SK286870B6 - Ľudská keratinocytová bunková línia, in vitro spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom - Google Patents

Abstract

Ľudská keratinocytová bunková línia imortalizovaná najmenej jedným funkčným nádorovým génom pochádzajúcim aspoň z SV40 vírusu a ľudského papilómu vírusu 16, ktorá (1) nie je tumorogénna, (2) zachováva si schopnosť diferencovať sa a exprimovať proteíny a enzýmy exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi, aj po zvýšenom počte pasáží zahŕňajúc aspoň 10 kultivačných pasáží, a (3) tvorí stratifikovaný a polarizovaný epitel s ortokeratinocytovým stratum corneum, ak sa kultivuje v organo-typovej kultúre v bezsérovom médiu a bez vrstvy výživných buniek. Vynález sa ďalej týka in vitro spôsobu prípravy imortalizovaných keratinocytových bunkových línií odvodených z normálnych kožných tkanív a použitia ľudskej ketanínocytovej bunkovej línie a umelej kože s jej obsahom.

Description

Oblasť vynálezu

Vynález sa týka imortalizovaných bunkových línií odvodených od normálnych ľudských kožných tkanív, ktoré majú zlepšené diferenciačné vlastnosti; ďalej sa týka in vitro spôsobu prípravy týchto bunkových línií a ich rôzneho použitia, najmä v oblasti vytvárania umelej kože.

Doterajší stav techniky

Príprava imortalizovaných („zvečnených“) bunkových línii, odvodených z normálnych ľudských kožných tkanív už bola opísaná. Spôsoby používané na tento účel všeobecne zahŕňajú transformáciu ľudských kožných buniek, napríklad keratinocytov a melanocytov, ktoré sa kultivujú in vitro s látkami vnášajúcimi bunkám imortalizovanosť. Imortalizácia sa týka prípravy buniek, ktoré možno kultivovať dlhší čas in vitro, teoreticky po nekonečný čas. Tieto bunky sa tiež označujú ako pokračujúce alebo večné bunkové línie. Na rozdiel od uvedeného nie imortalizované bunky sú schopné proliferácie počas iba určitého počtu bunkových delení in vitro. Imortalizované bunky sú mimoriadne výhodné, pretože poskytujú stály, potenciálne neobmedzený zdroj buniek, ktoré majú určité vlastnosti. Typické látky na prípravu imortalizovaných bunkových línií a imortalizovaných ľudských kožných bunkových línií zahŕňajú najmä, napríklad, rekombinantná vírusy a plazmidy, ktoré obsahujú DNA sekvencie, vnášajúce vlastnosť imortalizácie.

Najbežnejší spôsob prípravy imortalizovaných ľudských bunkových línií zahŕňa pravdepodobne použitie sekvencii vírusu Simian Vírus 40 (SV40), bližšie, zahŕňa použitie DNA T- antigénu (T-Ag) SV 40 ako imortalizačné činidlo. O použití SV 40 vektorov a vektorov obsahujúcich sekvenciu T - antigénu SV 40 na prípravu imortalizovaných ľudských bunkových línií referujú napríklad Steinberg et al., I. Celí Phys. 123, 117 až 125 (1985); patent USA 4 885 238 (Reddel et al.)', patent USA 4 707 448 (Major); Stoner et a!., Cancer Res. 51, 365 až 371 (1991); Chopra et al., In vitro Celí Dev. Biol. 30A, 539 až 546 (1994); Chopra et al., In vitro Celí Dev. Biol. 27A, 763 až 765 (1991); Christian et al., Cancer Res. 47. 6066 až 6073 (1987); Rhim et al., Science 227, 1250 až 1252 (1985); a Grubman et al., Gastrointest. Liver Physiol. 29, G1060 až G1070 (1994). Vloženie uvedených sekvencii sa vo všeobecnosti vykoná infekciou s SV 40 vírusom alebo s 12/SV 40 hybridným adenovírusom, alebo transfekciou buniek s rekombinantným plazmidom, obsahujúcim dlhé terminálne opakovania Rousovho nádorového vírusu a regulačnú SV40 ori-oblasť koprecipitáciou v prítomnosti fosforečnanu strontnatého (pozri Brash et al., Mol. Celí Biol. 7, 2031 až 2034 (1987).

Ďalší známy spôsob prípravy imortalizovaných bunkových línií najmä imortalizovaných ľudských keratinocytov zahŕňa transfekciu alebo infekciu buniek s DNA sekvenciami ľudskéhu vírusu papilloma (HPV). Napríklad, v patente USA 5 375 542 (Schlegel) sa opisuje spôsob dosiahnutia imortalizovaných ľudských epitelových buniek E6 a E7 génmi, izolovanými z HPV-16, 18, 31, 33 alebo 36, alebo E7 génmi samotnými, na prípravu nie nádorotvomých imortalizovaných ľudských bunkových línií. Ďalej, Barbosa et al., Oncogene 4, 1529 až 1532 (1989), Miinger et al., J. Virol. 63(10), 4417 až 4421 (1989) opisuje použitie E6 a E7 génov z HPV-16 a HPV-18 na prípravu imortalizovaných ľudských keratinocytov. Dúrst et al., Oncogene X, 251 až 256 (1987) opisuje spôsob dosiahnutia imortalizovanosti keratinocytov vírusom papilómu, typu 16.

Hoci imortalizované keratinocytové bunkové línie a ich použitie v pokusoch in vitro opisujú mnohé skupiny odborníkov, predsa línie imortalizovaných keratino-cytových buniek podľa doteraz známeho stavu v odbore majú jednu alebo dve vlastnosti, ktoré obmedzujú ich využitie. Už uvedené imortalizované keratinocyty majú napríklad jednu alebo viac z nasledujúcich nevýhodných vlastností: (a) majú zníženú alebo celkom chýbajúcu expresiu diferenciačných markerov, napríklad proteínov, ktoré sú exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi; (b) je im vlastný modifikovaný rast v tkanivovej kultúre a (c) tvoria stratifikovaný a polarizovaný epitél s para-keratinocytovým stratum corneum.

Aby sa vylúčili uvedené nevýhody, navrhuje sa v EP 780 496 (Société des Produits Nestlé) nový spôsob dosiahnutia imortalizácie keratinocytov alebo ľudských melanocytov, v ktorom sa používa en sus nové kultivačné médium, vektor pLXSHD+SV40(#328), ktorý je odvodený od vírusu SV40, alebo rovnako vektor pLXSHD+E6/E7, ktorý je odvodený od ľudského papilómu vírusu 16 (HPV-16). Imortalizované bunky získané týmto spôsobom si zachovávajú schopnosť diferenciácie a expresie proteínov a enzýmov, aké sú exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi a melanocytmi aj po väčšom počte kultivačných pasáží.

Napriek doteraz uvedenému stále sa v praktickej oblasti pociťuje významná potreba ľudských imortalizovaných keratinocytov, ktoré by mali ešte lepšie vlastnosti. Uvedené zlepšené bunky by boli mimoriadne výhodné v značnom počte aplikácií, najmä na analýzy, ktoré vyžadujú vysoko diferencované kožné bunky.

Podstata vynálezu

Ľudská keratinocytová bunková línia imortalizovaná najmenej jedným funkčným nádorovým génom pochádzajúcim aspoň z SV40 vírusu a ľudského papilómu vírusu 16, ktorá (1) nie je tumorogénna, (2) zachováva si schopnosť diferencovať sa a exprimovať proteíny a enzýmy, exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi aj po zvýšenom počte pasáži zahŕňajúc aspoň 10 kultivačných pasáží, a (3) tvorí stratifikovaný a polarizovaný epitel s orto-keratinocytovým stratum corneum, ak sa kultivuje v organo-typovej kultúre v bezsérovom médiu a bez vrstvy výživných buniek.

Vynález sa ďalej týka in vitro spôsobu prípravy imortalizovaných keratinocytových bunkových línií odvodených z normálnych kožných tkanív.

Vynález sa ešte ďalej týka použitia keratinocytových bunkových línií pripravených podľa tohto vynálezu, napríklad na imunologické, farmakologické, foto- a chemicko-toxikologické analýzy reakcie kože a na expresiu heterológnych génov.

Vynález poskytuje nie tumorogénne, imortalizované keratinocytové bunkové línie, to znamená bunkové línie, ktoré napríklad po injekčnom podkožnom podaní netvoria nádory u zvierat pri použití najmenej 2 x 10⁶ buniek v každej injekcii.

Tieto bunkové línie si tiež zachovávajú schopnosť diferencovať a exprimovať proteíny diferenciácie, exprimované normálnymi keratinocytmi, ešte aj po zvýšenom počte pasáží. Výraz „zvýšený počet pasáží“ znamená najmenej 10 pasáží v kultúre, výhodne najmenej 20 až 30 pasáží, výhodnejšie najmenej 50 pasáží a teoreticky neobmedzený počet pasáží. Imortalizované keratinocyty pripravené podľa tohto vynálezu napríklad exprimujú diferenciačné proteíny obsahujúce keratín K.l/10, keratín K14, involukrín, filagrín a lorikrín ešte aj po zvýšenom počte pasáží v tkaninových kultúrach.

Imortalizované keratinocyty podľa tohto vynálezu majú profil cytochrómu p450 (CYP450) podobný, ale nie zhodný, s profilom normálnych keratinocytov. Bunky podľa tohto vynálezu napríklad exprimujú CYP450 1A1, 2E1, 2C18 a 3A5. Imortalizované keratinocyty podľa tohto vynálezu ďalej exprimujú enzýmy fázy II, napríklad glutatión-S-transferázu π (GSTx) spôsobom, porovnateľným s normálnymi, nie imortalizovanými keratinocytmi.

Uvedené imortalizované keratinocyty podľa tohto vynálezu ďalej exprimujú proteíny a enzýmy, zúčastňujúce sa oxidačných pochodov v bunkách a zápalových reakcií, napríklad superoxydismutázy (SOD) a kolagenázy typu I a nádorového nekrotického faktora a (TNFa) po ošetrení forbolovými estermi, podobným alebo rovnakým spôsobom ako normálne diferencované keratinocyty. Týmito vlastnosťami predstavujú bunkové línie podľa tohto vynálezu mimoriadne zaujímavý, reprodukovateľný zdroj pre imunologické, farmakologické, zápalové, foto- a chemicko-toxikologické štúdiá kožných reakcií.

Ak sú línie imortalizovaných keratinocytov podľa tohto vynálezu kultivované v organotypových kultúrach v bezsérovom médiu (napríklad médium NR2 firmy Biofluids Inc. USA, obohatené s EGF (5 ng.mľ¹), vitamínom C (38 pg.mľ¹) a CaCĽ (1,5 mmolu)) a bez vrstvy výživných buniek (bez fibroblastov) navyše vytvárajú stratifikovaný a polarizovaný epitel s povrchovými keratinovanými vrstvami, bežne označované ako takzvané stratum corneum, ktoré má orto-keratinocytovú morfológiu, čo znamená, že stratum corneum je zbavené jadrových buniek, tzn. buniek obsahujúcich jadro.

Príprava stratifikovaného a polarizovaného epitelu s imortalizovanými keratinocytmi sa doteraz dosahovala v podmienkach tradičnej kultivácie, to znamená technikou využívajúcou teľacie sérum a vrstvu výživných buniek (Lechner et al., Virology 185, 536 až 571 (1991)). Uvedené imortalizované bunky ale netvoria normálne povrchové keratinované vrstvy. Napríklad bunkové línie, imortalizované vírusom papilómu 16 alebo 18, alebo E6/E7 sú známe tým, že tvoria veľmi neusporiadaný epitel (Blanton et al., Am. J. Pathol. 138, 673 až 685 (1991; Hudson et al., J. Virol. 64, 519 až 526 (1990); McCane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 7169 až 7173 (1988); Woodworth et al., Oncogene 7, 619 až 626 (1992)).

Na rozdiel od uvedeného, línie opísané v EP 780 496 (Société des Produits Nestlé), ak sú kultivované v organo-typovej kultúre v bezsérovom médiu a bez vrstvy výživných buniek, vytvárajú stratifikovaný a polarizovaný epitel s normálnymi povrchovými keratinovanými vrstvami, ale majú para-keratinocytovú morfológiu, to znamená, že stratum corneum ešte stále obsahuje bunky s jadrom.

Imortalizované keratinocyty podľa tohto vynálezu tiež pohlcujú exogénne esenciálne mastné kyseliny (AGE) a predstavujú nenasýtený stav; predĺženie reťazca uvedenej AGE dokonale zodpovedá nenasýtenému stavu a predĺženiu reťazca normálnych keratinocytov.

Imortalizované keratinocyty podľa tohto vynálezu možno vo všeobecnosti pripraviť spôsobom zahrnujúcim:

(a) získanie vzorky ľudskej kože;

(b) prípravu vzorky kože na získanie primárnych keratinocytov schopných kultivácie;

(c) kultiváciu uvedených primárnych keratinocytov v bezsérovom médiu, výhodne v médiu NR-3 (opísané v EP 780 496) na kultivačných platniach s povlakom, uľahčujúcim fixáciu a rast buniek; uvedený povlak obsahuje fibronektín, SAB a kolagén I. typu;

(d) nahradenie bezsérového média takým spôsobom, aby sa na kultivačných platniach dosiahol optimálny splývavý (konfluentný) nárast keratinocytov; povlak platne sa nepretržite udržiava;

(e) oddelenie keratinocytov v kultúre od melanocytov a prenos oddelených keratinocytov do infekčného média, výhodne do média NR-3 a výhodne po ošetrení buniek podobným spôsobom kompozíciou obsahujúcou trypsín a EDTA s použitím kultivačných platní s povlakom;

(f) infikovanie buniek funkčnými tumorogénnymi génmi z najmenej dvoch retrovírusov, ako sú vírus SV40 a vírus ľudského papilómu;

(g) prenos imortalizovaných keratinocytov do proliferačného média bez séra na kultivačné platne, vopred podobným spôsobom pokryté, výhodne do média NR-2 alebo NR-3 (média sú opísané v EP 780 496); uvedené médiá sa týmto odkazom zahŕňajú do tejto prihlášky; a (h) prenos imortalizovaných keratinocytov po proliferácii do bežného diferenciačného média, ktoré má vysoký obsah vápnika (1,5 mM), výhodne do média NR-2, obohateného s EGF (5 ng.mľ¹) a vitamínom C (38 pg.mlj.

Podrobný opis; krok (a) prípravy zvyčajne zahŕňa získanie vzoriek ľudského kožného tkaniva od normálneho ľudského darcu, napríklad získanie vzoriek počas chirurgického alebo pediatrického zákroku. Imortalizácia jednotlivej vzorky kožných buniek, to znamená autológnej vzorky kožných buniek, umožňuje produkciu imortalizovaných keratinocytových bunkových línií s určitými vlastnosťami, napríklad profil niektorého receptora je charakteristický pre určitého darcu.

Vzorka kožného tkaniva sa ďalej spracuje v kroku (b) tak, že je vhodná na kultiváciu in vitro. Toto spracovanie sa výhodne uskutoční počiatočným premývaním vzorky kožného tkaniva, napríklad premývaním médiom použitým na kultiváciu. Tento pracovný úkon sa výhodne uskutoční v médiu NR-2, ktoré je bezsérové a jeho presné zloženie sa uvádza EP 780 496; ukázalo sa, že na kultiváciu normálnych keratinocytov je toto médium výhodné. Je výhodné, ak sa vzorka kožného tkaniva po premytí oholí, napríklad pomocou dermatomu a následne sa rozreže na malé kúsky.

Je výhodné, ak sa výsledné rezy kože potom rozdelia na zamšu (dermis) a pokožku (epidermis). Rozdelenie možno uskutočniť fyzikálne a/alebo enzymaticky. Rozdelenie sa môže napríklad uskutočniť účinkom trypsínu, napríklad flotáciou vzoriek kožného tkaniva v roztoku trypsínu (napríklad v približne 0,5 % roztoku) obsahujúcom EDTA (napríklad 0,1 %) na čas, ktorý postačuje na oddelenie buniek, napríklad po dobu približne 30 až 60 minút pri teplote 37 °C, alebo napríklad cez noc pri 4 °C.

Zamša sa oddelí a pokožka sa potom vloží do média, v ktorom sa disperguje na suspenziu. Je výhodné, ak suspenzné médium obsahuje roztok inhibítora sójového trypsínu (SBTI) a ak sa médium privedie do styku s bunkami dostatočný čas, zvyčajne 5 minút, na inaktiváciu trypsínu a na vyvolanie uvoľňovania buniek. Aby sa získali vyžadované bunky, to znamená keratinocyty pridá sa potom tkanivové kultivačné médium, výhodne médium NR-2 zbavené séra (opísané v EP 780 496) a filtrované (napríklad filtrom s pórmi 100 nm).

Výsledné primárne keratinocyty, pripravené v kroku (b) sa potom použijú ako zárodky do bezsérového média, výhodne do média NR-3 (je opísané v EP 780 496); použijú sa vo vhodnej koncentrácii, výhodne v koncentrácii približne l,2xl0⁴ buniek na 1 cm² vopred pokrytých platní. Túto koncentráciu buniek možno ale v širokom rozmedzí meniť. Kultivačné platne sa výhodne pokryjú povlakom obsahujúcim kompozíciu, ktorá zlepšuje fixáciu a rast keratinocytov, bližšie roztokom fibronektínu, SAB a kolagénu I. typu.

V kroku (d) sa kultivačné médium nahrádza tak často, ako je potrebné na dosiahnutie optimálneho rastu buniek. Je výhodné, ak sa médium nahrádza vždy po približne dvoch dňoch. Tento interval ale môže byť rôzny v závislosti od príslušnej vzorky kožného tkaniva. Po dosiahnutí takmer úplného pokrytia, napríklad pokrytia približne 90 %, ktoré sa dosiahne po približne 10 až 14 dňoch, sa keratinocyty oddelia od melanocytov. Delenie sa môže uskutočniť ktorýmkoľvek zvoleným spôsobom, ktorý umožňuje delenie bez škodlivého účinku na melanocyty a/alebo keratinocyty. Delenie sa môže napríklad vykonať diferenciačným ošetrením trypsínom. Je výhodné, ak melanocyty a keratinocyty sa ošetria roztokom trypsínu/EDTA a následne prenesú do selekčného média. V prípade keratinocytov sa bunky výhodne ošetria počas približne 5 až 10 minút roztokom trypsinu/EDTA (0,025 % / 0,01 %) a potom sa použijú v kroku (e) ako zárodky do média NR-3 na vopred pokryté platne.

Keratinocyty sa následne spracujú s imortalizačným činidlom. Kým sa uskutoční imortalizácia bunky možno zmraziť. Zmrazenie možno vykonať napríklad v tekutom dusíku. Infekcia a imortalizácia sa výhodne uskutočnia použitím funkčných tumorogénnych génov z najmenej dvoch retrovírusov, ako sú napríklad T-Ag vírusu SV40 a E6/E7 HIV16. Každý z týchto génov môže byť prítomný v nezávislom retrovírusovom konštrukte, napríklad v retrovírusovom vektore pLXSHD+SV40(#328), znázornenom na obr. 1 a opísanom Stockshlaederom et al. (GeneBank, prístupové číslo M64753; Human Gene Therapy 2, 33 až 39 (1991) a v retrovírusovom vektore pLXSHD+E6/E7, ktorý je znázornený na obr. 2.

Retrovirusový vektor pLXSHD+SV40(#328) obsahuje okrem iných sekvencií sekvenciu T-Ag z SV40, dlhé 5' a 3' sekvencie, terminálne opakovania z SV40, sekvencie pBR322, ktoré umožňujú replikáciu E. coli, cyklus násobného klonovania, polyadenylačnú sekvenciu z SV40.

Vektor pLXSHD+E6/E7 obsahuje v polohe génu kódujúceho pre T antigén Ncol/Cfol fragment z E6/E7 génu odvodený od vírusu 16 ľudského papilómu.

Po imortalizácii sa následne bunky počas kultivácie podrobia potrebnému počtu pasáži a výsledné imortalizované bunky sa potom prenesú do proliferačného média v kroku (g). Tento prenos sa výhodne vykoná počas druhej pasáže. Ako uvedené proliferačné médium možno použiť bezsérové médium, výhodne médium NR-2 alebo NR-3. Imortalizované bunky sa kultivujú na kultivačných platniach, vopred spojito pokrytých povlakom, obsahujúcim opäť roztok fibronektínu, SAB a I. typ kolagénu.

Po multiplikácii imortalizovaných buniek v proliferačnom médiu (výhodne v NR-2) sa keratinocyty prenesú v kroku (h) do média podnecujúceho diferenciáciu normálnych a imortalizovaných buniek, výhodne do média simulujúceho podmienky prevládajúce v koži; tak sa vytvára organizácia keratinocytov v stratifikovanom a polarizovanom epiteli s normálnymi povrchovo keratínizovanými vrstvami. Bunky sa nakoniec môžu kultivovať v bezsérom médiu s vysokým obsahom vápnika, napríklad v médiu NR-2 obsahujúcom približne 1,5 mM vápnika, približne 5 ng.ml¹ EGF a približne 38 pg.mľ¹ vitamínu C; kultivácia sa vykoná na platniach v priebehu 2 až 3 týždňov na fázovom rozhraní tekutina-vzduch, napríklad na platniach s 12 jamkami Falcon No.3043, každá jamka má vložený Falcon No.3180, pričom keratinocyty sa vyvíjajú na rozhraní vzduch'kvapalina. Vzduch pozostáva z atmosféry, obsiahnutej vo vnútornom priestore vložky a je bez výživného média. Kvapalina je výživné médium a je v jamke; médium prechádza membránou vložky Falcon No. 3180, na ktorej sa vyvíjajú keratinocyty.

Čo sa týka vlastností imortalizovaných keratinocytov podľa tohto vynálezu, tieto sú bezvýhradne vhodné na imunologické, farmakologické, foto- a chemicko- toxikologické analýzy reakcií kože. Imortalizované línie keratinocytových buniek podľa tohto vynálezu možno napríklad použiť na analýzy vyžadujúce diferenciáciu kožných buniek, napríklad v štúdiách bariérovej funkcie (keratinizácie) rekonštruovaného kožného tkaniva, v štúdiách metabolizmu diferencovaných keratinocytov (metabolizmus mastných kyselín, metabolizmus antioxidantov), v štúdiách vplyvu UV žiarenia na kožné bunky, v štúdiách vplyvov látok s potenciálnym dráždivým účinkom na kožné bunky a látok spôsobujúcich precitlivelosť buniek pokožky, v štúdiách metabolizmu lipidov, na miestne ošetrenia a/alebo v štúdiách vplyvu média s xenobiotickými látkami (napríklad kozmetických olejov pri výbere prípustných ochranných kompozícií, napríklad foto-ochranných látok), v štúdiách zápalov a dráždenia kože a v ďalších.

Keratinocytové bunkové línie pripravené podľa tohto vynálezu možno ďalej použiť na výber potenciálne protirakovinových látok a zlúčenín, potenciálne použiteľných na liečbu kožných chorôb. Liečba vo všeobecnosti zahŕňa uvedenie bunkovej línie do styku po zvolený čas so skúšanými látkami a stanovenie potenciálnej indukcie akýchkoľvek škodlivých účinkov, napríklad genotoxických účinkov, tvorby DNA-aduktov, mutagenity, bunkovej transformácie alebo cytotoxických účinkov.

Línie imortalizovaných keratinocytov podľa tohto vynálezu možno ďalej použiť pri skúškach mutagenity DNA, pri skúškach selekcie látok spôsobujúcich mutagenitu kože, pri analýzach a identifikácii látok ovplyvňujúcich zmeny chromozómov, v štúdiách malignantných transformácií, v štúdiách bunkovej biochémie (napríklad analýzy aktivácie CYP450), pri výbere zlúčenín a kompozícií, napríklad zmesí esenciálnych mastných kyselín zapájajúcich sa v zápalových a alergických reakciách, v analýzach aktivácie kolagenázy (v spojení so zápalom), zahŕňajúcej TNFa a detekciu interleukínu.

Vzhľadom na skutočnosť, že bunkové línie podľa tohto vynálezu tvoria orto-keratínicytové stratum corneum, sú veľmi dobre prispôsobené na použitie pri príprave umelej kože, vhodnej na štúdiá mutagenity, na imunologické, farmakologické, foto- a chemicko- toxikologické štúdiá, uvedené skôr. Táto koža môže pozostávať iba z epitelu keratinocytov podľa tohto vynálezu, ale výhodne obsahuje tiež kolagén, fibroblasty, aj melanocyty, napríklad preto, aby sa dosiahla lepšia podobnosť s normálnou ľudskou kožou.

Keratinocytové bunkové línie podľa tohto vynálezu sú ďalej schopné exprimovať rekombinantné proteíny, napríklad ľudské polypetidy a proteíny a sú schopné produkovať aj RNA a DNA.

Medzi imortalizovanými keratinocytovými bunkovými líniami podľa tohto vynálezu je iba jediná bunková línia DK-7NR, ktorá je ako príklad od 19. marca 1998 uložená podľa Budapeštianskej dohody v Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M.) [Adresa: 25 rue de Docteur Roux, 75 724 Paris, France] a má pridelené úložné číslo CNCM 1-1996. Uloženie sa vykonalo podľa Budapeštianskej dohody. Všetky obmedzenia, ktoré sa týkajú dostupnosti tejto bunkovej línie budú zrušené po priznaní patentu, príslušnému tejto patentovej prihláške alebo inej prihláške, nárokujúcej prioritu tejto prihlášky.

Ďalšie znaky tohto vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho opisu príkladov, ktoré sa uvádzajú na objasnenie tohto vynálezu a v žiadnom prípade nie na jeho obmedzenie. Pokiaľ sa neuvádza inak, manipulácie s bunkami, príprava vektorov, transformácia buniek a všetky ďalšie technické postupy sa vykonávajú v súlade s protokolmi opísanými v publikácii Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Ilarbor Laboratory Press, USA 1989).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje konštrukciu podľa tohto vynálezu odvodeného retrovírusu SV40, menovite plazmidu pLXSHD+SV40((#328) použitého na dosiahnutie imortalizovanosti keratinocytov.

Obr. 2 predstavuje konštrukciu podľa tohto vynálezu odvodenú od retrovírusu vírusu papilómu 16, menovite plazmidu pLXSHD+E6/E7 použitú na dosiahnutie imortalizácie keratinocytov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava a vlastnosti bunkových línií

Vzorky kožného tkaniva sa odobrali z oblasti pŕs. Po oddelení dermálnej a epidermálnej časti sa zamša upravila rezom na malé kúsky 0,2 x 0,2 mm a kúsky sa fixovali sérom na 6 cm kultivačnú platňu. Po 2 až 4 hodinách sa pridalo Dulbeccovo minimálne médium (DMEM, 10 % fetálne teľacie sénim). Kultúra explantov sa potom inkubovala až do zreteľného intenzívneho rastu fibroblastov. Kultúry súvislo rozložených fibroblastov sa oddelili a multiplikovali, aby sa získali rezervné zmrazené kultúry.

Primárnymi bunkami sa očkovali kultivačné komory, ktoré mali súvislý povlak „koktejlu“; tento povlak bol opísaný pre bronchiálne bunky (Lechner et al., J. Tiss. Cult. Meth. 9, 43 až 49 (1985)). Po dosiahnutí takmer úplného pokrytia, napríklad po dosiahnutí 90 % pokrytia, čo trvalo zvyčajne približne 10 až 14 dní sa keratinocyty a melanocyty oddelili. Kultúra sa nakoniec počas 5 minút ošetrila roztokom trypsínu/EDTA (0,025 %/0,01 %) a prv samy odseparované melanocyty sa následne oddelili od keratinocytov. Primáme keratinocyty sa následne kultivovali s použitím opísaných kultivačných komôr v médiu NR-3 bez séra až do vyžadovanej koncentrácie buniek (médium NR-3 uprednostňuje rast keratinocytov v porovnaní s rastom melanocytov).

Bunky sa potom transfektovali plazmidmi pLXSHD+SV40(#328) a pLXSHD+E6/E7 podľa protokolu Pfeifera et al. (Meth. Celí. Sci. 17, 83 až 89 (1995)) s výnimkou, že vírus bol odobratý po enkapsulácii v bunkovej línii, ktorá rástla v médiu DMEM s 10 % fetálneho bovinného séra. Na dosiahnutie imortalizácie sa keratinocyty potom infektovali vírusom. Počas infekcie sa tiež použilo médium bez séra PC-1, ktoré sa opisuje v uvedenej publikácii Pfeifera et al.

Po imortalizácii sa imortalizované keratinocyty preniesli do proliferačného média NR-2 alebo NR-3, pričom sa použili kultivačné komôrky s vopred pripraveným povlakom. Po proliferácii buniek na vyžadovaný počet buniek sa bunky preniesli do diferenciačného média, vhodného na kultiváciu normálnych aj imortalizovaných keratinocytov (NR-2).

Možno preukázať, že imortalizované keratinocyty lepšie rastú aj pri zvýšenom počte kultivačných pasáží, čo možno porovnávať s rastom opísaným pre bunkové línie podľa EP 780 496.

V kožných bunkách obsahujúcich normálne alebo imortalizované keratinocyty sa hodnotila expresia CYP450, 1 Al, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 a 2D6 pomocou DNA polymerázovej reťazovej reakcie pri teplote miestnosti (expresia mRNA). Profil imortalizovanými keratinocytmi exprimovaného CYP450 je pri najmenšom podobný ak nie rovnaký ako uvedený profil normálnych keratinocytov.

Uvedené bunkové línie reagujú na indukčnú látku CYP450 obsahujúcu benz(a)pyrén rovnakým spôsobom ako neimortalizované bunky, a to aj pri zvýšenom počte pasáží.

Diferenciačné markery sa analyzovali pomocou špecifických protilátok proti T-Ag, involukrínu, filagrínu, lorikrínu, vimentínu a keratinomK4, K7, K8, K10/1, K13, K14, K17, K18 a K19. Najlepšiu schopnosť diferenciácie možno pripísať bunkovej línii DK-7-NR.

Spôsobmi Westem-blot a Northem-blot sa analyzovala glutatión-S-transfe-ráza (GST). Všetky línie keratmocytov silne exprimovali mesengerovú RNA pre GSTx. Profil expozície k GSTa, GS'ľp a GSTn v uvedených bunkových líniách je podobný profilu normálnych keratinocytov.

Na analýzu a porovnanie desaturácie a predĺženia ku keratinocytom pridanej AGE sa imortalizované keratinocyty (a tiež normálne keratinocyty) ošetrili kyselinou linolovou (LA, 15 pmolov) a kyselinou linolénovou (LN, 15 pmolov). V týchto pokusoch sa použilo médium NR-2 (Biofluids Inc.) nedostatočné na AEG. Po dosiahnutí konfluencie sa bunkové kultúry ošetrili a preniesli sa z uvedeného média do média NR-2 s vysokým obsahom vápnika (1,5 mM). Bunky sa ošetrovali AEG počas 4 dni (po dvoch dňoch sa AEG obnovilo). Analýza AEG sa vykonala extrakciou a separáciou fosfolipidov pomocou CCM (chromatografia v tenkej vrstve) a kvantitatívne stanovenie metylesterov mastných kyselín sa vykonalo pomocou GCL (chromatografia plyn/kvapalina). Zaznamenala sa desaturácia a elongácia LA (20:4n-6 a 22:4n-6) a LN (20:5n-3, 22:5n-3, a 22:6n-3). Metabolický profil bol zhodný s profilom pozorovaným u normálnych keratinocytov.

Všetky bunkové línie boli hypodiploidné s najväčším počtom chromozómov v intervale diploidných buniek. Okrem analyzovaných buniek neboli v kultúrach prítomné iné bunky. Tento výsledok potvrdzuje čistotu uvedených bunkových línií a žiadne znečistenie z iných zdrojov.

Schopnosť imortalizovaných buniek vyvolávať nádory sa stanovovala subkutánnou injekciou (1 až 2 x 10⁶ kyratínocytov) myši. Línie skúšaných keratinocytov a najmä línia DK-7-NR neboli voči myšiam tumorogénne.

Príklad 2

Príprava epitelu

Pripravilo sa médium NR-2 s obsahom 750 000 buniek z bunkovej línie z príkladu 1; do vložiek Falcon No.3180 sa odmeralo po 0,5 ml pripraveného média, vložky sa umiestnili do jamiek platní Falcon No. 3043, ktoré už obsahovali 2 ml čerstvého média NR-2; keratinocyty sa kultivovali 2 dni v podmienkach priaznivých pre rast keratinocytov. Tretí deň sa médium z vložiek odstránilo a bunky sa nechali voľne na vzduchu. Médium v jamkách sa pravidelne každé dva dni vymieňalo za médium NR-2 doplnené s EGF (5 ng.mľ¹), vitamínom C (38 ng.mľ') a CaCl₂ (1,5 mM). Týmto spôsobom sa v kultúre po dvoch až troch týždňoch na rozhraní vzduchu a kvapaliny vytvoril epitel, ktorý sa oddelil a fixoval kyselinou pikrovou; po fixácii sa zhodnotila morfológia.

Výsledky ukázali, že keratinocytové bunkové línie, najmä línia DK-7-NR vytvárajú stratifikovaný a polarizovaný epitel, bežne označovaný ako takzvaný stratum basale, obsahujúci bunky s kuboidálnou morfológiou identickou s normálnymi bunkami. Stratum corneum má morfológiu orto-keratinocytov, to znamená, že je zbavené buniek obsahujúcich jadro. Vznik orto-keratinocytovej bunkovej vrstvy pri iných známych imortalizovaných bunkových líniách nebol doteraz možný. Napríklad bunková línia DK-2-NR (EP 780 496) v rovnakých podmienkach tvorí stratum corneum para-keratinocytov, to znamená že vrstva zrohovatených buniek stále obsahuje bunky s jadrom. Normálnu situáciu ľudskej kože ale reflektuje iba orto-keratinocytová morfológia. Para-keratinocytové stratum corneum sa v skutočnosti vyznačuje anomálnou hypertrofiou epitelu, vedúcou k poruchám, ako je napríklad psoriáza alebo neoplazia.

Príklad 3

Skúška dráždivosti

Bunkové línie získané v príklade 1, najmä línia DK-7-NR sa kultivovali v médiu NR-2. Northemovým prenosom a biologickými analýzami sa po vystavení pokožky účinkom dráždivých činidiel obsahujúcich PMA (forbol-12-myristát-13-acetát) a UV-B (ultrafialové žiarenie B) hodnotila indukcia „stresového génu“ TNFa (nádorový nekrotický faktor ct). Výsledky preukázali, že uvedené bunkové línie, najmä bunková línia DK-7-NR poskytujú reakciu na PMA a na UV-B a exprimujú proteín TNFa aj po zvýšenom počte pasáží.

Príklad 4

Vo vložke Falcon No.3180 sa nahradila membrána vrstvou benzylesteru kyseliny hyalurónovej (Hyaff 11). Dno vložky sa očkovalo primárnymi ľudskými fibroblastmi (0,1 x 10⁶ buniek v 0,2 ml média); po 30 minútach reakcie sa vložka naplnila médiom DMEM, obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra; inkubovalo sa niekoľko dni pri 37 °C v atmosfére s obsahom 5 % CO₂; vložka sa potom vyprázdnila a pridalo sa 0,5 ml média NR-2, obsahujúceho 750 000 buniek bunkovej línie DK-7-NR; vložky sa vložili do jamiek platní Falcon No.3043, v ktorých už boli po 2 ml čerstvého média NR-2; bunky sa kultivovali 2 dni v podmienkach priaznivých pre rast keratinocytov. Tretí deň sa médium z vložiek odstránilo a bunky sa nechali voľne na vzduchu. Médium v jamkách sa pravidelne každé dva dni vymieňalo za médium NR-2 doplnené s EGF (5 ng.mľ'), vitamínom C (38 pg.mľ') a CaCl₂ (1,5 mM). Po dvoch až troch týždňoch sa týmto spôsobom v kultúre na rozhraní vzduchu a kvapaliny vytvorila umelá koža, ktorá podľa hodnotenia mala vlastnosti význačné pre normálnu kožu.

Claims (12)

PATENTOVÉ NÁROKY

1) nie je tumorogénna,

1. Ľudská keratmocytová bunková línia imortalizovaná najmenej jedným funkčným nádorovým génom pochádzajúcim z SV40 vírusu a najmenej jedným funkčným nádorovým génom pochádzajúcim z ľudského papilómu vírusu 16, ktorá:

2. Ľudská keratinocytová bunková línia podľa nároku 1, kde každý funkčný nádorový gén je obsiahnutý v nezávislom retro vírusom konštrukte.

2) zachováva si schopnosť diferencovať sa a exprimovať proteíny a enzýmy exprimované normálnymi diferencovanými keratinocytmi, aj po zvýšenom počte pasáží zahŕňajúc 10 a viac kultivačných pasáží, a

3. Ľudská keratinocytová bunková línia podľa nároku 1, ktorou je bunková línia DK-7-NR s úložným číslom podľa Budapeštianskej dohody CNCM 1-1996.

3) tvorí stratifikovaný a polarizovaný epitel s orto-keratinocytovým stratum corneum, ak sa kultivuje v organo-typovej kultúre v bezsérovom médiu a bez vrstvy výživných buniek.

4. In vitro spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek na získanie imortalizovaných keratinocytov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) prípravu vzorky získanej z ľudského kožného tkaniva na kultiváciu in vitro;

(b) získanie keratinocytov z uvedenej pripravenej vzorky kožného tkaniva a ich naočkovanie do rastového bezsérového média na kultivačných platniach s povlakom fibronektínu, BSA a kolagénom I. typu, ktoré uľahčujú fixáciu a rast buniek;

(c) nahrádzanie bezsérového média takým spôsobom, aby sa na kultivačných platniach dosiahol optimálny súvislý rast keratinocytov s nepretržitým udržiavaním tohto povlaku na platni;

(d) prenos keratinocytov zo selekčného bezsérového média na kultivačné platne vopred pokryté povlakom podľa odseku (b);

(e) infikovanie keratinocytov použitím funkčných nádorových génov minimálne z SV40 vírusu a humánneho papilómu vírusu 16 ;

(f) prenos výsledných imortalizovaných keratinocytov do proliferačného média bez séra vhodného na proliferáciu imortalizovaných keratinocytov, na kultivačné platne, vopred pokryté povlakom podľa odseku (b);

(g) prenos výsledných proliferovaných imortalizovaných keratinocytov do diferenciačného média bez séra, ktoré má vysoký obsah vápnika, do kultivačných komôr vopred pokrytých povlakom podľa odseku (b).

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že každý funkčný nádorový gén je obsiahnutý v nezávislom retrovírusovom konštrukte.

6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že použité retrovírusové konštrukty sú vektory pLXSHD+SV40(# 328) a pLXSHD+E6/E7, pričom pLXSHD+SV40(# 328) retrovírusový vektor obsahuje T-Ag z SV40, dlhé koncové replikačné sekvencie 5' a 3' z SV40, pBR322 sekvencie, ktoré umožňujú replikáciu v E. coli, multiplicitný klonovací cyklus, polyadenylačnú sekvenciu z SV40 a iné sekvencie, a retrovírusový vektor pLXSHD+E6/E7 obsahuje, na mieste génu kódujúceho T-antigén, Ncol/Cfol fragment E6/E7 génu pochádzajúceho z humánneho papiloma vírusu.

7. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že bezsérové médium v krokoch (b), (d) alebo (f) je médium NR-3.

8. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že diferenciačné médium v kroku (g) je upravené NR-2 médium s obsahom vápnika najmenej 1,5 mM.

9. Použitie keratinocytov podľa nároku 1 na imunologické, farmakologické, foto- a chemickotoxikologické analýzy reakcií kože a na expresiu heterológnych génov.

10. Použitie podľa nároku 9, pričom sa použije línia DK-7-NR s úložným číslom podľa Budapeštianskej dohody CNCM 1-1996.

11. Umelá koža, ktorá obsahuje keratinocytovú bunkovú líniu podľa nároku 1.

12. Umelá koža podľa nároku 11, ktorá obsahuje bunkovú líniu DK-7-NR, ktorá má úložné číslo podľa Budapeštianskej dohody CNCM 1-1996.