CN103275926B

CN103275926B - 一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法

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Publication number: CN103275926B
Application number: CN201310170574.9A
Authority: CN
Inventors: 陈正琳; 陈平; 李�杰; 夏佳音
Original assignee: Ningbo Placentasc Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Taizhou grace Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: CN103275926A

Abstract

本发明公开了一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的方法，特点是包括胎盘预处理后，利用胎盘小叶组织制备细胞悬液，再利用细胞悬液制备得到亚全能干细胞分离液的步骤；然后将亚全能干细胞分离液进行原代培养和二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至-80～-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存即可，优点是传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、脂肪和神经细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力，亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短，操作简单，成本低。

Description

一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞制备领域，尤其是涉及一种用胎盘组织制备亚全能干细胞的方法。

背景技术

干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一，其研究内容几乎涉及所有生命科学的生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，还在发现新基因、基因功能分析、发育生物学模型及新药开发等方面产生重要影响。亚全能干细胞(sub-totipotent stem cells)是来源于成熟胎盘组织中的干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。

亚全能干细胞作为干细胞产业中一个新兴、更具应用前景的项目，虽然前景光明，但还面临着一些产业化应用的技术标准，胎盘组织中含有多种亚全能干细胞，其采集部位比较多，比如羊膜、蜕膜、胎盘小叶等等，不同部位来源的亚全能干细胞的生长存在着一定的差异，有些部位来源的间充质干细胞生长周期比较长；有些组织来源的亚全能干细胞细胞形态差异比较大等等。中国发明专利名称为亚全能干细胞、其制备方法及其用途（申请号CN200810240040.8）公开了一种亚全能干细胞，其来源于剪断的人类脐带或胎盘，细胞标志是CD151+OCT4+CD184-，其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化，其制备过程要扩增到四代以上，才能获得足够的细胞用于建立亚全能干细胞种子库，增殖能力较弱，增殖速度较缓慢。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的方法，该亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短，操作简单，成本低。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，包括以下步骤：

（1）亚全能干细胞分离

A.细胞悬液制备：将胎盘预处理后获取胎盘小叶组织，将胎盘小叶组织剪成0.5～1.5mm³小块，置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后，加入与胎盘组织等体积的浓度为1～1.5mg/ml的Ⅱ型胶原蛋白酶充分混匀，于37℃消化0.5～2小时后，吸取离心管内上清液，将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀，瞬间离心并吸取上清液，重复离心操作两次，合并上述各上清液并用200目无菌滤网过滤，收集细胞初悬液；将细胞初悬液于1000～2000rpm的转速下离心5～20分钟，取离心得到的沉淀加入生理盐水定容，得到细胞悬液；在酶消化后，反复吸取上清和过滤是为了获取单个核细胞，去掉一些组织块，这样可以收集到更多的单个核细胞，有助于细胞快速增殖，同时细胞生长的会比较均一；

B.亚全能干细胞分离液的制备：将细胞悬液按体积比1～2:1的比例缓慢加入到淋巴细胞分离液中，于500～1000rpm离心5～20min后，离心管内混合液自下到上依次分层为红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和生理盐水层，吸取单个核细胞层至另一离心管内，加入1.5倍细胞悬液体积的生理盐水混匀，于1000～2000rpm离心5～20分钟后，将离心所得的沉淀用0.5倍细胞悬液体积的含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀，得到亚全能干细胞分离液；

（2）亚全能干细胞培养

将亚全能干细胞分离液以2×10⁵～10×10⁵个/cm²的密度接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5%的培养箱内开始原代培养3～4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85%的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液按20%培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1～5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000～2000rpm离心5～10分钟，将离心所得的沉淀用含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀；重复上述步骤进行二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞；

（3）亚全能干细胞冻存

将10%胎牛血清的培养液和99% 二甲基亚砜（DMSO）按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

步骤（1）中所述的胎盘预处理过程具体为：将胎盘置于无菌钢化皿内，加入生理盐水充分浸泡后，除去胎盘表面与脐带连接处的结缔组织，剪取胎盘小叶组织放入培养皿内，用无菌生理盐水清洗3～5次。

所述的培养液配置方法如下（成分单位mg/L）：无水氯化钙245.0，五水硫酸铜0.0013，L-亮氨酸59.05，亚油酸0.042，生素B12 0.65，1,4-丁二胺二盐酸盐0.061，L-赖氨酸盐酸盐91.25，硫辛酸0.105，定二酸75.00，九水硝酸铁0.05，L-蛋氨酸17.24，酚红9.30七水硫酸亚铁0.41，L-苯丙氨酸35.48，氯化钾400.00，L-丝氨酸42.00，丙酮酸钠55，氯化镁27.05，L-苏氨酸53.45，维生素H 0.0035，无水硫酸镁48.82，L-丙氨酸4.60，D-泛酸钙2.24，氯化钠6400.00，L-天门冬酰胺7.5，氯化胆碱8.98，无水磷酸二氢钠54.2，L-天门冬氨酸8.65，叶酸4.00，磷酸氢二钠71.02，L-半胱氨酸盐酸盐16.56，肌醇12.6，L-谷氨酸7.35，烟酰胺2.02，L-精氨酸盐酸盐147.5，L-脯氨酸17.25，盐酸吡哆醛2，L-胱氨酸盐酸盐31.25，L-色氨酸9.02，盐酸吡哆醇0.031，L-酪氨酸38.4，核黄素0.219，甘氨酸18.75，L-缬氨酸52.85，盐酸硫胺2.17，L-组氨酸盐酸盐31.46，D-葡萄糖1000.00，胸苷0.365，L-异亮氨酸54.47，次黄嘌呤3，成纤维细胞生长因子（BFGF）0.01，维生素C 0.89，L-谷氨酰胺325。使用上述方法配制的专门用于培养胎盘亚全能干细胞的培养液，经过培养能获得大量胎盘亚全能干细胞，所获得的干细胞各方面性能才能达本发明所述的效果，包括传代能力、扩增能力（如P2代就能得到足够多的细胞数量用于建亚全能干细胞种子库）、诱导分化成其他组织的能力等。

步骤（3）中所述的冻存程序如下：第一步 1～12℃，等待；第二步 0.5～1.2℃/分钟降至0～-4℃ ；第三步 5～12℃/分钟降至-15～-25℃ ；第四步 0.5～1.2℃/分钟降至-35～-45℃；第五步 5～12℃/分钟降至-80～-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

本发明采用程控降温仪通过设定适合于胎盘亚全能干细胞冻存的降温速度程序对干细胞进行冻存。在细胞冻存的过程中，液态水转化为冰，细胞代谢停止，同时，水分也随之散失，导致细胞内盐、代谢物浓度改变，进而造成渗透压失衡，直接影响细胞复苏后活性。过快或过慢降温都不是合适的方法，冷冻速率太快，细胞内冰晶形成，破坏细胞内超微结构；冷冻速率太慢，细胞外冰晶形成，容易导致细胞严重脱水皱缩而死亡，两者都不利于细胞存活。不同细胞冷冻在各个温度区域有最适合的降温速度。通过使用合适的降温速度程序，将冷冻程序分成多段进行，可安全而迅速地过度冷冻损害温度区以保持干细胞复苏后的活性。

上述冻存程序选优如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃ ，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种利用胎盘组织制备亚全能干细胞的方法，包括干细胞的分离、培养和冻存，采用胎盘小叶作为提取干细胞的组织来源，小叶组织来源的亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短，节约亚全能干细胞的制备成本。

本发明采用多次离心和过滤的干细胞分离技术，能够收集到更多的单个核细胞，去掉尽量多的组织块，有利于细胞快速增殖，同时提高细胞生长的均一性。

本发明中干细胞分离技术中所使用的酶是Ⅱ型胶原蛋白酶，用Ⅱ型胶原蛋白酶解离胎盘小叶组织细胞的时候解离细胞的效果比较好。

本发明分离技术中采用了淋巴细胞液作为分离液，有效分隔了红细胞和单个核细胞，大大加强了分离效果。未加入淋巴细胞液之前，离心以后，红细胞层贴着单个核细胞层，很难分离到纯净的单个核细胞，影响到最后的培养。加入淋巴液之后，经过离心，淋巴细胞分隔了红细胞层和单个核细胞，容易得到纯净的单个核细胞，有利于后期的分离培养。

采用本发明的干细胞分离技术结合本发明的专门针对亚全能干细胞配置的培养液，培养后的细胞传代至P2代就能得到足够数量的干细胞用于储存。干细胞传代代数越小，细胞的扩增能力、活力、状态以及诱导分化成其他组织的能力都越好，而现有技术（专利CN200810240040.8）要扩增到四代以上，才能获得足够的细胞用于建立亚全能干细胞种子库，增殖能力较弱，增殖速度较缓慢，而且由于传代代数的增加，使干细胞各方面的性能大打折扣。

本发明得到的胎盘亚全能干细胞的CD73、CD90、CD105、CD151、CD200、Oct-4、HLA-G表达率均在90%以上，而CD14、CD45、CD79α、HLA-DR、CD184表达率均在2%以下，说明我们分离得到的是胎盘亚全能干细胞而不是其他细胞。

本发明的干细胞经集落培养后，形成的集落种类较多，比如：CFU-E(红细胞形成单位)、CFE-G（粒细胞集落形成单位）、CFU-GEMM(粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞－集落形成单位)、CFU-GM（粒细胞、巨噬细胞-集落形成单位）、CFU-M（巨细胞-集落形成单位），并且形成的集落数较多。

本发明得到的胎盘亚全能干细胞传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、脂肪和神经细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力。

综上所述，本发明是一种实用简单的从胎盘小叶组织中大量分离胎盘亚全能干细胞的方法，操作简单，方便实用，能得到大量的亚全能干细胞。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，具体包括以下步骤：

1、亚全能干细胞分离

1.1 胎盘预处理

征得产前检查正常（无病毒感染、怀孕期无异常情况）的产妇同意并签署《知情同意书》后，从医院产科取回脱离母体24小时之内的胎盘，进入实验室备用；

在百级层流室内，将胎盘置于无菌钢化皿内，加入生理盐水充分浸泡后，除去胎盘表面与脐带连接处的结缔组织，剪取胎盘小叶组织放入培养皿内，用无菌生理盐水清洗3～5次；

1.2 细胞悬液制备

将胎盘小叶组织剪成0.5～1.5mm³小块，置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后，加入与胎盘组织等体积的浓度为1～1.5mg/ml的Ⅱ型胶原蛋白酶充分混匀，于37℃消化0.5～2小时后，吸取离心管内上清液，将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀，瞬间离心并吸取上清液，重复离心操作两次，合并上述各上清液并用200目无菌滤网过滤，收集细胞初悬液；将细胞初悬液于1000～2000rpm的转速下离心5～20分钟，取离心得到的沉淀加入生理盐水定容，得到的细胞悬液；在酶消化后，反复的吸取上清和过滤是为了收集更多的单个核细胞，去掉一些组织块，这样可以收集到更多的单个核细胞，有利于细胞快速增殖，同时细胞生长会比较均一；

1.3 亚全能干细胞分离液的制备

将细胞悬液按体积比1～2:1的比例缓慢加入到淋巴细胞分离液中，于500～1000rpm离心5～20min后，离心管内混合液自下到上依次分层为红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和生理盐水层，吸取单个核细胞层至另一离心管内，加入1.5倍细胞悬液体积的生理盐水混匀，于1000～2000rpm离心5～20分钟后，将离心所得的沉淀用0.5倍细胞悬液体积的培养液混匀沉淀，得到亚全能干细胞分离液。

2、亚全能干细胞培养

（1）用无菌移液枪头吸取20ul细胞悬液，显微镜下计数，根据细胞计数结果，以2×10⁵～10×10⁵个/cm²的密度，将细胞悬液接种到数个T75无菌培养瓶内，并每瓶加入培养液至15ml左右；其中所述的培养液配置方法如下（成分单位mg/L）：无水氯化钙245.0，五水硫酸铜0.0013，L-亮氨酸59.05，亚油酸0.042，生素B12 0.65，1,4-丁二胺二盐酸盐0.061，L-赖氨酸盐酸盐91.25，硫辛酸0.105，定二酸75.00，九水硝酸铁0.05，L-蛋氨酸17.24，酚红9.30七水硫酸亚铁0.41，L-苯丙氨酸35.48，氯化钾400.00，L-丝氨酸42.00，丙酮酸钠55，氯化镁27.05，L-苏氨酸53.45，维生素H 0.0035，无水硫酸镁48.82，L-丙氨酸4.60，D-泛酸钙2.24，氯化钠6400.00，L-天门冬酰胺7.5，氯化胆碱8.98，无水磷酸二氢钠54.2，L-天门冬氨酸8.65，叶酸4.00，磷酸氢二钠71.02，L-半胱氨酸盐酸盐16.56，肌醇12.6，L-谷氨酸7.35，烟酰胺2.02，L-精氨酸盐酸盐147.5，L-脯氨酸17.25，盐酸吡哆醛2，L-胱氨酸盐酸盐31.25，L-色氨酸9.02，盐酸吡哆醇0.031，L-酪氨酸38.4，核黄素0.219，甘氨酸18.75，L-缬氨酸52.85，盐酸硫胺2.17，L-组氨酸盐酸盐31.46，D-葡萄糖1000.00，胸苷0.365，L-异亮氨酸54.47，次黄嘌呤3，成纤维细胞生长因子（BFGF）0.01，维生素C 0.89，L-谷氨酰胺325；

(2)将T75无菌培养瓶置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5% 的CO₂培养箱内，开始原代培养；原代培养开始3天后，取出T75无菌培养瓶到百级层流室内，将瓶中培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入15ml培养液，置于CO₂培养箱内继续培养；

(3)每天在显微镜下观察细胞形态，细胞达到75～85%的融合度时，取出T75无菌培养瓶到百级层流室内，将T75无菌培养瓶内培养液倒入50ml无菌离心管内；

(4)向T75无菌培养瓶内加入3ml的0.25%的胰蛋白酶溶液，37℃消化1～5分钟后，将无菌培养液内的培养液倒入培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落；

(5)将完全脱落的细胞和培养液再次倒入离心管内，1000～2000rpm离心5～10分钟；

(6)离心后去除上清，用10ml含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀；

(7）用无菌移液枪头吸取20ul细胞悬液，显微镜下计数，根据细胞计数结果，以2×10⁵～10×10⁵个/cm²的密度，将细胞悬液接种到数个T75无菌培养瓶内，并每瓶加入培养液至15ml左右；

（8）将T75无菌培养瓶标记为P1，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5% 的CO₂培养箱内开始培养3-4天；

（9）重复步骤（3）～（8），进行P2代细胞培养，收集P2代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细；由于P1代得到的细胞量太少，需要进行P2代细胞培养以得到更多的细胞。

3、亚全能干细胞冻存

将3mL含10%胎牛血清的培养液，1mL 99% 二甲基亚砜（DMSO）缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的5mL冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，冻存程序如下：

第一步 1～12℃，等待；

第二步 0.5～1.2℃/分钟降至0～-4℃ (箱体)；

第三步 5～12℃/分钟降至-15～-25℃ (箱体)；

第四步 0.5～1.2℃/分钟降至-35～-45℃(箱体)；

第五步 5～12℃/分钟降至-80～-90℃(箱体)；

第六步结束后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

上述冻存程序可优选如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃ ，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

4、亚全能干细胞鉴定

（1）流式细胞仪检测干细胞表面标志物：将上述亚全能干细胞培养的步骤（10）收集的亚全能干细胞用5ml PBS缓冲液混匀，用PBS缓冲液洗涤并离心2次，鼠抗人CD14、CD45、CD73、CD105、HLA-G、HLA-DR、CD90、CD79α、CD151、CD200、Oct-4、CD184单克隆抗体细胞悬液4℃避光孵育30min，PBS缓冲液洗涤并离心3次后，流式细胞仪检测分析结果，发现CD73、CD90、CD105、CD151、CD200、Oct-4、HLA-G表达率均在90%以上，而CD14、CD45、CD79α、HLA-DR、CD184表达率均在2%以下。

（2）成骨细胞诱导：向上述亚全能干细胞培养的步骤（3）中达到80%左右细胞融合度的培养瓶中加入成骨诱导培养基，在37℃、饱和湿度、体积分数为5% 的CO₂培养箱内培养，每3天换液。21～28天后，进行茜素红染色，出现大量黑色的ALP阳性成骨细胞，证明亚全能干细胞可向成骨细胞分化。

（3）成脂肪细胞诱导：向上述亚全能干细胞培养的步骤（3）中达到80%左右细胞融合度的培养瓶中加入成脂诱导培养基，在37℃、饱和湿度、体积分数为5% 的CO₂培养箱内培养，每3天换液。14～21天后，弃培养液，在倒置相差显微镜下观察细胞质中脂滴状态并用油红O染色，出现大量红色的油红O染色阳性脂肪细胞，证明亚全能干细胞可向脂肪细胞分化。

（4）成神经元样细胞诱导：向上述亚全能干细胞培养的步骤（3）中达到80%左右细胞融合度的培养瓶中加入2％DMSO、100umol/L BHA和10ng/ml b-FGF诱导，在37℃、饱和湿度、体积分数为5% 的CO₂培养箱内培养，培养细胞在诱导分化1天后采用常规方法免疫细胞化学染色，发现60%以上的细胞神经元细胞标志物NSE、NF为阳性，证明亚全能干细胞可向神经元细胞分化。

（5）成胰岛样细胞诱导：向上述亚全能干细胞培养的步骤（3）中达到80%左右细胞融合度的培养瓶中加入10ug/L碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺诱导，双硫腙染色后镜检，发现胰腺细胞标志物PDX-1、Ngn3呈不同程度的阳性，证明亚全能干细胞可向胰腺细胞分化。

（6）成表皮细胞诱导：向上述亚全能干细胞培养的步骤（3）中达到80%左右细胞融合度的培养瓶中加入20μg/L表皮细胞生长因子，常规培养7天，每2天半量换液1次，诱导细胞免疫荧光染色分析，发现表皮细胞标志物CK19、CK10呈不同程度的阳性，证明亚全能干细胞可向表皮细胞分化。

集落培养：将上述亚全能干细胞培养的步骤（10）中收集的亚全能干细胞用甲基纤维素做集落培养，发现形成的集落种类较多，比如：CFU-E(红细胞形成单位)、CFE-G（粒细胞集落形成单位）、CFU-GEMM(粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞－集落形成单位)、CFU-GM（粒细胞、巨噬细胞-集落形成单位）、CFU-M（巨细胞-集落形成单位），并且形成的集落数较多，细胞贴壁生长可达20代。

上述细胞悬液制备过程中，胎盘小叶组织可剪成0.5mm³、1mm³或1.5mm³小块；Ⅱ型胶原蛋白酶浓度可为1mg/ml、1.2mg/ml或1.5mg/ml；细胞初悬液于1500rpm的转速下离心12分钟或者细胞初悬液于1000rpm的转速下离心20分钟或者细胞初悬液于2000rpm的转速下离心5分钟。

上述亚全能干细胞分离液的制备过程中，细胞悬液与淋巴细胞分离液的体积比为1:1、1.5:1或者2:1；两者混合后于500rpm离心20min、750rpm离心15min或者1000rpm离心5min；吸取单个核细胞层至另一离心管内，加入1.5倍细胞悬液体积的生理盐水混匀，于于1000rpm离心20min、1500rpm离心15min或者2000rpm离心5min。

上述亚全能干细胞培养过程中，细胞融合度可达75%、80%或者85%；加入胰蛋白酶溶液的消化时间可为1、3或5分钟；将完全脱落的细胞和培养液再次倒入离心管内，于1000rpm离心10分钟、1500rpm离心7.5分钟或者2000rpm离心5分钟；

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)亚全能干细胞分离

A.细胞悬液制备：将胎盘预处理后获取胎盘小叶组织，将胎盘小叶组织剪成0.5～1.5mm³小块，置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后，加入与胎盘组织等体积的浓度为1～1.5mg/ml的Ⅱ型胶原蛋白酶充分混匀，于37℃消化0.5～2小时后，吸取离心管内上清液，将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀，瞬间离心并吸取上清液，重复离心操作两次，合并上述各上清液并用200目无菌滤网过滤，收集细胞初悬液；将细胞初悬液于1000～2000rpm的转速下离心5～20分钟，取离心得到的沉淀加入生理盐水定容，得到的细胞悬液；

B.亚全能干细胞分离液的制备：将细胞悬液按体积比1～2:1的比例缓慢加入到淋巴细胞分离液中，于500～1000rpm离心5～20min后，离心管内混合液自下到上依次分层为红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和生理盐水层，吸取单个核细胞层至另一离心管内，加入1.5倍细胞悬液体积的生理盐水混匀，于1000～2000rpm离心5～20分钟后，将离心所得的沉淀用0.5倍细胞悬液体积的含10％胎牛血清的培养液混匀沉淀，得到亚全能干细胞分离液；

(2)亚全能干细胞培养

将亚全能干细胞分离液以2×10⁵～10×10⁵个/cm²的密度接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5％的培养箱内开始原代培养3-4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液按20％培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1～5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000～2000rpm离心5～10分钟，将离心所得的沉淀用含10％胎牛血清的培养液混匀沉淀；重复上述步骤进行二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞；所述的培养液配置方法如下，其中各成分单位为mg/L：无水氯化钙245.00，五水硫酸铜0.0013，L-亮氨酸59.05，亚油酸0.042，维生素B12 0.65，1,4-丁二胺二盐酸盐0.061，L-赖氨酸盐酸盐91.25，硫辛酸0.105，丁二酸75.00，九水硝酸铁0.05，L-蛋氨酸17.24，酚红9.30，七水硫酸亚铁0.41，L-苯丙氨酸35.48，氯化钾400.00，L-丝氨酸42.00，丙酮酸钠55，氯化镁27.05，L-苏氨酸53.45，维生素H 0.0035，无水硫酸镁48.82，L-丙氨酸4.60，D-泛酸钙2.24，氯化钠6400.00，L-天门冬酰胺7.5，氯化胆碱8.98，无水磷酸二氢钠54.2，L-天门冬氨酸8.65，叶酸4.00，磷酸氢二钠71.02，L-半胱氨酸盐酸盐16.56，肌醇12.6，L-谷氨酸7.35，烟酰胺2.02，L-精氨酸盐酸盐147.5，L-脯氨酸17.25，盐酸吡哆醛2，L-胱氨酸盐酸盐31.25，L-色氨酸9.02，盐酸吡哆醇0.031，L-酪氨酸38.4，核黄素0.219，甘氨酸18.75，L-缬氨酸52.85，盐酸硫胺2.17，L-组氨酸盐酸盐31.46，D-葡萄糖1000.00，胸苷0.365，L-异亮氨酸54.47，次黄嘌呤3，成纤维细胞生长因子0.01，维生素C 0.89，L-谷氨酰胺325；

(3)亚全能干细胞冻存

将含10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜按体积比3:1的比例缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-80～-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

2.根据权利要求1所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，其特征在于步骤(1)中所述的胎盘预处理过程具体为：将胎盘置于无菌钢化皿内，加入生理盐水充分浸泡后，除去胎盘表面与脐带连接处的结缔组织，剪取胎盘小叶组织放入培养皿内，用无菌生理盐水清洗3～5次。

3.根据权利要求1所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，其特征在于步骤(3)中所述的冻存程序如下：第一步1～12℃，等待；第二步0.5～1.2℃/分钟降至0～-4℃；第三步5～12℃/分钟降至-15～-25℃；第四步0.5～1.2℃/分钟降至-35～-45℃；第五步5～12℃/分钟降至-80～-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

4.根据权利要求3所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，其特征在于步骤(3)中所述的冻存程序如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。