CN103333854A

CN103333854A - 一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法

Info

Publication number: CN103333854A
Application number: CN2013103029420A
Authority: CN
Inventors: 孙源超; 陈春雷; 李兰; 沈伟
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-07-18
Also published as: CN103333854B

Abstract

本发明涉及一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法，首先分离绒山羊毛囊：剪下绒山羊背颈部皮肤，利用胶原酶IV消化，将毛囊结构分离并去除杂质；第二步，毛囊经培养液洗涤后，在消化液中消化为单细胞后过400目细胞筛转入毛囊干细胞培养液培养，以培养当天为零代，每3-4天传代一次；第三步，收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球，将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4，将细胞悬液移至新培养液中，根据细胞密度按照1:2或1:3传代。本方法从有限的材料来源获得大量的毛囊干细胞，操作简便，可重复性好，培养的毛囊干细胞表达β-intigren，oct-4等，碱性磷酸酶阳性，显示毛囊干细胞具有多向分化潜能。

Description

一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法

技术领域：

本发明涉及一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法，属于生物医学的干细胞与组织工程学技术领域。

背景技术：

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。胚胎干细胞具有发育的全能性，但是它只存在于胚胎发育早期，因此其获得性以及伦理问题限制其进一步的研究及应用。

成体干细胞虽然没有胚胎干细胞发育全能性上的优势，但是其取材方便，来源广泛，并且仍保留向多种细胞类型分化，因此成体干细胞的体外培养以及功能研究成为近年来研究的热点。毛囊干细胞是成体干细胞的一种，是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能干细胞。这种细胞聚居于毛囊的隆突区，一旦需要，便可按特定发育途径分化产生出另外一群具有有限分裂能力的细胞群，是表皮、皮脂腺和毛囊细胞更新和修复的细胞来源。对毛囊干细胞的研究对于毛囊及附属器官再生及脱发，皮肤愈合及畜牧业生产具有重要意义。

绒山羊是我国一种独特的生物资源，是经过长期的自然选择和人工选育而成的目前世界上产绒量最高、绒纤维品质最好的品种。因此绒山羊毛囊干细胞体外分离培养将对我们在理论上研究绒山羊毛囊干细胞的发育以及在实践中应用有重要意义。

目前国内外研究中由于对组织内毛囊干细胞缺乏有效的分离培养方法，阻碍了该领域研究的深入发展。如何高效获得具有良好生物学性能的干细胞,，是目前毛囊干细胞研究急需解决的问题。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种绒山羊毛囊干细胞(Hair Follicle Stem Cell,HFSC)体外高效培养的技术方法。本发明方法分离1-2年绒山羊背颈部皮肤，拔取附着其上的毛囊，将毛囊消化为单细胞并过400目细胞筛后，体外培养毛囊干细胞，成功获得大量状态良好的毛囊干细胞。

为了实现上述发明目的，本发明方法将绒山羊毛囊消化为单细胞后，采用悬浮培养方式，以无血清培养液培养，可以在体外获得大量毛囊干细胞的高效培养方法，按照如下步骤操作：

第一步，绒山羊毛囊的分离：剪取绒山羊背颈部皮肤，剪掉外侧毛发至根部，剪成小块后，置于生理盐水洗三遍，75%的酒精浸泡5分钟，转移至磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）+10% 胎牛血清（FCS）的操作液中，在操作液中清洗，利用胶原酶IV在37℃下消化10-15分钟，然后用手术镊子将毛囊结构分离出来，转移到前述操作液中，去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪等杂质，在新鲜细胞培养液DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium，F-12Nutrient Mixture）中将毛囊洗3次；

第二步，绒山羊毛囊干细胞体外原代培养：毛囊经DMEM/F12洗完后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液，37℃消化20-30分钟，轻轻吹打混匀，使毛囊周围的所有细胞变成单细胞或多细胞聚集物时，加入体积相当于消化液体积10%的胎牛血清终止消化，在DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12；2%B27；20ng/ml表皮生长因子（EGF）；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；1%青链霉素；以培养当天为零代，每3-4天传代一次；

第三步，绒山羊毛囊干细胞体外传代培养：收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球至15ml离心管，离心后去掉上清液，加入0.5ml毛囊干细胞培养液，重悬吹打，稍用力将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4，将吹打好的细胞悬液转移至新鲜毛囊干细胞培养液中，根据细胞密度按照1:2或1:3传代。其中，所述毛囊干细胞培养液成分同第二步。

本发明方法建立了绒山羊毛囊干细胞体外高效培养方法的技术方法，从有限的材料来源获得大量的毛囊干细胞，操作简便，可重复性好。为毛囊干细胞体外培养及研究应用提供了技术基础。

附图说明：

图1为成年绒山羊背颈部皮肤毛囊的分离图。

图2为绒山羊毛囊干细胞体外培养显微图。

图3为绒山羊毛囊干细胞的碱性磷酸酶染色图。

图4为绒山羊毛囊干细胞进行免疫荧光组织化学染色图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例和附图对本发明方法做进一步阐述。

实施例1、

1、绒山羊毛囊的分离

毛囊干细胞（HFSC）来源于成年绒山羊背颈部皮肤。剪取绒山羊背颈部皮肤，剪掉外侧毛发至根部，剪成2平方厘米小块后，用手术镊子将毛囊从皮肤上取下，见图1，置于生理盐水洗三遍，75%的酒精浸泡5分钟，转移至磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.0）+10%胎牛血清（FCS，Hyclone公司）的操作液中，在操作液中洗3次，利用胶原酶IV（sigma公司）在37℃下消化10分钟，然后在体视镜下用手术镊子将毛囊结构分离出来，转移到前述操作液中，并去除与毛囊连接在一起的皮脂腺，立毛肌，脂肪等杂质，在新鲜DMEM/F12(Hyclone公司)中将毛囊洗3次。

2、毛囊干细胞的体外培养

原代培养：毛囊经DMEM/F12（Hyclone公司）洗完3遍后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液（Hyclone公司），37℃消化20分钟，轻轻吹打混匀，使毛囊周围的所有细胞变成单细胞或多细胞聚集物时，加入体积相当于消化液体积10%胎牛血清终止消化，在DMEM/F12（Hyclone公司）中洗3遍，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12（Hyclone公司）；2%B27(Gibco公司)；20ng/ml表皮生长因子（EGF，Sigma公司）；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Peprotech公司）；1%青链霉素（Hyclone公司）；以培养当天为零代，每4天传代一次。

传代培养：收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球至15ml离心管，离心后去掉上清液，加入0.5ml毛囊干细胞培养液，重悬吹打，稍用力将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4，将吹打好的细胞悬液转移至新鲜毛囊干细胞培养液中，根据细胞密度按照1:2或1:3传代；所述毛囊干细胞培养液成分同上。

图2中1为过细胞筛后单细胞悬液，培养1天后有明显细胞聚集物出现（图2中2），继续培养3天后，克隆球变大，边界清晰（图2中3），传代1次后克隆的边缘非常光滑紧凑，克隆呈一个个的球状（图2中4-5），传代两次后毛囊干细胞克隆结实，紧凑，细胞均一紧密。（图2中6）。

3、绒山羊毛囊干细胞的碱性磷酸酶染色

将毛囊干细胞克隆球在PBS中洗3次后，置于4%多聚甲醛（索莱宝公司）室温固定15分钟,同时按如下方式配制磷酸酶染色工作液：

碱性磷酸酯酶显色缓冲液（碧云天公司） 3ml

BCIP溶液(300X，碧云天公司) 10μl

NBT溶液(150X，碧云天公司) 20μl

BCIP/NBT染色工作液 3.03ml

固定结束后，PBS洗涤3次，最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。常温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。图3为绒山羊毛囊干细胞的碱性磷酸酶染色，显示毛囊干细胞为碱性磷酸酶阳性（蓝紫色）。

4、细胞免疫荧光化学毛囊干细胞特定基因表达

取出传代两次的毛囊干细胞，消化为单细胞后，PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛（索来宝公司）室温固定15分钟。或PBS洗3遍，每遍5分钟。用PBST（PBS+0.5%Trition-100）溶液进行透化，室温10分钟。PBS（磷酸亚缓冲液，PH7.0）洗1遍，5分钟。加入含10％山羊血清或马血清(索来宝公司)的PBST（PBS+0.5%Trition-100），室温封闭30－60分钟。弃封闭液，加入一抗（1：50－1：200，abcam公司）稀释于封闭液中，4℃过夜或37℃孵育2小时。1％BSA（牛血清白蛋白）的PBS洗3遍，每遍5分钟。加入二抗（1：50－1：200，碧云天公司）稀释于二抗稀释液中，37℃避光放置1小时。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入终浓度的DAPI（碧云天公司），室温放置5分钟。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入500μl PBS或PBS甘油（1：1）在荧光显微镜下拍照或避光保存。图4中1-3说明HFSC呈Oct-4阳性并在细胞核表达，图4中4-6说明HFSC呈β-integrin阳性并在细胞质表达。

Claims

1.一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，绒山羊毛囊的分离：剪取绒山羊背颈部皮肤，剪掉外侧毛发至根部，剪成小块后，置于生理盐水洗三遍，75%的酒精浸泡5分钟，转移至pH7.0磷酸盐缓冲液+10%胎牛血清的操作液中，在操作液中清洗，利用胶原酶IV在37℃下消化10-15分钟，然后用手术镊子将毛囊结构分离出来，转移到前述操作液中，去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪杂质，在新鲜细胞培养液DMEM/F12中将毛囊洗3次；第二步，绒山羊毛囊干细胞体外原代培养：毛囊经DMEM/F12洗完后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液，37℃消化20-30分钟，轻轻吹打混匀，使毛囊周围的所有细胞变成单细胞或多细胞聚集物时，加入体积相当于消化液体积10%的胎牛血清终止消化，在DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12；2%B27；20ng/ml表皮生长因子；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；1%青链霉素；以培养当天为零代，每3-4天传代一次；第三步，绒山羊毛囊干细胞体外传代培养：收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球至15ml离心管，离心后去掉上清液，加入0.5ml毛囊干细胞培养液，重悬吹打，稍用力将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4，将吹打好的细胞悬液转移至新鲜毛囊干细胞培养液，根据细胞密度按照1:2或1:3传代；所述毛囊干细胞培养液成分同第二步。