CN105219697A - 一种人原代角质细胞分离制备的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人原代角质细胞分离制备的方法，其包括以下步骤：(1)原代角质细胞分离；(2)原代角质细胞培养；(3)原代角质细胞冻存；(4)原代角质细胞活性检测。本发明提供的角质细胞分离制备的方法，采用DKSFM成分限定的无血清角质细胞专用培养体系，不含牛血清成分及滋养层细胞，避免了非人源活性蛋白及其它生物成分的引入，使下游研究体系更单一；直接冻存原代细胞，复苏后细胞具有更高的存活率，同时由于采用成分限定的无血清角质细胞专用培养基，减少了促进细胞分化的因子含量，有利于角质细胞体外培养周期的延长，表现出更多的倍增次数，使下游研究体系更稳定。

Description

一种人原代角质细胞分离制备的方法

技术领域

本发明涉及一种人原代角质细胞分离制备的方法。

背景技术

人角质细胞是组成人表皮的主要细胞，由于培养的表皮细胞膜片可以用于临床移植治疗烧伤、白癜风等多种皮肤疾病，获得稳定高存活率的人表皮角质细胞对于基础和临床研究都十分重要。目前普遍的角质细胞分离和培养体系大多会引入非人源的成分，比如使用血清和滋养层细胞，大大带来安全风险。同时角质细胞是一种非常容易终末分化的原代细胞，而作为研究对象，往往需要比较好的稳定性和传代能力，这就需要对分离和培养体系进行改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种角质细胞分离制备的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明一种人原代角质细胞分离制备的方法，其包括以下步骤：

(1)原代角质细胞分离：取新鲜皮肤样本经乙醇消毒，去除皮肤表面微生物的污染，之后用磷酸盐缓冲液清洗若干次，去除样本上的残余乙醇，将样本切割成1.8～2.2mm直径的微小颗粒；用35～45mL酶活为150-300U/mL的胶原蛋白酶处理所得微小颗粒，4℃过夜放置；过滤收集含角质细胞的表皮组织，并放入胰酶-EDTA中35～40℃处理1-3小时，分离角质细胞；在转速为1800rpm下离心收集细胞沉淀；用40mLDMEM细胞培养基洗涤细胞2次；收集到的皮肤细胞用角质细胞专用培养液DKSFM重悬，使用血细胞计数仪对细胞数量及活性进行计算；按照5×10⁴cells/cm²接种在直径为100mm细胞培养皿；

(2)原代角质细胞培养：接种后第2天，倒置显微镜下观察细胞贴壁生长状态，记录生长状态；细胞接种后每天更换新鲜培养基；细胞接种后每天观察记录细胞贴壁生长情况；

(3)原代角质细胞冻存：细胞接种培养3-7天后达到60-90％的汇合度，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液清洗数遍；用5mLTrypLE处理细胞，在37℃，5-10分钟；显微镜下观察细胞收缩情况，待所有细胞变圆后加入10mLDKSFM，轻微吹打使细胞分散成悬液，取出100ul细胞进行细胞计数，在1800rpm下离心收集细胞沉淀；90％DKSFM+10％DMSO配置细胞冻存液，根据细胞计数结果，按照1×10⁶cells/mL添加细胞冻存液，重悬细胞，置入程序性降温盒，放入零下80℃超低温冰箱过夜冻存细胞；从上步冻存盒中取出细胞，放入液氮罐中长期保存，并记录保存批次及数量；

(4)原代角质细胞活性检测：从同一批冻存的原代角质细胞中任意选取1管，37摄氏度水浴中迅速融化细胞，加入不含抗生素的DKSFM细胞培养液，取出100ul进行细胞数量和存活率的计算；细胞悬液1800rpm离心，收集细胞沉淀；DKSFM重悬细胞，使细胞均匀分散，接种细胞培养皿；之后在37℃下采用5％的CO₂培养；隔天更换培养基，至细胞汇合度达到40-60％时，改为每天更换培养基；每天用倒置显微镜观察细胞生长状态及有否细菌感染情况，并拍照记录；细胞汇合度达到60-90％时，传代细胞；细胞持续培养至完全分化，停止增殖时，根据最终细胞数量及复苏时起始细胞数量，计算倍增周期及次数。

本发明所达到的有益效果是：

(1)采用DKSFM(Definedkeratinocyte－SFM)成分限定的无血清角质细胞专用培养体系，不含牛血清成分及滋养层细胞，避免了非人源活性蛋白及其它生物成分的引入，使下游研究体系更单一；

(2)直接冻存原代细胞，复苏后细胞具有更高的存活率，可以高达75％以上，同时由于采用成分限定的无血清角质细胞专用培养基，减少了促进细胞分化的因子含量，有利于角质细胞体外培养周期的延长，表现出更多的倍增次数，大于26次，使下游研究体系更稳定。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明一种角质细胞分离制备的方法，其包括以下步骤：

(1)原代角质细胞分离：取新鲜包皮环切术后皮肤样本经乙醇消毒，去除皮肤表面微生物的污染，之后用磷酸盐缓冲液清洗若干次，去除样本上的残余乙醇，将样本切割成2mm直径的微小颗粒；用35～45mL酶活为150-300U/mL的胶原蛋白酶处理所得微小颗粒，4℃过夜放置；过滤收集含角质细胞的表皮组织，并放入胰酶-EDTA中35℃处理1小时，分离角质细胞；在转速为1800rpm下离心收集细胞沉淀；用40mLDMEM(高糖)细胞培养基洗涤细胞2次；收集到的皮肤细胞(含大量角质细胞，少量黑素细胞和成纤维细胞等)用角质细胞专用培养液DKSFM(Gibco，ThermoFisher，USA)重悬，使用血细胞计数仪对细胞数量及活性进行计算；按照5×10⁴cells/cm²接种在直径为100mm细胞培养皿(Corning，USA)；

(2)原代角质细胞培养：接种后第2天起，在倒置显微镜下观察并记录细胞贴壁生长状态；细胞接种后每天更换新鲜培养基；细胞接种后每天观察记录细胞贴壁生长情况；

(3)原代角质细胞冻存：细胞接种培养3-7天后达到60％的汇合度，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液清洗数遍；用5mLTrypLE(Gibco，ThermoFisher，USA)处理细胞，在37℃，5-10分钟；显微镜下观察细胞收缩情况，待所有细胞变圆后加入10mLDKSFM，轻微吹打使细胞分散成悬液，取出100ul细胞进行细胞计数，在1800rpm下离心收集细胞沉淀；90％DKSFM+10％DMSO配置细胞冻存液，根据细胞计数结果，按照1X10⁶cells/mL添加细胞冻存液，重悬细胞，置入程序性降温盒，放入零下80℃超低温冰箱过夜冻存细胞；从上步冻存盒中取出细胞，放入液氮罐中长期保存，并记录保存批次及数量；

(4)原代角质细胞活性检测：从同一批冻存的原代角质细胞中任意选取1管，37摄氏度水浴中迅速融化细胞，加入不含抗生素的DKSFM细胞培养液，取出100ul进行细胞数量和存活率的计算(活细胞/细胞总数)；细胞悬液1800rpm离心，收集细胞沉淀；DKSFM重悬细胞，使细胞均匀分散，接种细胞培养皿；之后在37℃下采用5％的CO₂培养；隔天更换培养基，至细胞汇合度达到40-60％时，改为每天更换培养基；每天用倒置显微镜观察细胞生长状态及有否细菌感染情况，并拍照记录；细胞汇合度达到60％时，传代细胞；细胞持续培养至完全分化，停止增殖时，根据最终细胞数量及复苏时起始细胞数量，计算倍增周期及次数。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种人原代角质细胞分离制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原代角质细胞分离：取新鲜皮肤样本经乙醇消毒，去除皮肤表面微生物的污染，之后用磷酸盐缓冲液清洗若干次，去除样本上的残余乙醇，将样本切割成直径为2mm的微小颗粒；用35～45mL酶活为150-300U/mL的胶原蛋白酶处理所得微小颗粒，4℃过夜放置；过滤收集含角质细胞的表皮组织，并放入胰酶-EDTA中35～40℃处理1-3小时，分离角质细胞；在转速为1800rpm下离心收集细胞沉淀；用40mLDMEM细胞培养基洗涤细胞2次；收集到的皮肤细胞用角质细胞专用培养液DKSFM重悬，使用血细胞计数仪对细胞数量及活性进行计算；调整为5×10⁴cells/cm²后接种在直径为100mm细胞培养皿上；

(2)原代角质细胞培养：接种后第2天，倒置显微镜下观察细胞贴壁生长状态，记录生长状态；细胞接种后每天更换新鲜DKSFM培养基；细胞接种后每天观察记录细胞贴壁生长情况；

(3)原代角质细胞冻存：细胞接种培养3-7天后达到60-90％的汇合度，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液清洗数遍；用5mLTrypLE处理细胞，在37℃，5-10分钟；显微镜下观察细胞收缩情况，待所有细胞变圆后加入10mLDKSFM，轻微吹打使细胞分散成悬液，取出100ul细胞进行细胞计数，在1800rpm下离心收集细胞沉淀；90％DKSFM+10％DMSO配置细胞冻存液，根据细胞计数结果，按照1×10⁶cells/mL添加细胞冻存液，重悬细胞，置入程序性降温盒，放入零下80℃超低温冰箱过夜冻存细胞；从上步冻存盒中取出细胞，放入液氮罐中长期保存，并记录保存批次及数量；

(4)原代角质细胞活性检测：从同一批冻存的原代角质细胞中任意选取1管，37摄氏度水浴中迅速融化细胞，加入不含抗生素的DKSFM细胞培养液，取出100ul进行细胞数量和存活率的计算；细胞悬液1800rpm离心，收集细胞沉淀；DKSFM重悬细胞，使细胞均匀分散，接种细胞培养皿；之后在37℃下采用5％的CO₂培养；隔天更换培养基，至细胞汇合度达到40-60％时，改为每天更换培养基；每天用倒置显微镜观察细胞生长状态及有否细菌感染情况，并拍照记录；细胞汇合度达到60-90％时，传代细胞；细胞持续培养至完全分化，停止增殖时，根据最终细胞数量及复苏时起始细胞数量，计算倍增周期及次数。