CN102321566B - 一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，应用微载体结合Hyperflask细胞培养容器在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞。本发明应用商品化微载体结合Hyperflask在体外能够在较小的培养空间中大量的扩增细胞，从而在节约成本的前提下大量的获得目的细胞。

Description

一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，尤其是一种应用微载体结合Hyperflask在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法。

背景技术

近年来有关干细胞的研究日益深化，随着相关知识的不断积累干细胞成为人类对抗疾病的全新的武器。目前，关于干细胞多向分化能力的研究发现可以将来源于不同组织的干细胞应用于器官、组织疾病的治疗，例如比较容易获得的造血干细胞和间充质干细胞已经被广泛的应用于不同组织的各种疾病的治疗研究，并且在治疗心血管疾病、神经损伤疾病以及代谢疾病方面取得了比较令人振奋的结果。

但是，在干细胞的临床应用过程中如何获得大量的细胞成为了关键问题，并且也成为了瓶颈问题，因为无论是造血干细胞或者脐带间充质干细胞在细胞数量上都是有限的。关于如何在体外大量扩增干细胞的研究越来越受到研究人员的重视，虽然也取得了一定的进展但远不能达到临床应用的需求。

Hyperflask是康宁公司的一个新式细胞培养容器，其体积与T175细胞培养瓶相当，却可以提供10倍T-175的培养面积，适合贴壁细胞的大规模培养扩增。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种充分利用hyperflask系统的优势，应用微载体结合Hyperflask在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，应用微载体结合Hyperflask细胞培养容器在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞。

具体包括以下步骤：

1)微载体的预处理：适合于细胞表面贴壁生长的微载体以无钙、镁磷酸盐缓冲液PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小时后按照5g/L的浓度配制成微载体母液，高温蒸汽灭菌30分钟后补加细胞培养用水到原浓度；

2)微载体的保存：高压灭菌后的微载体分装入洁净的离心管中，于4℃保存；

3)细胞接种：在离心管中按照1*10⁵细胞/ml加入细胞以及适量细胞培养基，在另一个离心管中按照5mg/100ml加入全量微载体以20mlPBS清洗两次后尽量吸弃PBS并加入细胞悬液充分混匀后，在CO₂培养箱中孵育30分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，最后将混合液按照培养瓶的体积加入细胞培养瓶中，放入CO₂培养箱中培养；

4)细胞培养、换液：将接种好的细胞在细胞培养箱中静置培养，按照每天半换液、每3天全换液的方法持续培养，在进行全换液时将所有微载体以PBS清洗两次后加入新鲜培养基；

5)细胞的传代以及扩大培养：显微镜下观察当微载体上细胞生长达到最大密度时，将所有微载体回收后，以PBS清洗2次后按照1/6扩大培养，补加5/6量的新鲜微载体和足量的细胞培养基；

6)Hyperflask大规模培养：将初步放大培养的细胞经PBS清洗两次后，加入560ml完全培养基和以及按照5mg/100ml补加微载体后，充分混合，移入Hyperflask中继续扩大培养；

7)细胞的回收、计数以及活率统计：待微载体上细胞生长达到最大量时，将全部的微载体回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至细胞全部脱落，对回收的细胞进行细胞计数以及计算活率。

所述PBS-EDTA含有质量百分比0.2％EDTA；所述胰酶-EDTA为质量百分比0.5％胰酶+0.2％EDTA+99.3％PBS。

本发明的有益效果是：应用商品化微载体结合Hyperflask在体外能够在较小的培养空间中大量的扩增细胞，从而在节约成本的前提下大量的获得目的细胞。微载体培养结合Hyperflask培养技术一定程度上克服了最初的转瓶培养的不足，具有很多优点：

1)不需要额外的细胞培养设备-转瓶培养箱。

2)操作简单，应用常规的细胞培养设备可以完成。

3)相同的培养体积下可以获得更多的细胞。

4)节省培养基、血清、胰酶用量。

5)细胞传代简便。

6)兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。

7)细胞所处环境均一。

8)环境条件(温度、pH和CO₂等)容易测量与监控。

9)具有较高的比表面积。

附图说明

图1微载体培养COS1细胞

图2微载体培养rADSC细胞

图3微载体培养rADSC细胞脂肪诱导

图4不同细胞应用不同培养方法的比较(1.T-25细胞培养瓶+微载体培养COS1细胞；2.T-25细胞培养瓶培养COS1细胞；3.T-25细胞培养瓶+微载体培养rADSC；4.T-25细胞培养瓶培养rADSC)

图5应用微载体在不同培养瓶中培养细胞(1.T-175细胞培养瓶培养rADSC；2.T-175细胞培养瓶+微载体培养rADSC；3.Hyperflask+微载体培养rADSC；4.T-175细胞培养瓶培养COS1；5.T-175细胞培养瓶+微载体培养COS1；6.Hyperflask+微载体培养COS 1)

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的技术方案如下：

1.微载体的预处理：适合于细胞表面贴壁生长的微载体Cytodex3购自SIGMA公司，以PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小时后按照5g/L的浓度配制成微载体母液。高温蒸汽灭菌30分钟后补加细胞培养用水到原浓度。

2.微载体的保存：高压灭菌后的微载体分装入洁净的离心管中，于4℃可以长期保存一年左右，不影响微载体的使用。

3.细胞接种：在离心管中按照1*10⁵细胞/ml加入细胞以及适量细胞培养基{T-25(5ml)、T-75(15ml)以及T-175(40ml)}，在另一个离心管中按照5mg/100ml加入全量微载体以20mlPBS清洗两次后尽量吸弃PBS并加入细胞悬液充分混匀后，在CO₂培养箱中孵育30分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次。最后将混合液按照T-25(5ml)、T-75(15ml)以及T-175(40ml)的体积加入细胞培养瓶中，放入CO₂培养箱中培养。

4.细胞培养、换液：将接种好的细胞在细胞培养箱中静置培养，按照每天半换液、每3天全换液的方法持续培养。在进行全换液时将所有微载体以PBS清洗两次后加入新鲜培养基。

5.细胞的传代以及扩大培养：显微镜下观察当微载体上细胞生长达到最大密度时将所有微载体回收后以PBS清洗2次后按照1/6扩大培养，补加5/6量的新鲜微载体和足量的细胞培养基。

6.Hyperflak大规模培养：将初步放大培养的细胞经PBS清洗两次后，加入560ml完全培养基和足量的微载体后，充分混合，移入Hyperflask中继续扩大培养。

7.细胞的回收、计数以及活率统计：待微载体上细胞生长达到最大量时将全部的微载体回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至细胞全部脱落，用含2％FBS的完全培养基中和胰酶活性，离心收集细胞，并重悬到完全培养基当中。对回收的细胞进行苔盼蓝染色进行细胞计数以及计算活率。

本发明通过摸索建立了完整的应用微载体结合Hyperflask扩增细胞系以及间充质干细胞的方法。

实施例1：(以下百分比均为质量百分比)

以非洲绿猴细胞(COSl)作为对象细胞尝试微载体培养最终与正常细胞培养瓶培养所能获得的细胞总量进行比较。

1)微载体处理：称取0.1g微载体磁珠放入50ml离心管中加入40mlPBS清洗一次，静置待磁珠全部沉降到底部后轻轻吸出PBS再次加入40mlPBS4℃条件下静置水合3小时。将水合后的微载体进行高温蒸汽灭菌，条件为121℃、30min。最终获得的微载体浸泡于40mlPBS中待用。

2)COS1细胞接种：将微载体母液充分混合后吸取0.1ml加入到5mlDMEM培养基中混合待用。将复苏的COS1细胞按照1*10⁵/ml的密度接种于5mlDMEM培养基中(10％FBS/1％双抗)，吸弃微载体管中的液体将细胞悬液加入到微载体中充分混合后放入CO₂培养箱中孵育30min每10min轻轻混匀一次，最后将细胞与微载体一同接种到T-25细胞培养瓶中。

3)COS1细胞的培养：将细胞培养于CO₂培养箱中，由于COS1细胞的增殖速度很快，所以从接种的第二天开始为细胞半换液(全部培养基置于离心管中，待微载体沉降后轻轻吸弃2ml培养基，加入新鲜培养基至总量5ml混合后移至培养瓶中继续培养)；第三天全换液(将全部微载体吸取至离心管中，待微载体完全沉降后吸弃全部培养基并加入10mlPBS清洗2次。最后尽量吸弃所有PBS并且加入新鲜培养基至5ml混匀后移至培养瓶中继续培养)，按照半换液与全换液交替进行的方式对细胞持续培养。

4)COS1细胞回收：培养一周后显微镜下观察微载体已经完全被细胞覆盖(如图1)并且培养基中也有细胞碎片出现，所以判断细胞已经达到最大生长密度并对细胞进行回收。将全部培养基以及微载体转移至离心管中，待微载体沉降后吸弃培养基并加入10mlPBS清洗2次后再加入10mlPBS-EDTA浸泡5min后吸弃上清并加入2ml胰酶-EDTA消化5min后吸取所有液体，再加入5mlPBS吹打微载体并回收所有液体。在回收的细胞中加入3mlDMEM-2％FBS培养基终止胰酶活性300g离心5min，回收细胞苔盼蓝染色计数并计算活率。最终在5ml培养基中共得到1*10⁷个细胞、细胞活率95％以上。而以T-25培养瓶进行正常培养的情况下最多只能得到2*10⁶个细胞。

实施例2：

以大鼠脂肪间充质干细胞作为(rADSC)作为对象细胞尝试微载体培养最终与正常细胞培养瓶培养所能获得的细胞总量进行比较，并且通过将获得的细胞进行诱导分化进一步检测细胞的状态。

1)微载体处理：称取0.1g微载体磁珠放入50ml离心管中加入40mlPBS清洗一次，静置待磁珠全部沉降到底部后轻轻吸出PBS再次加入40mlPBS4℃条件下静置水合3小时。将水合后的微载体进行高温蒸汽灭菌，条件为121℃、30min。最终获得的微载体浸泡于40mlPBS中待用。

2)rADSC分离：于洁净条件下手术获得6周Wistar大鼠腹股沟处脂肪1.5g；将脂肪组织用解剖剪剪成约1cm³大小碎片；用D-Hanks洗涤两次，去除血液；加入预热的2％一型胶原酶D-Hanks溶液1ml；37℃空气浴摇床中，以100转/分钟的速度震荡孵育1小时；加入10mlD-Hanks溶液，离心去除上清和脂肪层；加入10ml D-Hanks溶液洗涤，离心2次；将沉淀重悬于3m1间充质干细胞培养基中；细胞悬液过40μm滤网后进行细胞苔盼蓝染色和细胞计数

3)rADSC细胞接种：将微载体母液充分混合后吸取0.1ml加入到4ml干细胞培养基中混合待用。将新鲜分离的rADSC细胞按照0.5*10⁵/ml的密度接种于5ml干细胞培养基中(10％FBS\1％双抗)，吸弃微载体管中的液体将细胞悬液加入到微载体中充分混合后放入CO₂培养箱中孵育30min每10min轻轻混匀一次，最后将细胞与微载体一同接种到T-25细胞培养瓶中。

4)rADSC细胞的培养：将细胞培养于CO₂培养箱中，由于rADSC细胞的增殖速度适中所以从接种的第2天开始为细胞半换液(全部培养基置于离心管中，待微载体沉降后轻轻吸弃2ml培养基，加入新鲜培养基至总量5ml混合后移至培养瓶中继续培养)；第4天全换液(将全部微载体吸取至离心管中，待微载体完全沉降后吸弃全部培养基并加入10mlPBS清洗2次。最后尽量吸弃所有PBS并且加入新鲜培养基至5ml混匀后移至培养瓶中继续培养)，按照半换液与全换液交替进行的方式对细胞持续培养。

5)rADSC的扩大培养：培养10天后显微镜下观察微载体已经完全被细胞覆盖(如图2)，细胞已经达到最大生长密度，对细胞进行回收。将全部培养基以及微载体转移至离心管中，待微载体沉降后吸弃培养基并加入10mlPBS清洗2次后，加入10ml完全培养基重悬混匀后加入到T-175细胞培养瓶。再加入30ml完全培养基，补加0.6ml微载体母液。按步骤(3)进行放大培养6天。

6)Hyperflask细胞培养瓶扩大培养rADSC：

a)将T-175全部培养基以及微载体转移至离心管中，待微载体沉降后吸弃培养基并加入40mlPBS清洗2次后加入490ml完全培养基中，同时加入10ml微载体母液。充分混匀后移入Hyperflask细胞培养瓶中，缓慢补加60ml培养基装满整个培养瓶充分混匀后CO₂培养箱中静置培养。

b)培养的第4天进行半换液，将培养瓶轻轻竖起待微载体完全沉降后打开瓶盖轻轻倒出300ml培养基并按照a)中的方式补加等量新鲜培养基混合均匀后继续培养。

c)至培养的第7天细胞已经达到最大生长密度，将全部培养基以及微载体转移至经过灭菌处理的烧杯中，待微载体沉降后吸弃全部培养基并加入100mlPBS清洗2次后再加入40ml PBS-EDTA重悬微载体并转移至50ml离心管中浸泡5min后吸弃上清加入胰酶-EDTA消化三次，每次加入20ml消化5min，再加入20mlPBS吹打微载体并回收所有液体。在回收的细胞中加入3mlFBS终止胰酶活性300g离心5min，回收细胞苔盼蓝染色计数并计算活率。最终共得到2.3*10⁸个细胞、细胞活率95％以上。

5)rADSC细胞的诱导分化：将微载体培养的rADSC细胞按照2*10⁵/孔铺满一快12孔细胞培养板，待第二天以脂肪细胞诱导培养基诱导细胞分化并且以干细胞培养基培养的细胞作为对照。按照本发明的脂肪干细胞诱导分化的方法经过2周的时间最终将rADSC诱导为脂肪细胞并且通过油红O染色进行鉴定(如图3)。

实施例3：

以非洲绿猴细胞(COS1)作为对象细胞尝试应用微载体进行大规模培养：

1)微载体处理：称取0.1g微载体磁珠放入50ml离心管中加入40mlPBS清洗一次，静置待磁珠全部沉降到底部后轻轻吸出PBS再次加入40mlPBS4℃条件下静置水合3小时。将水合后的微载体进行高温蒸汽灭菌，条件为121℃、30min。最终获得的微载体浸泡于40mlPBS中待用。

2)COS1细胞接种：将微载体母液充分混合后吸取0.1ml加入到4mlDMEM培养基中混合待用。将复苏的COS1细胞按照1*10⁵/ml的密度接种于5mlDMEM培养基中(10％FBS/1％双抗)，吸弃微载体管中的液体将细胞悬液加入到微载体中充分混合后放入CO₂培养箱中孵育30min每10min轻轻混匀一次，最后将细胞与微载体一同接种到T-25细胞培养瓶中。

3)COS1细胞的培养：将细胞培养于CO₂培养箱中，由于COS1细胞的增殖速度很快所以从接种的第二天开始为细胞半换液(全部培养基置于离心管中，待微载体沉降后轻轻吸弃2.5ml培养基，加入新鲜培养基至总量5ml混合后移至培养瓶中继续培养)；第三天全换液(将全部微载体吸取至离心管中，待微载体完全沉降后吸弃全部培养基并加入10mlPBS清洗2次。最后尽量吸弃所有PBS并且加入新鲜培养基至5ml混匀后移至培养瓶中继续培养)，按照半换液与全换液交替进行的方式对细胞持续培养。

4)COS1细胞的扩大培养：当细胞在微载体上达到最大生长密度时回收全部的微载体以10mlPBS清洗两次后加入等量的按照1)处理的微载体在40ml培养基中充分混合后放入CO₂培养箱中孵育30min每10min轻轻混匀一次，最后将细胞与微载体接种到1个T-175细胞培养瓶中。继续按照每天半换液，每三天全换液的模式培养；

5)Hyperflask细胞培养瓶扩大培养COS1细胞：

a)接种第6天T-175细胞培养瓶中的微载体达到最大生长密度。将全部培养基以及微载体转移至离心管中，待微载体沉降后吸弃培养基并加入40mlPBS清洗2次后加入490ml完全培养基中，同时加入10ml微载体母液。充分混匀后移入Hyperflask细胞培养瓶中，缓慢补加60ml培养基装满整个培养瓶充分混匀后CO₂培养箱中静置培养。

b)培养的第3天进行半换液，将培养瓶轻轻竖起待微载体完全沉降后打开瓶盖轻轻倒出300ml培养基并按照a)中的方式补加等量新鲜培养基混合均匀后继续培养。

c)培养第6天微载体已达到最大生长密度，将全部培养基以及微载体转移至经过灭菌处理的烧杯中，待微载体沉降后吸弃全部培养基并加入150mlPBS清洗2次后再加入40ml PBS-EDTA重悬微载体并转移至50ml离心管中浸泡5min后吸弃上清加入胰酶-EDTA消化三次，每次加入20ml消化5min，再加入20mlPBS吹打微载体并回收所有液体。在回收的细胞中加入20ml含2％FBS的DMEM培养基终止胰酶活性，300g离心5min，回收细胞进行苔盼蓝染色计数并计算活率。最终共得到2.8*10⁸个细胞、细胞活率95％以上。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (2)

1.一种体外大量扩增间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）微载体的预处理：适合于细胞表面贴壁生长的微载体以无钙、镁磷酸盐缓冲液PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小时后按照5g/L的浓度配制成微载体母液，高温蒸汽灭菌30分钟后补加细胞培养用水到原浓度；

2）微载体的保存：高压灭菌后的微载体分装入洁净的离心管中，于4℃保存；

3）细胞接种：在离心管中按照1*10⁵细胞/ml加入细胞以及适量细胞培养基，在另一个离心管中按照5mg/100ml加入全量微载体以20mlPBS清洗两次后尽量吸弃PBS并加入细胞悬液充分混匀后，在CO₂培养箱中孵育30分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，最后将混合液按照培养瓶的体积加入细胞培养瓶中，放入CO₂培养箱中培养；

4）细胞培养、换液：将接种好的细胞在细胞培养箱中静置培养，按照每天半换液、每3天全换液的方法持续培养，在进行全换液时将所有微载体以PBS清洗两次后加入新鲜培养基；

5）细胞的传代以及扩大培养：显微镜下观察当微载体上细胞生长达到最大密度时，将所有微载体回收后，以PBS清洗2次后按照1/6扩大培养，补加5/6量的新鲜微载体和足量的细胞培养基；

6）Hyperflask大规模培养：将初步放大培养的细胞经PBS清洗两次后，加入560ml完全培养基和以及按照5mg／100ml补加微载体后，充分混合，移入Hyperflask中继续扩大培养；

7）细胞的回收、计数以及活率统计：待微载体上细胞生长达到最大量时，将全部的微载体回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至细胞全部脱落，对回收的细胞进行细胞计数以及计算活率。

2.根据权利要求1所述的体外大量扩增间充质干细胞的方法，其特征在于，所述PBS-EDTA含有质量百分比0.2%EDTA；所述胰酶-EDTA为质量百分比0.5%胰酶+0.2%EDTA+99.3%PBS。

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