以列举如下：用以往的方法由ES细胞或EG细胞所形成的EB出发，除心肌细胞以外还混合产生血球系细胞和血管系细胞、神经系统细胞、肠道系细胞、骨·软骨细胞等其它细胞。而且，在这些分化的细胞中，心肌细胞所占的比例不怎么高，只不过为总体的5～20％左右。

从其它种类的细胞混合中只选择性地筛选心肌细胞的方法，可以列举，通过对ES细胞的基因人为地进行修饰，给予耐药性或异位性表达能力，回收具有心肌细胞或其前体细胞的性状的细胞的方法。例如，Field和共同研究者们通过向小鼠ES细胞中导入位于α型肌球蛋白重链启动子控制下的可以表达新霉素(G418)耐性基因的基因盒，只有在该ES细胞分化成心肌细胞，随之表达α型肌球蛋白重链基因时，才构建出可在添加了G418的培养基中生存的细胞系(参照专利文献1、非专利文献4)。确认了通过该方法选择为G418耐性细胞的细胞99％以上的几率为心肌细胞。但是，该方法中，心肌细胞的纯度极高，但是最终获得的心肌细胞数仅仅为全部细胞数的百分之几左右，要获得移植治疗所必需的心肌细胞并不容易。

最近，Chunhui等人报道了通过用5-氮杂胞嘧啶核处理人ES细胞，EB中的肌钙蛋白I阳性(心肌)细胞由15％增加到44％(参照非专利文献9)。但是，即使是该方法中，心肌细胞所占的比例也不超过EB中的50％。而且，脱甲基化剂5-氮杂胞嘧啶核是通过使结合于DNA的甲基脱离而使基因的表达状态变化的药剂，由于药剂直接作用于染色体，因此并不适于作为制备移植用细胞的药剂。

此外，作为使ES细胞高效发生为心肌细胞的方法，例如，在小鼠ES细胞中，添加视黄酸(参照非专利文献10)或抗坏血酸(参照非专利文献11)、TGFβ、BMP-2(参照非专利文献12)、PDGF(参照非专利文献13)、强啡肽(Dynorphin)B(参照非专利文献14)、或使细胞内的活性氧类(reactive oxygen species：ROS)(参照非专利文献15)和Ca²⁺(参照非专利文献16)增加的处理促进性作用于心肌细胞的分化诱导。但是，在这些方法的任意一种中，都无法实现心肌细胞特异性的或选择性的分化诱导。

发明人发现，在培养时的某段时期，通过在培养基中添加抑制骨形成因子(Bone Morphogenic Protein；BMP)的信号转导的物质，尤其是Noggin，与以前的方法相比，可以高效地选择性地且高效地使识别为具有搏动能力的心肌细胞的细胞产生(参照专利文献5)。

粒细胞集落刺激因子(以下称为G-CSF)是被发现为粒细胞系造血干细胞的分化诱导因子的造血因子，在生物体中促进嗜中性粒细胞造血，因此可作为骨髓移植或癌症化疗后的嗜中性粒细胞减少症治疗剂在临床中应用。而且，除了上述作用之外，据报道人G-CSF还具有作用于干细胞刺激其分化增殖的作用和将骨髓中的干细胞移动到末梢血中的作用。有报道指出在体内实验中由于G-CSF而募集的骨髓干细胞在募集的组织中分化成心肌细胞(专利文献6，非专利文献17)。但是，并没有报道指出G-CSF直接使骨髓干细胞分化成心肌细胞，而且也没有报道指出G-CSF在胚胎期的心肌细胞中表达或直接用于心肌细胞的分化诱导。而且，也完全没有关于G-CSF直接作用于ES细胞，用于向心肌细胞的分化诱导的报道。

如上所述，单独用以往的方法的心肌诱导效率低，需要一种更有效且选择性分化诱导成心肌细胞的方法。

专利文献1：美国专利第6,015,671号说明书

专利文献2：美国专利第5,843,780号说明书

专利文献3：美国专利第6,090,622号说明书

专利文献4：国际公开WO 03/06950小册子

专利文献5：国际公开WO 05/033298小册子

专利文献6：国际公开WO04/054604小册子

非专利文献1：Soonpaa等人，Science，264：98，1994

非专利文献2：Maltsev等人，Mech.Dev.，44：41，1993

非专利文献3：Maltsev等人，Circ.Res.，75：233，1994

非专利文献4：Klug等人，J.Clin.Invest.，98：216，1996

非专利文献5：Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7844，1995

非专利文献6：Thomson等人，Science，282：114，1998

非专利文献7：Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13726，1998

非专利文献8：Kehat等人，J.Clin.Invest.，108：407，2001

非专利文献9：Chunhui等人，Circ.Res.，91：501，2002

非专利文献10：Wobus等人，J.Mol.Cell.Cardiol.，29：1525，1997

非专利文献11：Takahashi等人，Circulation，107：1912，2003

非专利文献12：Behfar等人，FASEB J.，16：1558，2002

非专利文献13：Sachinidis等人，Cardiovasc.Res.，58：278，2003

非专利文献14：Ventura等人，Circ.Res.，92：623，2003

非专利文献15：Sauer等人，FEBS Letters，476：218，2000

非专利文献16：Li等人，J.Cell Biol.，158：103，2002

非专利文献17：Minatoguchi等人，Circulation，109：2572，2004

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供高效且有选择性地将ES细胞分化诱导成心肌细胞的方法，由该方法获得的心肌细胞，以及分化诱导成心肌细胞的分化诱导剂等。

用于解决问题的方法

本发明人发现G-CSF受体在小鼠胚胎期的心肌细胞中强表达，并且G-CSF与胚胎期的心肌细胞的增殖相关。而且，本发明人采用ES细胞对向心肌细胞分化诱导的条件反复进行了各种研究，结果发现，通过在培养基中添加针对G-CSF受体的激动剂，产生了具有搏动能力的且被鉴定为心肌细胞的细胞，而且G-CSF在ES细胞分化成心肌细胞时，对心肌细胞具有强增殖活性。本发明人基于这种认识完成了本发明。

即，本发明提供以下内容：

(1)将ES细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其包括使ES细胞与针对G-CSF受体的激动剂接触。

(2)前述(1)所述的方法，其包括在针对G-CSF受体的激动剂存在下培养ES细胞。

(3)前述(1)或(2)所述的方法，所述针对G-CSF受体的激动剂是G-CSF。

(4)前述(1)-(3)任一项所述的方法，其包括以下工序：

(a)在细胞培养液中添加G-CSF的工序，和

(b)使用(a)的培养液培养ES细胞的工序。

(5)前述(1)-(4)任一项所述的方法，ES细胞与G-CSF的接触在体外进行。

(6)前述(1)-(5)任一项所述的方法，其还包括在使ES细胞与针对G-CSF受体的激动剂接触之前，在抑制BMP信号转导的物质的存在下培养ES细胞的工序。

(7)前述(6)所述的方法，抑制BMP信号转导的物质是Noggin。

(8)通过前述(1)-(7)任一项所述的方法获得的心肌细胞。

(9)由ES细胞分化诱导成心肌细胞的分化诱导剂，其包括针对G-CSF受体的激动剂。

(10)前述(9)所述的分化诱导剂，针对G-CSF受体的激动剂是G-CSF。

(11)前述(9)或(10)所述的分化诱导剂，其是在体外使用的。

(12)针对G-CSF受体的激动剂在使ES细胞分化诱导成心肌细胞的用途。

(13)前述(12)所述的用途，所述针对G-CSF受体的激动剂是G-CSF。

(14)前述(12)或(13)所述的用途，其是在体外使用。

而且，本发明的实施中，使用ES细胞的细胞培养和发生，细胞生物学实验的一般方法可以参照本领域的标准参考书。它们包括Guideto Techniques in Mouse Development(Wasserman等人编，AcademicPress，1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；Manipulating the MouseEmbryo：A laboratory manual(Hogan等人编，冷泉港实验室出版社1994)；Embryonic Stem Cells(Turksen编，Humana Press，2002)。本说明书中参照的用于细胞培养，发生·细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从Invitrogen/GIBCO公司或Sigma公司等商家购买。

附图说明

图1是表示小鼠胚胎的心脏中小鼠G-CSF受体(csf3r)和心肌特异转录因子Nkx2.5的表达的原位杂交的照片。

图2是表示小鼠胚胎的心脏切片中G-CSF受体(G-CSFR)或心肌特异性的蛋白质α-辅肌动蛋白的表达的免疫染色的照片。核酸用DAPI(4′，6-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐：Sigma Aldrich)染色。

图3是通过RT-PCR试验胚胎发育第9.5天，胚胎发育第10.5天和胚胎发育第13.5天的小鼠胚胎心脏，新生小鼠心脏，成体小鼠心脏和小鼠肝脏中G-CSFR，G-CSF的表达的照片。采用GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)作为对照。

图4是在妊娠小鼠中施用G-CSF或作为对照的PBS(磷酸缓冲生理食盐水)，然后给母体腹腔内施用BrdU(溴脱氧尿嘧啶核苷)时胚胎心脏切片的免疫染色的照片。

图5是表示给妊娠小鼠施用G-CSF时的效果，图5a是用苏木精伊红对与图4相同的心脏切片进行染色，再用显微镜观察获得的照片。图5b是用苏木精·伊红对G-CSFR敲除小鼠和野生型小鼠的心脏切片进行染色，再用显微镜观察获得的照片。图中LV表示左心室，RV表示右心室，LA表示左心房，RA表示右心房。

图6是计算BrdU标记指数(labeling index)，进行图示的坐标图。

图7是对妊娠小鼠母体施用G-CSF后，取出胚胎制作心脏切片，用Phospho-Histon H3进行免疫染色的照片。

图8是计算Phospho-Histon H3标记指数(labeling index)，进行图示的坐标图。

图9是对胚胎发育第10.5天的心脏进行Tunel染色的照片。

图10是表示制作来源于经Noggin处理(Noggin(+)组)的ES细胞的EB和来源于未经Noggin处理(Noggin(-)组)的ES细胞的EB，通过RT-PCR测定EB中的G-CSFR的表达结果的照片。使用特异于心肌细胞的基因GAPDH作为对照。

图11是表示制作来源于经Noggin处理(Noggin(+)组)的ES细胞的EB和来源于未经Noggin处理(Noggin(-)组)的ES细胞的EB，通过免疫染色对EB中的G-CSFR的表达进行测定所获结果的照片。

图12是表示EB形成后第6天，第7天和第8天的EB中，G-CSFR或心肌特异性蛋白质α-辅肌动蛋白表达的免疫染色的照片。

图13是表示采用G-CSF的心肌细胞的分化诱导试验方法的图。

图14是表示心肌细胞的分化诱导中G-CSF施用的最适时期的坐标图。

图15是表示使用EB形成后的第9天的EB，通过RT-PCR法和免疫染色法对各种心肌中特异性基因表达进行测定所获结果的照片。

图16是表示为了研究G-CSF的最适浓度，在胚胎发育第6天添加各种浓度的G-CSF，通过RT-PCR法研究各心肌标记物的表达的结果的照片。

图17是表示心肌细胞的分化诱导中G-CSF的最适浓度的坐标图。

图18是表示为了研究抗G-CSF抗体对由G-CSF处理产生的ES细胞的心肌分化诱导促进效果的影响，使各种浓度的抗G-CSF抗体共存，通过RT-PCR法研究各心肌标记物的表达的结果的照片。

图19是表示为了测定G-CSF对来源于ES细胞的心肌细胞的增殖促进作用，在胚胎发育第6天时通过RT-PCR法研究G-CSF添加组和未添加组以及G-CSF+诺考达唑添加组中各心肌标记物的表达的结果的照片。

图20是表示在G-CSF添加组和未添加组中，用抗BrdU抗体和抗mef2c抗体进行双重免疫染色的结果的照片(左侧)和计算BrdU标记指数(labeling index)，进行图示的图(右侧)。

图21表示G-CSF对普通绒猴ES(CMES)细胞的效果，图21a表示对普通绒猴ES(CMES)细胞的自律搏动性进行观察的结果。图21b是表示添加小鼠G-CSF或人G-CSF，通过RT-PCR研究CMES细胞中各种心肌标记物的表达的结果的照片。图21c是表示通过免疫染色调查G-CSF添加组和未添加组中，来源于CMES的EB的心脏肌钙蛋白I和Nkx2.5的表达的结果的照片。

具体实施方式

可以在本发明中使用的ES细胞可以列举已经作为培养细胞被广泛使用的小鼠，猴，人等来源于哺乳动物的ES细胞。作为来源于小鼠的ES细胞的具体例子，可以列举EB3细胞，E14细胞，D3细胞，CCE细胞，R1细胞，129SV细胞，J1细胞等。作为来源于猴的ES细胞的具体例子，可以列举普通绒猴ES细胞。此外，就ES细胞的制作，传代，保持方法，已经建立了标准的程序，实施者通过参照前面列举的参考书籍和多种参考文献(Matsui等人，Cell 70：841，1992；Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13726，1998；美国专利第6090622号；Jiang等人，Nature 418：41，2002；WO01/11011A)，可以容易地获得这些细胞。

本发明中，所谓“心肌细胞”是指包括具有将来可以形成有功能的心肌细胞的能力的心肌前体细胞，胎儿型心肌细胞，成体型心肌细胞这所有的分化阶段的细胞在内的，通过以下记载的至少1种、优选多种方法，可以确认1个、优选多个标记物或基准的细胞。

特异于心肌细胞的各种标记物的表达可以通过以往的生物化学或免疫化学方法检测。其方法没有特别的限定，优选使用免疫组织化学染色法或免疫电泳法等各种免疫化学方法。这些方法中可以使用与心肌前体细胞或心肌细胞结合的标记特异性多克隆抗体或单克隆抗体。以各个特异性标记作为靶的抗体已有市售，可以容易地使用。特异于心肌前体细胞或心肌细胞的标记物可以列举例如、肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。

或者，心肌前体细胞或心肌细胞特异性标记的表达，并没有特别的方法，但可以通过逆转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)和杂交分析等用于扩增、检测、分析编码任意标记蛋白质的mRNA的以往经常使用的分子生物学的方法进行确认。编码特异于心肌前体细胞或心肌细胞的标记物(例如、肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白质的核酸序列是已知的，在GenBank等各种公共数据库中可以使用，可以容易地确定用于作为引物或探针使用的所需要的标记特异性序列。

进而，为了确认ES细胞向心肌细胞的分化，还可以附加使用生理学的基准。也就是说，以来源于ES细胞的细胞具有自律的搏动性，各种离子通道表达，可以在电生理刺激中反应等作为有用的指标。

本发明中“针对G-CSF受体的激动剂”只要是与G-CSF受体结合可以诱导G-CSF受体的信号转导的物质，就没有特别限定。针对G-CSF受体的激动剂可以使肽、激动剂抗体，低分子化合物等任何物质。G-CSF受体的氨基酸序列是公知的(WO91/14776A)。

针对G-CSF受体的激动剂的优选例子可以列举G-CSF。本发明中使用的G-CSF尽管可以使用任何一种G-CSF，但优选高度纯化的G-CSF，更具体的是哺乳动物G-CSF，尤其是人G-CSF及具有基本相同生物学活性的物质。G-CSF的来源没有特别限定，可以使用天然来源的G-CSF，通过基因重组法获得的G-CSF等，但优选是通过基因重组法获得的G-CSF。可以是通过基因重组法获得的G-CSF中与天然来源的G-CSF的氨基酸序列相同者，或者由于该氨基酸序列中进行了1个或多个氨基酸的缺失、取代、添加等，具有与天然来源的G-CSF相同的生物学活性的G-CSF等。天然来源的G-CSF的氨基酸序列是公知的(SEQ IDNO：1)。氨基酸的缺失、取代、添加等方式可以通过公知的方法进行。例如，如果是本领域技术人员，使用定点诱变法(Gotoh，T.等人(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.and Smith，M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W等人(1984)Nucleic AcidsRes.12，9441-9456；Kramer，W and Fritz，H.J.(1987)MethodsEnzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，通过在G-CSF的氨基酸中导入适当变异，可以制备与G-CSF功能相同的多肽。而且，氨基酸的变异在自然界也会发生。进行了取代、缺失、添加等的氨基酸数没有特别限定，优选为30个氨基酸以内，更优选在20个氨基酸以内，更优选在10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。而且，一般与G-CSF功能等同的多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有高同源性。本发明中所谓高同源性是指与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有70％以上的同源性，优选80％以上的同源性，更优选90％以上的同源性，更优选95％以上的同源性。氨基酸的同源性可以通过文献(Wilbur，W.J.andLipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730)中记载的算法来确定。一般而言，待取代的氨基酸残基优选被保留了氨基酸侧链性质的其它氨基酸取代。例如，作为氨基酸侧链的性质，可以列举疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I，P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S，T，Y)，具有含硫原子侧链的氨基酸(C，M)、具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D，N，E，Q)，具有含碱基侧链的氨基酸(R，K，H)，具有含芳香族的侧链的氨基酸(H，F，Y，W)(括号内内容都用单字符表示氨基酸)。具有对某个氨基酸序列进行1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或用其它氨基酸进行取代来修饰的氨基酸序列的多肽维持其生物学活性这是已知的(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.&Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等人，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。

而且，还可以使用G-CSF和其它蛋白质的融合蛋白质。在制作融合蛋白质时，可以将例如编码G-CSF的DNA和编码其它蛋白质的DNA按框架一致方式连接，再导入于表达载体中，使之在宿主中表达。作为本发明的与G-CSF融合的其它蛋白质没有特别限定。

此外，还可以使用经化学修饰的G-CSF。经化学修饰的G-CSF的例子，可以列举，例如进行了糖链的结构改变·添加·缺失操作的G-CSF，或结合了聚乙二醇、维生素B12等无机或有机化合物等化合物的G-CSF等。

此外还可以使用G-CSF的部分肽。G-CSF的部分肽没有特别限定，通常具有与G-CSF受体的结合活性。

本发明中使用的G-CSF可以用任意一种方法制造，例如，培养肿瘤细胞或产生人G-CSF的杂交瘤的细胞株，通过各种方法从中提取，并进行分离纯化的G-CSF，或通过基因工程的方法使之在大肠杆菌、酵母菌、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，C127细胞，COS细胞，骨髓瘤细胞，BHK细胞，昆虫细胞等中产生，通过各种方法提取，并进行分离纯化的G-CSF等。可以在本发明中使用的G-CSF优选是通过基因工程方法制造的G-CSF，优选是使用哺乳动物细胞(尤其是CHO细胞)制造的G-CSF(例如，特公平1-44200号公报，特公平2-5395号公报，特开昭62-129298号公报，特开昭62-132899号公报，特开昭62-236488号公报，特开昭64-85098号公报)。

本发明人如后所述的实施例记载的，发现G-CSF受体在小鼠胚胎期的心肌细胞中强表达，并且G-CSF与胚胎期的心肌细胞的增殖相关。而且，首次确认G-CSF在体内显著促进胚胎期的心肌细胞的增殖。此外，本发明中表明G-CSF对于灵长类的心肌细胞增殖而言是必需的，这提示出G-CSF在包括人在内的所有哺乳动物中的作用。

本发明中，作为由ES细胞制作心肌细胞的培养方法，只要是适于心肌细胞的分化诱导的方法，可以使用任意一种。例如，可以列举悬浮凝集培养法，悬滴(hanging drop)培养法，与饲养层细胞的共培养法，旋转培养法，软琼脂培养法，微载体培养法等。作为具体的方法的例子，例如在浮游凝集培养法时，将呈单一细胞状态(通过实施酶消化等细胞之间不粘着，使各个细胞在液相中分散的状态)的ES细胞优选按10细胞/mL-1×10⁷细胞/mL，更优选100细胞/mL-1×10⁶细胞/mL的细胞密度悬浮于培养基中，接种在培养皿中后，在4-30天内，优选6-15天内，于37℃通气5％二氧化碳的CO₂条件下进行培养的方法。

而且，作为其它实施方式，在使用与饲养层细胞的共培养法时，作为饲养层细胞，没有特别限定，但可以列举，优选具有间充质类细胞性状的细胞，更优选ST2细胞，OP9细胞，PA6细胞等具有骨髓基质细胞样的性状的细胞。可以通过高密度培养，丝裂霉素C处理或放射线照射等方法饲养化这些饲养层细胞，在其上以至1细胞/mL-1×10⁶细胞/mL，优选100细胞/mL-1×10⁵细胞/mL，更优选1×10³细胞/mL-1×10⁴细胞/mL的细胞密度接种悬浮的单一细胞状态的ES细胞后，在4-30天内，优选6-15天内，于37℃通气5％二氧化碳的CO₂条件下进行培养。

本发明中，通过使针对G-CSF受体的激动剂(优选G-CSF)与ES细胞接触，促进ES细胞分化诱导成心肌细胞。优选，可列举在培养基中添加纯化重组G-CSF的方法。此外，只要是与在培养基中添加纯化重组G-CSF的方法呈现相同效果的方法，可以使用任意一种。例如，可以列举向ES细胞自身导入G-CSF的基因表达载体的方法，向饲养层细胞中导入G-CSF的基因表达载体，并将该导入细胞作为共培养细胞使用的方法，或者使用该导入细胞的培养上清等细胞产生物的方法等，本发明涉及的方法中包括任何作为向培养基中添加针对G-CSF受体的激动剂的实施方式。

具体的是，例如，本发明包括以下工序：

(a)向细胞培养液中添加G-CSF的工序和

(b)用(a)的培养液培养ES细胞的工序。

在本发明的实施中，使用的针对G-CSF受体的激动剂优选与作为ES细胞的来源的动物同种的动物来源的，也可以使用来源于异种动物的。

此外，本发明中，优选在体外进行ES细胞和G-CSF的接触。

本发明的实施中，为了将ES细胞维持在未分化状态，优选，根据该ES细胞的动物品种，在通常使用的条件下培养。即，小鼠ES细胞的情况下，优选在培养基中预先添加100-10000U/mL，优选500-2000U/mL浓度的白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor：LIF)。

然后，在除去LIF的分化用培养基中将ES细胞分化诱导至心肌细胞。优选，在分化诱导开始时，在使ES细胞与针对G-CSF受体的激动剂接触之前，在ES细胞和抑制BMP信号转导的物质的存在下培养ES细胞。在使用BMP拮抗体(例如，Noggin蛋白质、Chordin蛋白质等)作为抑制BMP信号的物质时，在无菌除去老的培养基后，用含有浓度为1ng/mL-2μg/mL，优选5ng/mL-1000ng/mL，更优选10ng/mL-500ng/mL的Noggin蛋白质或Chordin蛋白质的培养基替换，优选继续培养数日，更优选继续培养3天。

然后，在使用G-CSF作为针对G-CSF受体的激动剂时，在无菌除去老的培养基后，以培养基中的终浓度达到0.01ng/mL-500ng/mL，优选0.05ng/mL-300ng/mL，更优选0.75ng/mL-25ng/mL或2.5ng/mL-25ng/mL添加G-CSF，继续培养。添加G-CSF时期为分化开始后第3-10天，更优选为第5-8天，最适浓度或适用天数可适当改变。

通过上述方法，由ES细胞分化诱导的心肌细胞，接着通过用公知方法进行的细胞回收，分离，纯化法，可以有效且大量地获得高纯度的心肌细胞。

心肌细胞的纯化方法，只要是公知的细胞分离纯化方法就可以使用任意一种，作为具体的例子，可以列举流式细胞仪或磁珠，淘选法(panning)等基于抗原-抗体反应的方法(Monoclonal Antibodies：principles and practice，第三版(Acad.Press，1993)；AntibodyEngineering：A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press，1996))，或通过使用蔗糖、Percoll等载体的密度梯度离心进行细胞分级法。而且，作为其它的心肌细胞选择法，可以列举作为基础的ES细胞等多能性干细胞的基因中预先进行人为修饰，给予药物耐受性或异位性蛋白质的表达能力，回收具有作为心肌细胞的性状的细胞的方法。例如、Field和共同研究者，通过向小鼠ES细胞中导入位于α型肌球蛋白重链启动子的控制下的可以表达新霉素(G418)耐受性基因的基因盒，只有在该ES细胞分化成心肌细胞，随之表达α型肌球蛋白重链基因时，构建出在添加了G418的培养基中可以生存的细胞系，确认通过该方法选择为G418耐受性细胞的细胞99％以上的几率为心肌细胞(美国专利第6,015,671号；Klug et al.，J.Clin.Invest.98：216，1996)。

作为其它的实施方式，本发明涉及使用上述本发明的分化诱导方法通过分化诱导ES细胞制做的心肌细胞，即呈现出心肌细胞形态学，生理学和/或免疫学特征的细胞。生理学和/或免疫学特征没有特别限定，通过本发明的方法制备的细胞可以表达作为心肌细胞被识别的物异于心肌细胞的1个或1个以上的标记。

此外，在其它实施方式中，本发明还涉及含有针对G-CSF受体的激动剂的将ES细胞向心肌细胞分化诱导的分化诱导剂。优选针对G-CSF受体的激动剂为G-CSF，而且优选在体外使用。

此外，在其它实施方式中，本发明还涉及针对G-CSF受体的激动剂用于使ES细胞分化成心肌细胞的使用。针对G-CSF受体的激动剂优选是G-CSF，而且优选在体外使用。

根据本发明制备的心肌细胞可以作为心肌再生药或心脏疾病的治疗药使用。作为心脏疾病，可以列举心肌梗塞、缺血性心脏疾病、充血性心力衰竭、肥大型心肌症、扩张型心肌症、心肌炎、慢性心力衰竭等。作为心肌再生药或心脏疾病治疗药，只要是以高纯度含有根据本发明制备的心肌细胞即可，可以采用使细胞悬浮于培养基等水性载体上的，将细胞包埋于生物体分解性基质等支持体中的，或加工成单层或多层心肌细胞层(Shimizu et al，Circ.Res.90：e40，2002)的药物等各种形状的药物。

作为向障碍部位输送上述治疗药的方法，可以列举开胸，用注射器直接注入到心脏中的方法，外科切开心脏的一部分再移植的方法，以及通过使用导管的经血管的方法进行移植的方法等(Murry et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.67：519，2002；Menasche、Ann.Thorac.Surg.75：S20，2003；Dowell et al.，Cardiovasc.Res.58：336，2003)，但并没有特别的限定。据报道若通过这样的方法，将从胎儿心脏回收的心肌细胞移植到心脏受损的动物的心脏中，则呈现极好的治疗效果(Menasche、Ann.Thorac.Surg.75：S20，2003；Reffelmann等人，Heart Fail.Rev.8：201，2003)。ES细胞来源的心肌细胞呈现出与来源于胎儿心脏的心肌细胞极为相似的性状(Maltsev et al.，Mech.Dev.44：41，1993；Circ.Res.75：233，1994)。而且，实际上在将ES细胞来源的心肌细胞移植到成体心脏中的动物实验例中，也确认了与移植了胎儿心肌的例子相比几乎没有变化，显示出极高的生长附着性(Klug等人，J.Clin.Invest.98：216，1996)。因此，在由心肌细胞的疲惫和脱落引起的上述心脏疾病中，通过在不健康的心脏组织中补充性移植用本发明记载的方法制备的心肌细胞，可以期待促进心脏功能的改善。

发明的效果

通过使用本发明的方法，可以有效且有选择性地由ES细胞生产心肌细胞。尤其是，由于本发明的方法作用于刚分化后的心肌，因此通过与已知方法组合，可以进一步提高诱导效率。这样制备的心肌细胞可以用于对心脏疾病有效的药物的探索和开发，基于此，可以在对严重心脏疾病的心脏移植治疗中使用。

实施例

下面，通过列举实施例对本发明进行更具体的说明，但以下的实施例只不过是本发明的例示，不对本发明的范围做任何限定。

实施例1：来源于小鼠胚胎心脏的心肌中G-CSF受体的表达

用以下的方法研究来源于小鼠胚胎心脏的心肌中G-CSF受体的表达。

(1)通过原位杂交进行研究

从日本CLEA购买妊娠的ICR野生型小鼠。在胚胎发育第7.5天、第8.5天、第9.5天和第10.5天时取出胚胎，使用地高辛标记的RNA探针，按照文献记载的方法(Sasaki H等人，Development118，47-59(1993))进行心脏的整体原位杂交(WISH)。小鼠G-CSF受体(csf3r)和心肌特异性转录因子Nkx2.5(登录号分别为NM_008711，NM_008700)的全长cDNA通过逆转录PCR(RT-PCR)获得，将其亚克隆到pBluescript质粒中。使用5′-CCC CTC AAA CCT ATC CTG CCT C-3′(SEQID NO：2)作为csf3r的正义引物，5′-TCC AGG CAG AGA TCA GCG AATG-3′(SEQ ID NO：3)作为反义引物，使用5′-CAG TGG AGC TGG ACA AAGGG-3′(SEQ ID NO：4)作为Nkx2.5的正义引物，5′-TAG CGA TTC TGG AACCA-3′(SEQ ID NO：5)作为其反义引物。用T3或T7 RNA聚合酶转录探针。获得的结果示于图1。G-CSF受体(csf3r)在胚胎发育第7.5天和胚胎发育第8.5天时强表达，但在这之后的阶段没有检测到。而Nkx2.5在后半阶段表达。

(2)通过免疫染色进行研究

用4％多聚甲醛将胚胎发育第8.5天、第9.5天和第10.5天时的小鼠心脏固定45分钟，用Tissue-Tek OCT(Sakura Finetek)包埋，制作切片。使各个试样与G-CSF受体(G-CSFR)(H176：santa cruz公司)或者针对心肌特异性蛋白质α-辅肌动蛋白的1级抗体结合。再与经Alexa 488标记的2级抗体(Molecular Probes公司)依次反应后，用荧光显微镜进行观察。核酸用DAPI(4′，6-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐：Sigma Aldrich)染色。结果示于图2。确认了在心脏和体节中从胚胎发育第8.5天开始表达G-CSF受体，这之后第9.5天达到顶点。

(3)通过逆转录PCR(RT-PCR)反应进行研究

研究胚胎发育第9.5天、第10.5天和第13.5天的小鼠胚胎心脏、新生小鼠心脏，成体小鼠心脏和小鼠肝脏中G-CSFR，G-CSF的表达。使用特异于心肌细胞的基因GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)作为对照。用Trizol试剂(GIBCO)从各组织中提取总RNA，用文献记载的方法(Niwa，H等人，Nat.Genet.24，372-376(2000))进行RT-PCR。获得的结果示于图3。确认了G-CSF4在胚胎发育第9.5天、第10.5天的胚胎心脏中强表达。

实施例2：心脏发生中G-CSF的体内作用(1)

在妊娠第9.0天对小鼠开腹，在子宫内直接施用G-CSF(100ng/kg)或作为对照的PBS(磷酸缓冲液生理盐水)。然后在妊娠第9.5天向母体内腹腔内施用BrdU(溴脱氧尿嘧啶核苷)。BrdU在DNA合成时被吸收，可以通过免疫染色评价增殖。在妊娠第12.5天取出胚胎制作心脏的切片。用与实施例1(2)中记载的免疫染色相同的方法进行试验，其结果示于图4。可以确认G-CSF促进胚胎的心肌增殖。

此外，用苏木精·伊红对心脏切片染色，用显微镜观察的结果示于图5a。经G-CSF施用的胚胎的心脏中，观察到了小梁层(trabecularlayer)延长。

进而，在缺失了G-CSF受体的G-CSFR敲除小鼠(以下记载为G-CSF-/-小鼠)(由Washington University，School of Medison的Dr.Daniel C.Link惠赠)(Richards等人，Blood，102，3562-3568，(2003))中实施同样的试验，与野生型小鼠进行比较。用苏木精·伊红对心脏切片染色，用显微镜观察的结果示于图5b。G-CSF-/-小鼠中，胚胎心脏的心房壁和心室壁显著薄于野生型小鼠，在几只小鼠中发现心房中有心房间隔缺损。这些小鼠的约50％在后期胚阶段死亡。

进而，为了定量心肌增殖促进效果，通过下式计算BrdU标记指数。并且，本试验中，用野生型小鼠，在妊娠第10.5天施用BrdU，在第12.5天时分析。

BrdU标记指数＝BrdU阳性核/总核×100(％)

获得的结果示于图6。观察到G-CSF施用增强心肌的增殖。

实施例3：心脏发生中G-CSF的体内作用(2)

在妊娠第9.0天时向妊娠小鼠母体子宫内直接施用2ng。妊娠第13.5天时取出胚胎，制作心脏的切片，通过Phospho-Histon H3进行免疫染色。Phospho-Histon H3是在细胞增殖过程中被特异染色的色素。获得的结果示于图7。观察到G-CS施用促进胚胎的心肌增殖。

通过下式计算标记指数。

标记指数＝Phospho-Histon H3阳性核/总核×100(％)

获得的结果示于图8。观察到G-CSF从胚胎发育第8.5天到第10.5天强烈增强心肌增殖。

此外，为了研究G-CSF对胚胎发育期心脏的凋亡的影响，对胚胎发育第10.5天的心脏进行Tunel染色。Tunel染色是可以识别凋亡时产生的DNA片段的染色法。获得的结果示于图9。胚胎发育第10.5天的心脏中几乎没有观察到凋亡。

实施例4：来源于ES细胞的心肌细胞中G-CSF受体的表达

在以下的实验中，使用EB3细胞(由丹羽仁史博士[理科学研究所]惠赠)和R1细胞(由Andrew Nagy博士[Mount Sinai医院；加拿大]惠赠)。这些ES细胞在含有10％胎儿牛血清，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸液，1mM丙酮酸钠，0.1mM 2-硫基乙醇和2000U/mL白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor：LIF)(ESGRO；Chemicon公司)的Glasgow最少必需培养值(GMEM；Sigma公司)培养基中，在经明胶包被的培养皿中维持。

用于使ES细胞形成EB的悬浮培养如下述方式进行。在含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸液，1mM丙酮酸钠，0.1mM 2-硫基乙醇和2000U/mL白血病抑制因子和0.15μg/ml Noggin(Noggin-Fc，R&D公司)的α-MEM培养基中，在经明胶包被的培养皿中培养3天。然后通过用胰蛋白酶溶液处理ES细胞达到单一细胞状态，然后在未包被的平皿上，用三维培养系统在与上述相同的分化培养基(但不含LIF)中培养，使之形成球状体，诱导EB(肺样体)。在本实验条件下，在悬浮培养后马上确认了ES细胞凝集，形成EB，悬浮培养后第7-8天就开始观察到一部分EB中有自律搏动性。

通过上述方法制作来源于经Noggin处理的(Noggin(+)组)的ES细胞的EB和来源于未经Noggin处理的(Noggin(-)组)ES细胞的EB，通过RT-PCR对EB中G-CSFR的表达进行试验。使用特异于心肌细胞的基因GAPDH作为对照。获得的结果示于图10。来源于经Noggin处理(Noggin(+)组)的ES细胞的EB中观察到G-CSFR在EB形成后第5天以后表达。

此外，使用EB形成后第6天的EB，进行免疫染色的结果示于图11。在来源于经Noggin处理(Noggin(+)组)的ES细胞的EB中G-CSFR的表达增加，这表明由Noggin导致的心肌诱导增加G-CSFR的表达。

然后，使用EB形成后第6天，第7天和第8天的EB，使用与实施例1(2)相同的方法进行免疫染色，结果示于图12。通过用OCT包埋EB制作切片，按1∶50的比率使之与作为一级抗体的上述G-CSF受体抗体反应，按1∶800的比率使α辅肌动蛋白抗体(EA-53，Sigma)反应，与作为2级抗体的Alexa488和Alexa546反应后，进行核染。在EB形成后第6天，第7天和第8天的EB中，心肌标记物α辅肌动蛋白与G-CSF共表达，这表明在将ES分化诱导至心肌细胞时，G-CSF与心肌标记物共表达。

实施例5：G-CSF对来源于ES细胞的心肌细胞的分化诱导作用

使用G-CSF的心肌细胞的分化诱导试验按图13中所示方法进行。即，在包被了明胶的培养皿上在LIF存在下将ES细胞维持未分化的状态，在第0天时在不存在LIF下悬浮培养，一旦ES细胞开始分化，在第9天可以获得分化成心肌细胞的EB。在第5天，第6天，第7天和第8天添加G-CSF(2.5ng/ml)，研究对EB形成的作用，其结果示于图14。对于本作用，通过自律搏动的EB数除以总EB数来计算。在第6天施用G-CSF时对EB形成最有效果，这表明G-CSF施用的最适时期是第6天。

然后，用第9天的EB1，通过RT-PCR法和免疫染色法对各种特异于心肌的基因表达进行测定。RT-PCR法中使用的心肌标记物是Txb-5，MEF-2c(肌肉增强因子-2c)，Nkx2.5，GATA-4，βMHC(β肌球蛋白重链)，MLC-2v(肌球蛋白轻链-2v)，αMHC(α-肌球蛋白重链)，BNP(大脑性利尿肽，brain natriuretic peptide)，ANP(心房性利尿肽，atrial natriuretic peptide)和GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)。免疫染色法中使用的心肌标记物是α-辅肌动蛋白，肌动蛋白，肌钙蛋白1-C、MF20和ANP。获得的结果示于图15。G-CSF施用组中所有的心肌标记物的表达都增加了。

进而，为了研究G-CSF的最适浓度，在胚胎发育第6天添加各个浓度(0.25，0.75，2.5，7.5，25，75ng/ml)的G-CSF，用RT-PCR法研究各心肌标记物的表达。并且，在试验中使用H(2×10³细胞/ml)和L(5×10⁴细胞/ml)这两种细胞密度的EB。获得的结果示于图16。不依赖于细胞密度，收缩蛋白，转录因子，分泌蛋白的表达均由于0.25-25ng/ml的G-CSF添加而比对照组有所上升，我们认为该浓度是最适浓度。

根据上述结果求出G-CSF的最适浓度，其结果示于图17。最适浓度的研究，通过比较通过用自律搏动的EB数除以总EB数求出的数值来实施。其结果是，观察到G-CSF的最适浓度为0.75ng/ml。

实施例6：G-CSF抗体对G-CSF的心肌分化诱导作用的抑制效果

为了确认由G-CSF处理产生的ES细胞的心肌分化诱导促进效果是通过内源性G-CSF信号转导途径的可能性，在G-CSF处理的同时在培养基中添加抗G-CSF抗体(R&D systems公司)，研究其效果。在胚胎发育第6天时在添加G-CSF(7.5ng/mL)的同时，使各种浓度(0，1，3，9ng/mL)的抗G-CSF抗体共存，用各种心肌标记物研究其影响，其结果示于图18。观察到抗G-CSF抗体以浓度依赖性使心肌标记物表达降低。

实施例7：G-CSF对来源于ES细胞的心肌细胞的增殖促进作用

为了就G-CSF对来源于ES细胞的心肌细胞的增殖促进作用进行试验，在胚胎发育第6天制作G-CSF(7.5ng/mL)添加组和未添加组以及G-CSF+诺考达唑(0.2μg/mL)添加组。诺考达唑是一种通过纺锤丝形成抑制作用特异性抑制细胞分裂的药剂。对这3组，使用各种心肌标记通过RT-PCR研究，其结果示于图19。在使G-CSF与EB作用的同时，添加诺考达唑，通过抑制细胞分离导致心肌标记物的表达上升被消除。这表明G-CSF的作用促进心肌的前体细胞的增殖。

此外，在胚胎发育第6天制备G-CSF(2.5ng/mL)添加组和未添加组，然后与BrdU一起温育18小时。对它们用抗BrdU抗体(Roche公司制)和抗mef2c抗体(Santa Cruz公司制)进行双重免疫染色，其结果示于图20(左)。此外，计算BrdU标记指数，结果示于图20(右)。确认了G-CSF促进心肌细胞的细胞增殖。

实施例8：G-CSF在灵长类的心脏发生中的作用

普通绒猴ES(Common Marmoset ES：CMES)细胞的制作

为了试验G-CSF在灵长类的心脏发生中的作用，使用普通绒猴ES(Common Marmoset ES：CMES)细胞(#20)(Sasaki等人，Stem Cells23，1304-1313(2005))。在Knockout DMEM(GIBCO)培养基(补充20％Knockout血清替代品(KSR；GIBCO)、1mM L-谷氨酰胺(GIBCO)、0.1mMMEM非必需氨基酸液(GIBCO)、0.1mmM β-巯基乙醇(2-ME；Sigma)，10ng/ml成纤维细胞增殖因子(Bfgf；Invitrogen)和10ng/ml人白血病抑制因子(hLIF；Alomone labs))中，在有丝分裂非活性化小鼠胚成纤维细胞(MEF)的层上维持。通过每5天传代一次CMES细胞，维持在未分化状态。

EB的制作

将未分化的CMES细胞从MEF饲养层剥离，用人及猴ES细胞用剥离液(Repro CELL，日本)分离小集落，接下来将其在不含bFGF和hLIF的培养基中用Hydro Cell(注册商标)培养皿(CellSeed，日本)进行悬浮培养而得到EB。

G-CSF的作用的研究

EB形成后，在第4天，第6天和第9天时添加G-CSF(2.5ng/mL)，观察自我搏动性。所得结果示于图21a。最好的是，在EB形成后第6天时添加时，G-CSF添加组和未添加组的差异在第14天变得明显了。观察到G-CSF添加对心脏形成的作用在EB形成后第6天时最大，这之前，之后都变小。

添加小鼠G-CSF或人G-CSF，通过RT-PCR调查CMES细胞中各种心肌标记物的表达，结果示于图21b。观察到小鼠G-CSF和人G-CSF均强烈增强心肌标记物的表达。而且，通过免疫染色调查的结果示于图21c。G-CSF增强来源于CMES细胞的EB的心脏肌钙蛋白I和Nkx2.5阳性区域。

根据这些结果，表明G-CSF是灵长类的心肌细胞增殖所必需的，这提示出其在包括人在内的所有哺乳动物中的作用。

Claims (14)

1.将ES细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其包括使ES细胞与针对G-CSF受体的激动剂接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括在针对G-CSF受体的激动剂的存在下培养ES细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述针对G-CSF受体的激动剂是G-CSF。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其包括以下步骤：

(a)向细胞培养液中添加G-CSF的工序，和

(b)使用(a)的培养液培养ES细胞的工序。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，ES细胞与G-CSF的接触在体外进行。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，还包括在使ES细胞与针对G-CSF受体的激动剂接触之前，在抑制BMP信号转导的物质的存在下培养ES细胞的工序。

7.根据权利要求6所述的方法，抑制BMP信号转导的物质是Noggin。

8.通过权利要求1-7任一项所述的方法获得的心肌细胞。

9.由ES细胞分化诱导成心肌细胞的分化诱导剂，其包括针对G-CSF受体的激动剂。

10.根据权利要求9所述的分化诱导剂，针对G-CSF受体的激动剂是G-CSF。

11.根据权利要求9或10所述的分化诱导剂，其是在体外使用的。

12.针对G-CSF受体的激动剂在使ES细胞分化诱导成心肌细胞的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，所述针对G-CSF受体的激动剂是G-CSF。

14.根据权利要求12或13所述的用途，其是在体外使用。

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