CN103289950A - 奶牛瓣胃上皮细胞体外分离、培养以及保存和复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶牛瓣胃上皮细胞体外分离、培养以及保存和复苏方法。分离、培养包括以下步骤：1）瓣胃组织的取得；2）培养液的制备；3）细胞分离：得原代培养的瓣胃上皮细胞；4）瓣胃上皮细胞的纯化：得纯化后的瓣胃上皮细胞；5）瓣胃上皮细胞的传代培养。奶牛瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，包括以下步骤：1）制备含奶牛瓣胃上皮细胞的冷冻保护液；2）将上述冷冻保护液逐步慢速降温；3）冻存细胞的解冻复苏培养。采用本发明的方法能延长奶牛瓣胃上皮细胞的保存时间。本发明是第一个公布奶牛瓣胃上皮细胞分离纯化培养法和保存复苏法的发明。本发明为研究奶牛胃肠道上皮细胞对小肽等营养物质的吸收提供了重要的实验材料和技术平台。

Description

奶牛瓣胃上皮细胞体外分离、培养以及保存和复苏方法

技术领域

本发明涉及组织与细胞工程、转基因动物等研究领域，特别是上皮细胞的分离、纯化、培养、冻存和复苏的方法。

背景技术

瓣胃上皮可以吸收大量小肽和氨基酸等多种营养物质，对奶牛营养吸收有重要意义。动物细胞培养模型在一定程度上模拟体内环境而广泛应用于医学、生物学、毒理学和营养学等领域，可用于研究细胞的形态、生长发育、细胞营养和代谢以及病变等微观过程，进行外源性物质吸收机制、转运途径及作用机理等方面的研究。从复杂的器官体外培养到简单的单一上皮细胞培养，可以很好的解决对于特定因素研究的问题，国内外很少有对奶牛瓣胃上皮细胞的体外培养的报告，并且仅限于短期的原代培养，对于其形态学、免疫鉴定、微观结构观察、冷冻保存以及吸收功能的研究就更少了；通过研究瓣胃上皮细胞的吸收功能和相关基因的表达，可以揭示奶牛前胃是如何吸收小肽等营养物质的、奶牛相关营养物质转运载体的吸收特征以及营养供应和相关基因表达间的关系。

细胞的原代培养是从体内取出细胞开始培养到第一次进行传代之前的时期，是一个特征性的必然生长阶段。细胞完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育的能力；对瓣胃上皮细胞的原代培养是构建细胞吸收模型系统的基础。

瓣胃上皮细胞是高度分化的体细胞，其体外培养存在一定的困难，特别是细胞原代分离所需的胰蛋白酶浓度和消化时间，这两个因素对分离下来的细胞活力影响很大，关系到原代培养的成功与否，目前对于奶牛瓣胃上皮细胞的体外培养技术一直不成熟，也很少有文献报道，本发明找到了分离瓣胃上皮细胞的最佳酶浓度和消化时间等因素，从而解决了这一难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种奶牛瓣胃上皮细胞体外分离、培养以及保存和复苏方法。

一种奶牛瓣胃上皮细胞体外分离方法，包括以下步骤：

1）瓣胃组织的取样

选用已经与奶牛相分离的瓣胃，剪取瓣胃叶，清洗、处理后得到瓣胃组织块，备用；

2）细胞分离

将步骤1）所得的瓣胃组织块放入容器中，加入2%～3%（M/V）的胰蛋白酶消化液消化1 h，弃上清液，再加入胰蛋白酶消化液继续消化30 min，取上清液观察，当视野中出现大量形态结构一致的细胞时，开始收集上清液得到含有细胞的收集液，此后每15-30 min收集一次，并向各收集液中加入血清终止消化，所得的细胞悬液经过滤和离心，得到分离的瓣胃上皮细胞。

 步骤1）中，所述的清洗中清洗液为添加了5倍双抗和2倍两性庆大霉素D-Hanks液；步骤2）中质量百分比浓度为2%～3%胰酶的消化液是用D-Hanks液配制的。

 一种所述的方法得到的分离的瓣胃上皮细胞的培养方法，用含抗生素的D-Hanks液清洗所述的分离的瓣胃上皮细胞多遍；然后调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于铺过鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下利用瓣胃上皮细胞培养液培养得到原代培养的瓣胃上皮细胞；所述的瓣胃上皮细胞培养液通过每毫升DMEM培养液中添加0.1 ml胎牛血清、10 ng表皮生长因子、5 μg胰岛素、6.8 μmol谷氨酰胺、100 IU青霉素、100 μg链霉素和2.5 μg两性霉素B制备得到。

所述的分离的瓣胃上皮细胞进一步纯化，所述的纯化方法为刮除法、差酶法、或差速贴壁法。

所述的分离的瓣胃上皮细胞进一步纯化后，经离心得瓣胃上皮细胞，接着用所述的培养液清洗后；去掉上清液，用所述的培养液重新悬浮细胞，并调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于细胞培养瓶，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔1天换一次液得到传代培养的瓣胃上皮细胞。

 一种得到的原代培养的瓣胃上皮细胞或得到的传代培养的瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，包括以下步骤：

1.1）制备冷冻保护液

冷冻保护液由以下体积百分比的组分组成：10% DMSO、20%胎牛血清和70%细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM基础培养基形成的混合物，装于冻存管中，所述细胞为纯化后的原代培养的瓣胃上皮细胞或传代培养的瓣胃上皮细胞；

2.1）将上述步骤1.1）所得的冷冻保护液逐步慢速降温：

a、将冻存管放入加了新鲜异丙醇的冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜，降温速率为1℃/min；

b、将上述步骤所得的-80℃的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被降温至-196℃；

将上述-196℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存;

3.1）将上述步骤2.1）中的冻存细胞进行解冻复苏培养：

a、从液氮中取出冻存管，放在37℃的水浴中晃动1-2 min，使其快速融化；

b、向冻存液中缓慢加入5 ml培养液悬浮细胞，1000 rpm离心5 min，去上清液，收集细胞，再用培养液清洗2遍，收集细胞，培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，当细胞生长至80%汇合度时，传代扩大培养。

本发明旨在建立可用于奶牛瓣胃上皮细胞吸收和转运营养物质机制、瓣胃上皮细胞生理、瓣胃上皮细胞凋亡以及瓣胃与营养供应等相关研究；发明涵盖了瓣胃上皮细胞分离、纯化、培养、生长、保存和复苏等过程。

本发明中奶牛瓣胃上皮细胞的分离纯化法，采用胰酶消化法、经过差酶法纯化了上皮细胞，发现在添加了胰岛素、L-Gln等成分的高糖DMEM培养液中，细胞呈典型上皮样形态，传至第10代的细胞依旧具有上皮细胞特征。

本发明的奶牛瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，相对于现有的保存方法，具有如下优点：能够显著提高冻存细胞的活力、有利于保护剂向细胞内部渗透，减少冰晶的形成，获得较好的保护效果，使细胞长期保存，复苏后细胞生长及形态均正常，生长良好，完善了瓣胃上皮细胞吸收模型。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1 是瓣胃上皮细胞不同生长时期形态变化图；A：刚消化下的接种于培养瓶2 h的细胞悬液，细胞开始贴壁；B：培养了12 h后的瓣胃上皮细胞生长状况，大部分细胞已经贴壁；C：培养2 d的瓣胃上皮细胞生长状况，细胞开始汇合；D：培养1周的瓣胃上皮细胞生长状况，细胞已汇合成片；E：纯化后的瓣胃上皮细胞生长状况；F：作为阴性对照的成纤维细胞。其中，A，B，E，F：200倍；C，D：100倍；箭头：成纤维细胞。

图2 是奶牛瓣胃上皮组织在消化酶处理前后的形态特征；A：在处理前，上皮结构比较完整；B：经过消化酶的处理，上皮已被消化下来，说明所分离得到的细胞为来源于上皮的细胞。其中，A：100倍；B：400倍；C：200倍。

图3 是奶牛瓣胃上皮细胞CK-18免疫细胞化学染色鉴定结果图；A：瓣胃上皮细胞有绿色荧光，B：未加一抗的阴性对照，无荧光。

图4 是瓣胃上皮细胞生长曲线图。

图5是瓣胃上皮细胞超微结构透射电镜图。

图6是是瓣胃上皮细胞超微结构扫描电镜图。

微绒毛结构（MV）、桥粒（D）、紧密连接（TJ）和张力微丝（T）。

具体实施方式

本发明提供的奶牛瓣胃上皮的分离、纯化培养法，包括以下步骤：

1）瓣胃组织的取样

选用已经与奶牛相分离的瓣胃，剪取瓣胃叶，将瓣胃叶上的食糜洗去，并经杀菌、清洗和剪碎处理后；得体积为1 cm²的瓣胃组织叶块，备用；

2）培养液的制备

培养液按照下述投料比获得：

每毫升DMEM培养液中添加0.1 ml胎牛血清、10 ng表皮生长因子、5 μg胰岛素、6.8 μmol谷氨酰胺、100 IU青霉素、100 μg链霉素和2.5 μg两性霉素B。

3）细胞分离

将步骤1）所得的瓣胃组织块放入锥形瓶中，加入10倍于组织体积的2%～3%（M/V）胰蛋白酶消化液气浴震荡消化1 h，弃去上清液，再向锥形瓶中加入新鲜的2%～3%（M/V）胰蛋白酶消化液继续消化30 min，取上清液，在倒置显微镜下观察，当视野中出现大量形态结构一致的细胞时，开始收集上清液，此后每15-30 min收集一次，向各含有细胞的收集液中加入血清终止消化，所得的细胞悬液经过滤和离心，得到分离的瓣胃上皮细胞。

用含抗生素的D-Hanks液清洗上述细胞3遍；最后用血细胞计数板调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于铺过鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养；培养至细胞覆盖80%的瓶底表面积时，得原代培养的瓣胃上皮细胞；

4）瓣胃上皮细胞的纯化

将原代培养的瓣胃上皮细胞采用刮除法、差酶法和差速贴壁法，用来纯化上皮细胞；具体如下：

刮除法：若上皮细胞簇和成纤维细胞间隔生长，用记号笔在培养瓶底标出成纤维细胞位置，用枪头或接种环刮去成纤维细胞，D-Hanks液清洗掉成纤维细胞，加入培养基继续培养；

差酶法：若成纤维细胞和上皮细胞混合生长，利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感性不同，先用质量浓度为0.15%胰酶的消化液消化成纤维细胞5-10 min，当成纤维细胞回缩变圆时，除去成纤维细胞及消化液；再加入质量浓度为0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化上皮细胞4-8 min，收集细胞培养；

差速贴壁法：根据成纤维细胞和上皮细胞的贴壁时间不同，在接种细胞半小时后，将含未贴壁细胞的悬液倒入新的培养瓶中培养养，则大部分上皮细胞存在于新培养瓶中，继续培养；

待细胞铺展到瓶底80%时，再重复上述方法，得到预纯化处理后的瓣胃上皮细胞；

当上述预纯化处理后的瓣胃上皮细胞达到80%汇合时，去除培养液；D-Hanks液冲洗细胞，然后加入质量浓度为0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液，以消化细胞，直到80%细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大时，用血清终止消化，所得的即为纯化后的瓣胃上皮细胞；

5）瓣胃上皮细胞的传代培养

将上述纯化后的瓣胃上皮细胞经离心，得细胞，接着用培养液清洗2遍；去掉上清液，用培养液重新悬浮细胞，并用血细胞板计数调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于细胞培养瓶，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔1天换一次液。

所述步骤1）和步骤3）中，清洗液D-Hanks液里加了5倍双抗和2倍两性庆大霉素；质量百分比浓度为2%～3%胰酶的消化液是用D-Hanks液配制的。

一种奶牛瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，包括以下步骤：

1）制备冷冻保护液：

冷冻保护液由以下体积百分比的组分组成：10% DMSO、20%胎牛血清和70%细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM基础培养基形成的混合物，以适量细胞密度装于冻存管中，所述细胞为纯化后的瓣胃上皮细胞或传代培养的瓣胃上皮细胞；

2）将上述步骤1）所得的冷冻保护液逐步慢速降温：

a、将冻存管放入加了新鲜异丙醇的冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜，降温速率为1℃/min；

b、将上述步骤所得的-80℃的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被降温至-196℃；

将上述-196℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。

3）将上述步骤2）中的冻存细胞进行解冻复苏培养：

a、从液氮中取出冻存管，放在37℃的水浴中晃动1-2 min，使其快速融化；

b、向冻存液中缓慢加入5 ml培养液悬浮细胞，1000 rpm离心5 min，去上清液，收集细胞，再用培养液清洗2遍，收集细胞，培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，当细胞生长至80%汇合度时，传代扩大培养。

为了证明本发明的优点，发明人做了如下的验证实验：

实验1、发明人对步骤3）所得的消化酶处理前后的组织进行了H&E染色，鉴定所分离细胞的来源，具体如下：

经过4%多聚甲醛固定后的组织，进行梯度脱水、包埋、切片、染色和观察，结果如图2所示。

实验2、发明人对步骤4）所得的纯化后的瓣胃上皮细胞和步骤5）所得的传代培养的瓣胃上皮细胞进行了如下鉴定，具体如下：

按照常规的细胞免疫荧光染色方法，一抗为鼠抗角蛋白18单克隆抗体，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG，激光共聚焦显微镜观察瓣胃上皮细胞的上皮特性以对细胞进行鉴定。

结果如图3所示，发现：CK-18特异性在瓣胃上皮细胞中表达，并在传代后的上皮细胞中检测到了相同的结果，说明培养的瓣胃细胞角蛋白特性（上皮特性）依然存在。

实验3、发明人对步骤4）所得的纯化后的瓣胃上皮细胞和步骤5）所得的传代培养的瓣胃上皮细胞进行了生长曲线的绘制，将细胞以适当密度接种于96孔板中，连续10天每天选6孔用WST-8液37℃孵育1 h，用酶标仪（Molecular Devices， USA）在450 nm处测吸光度，吸光度与细胞量呈正比。用6孔的平均值绘图，结果如图4所示，生长曲线呈“S”形，倍增时间为62 h。

实验4、发明人对步骤4）所得的纯化后的瓣胃上皮细胞和步骤5）所得的传代培养的瓣胃上皮细胞进行了超微结构观察，具体如下：传代培养至第三代生长旺盛的瓣胃细胞除培养液，原瓶用冷2.5%戊二醛4℃固定过夜，经0.1 M磷酸缓冲液漂洗样品三次，再用1%锇酸固定，后经乙醇梯度脱水、包埋、聚合、切片和染色等步骤制成超薄切片，在透射电镜（TEM，JEM-1230，JEOL）下观察，结果如图5所示。 对细胞玻璃爬片固定、脱水、包埋后，进行扫描电镜（Philips，XL30，Holland）观察，结果如图6所示。细胞表面有上皮细胞微绒毛结构，还有上皮细胞间的细胞连接方式-桥粒、紧密连接和张力细丝。实验结果表明，体外培养的瓣胃上皮细胞生长状态良好，上皮细胞特征完备，保持了体内上皮细胞的特点。

本发明的奶牛瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，相对于现有的保存方法，具有如下优点：能够显著提高冻存细胞的活力、有利于保护剂向细胞内部渗透，减少冰晶的形成，获得较好的保护效果，使细胞长期保存，复苏后细胞生长及形态均正常，生长良好，完善了瓣胃上皮细胞吸收模型。

为了证明本发明的奶牛瓣胃上皮细胞的保存法的优点，发明人作了如下的实验：将所培养的瓣胃上皮细胞冻存，至于液氮中保存2个月后，37℃热水浴迅速解冻复苏，将复苏的细胞调整好细胞浓度再种植到细胞培养瓶中，37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，细胞生长及形态均正常，达到了本实验的预期目的。

以下实施例中：

D-Hanks：不含Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks平衡盐溶液

DMSO：二甲基亚砜；

EDTA：乙二胺四乙酸；

FBS：胎牛血清；

5倍双抗和2倍庆大两性霉素：500 IU/ml青霉素+ 500 μg/ml链霉素和100 μg/ml庆大霉素+ 5 μg/ml两性霉素B。

实施例1、一种奶牛瓣胃上皮细胞的分离、纯化和培养法

依次进行以下步骤：

1）瓣胃组织的取样

瓣胃组织来源于一头出生不久的荷斯坦犊牛。

选用已经与奶牛相分离的瓣胃，剪取瓣胃叶，将瓣胃叶上的食糜尽快洗去，用加了5倍双抗和2倍庆大两性霉素的D-Hanks缓冲液清洗处理（3×5 min）；保存在含5倍双抗和2倍庆大两性霉素的DMEM基础培养基中，冰盒保存，尽快带回实验室。

在超净台中，用含5倍双抗和2倍庆大两性霉素的D-Hanks缓冲液再次清洗组织（3×5 min），然后把组织转入青霉素瓶中，剪碎到为1 cm²体积的瓣胃组织叶块，再次清洗，直到清洗液澄清为止，备用。

2）培养液的制备

培养液按照下述投料比获得：

每毫升DMEM培养液中添加0.1 ml胎牛血清、10 ng表皮生长因子、5 μg胰岛素、6.8 μmol谷氨酰胺、100 IU青霉素、100 μg链霉素和2.5 μg两性霉素B；

3）瓣胃上皮细胞的分离

将剪碎的组织转入锥形瓶中，加入10倍于组织体积的质量浓度为2.5%的胰蛋白酶消化液气浴震荡消化1 h，弃去上清液，再往锥形瓶中加入新鲜的2.5%胰蛋白酶消化液继续消化30 min，取上清液，在倒置显微镜下观察，当视野中出现大量形态一致的细胞时，开始收集上清液，此后每15-30 min收集一次，向含有上皮细胞的各收集液中加入0.5 ml血清终止消化，收集液用孔径105 μm的不锈钢滤网过滤，1000 rpm离心5 min，得形态一致的瓣胃上皮细胞。

用含抗生素的D-Hanks液上述细胞3遍；最后用血细胞计数板调整细胞密度，以5×10⁴/ml的密度接种于铺过鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养；当培养2 h时，细胞开始贴壁，有些细胞开始铺展开来（图1-A）；培养12 h后，大部分细胞已经贴壁，上皮细胞呈鹅卵石状并成簇生长，成纤维细胞呈梭形并单个成长（图1-B）；培养2天后上皮细胞簇面积变大，呈“铺路石”状，并有汇合成片的趋势，此时细胞消耗营养物质较快（图1-C）；培养一周后的细胞汇合成单层，上皮细胞和少量成纤维细胞混合生长（图1-D）。

4）瓣胃上皮细胞的纯化

将原代培养的瓣胃上皮细胞采用刮除法、差酶法和相差贴壁法，用以纯化上皮细胞；具体如下：

若上皮细胞簇和成纤维细胞间隔生长，用记号笔在培养瓶底标出成纤维细胞位置，用枪头或接种环刮去成纤维细胞，D-Hanks液清洗掉成纤维细胞，然后再用质量浓度为0.15%胰酶的消化液消化成纤维细胞5-10 min，此时成纤维细胞已变圆、呈灯笼状，上皮细胞形态还未变化，用D-Hanks液冲洗细胞，用移液枪吹打除去成纤维细胞及消化液；再加入质量浓度为0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化上皮细胞4-8 min，此时上皮细胞回缩、变圆、呈灯笼状，立即加入血清终止消化；D-Hanks液冲洗细胞，吹打，离心；将得到的上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度后，以5×10⁴/ml的密度接种于细胞培养瓶，在接种细胞半小时后，将含未贴壁细胞的悬液倒入新的培养瓶中培养养，则大部分上皮细胞存在于新培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养；待细胞铺展到瓶底80%时，再重复上述差酶法，得到预纯化处理后的瓣胃上皮细胞；当上述预纯化处理后的瓣胃上皮细胞达到80%汇合时，去除培养液；用D-Hanks液冲洗细胞，然后加入质量浓度为0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液，以消化细胞，直到80%细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大时，用血清终止消化；所得的即为纯化后的瓣胃上皮细胞，经过传代纯化后的上皮细胞形态一致，有典型“铺路石”状上皮形态（图1-E）；纯化过程中分离出的典型的梭状成纤维细胞如图1-F所示。

5）瓣胃上皮细胞的培养和生长

将上述纯化后的瓣胃上皮细胞经1000 rpm离心5 min以除去消化液并收集细胞，接着用D-Hanks缓冲液清洗，重复上述步骤3遍；去掉上清液，用培养液重新悬浮细胞，并用血细胞板计数，培养液调整细胞密度，以5×10⁴/ml的密度接种于细胞培养瓶，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔1天换一次液。传代细胞的形态经历了初始的单细胞分散生长、半汇合、汇合到密集生长三种基本形态变化。细胞核呈圆形或椭圆形，核仁以2-5个居多，细胞有接触抑制现象。四代以内的细胞基本以多角形上皮细胞为主，随着传代次数的增多，细胞形态不均一，呈长形、梭形和三角形混合生长。

实施例2、一种奶牛瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法

    依次进行以下步骤：

1）制备冷冻保护液：

冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成：10% DMSO、20%胎牛血清和70%细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM基础培养基形成的混合物，以适量细胞密度装于冻存管中，所述细胞为纯化后的瓣胃上皮细胞或传代培养的瓣胃上皮细胞。

2）将上述步骤1）所得的冷冻保护液逐步慢速降温

a、将冻存管放入加了新鲜异丙醇的冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜，降温速率为1 ℃/min；

b、将上述步骤所得的-80℃的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被降温至-196℃；

将上述-196℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。

3）将上述步骤2）中的冻存细胞进行解冻复苏培养

a、从液氮中取出冻存管，放在37℃的水浴中晃动1-2 min，使其快速融化；

b、向冻存液中缓慢加入5 ml培养液悬浮细胞，1000 rpm离心5 min，去上清液，收集细胞，再用培养液清洗2遍，收集细胞，培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，当细胞生长至80%汇合度时，传代扩大培养。

Claims (6)

1.一种奶牛瓣胃上皮细胞体外分离方法，其特征是，包括以下步骤：

1）瓣胃组织的取样

选用已经与奶牛相分离的瓣胃，剪取瓣胃叶，清洗、处理后得到瓣胃组织块，备用；

2）细胞分离

将步骤1）所得的瓣胃组织块放入容器中，加入2%～3%（M/V）的胰蛋白酶消化液消化1 h，弃上清液，再加入胰蛋白酶消化液继续消化30 min，取上清液观察，当视野中出现大量形态结构一致的细胞时，开始收集上清液得到含有细胞的收集液，此后每15-30 min收集一次，并向各收集液中加入血清终止消化，所得的细胞悬液经过滤和离心，得到分离的瓣胃上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的奶牛瓣胃上皮细胞体外分离方法，其特征是：步骤1）中，所述的清洗中清洗液为添加了5倍双抗和2倍两性庆大霉素D-Hanks液；步骤2）中质量百分比浓度为2%～3%胰酶的消化液是用D-Hanks液配制的。

3.一种根据权利要求1中所述的方法得到的分离的瓣胃上皮细胞的培养方法，其特征是，用含抗生素的D-Hanks液清洗所述的分离的瓣胃上皮细胞多遍；然后调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于铺过鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下利用瓣胃上皮细胞培养液培养得到原代培养的瓣胃上皮细胞；所述的瓣胃上皮细胞培养液通过每毫升DMEM培养液中添加0.1 ml胎牛血清、10 ng表皮生长因子、5 μg胰岛素、6.8 μmol谷氨酰胺、100 IU青霉素、100 μg链霉素和2.5 μg两性霉素B制备得到。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征是，所述的分离的瓣胃上皮细胞进一步纯化，所述的纯化方法为刮除法、差酶法、或差速贴壁法。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征是，所述的分离的瓣胃上皮细胞进一步纯化后，经离心得瓣胃上皮细胞，接着用所述的培养液清洗后；去掉上清液，用所述的培养液重新悬浮细胞，并调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于细胞培养瓶，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔1天换一次液得到传代培养的瓣胃上皮细胞。

6.一种根据权利要求3得到的原代培养的瓣胃上皮细胞或权利要求5得到的传代培养的瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，其特征是包括以下步骤：

1.1）制备冷冻保护液

冷冻保护液由以下体积百分比的组分组成：10% DMSO、20%胎牛血清和70%细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM基础培养基形成的混合物，装于冻存管中，所述细胞为纯化后的原代培养的瓣胃上皮细胞或传代培养的瓣胃上皮细胞；

2.1）将上述步骤1.1）所得的冷冻保护液逐步慢速降温：

a、将冻存管放入加了新鲜异丙醇的冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜，降温速率为1℃/min；

b、将上述步骤所得的-80℃的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被降温至-196℃；

将上述-196℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存;

3.1）将上述步骤2.1）中的冻存细胞进行解冻复苏培养：

a、从液氮中取出冻存管，放在37℃的水浴中晃动1-2 min，使其快速融化；

b、向冻存液中缓慢加入5 ml培养液悬浮细胞，1000 rpm离心5 min，去上清液，收集细胞，再用培养液清洗2遍，收集细胞，培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，当细胞生长至80%汇合度时，传代扩大培养。

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