CN106011049A - 敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法 - Google Patents

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CN106011049A CN201610352736.4A CN201610352736A CN106011049A CN 106011049 A CN106011049 A CN 106011049A CN 201610352736 A CN201610352736 A CN 201610352736A CN 106011049 A CN106011049 A CN 106011049A
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赵金山
柳楠
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Abstract

本发明公开了一种敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，属于生物技术领域，用40日龄的敖汉细毛羊皮肤作为实验材料，通过对皮肤进行体外培养，将分离出来的毛囊细胞进行生物学特性分析及鉴定，包括形态学观察、冻存、复苏及过程中细胞活力检测、生长动力学分析及生长曲线绘制、核型分析、波形蛋白免疫组化以及微生物污染检测等，以获得活性较高活力较强的细胞，进而建立敖汉细毛羊皮肤毛囊细胞细胞系。细胞活性更好，更利于后续的试验。降低了消化过程中胰蛋白酶的用量，同时缩短了消化时间。同时，细胞冻存保护液采用(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，对细胞冻存保护效果在敖汉细毛羊成纤维细胞上效果更好。

Description

敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法
技术领域
本发明公开了一种敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着国内经济的发展，细毛羊产业得到迅速的提升，国内原毛进口量实现飞跃，在当前的环境下，细毛羊的研究更是迫切的到突破，而国内的研究现状大多转为分子方面的研究。细胞培养技术是从1907年开始，在其后的近一个世纪的到飞速的发展，目前可通过不同种的培养细胞进行细胞融合、核移植、及基因转移等的建立。在细胞培养的过程中，细胞培养、生长的状态对于试验的成功及后继试验的研究都起着至关重要的作用，是各项细胞水平研究的前提和基础，由此可见细胞培养及培养出好的细胞系对细胞学、分子细胞学、遗传育种及个体新品种的培育影响甚大。
毛囊是控制毛发周期性生长的重要结构，它是一个多层细胞组成的特殊器官，而洗毛衣的羊毛品质及产量都取决于绵羊皮肤组织结构和毛囊性状。但是如何在体外培养中大量获得毛囊隆突部干细胞，且尽量减少其分化，仍是有待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，用敖汉细毛羊皮肤作为实验材料，通过对皮肤进行体外培养，将分离出来的毛囊细胞进行生物学特性分析及鉴定，包括形态学观察、冻存、复苏及过程中细胞活力检测、生长动力学分析及生长曲线绘制、核型分析、波形蛋白免疫组化以及微生物污染检测等，以获得活性较高活力较强的细胞，进而建立敖汉细毛羊皮肤毛囊细胞细胞系。
本发明的技术方案是：
敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞
①取40日龄出生羊采样部位清除羊毛，灭菌，切取含完整组织的皮肤样品，消毒，放入生理盐水中浸泡，然后用PBS(pH＝7.2-7.4)清洗，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；
②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品消毒，清洗，后消化，然后放入含有DMEM/F12培养液的培养皿中，取得毛囊置于离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶消化15min，加入3倍体积的工作液终止消化，离心，吸去上清，打碎毛囊，过细胞筛，后接种，加入培养基中，培养，至细胞涨满90％时进行传代；
所述工作液为20％FBS和1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液；
③传代培养：吸去培养液，清洗，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，然后加入0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘，间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；
(2)细胞冻存与复苏
当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记，然后用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h，-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。
优选的，步骤(2)所述的4℃预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1。
优选的，所述步骤(1)②中取得毛囊的方法为：用眼科剪将经过消化的待分离培养组织样品剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中。
优选的，所述方法包括以下步骤：
(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞
①取40日龄初生羊，肩部采样部位羊毛剪除，75％酒精擦拭灭菌，用提前灭菌的医用剪刀切去肩部皮肤1cm*1cm大小含完整组织的皮肤样品，75％酒精消毒3次，放入生理盐水中浸泡涮洗30S，然后用PBS(pH＝7.2-7.4)清洗2次，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；
②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品置于75％酒精中浸泡1min，然后用PBS(pH＝7.2-7.4)溶液清洗5次，置于0.25％胰蛋白酶中37℃消化1h，取出放入含有DMEM/F12培养液的培养皿中，用眼科剪将其剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶37℃消化15min，加入3倍体积的工作液(20％FBS和1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液)终止消化，1500r/min离心5min，吸去上清，将毛囊充分打碎，经150目细胞筛后接种到60mm贴壁培养皿中，加入5ml含1％生长因子(细胞生长因子，也即是T细胞生长因子)的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养相中培养，细胞涨满90％快会合状态时进行传代；
③传代培养：吸去旧培养液，用PBS(pH＝7.2-7.4)洗3次，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，吸去然后加入1ml 0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；
(2)细胞冻存与复苏
当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液所述预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记。用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h,-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。
本发明的有益效果是：
1所用样品不同在于本试验采用40日龄敖汉细毛羊，品种和样品时间的差异，敖汉细毛羊为本实验室所需，40日龄的的羊所得到的细胞活性更好，并且最大优势在于相比较1-3日龄或者更小的羊来说，40日龄对羊伤害更小，对比更大的羊来说40日龄的羊细胞活力更高，更利于后续的试验。
2二次消化中采用胰蛋白酶的浓度为0.1％，消化时间为15分钟，在细胞脱离组织的前提下对细胞的伤害更小。降低了用量，同时缩短了消化时间，对细胞损伤较小。
3细胞冻存保护液采用(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，不容易造成细胞冷冻时产生冰晶破坏细胞，并且保存时间可达十年以上，对细胞冻存保护效果在敖汉细毛羊成纤维细胞上效果更好。
附图说明
图1为原代细胞生长3d的细胞形态；
图2为F2代第3d及F3代第5d的细胞形态；
图3左为冻存前细胞流式图，右为复苏后细胞流式图；
图4为敖汉细毛羊毛囊细胞细胞的生长曲线；
图5细胞核型分析；
图6微生物污染检测结果；
图7为吉姆萨染色图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例(各例均为重量％)进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验样本来源初生40日龄以内的敖汉细毛羊羊肩部皮肤，来自青岛奥特种羊场。
1.1.2试验材料及主要试剂
DMEM购自Hyclone；
胰蛋白酶、L-Glutamine、标准胎牛血清购自Gibco；
DPBS、二甲基亚砜(DMSO)、秋水仙素、0.4％台盼蓝染液、非必需氨基酸、青链霉素和Giemsa均购自Solarbio；
4％多聚甲醛购自Biotopped等；
1.2试验方法
1.2.1绵羊皮肤毛囊细胞的分离培养
将40日龄初生羊肩部采样部位羊毛剪除，75％酒精擦拭灭菌，用提前灭菌的医用剪刀切去肩部皮肤1cm*1cm大小含完整组织的皮肤样品，75％酒精消毒3次，放入生理盐水中浸泡涮洗30s，然后用PBS溶液(pH＝7.2-7.4)清洗2次，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒迅速带回实验室进行分离培养。
将组织放入装有75％酒精的培养皿中浸泡1min后用PBS(pH＝7.2-7.4)快速清洗5次，置于0.25％胰蛋白酶中37℃消化1h，取出放入含有基础培养基(DMEM/F12培养液)的培养皿中，用眼科剪将其剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中，加入400μl 0.1％的胰蛋白酶37℃消化15min，加入三倍体积的工作液终止消化，1500r/min离心5min，小心吸去上清，将毛囊充分打碎，经150目细胞筛后接种到60mm贴必培养皿中，加入5ml含1％生长因子(此处所述的生长因子为T细胞生长因子)的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养相中培养。每天观察细胞形态和生长状态，当细胞涨满90％快会合状态时进行传代。
吸去旧培养液(此处所述的旧培养液是指上个步骤中的培养液)，用PBS(pH＝7.2-7.4)洗3次，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，吸去然后加入1ml 0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，在显微镜下观察，当细胞质回缩，细胞边缘，间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代。
1.2.2细胞冻存与复苏
当细胞生长到对数生长期时，按照传代步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的新冷冻液(30％FBS+20％DMSO+50％DMEM)然后转移到无菌冻存管中，封口，标记。用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h，-80℃12h，然后转入液氮保存。复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。
1.2.3复苏及冻存细胞活力检测
细胞生长到平台期，吸去旧培养液，用PBS(pH＝7.2-7.4)清洗细胞，0.1％胰蛋白酶消化，形成细胞悬液，将样品细胞用FITC标记的单克隆抗体进行染色。
A、在最后的洗涤步骤后，将样品细胞悬浮于PI缓冲液中，于4℃下密封避光保存以备通过流式细胞仪分析；
B、在最后的洗涤步骤后，如前述将样品细胞悬浮后备用。在每一管中加入2μl的PI浓缩液，混匀。将样品置于4℃下密封避光保存然后进行流式细胞仪分析。将剩余细胞分两份冻存，分别于1个月和3个月后取出复苏，换新培养液并进行流式细胞仪分析。计算细胞活力。
1.2.4生长曲线绘制
将培养皿中的细胞稀释到1.0×l04个/mL接种到24孔板上，每隔24小时消化3个孔板进行计数，计数时用血细胞计数板每个室的5个大方格细胞数，一共计数10个，每孔细胞浓度为10个方格细胞数乘以1000个/ml。将三孔细胞浓度求平均值作为纵坐标，培养天数作为横坐标，绘制8天所得曲线作为生长曲线。
1.2.5免疫组化鉴定方法(ABC法)
在细胞生长到会合状态时，吸去培养液，用5％多聚甲醛浸泡20min固定，去除多聚甲醛，用PBS(pH＝7.2-7.4)清洗并浸泡5min。取出PBS(pH＝7.2-7.4)用3％去离子双氧水孵育15min，使过氧化物酶活性丧失，吸去去离子双氧水，滴加试剂A并室温孵育15min后去除。然后滴加稀释50倍的一抗，4℃放置12小时后用PBS(pH＝7.2-7.4)浸泡清洗5分钟，清洗3次。加入试剂B，37℃孵育15min后PBS(pH＝7.2-7.4)清洗浸泡5min，清洗3次。加入试剂C，37℃孵育15min后PBS(pH＝7.2-7.4)清洗浸泡5min，清洗3次。将显色液A、B、C各1滴(约30ul)滴加到1ml超纯水中混合后加入培养皿进行显色反应，10min后冲洗，在荧光显微镜下观察结果。
1.2.6核型分析方法
向细胞培养皿中加入秋水仙素，培养3—5h后吸去培养液，加入0.1％胰蛋白酶消化处理5min，将细胞移入15ml离心管中1000r/min离心10min，小心并尽可能的取出上清。加入10ml 37℃预热的浓度为0.075mol/L的KCl低渗液将细胞重悬，置于37℃环境低渗处理30min，然后1000r/min离心5min，去上清后加入固定液(冰醋酸：甲醇＝1：3)4℃放置15分钟，重复固定3次。离心去上清加入少许固定液重悬，取出提前处理好的冷冻玻片倾斜45°放置，吸取细胞悬液1—3滴于载玻片上，立即在酒精灯上烘烤，放入Giemsa(1：9)染液染色20min，蒸馏水冲洗晾干于100倍油镜下观察计数。
1.2.7污染检测方法
将细胞在无青霉素-链霉素的培养基中培养4d，观察是否有细菌污染，培养液是否浑浊；是否出现云雾状真菌或纤维状菌丝及密集孢子类真菌；并在显微镜下观察细胞形态是否正常，有无出现病毒导致的石斑等，最后将细胞接种到该玻片上固定20min，用Hoeehst33258室温染色30min后PBS(pH＝7.2-7.4)清洗并干燥，然后再荧光显微镜下观察是否有支原体污染。
2结果分析
2.1细胞形态观察
2.1.1细胞原代培养形态观察
组织经胰蛋白酶处理后24h可观察到组织块附近有呈立方形，细胞体积小，表面光滑，皱褶少的细胞游离生长，除此细胞外还有梭形的成纤维细胞生长，没有组织块的区域细胞密度较低。培养至第6d，培养皿皿底长满细胞，即可进行传代培养。原代细胞生长3d的细胞形态见附图1。
2.1.2细胞传代培养形态观察
当细胞密度达到90％左右时进行传代，采用胰酶消化法和差速离心法可将毛囊细胞和成纤维细胞及其他细胞分离开来，经2～4代培养的细胞仅剩毛囊细胞，经传代后细胞增殖加快，细胞形态没有发生明显的变化。
其中，附图2为F2代第3d及F3代第5d的细胞形态图。
所述F2代为第二次传代，所述F3代为第三次传代。
2.1.3染色后细胞形态观察
经吉姆萨染色后观察，细胞呈立方形、体积较小、表面光滑，细胞大致呈不规则排列，核浆比率大，褶皱少，为典型的毛囊细胞形态。吉姆萨染色图见附图7。
2.2细胞冻存前与复苏后活力检测结果(本文件所述细胞培养天数均为不含生长因子的情况，如果加了生长因子24-48小时即可涨满进行传代)
复苏细胞在6h后大量贴壁，24h后大部分细胞都已贴壁(96％以上，最高可达99％)并立方形生长。培养24h后更换培养液，去除死细胞和未贴壁细胞，培养4～5d左右细胞密度极达到80％～90％，即可进行传代。
复苏前活力较冻存前细胞活力稍有下降，冻存前细胞活力约为94.19％，而冻存1个月复苏后约为91.96％，可能与冻存时间、冻存液及解冻时间等有关，对细胞造成了机械性损伤。
其中，图3中，左图为冻存前细胞流式图，右为复苏后细胞流式图。(流式细胞仪计算细胞数量可以精确到每一个细胞，这是常规方法靠人力数永远数不过来的，靠人力计数存在很大误差)
2.3生长曲线绘制(生长曲线是做了三个重复去平均值然后用R语言进行统计分析并绘图，所得结果比较常规细胞计数更准确)
敖汉细毛羊毛囊细胞细胞的生长曲线呈“S”型，如图4所示，细胞在第1～2d处于潜伏期，细胞生长缓慢，主要由于细胞刚适应所处环境，开始贴壁生长；从第2d开始生长速度加快，处于对数生长期；到第6d开始，细胞生长速度逐渐变慢，处于平台期，随着细胞数量的增加，营养物质的缺乏，细胞生长逐渐受到抑制，最后开始凋亡。
2.4细胞核型分析
试验结果与前人所得结果进行对比得到染色体数2n＝54，1、2、3号染色体是中着丝粒染色体与试验结果相一致，X染色体为最大端着丝粒染色体，Y染色体为双臂染色体，是最小染色体，其中在不同个体的细胞中的Y染色体的大小不一致，猜测是由于细胞遗传事件造成的。
2.5微生物污染检测结果
2.5.1细菌、真菌及病毒检测结果显微镜观察工作液培养的细胞，培养液没有变浑浊，也无丝状物生长，显微镜下观察无空斑、蚀斑现象，表明细菌、真菌及病毒检测结果均呈阴性。
2.5.2支原体检测结果
Hoechst 33258荧光染料检测，细胞核呈椭圆状或圆状，荧光为蓝色，结果呈阴性。
以上仅为本发明较佳的实施方式，并不对本发明的保护范围进行限制，本领域技术人员在本发明公开的范围内，通过技术的简单变化和/或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞
①取40日龄出生羊采样部位清除羊毛，灭菌，切取含完整组织的皮肤样品，消毒，放入生理盐水中浸泡，然后用PBS清洗，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；
②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品消毒，清洗，后消化，然后放入含有DMEM/F12的培养皿中，取得毛囊置于离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶消化15min，加入3倍体积的工作液终止消化，离心，吸去上清，打碎毛囊，过细胞筛，后接种，加入培养基中，培养，至细胞涨满90％时进行传代；
所述工作液为20％FBS和1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液；
③传代培养：吸去培养液，清洗，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，然后加入0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘，间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；
(2)细胞冻存与复苏
当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记，然后用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h，-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。
2.根据权利要求1所述的敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，步骤(2)所述的4℃预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1。
3.根据权利要求1所述的敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，所述步骤(1)②中取得毛囊的方法为：用眼科剪将经过消化的待分离培养组织样品剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中。
4.根据权利要求1-3任一所述的敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞
①取40日龄初生羊，肩部采样部位羊毛剪除，75％酒精擦拭灭菌，用提前灭菌的医用剪刀切去肩部皮肤1cm*1cm大小含完整组织的皮肤样品，75％酒精消毒3次，放入生理盐水中浸泡涮洗30S，然后用PBS清洗2次，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；
②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品置于75％酒精中浸泡1min，然后用PBS溶液清洗5次，置于0.25％胰蛋白酶中37℃消化1h，取出放入含有DMEM/F12培养液的培养皿中，用眼科剪将其剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶37℃消化15min，加入3倍体积的工作液终止消化，1500r/min离心5min，吸去上清，将毛囊充分打碎，经150目细胞筛后接种到60mm贴壁培养皿中，加入5ml含1％生长因子的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养相中培养，细胞涨满90％快会合状态时进行传代；
③传代培养：吸去旧培养液，用PBS洗3次，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，吸去然后加入1ml 0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；
(2)细胞冻存与复苏
当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液，所述预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记，用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h，-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。
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