PL201401B1 - Unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, zastosowanie keratynocytów oraz sztuczna skóra - Google Patents
Unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, zastosowanie keratynocytów oraz sztuczna skóraInfo
- Publication number
- PL201401B1 PL201401B1 PL364980A PL36498099A PL201401B1 PL 201401 B1 PL201401 B1 PL 201401B1 PL 364980 A PL364980 A PL 364980A PL 36498099 A PL36498099 A PL 36498099A PL 201401 B1 PL201401 B1 PL 201401B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- keratinocytes
- medium
- culture
- serum
- immortalized
- Prior art date
Links
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 122
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 64
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 claims abstract description 6
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 claims abstract description 6
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 9
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 5
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002649 leather substitute Substances 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 abstract description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 abstract 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 abstract 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 10
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 7
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 NR-2 Chemical compound 0.000 description 4
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 4
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 4
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 description 2
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 description 2
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000388169 Alphapapillomavirus 7 Species 0.000 description 1
- 101100148654 Arabidopsis thaliana SAB gene Proteins 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000954519 Human papillomavirus type 18 Protein E6 Proteins 0.000 description 1
- 101000767629 Human papillomavirus type 18 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 241000701830 Human papillomavirus type 31 Species 0.000 description 1
- 241000701827 Human papillomavirus type 35 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101710183391 Keratin, type I cytoskeletal 14 Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 102100031784 Loricrin Human genes 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100338009 Mus musculus Gsta1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100123101 Mus musculus Gsta4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102100040119 SH3 domain-binding protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010079309 loricrin Proteins 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000051 skin sensitiser Toxicity 0.000 description 1
- 230000036555 skin type Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
- C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Abstract
Linia ludzkich keratynocytów unie smiertelniona przy u zyciu przynajmniej jednego funkcjonalnego genu nowotworowego pochodzenia retrowirusowego, charakteryzuj aca si e tym, ze (1) nie tworzy guzów; (2) zachowuje zdolno sc do ró znicowania i ekspresji bia lek i enzymów wyra zanych przez normalnie zró znicowane keratynocyty nawet po zwi ekszonej liczbie pasa zy w hodowli, gdzie zwi ekszona liczba pasa zy obejmuje co najmniej 10 pasa zy; i (3) tworzy warstwowy i spolaryzowany naskórek zawieraj acy orto-keratynocyty stratum corneum po typowej hodowli organicznej w po zywce bez surowicy i bez warstwy komórek zywicielskich (od zywczych). Ulepszony sposób unie smiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unie smiertelnionych keratynocytów, charak- teryzuj acy si e tym, ze obejmuje nast epuj ace etapy: (i) wytworzenia próbki otrzymanej z ludzkiej skóry do hodowli in vitro; (ii) otrzymania keratynocytów z tej wytworzonej próbki tkanki skóry i wysianie keratynocytów na po zywk e wzrostow a bez surowicy na p lytkach hodowlanych dostarczonych z pow loczk a fibronektyny, kolagenu typu I i BSA, która u latwia przyleganie i wzrost komórek; (iii) wymiana po zywki w sposób wystarczaj acy do otrzymania optymalnego konfluentnego wzrostu komórek w hodowli, nieprzerwanie utrzymuj ac pow loczk e na p lytce; (iv) przeniesienie powsta lych unie smiertelnionych keratynocytów z po zywki selekcyjnej bez surowicy na p lytki hodow- lane powleczone poprzednio w podobny sposób; (v) zaka zania keratynocytów z zastosowaniem funkcjonalnych genów nowotworowych co najmniej wirusa SV 40 i wirusa ludzkiego brodawczaka 16; (vi) przeniesienie powsta- lych unie smiertelnionych keratynocytów do po zywki proliferacyjnej bez surowicy odpowiedniej do namna zania unie smiertelnionych keratynocytów na p lytkach hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób; i (vii) przeniesienia powsta lych unie smiertelnionych keratynocytów na po zywk e ró znicuj ac a bez surowicy o wysokiej zawarto sci wapnia do pojemników hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób. Zastosowanie keratynocytów do immunologicznych, farmakologicznych, foto- i chemio-toksykologicznych analiz reakcji skóry i do wyra zania genów heterologicznych oraz sztuczna skóra. PL PL PL PL
Description
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 07.04.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
07.04.1999, PCT/EP99/02347 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
28.10.1999, WO99/54435 PCT Gazette nr 43/99 (51) Int.Cl.
C12N 5/10 (2006.01) C12N 5/22 (2006.01) C12N 1/00 (2006.01) C12N 5/08 (2006.01)
Unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, zastosowanie keratynocytów oraz sztuczna skóra
| (30) Pierwszeństwo: 17.04.1998,EP,98201247.8 | (73) Uprawniony z patentu: SOCIETE DES PRODUITS NESTLE,Vevey,CH |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.12.2004 BUP 26/04 | (72) Twórca(y) wynalazku: Markus Baur,Epalinges,CH |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2009 WUP 04/09 | (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. |
(57) Linia ludzkich keratynocytów unieśmiertelniona przy użyciu przynajmniej jednego funkcjonalnego genu nowotworowego pochodzenia retrowirusowego, charakteryzująca się tym, że (1) nie tworzy guzów; (2) zachowuje zdolność do różnicowania i ekspresji białek i enzymów wyrażanych przez normalnie zróżnicowane keratynocyty nawet po zwiększonej liczbie pasaży w hodowli, gdzie zwiększona liczba pasaży obejmuje co najmniej 10 pasaży; i (3) tworzy warstwowy i spolaryzowany naskórek zawierający orto-keratynocyty stratum corneum po typowej hodowli organicznej w pożywce bez surowicy i bez warstwy komórek żywicielskich (odżywczych). Ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytów, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy: (i) wytworzenia próbki otrzymanej z ludzkiej skóry do hodowli in vitro; (ii) otrzymania keratynocytów z tej wytworzonej próbki tkanki skóry i wysianie keratynocytów na pożywkę wzrostową bez surowicy na płytkach hodowlanych dostarczonych z powłoczką fibronektyny, kolagenu typu I i BSA, która ułatwia przyleganie i wzrost komórek; (iii) wymiana poż ywki w sposób wystarczający do otrzymania optymalnego konfluentnego wzrostu komórek w hodowli, nieprzerwanie utrzymując powłoczkę na płytce; (iv) przeniesienie powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów z pożywki selekcyjnej bez surowicy na płytki hodowlane powleczone poprzednio w podobny sposób; (v) zakażania keratynocytów z zastosowaniem funkcjonalnych genów nowotworowych co najmniej wirusa SV 40 i wirusa ludzkiego brodawczaka 16; (vi) przeniesienie powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów do pożywki proliferacyjnej bez surowicy odpowiedniej do namnażania unieśmiertelnionych keratynocytów na płytkach hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób; i (vii) przeniesienia powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów na pożywkę różnicującą bez surowicy o wysokiej zawartości wapnia do pojemników hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób. Zastosowanie keratynocytów do immunologicznych, farmakologicznych, foto- i chemio-toksykologicznych analiz reakcji skóry i do wyrażania genów heterologicznych oraz sztuczna skóra.
PL 201 401 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry, zastosowanie keratynocytów oraz sztuczna skóra. Wynalazek dotyczy nowych, unieśmiertelnionych linii komórkowych pochodzących z tkanek normalnej ludzkiej skóry, wykazujących ulepszoną charakterystykę różnicowania, nowego sposobu wytwarzania takich linii komórkowych i ich różnych zastosowań, w szczególności w dziedzinie wytwarzania sztucznej skóry.
Wytwarzanie unieśmiertelnionych linii komórkowych pochodzących z normalnych tkanek skóry ludzkiej już uprzednio opisano. Na ogół, sposoby stosowane do takich celów obejmują transformację komórek skóry ludzkiej, np. keratynocytów i melanocytów, które hoduje się in vitro z czynnikami zapewniającymi unieśmiertelnienie. Unieśmiertelnienie dotyczy wytwarzania komórek, które można hodować przez dłuższy czas in vitro z czynnikami, które zapewniają unieśmiertelnienie. Unieśmiertelnienie dotyczy wytwarzania komórek, które mogą być hodowane przez przedłużony czas in vitro, teoretycznie w nieskończoność. Komórki te są również określane jako linie komórkowe ciągłe. Przeciwnie, komórki nieuśmiertelnione są zdolne do wzrostu tylko przez ograniczoną liczbę podziałów komórkowych in vitro. Komórki unieśmiertelnione są niezwykle korzystne, ponieważ zapewniają stabilne, potencjalnie nieograniczone źródło komórek o określonej charakterystyce. Typowe czynniki do wytwarzania unieśmiertelnionych linii komórkowych i linii unieśmiertelnionych komórek skóry ludzkiej w szczególności obejmują, np. wirusy, rekombinowane wirusy i plazmidy zawierające sekwencje DNA zapewniające unieśmiertelnienie.
Najpowszechniejszy sposób wytwarzania unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych obejmuje prawdopodobnie zastosowanie sekwencji Simian Virus 40 (SV40), zaś bardziej konkretnie DNA wielkiego antygenu T SV40 (T-Ag), jako środka unieśmiertelniającego. Przykładowo, Steinberg i in., J. Cell Phys., 123,117-125 (1985); patent USA nr 4,885,238 (Reddel i in.); patent USA nr 4,707,448 (Major); Stoner i in., Cancer Res., 51:365-371 (1991); Chopra i in., In vitro Cell Dev. Biol., 30A:539-546 (1994); Chopra i in., In vitro Cell Dev. Biol., 27A:763-765 (1991); Christian i in., Cancer Res., 47:60666073 (1987); Rhim i in., Science, 227:1250-1252 (1985); i Grubman i in., Gastrointest. Liver Physiol., 29:G1060-G1070 (1994) opisują zastosowanie wektorów SV40 i wektorów zawierających sekwencje wielkiego antygenu T SV40 do wytwarzania unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych. Wprowadzanie takich sekwencji przeprowadza się zwykle przez zakażenie z użyciem wirusa SV40 albo hybrydy adenowirusa 12/S%40 albo przez transfekowanie komórek rekombinowany plazmidem zawierającym długie końcowe powtórzenia wirusa mięsaka Rousa i region wczesny Ori-SV 40 metodą koprecypitacji fosforanem strontu (patrz, Brash i in., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034 (1987)).
Inny znany sposób wytwarzania unieśmiertelnionych linii komórkowych, a szczególnie unieśmiertelnionych linii keratynocytów, obejmuje transfekcję albo zakażenie komórek sekwencjami DNA wirusa ludzkiego brodawczaka (HPV). Przykładowo, w patencie USA nr 5,376,542 (Schlegel), opisano unieśmiertelnienie ludzkich komórek nabłonkowych genami E6 i E7 wyizolowanymi z HPV-16, 18, 31, albo 35 albo samym genem E7, w celu wytworzenia unieśmiertelnionej linii komórkowej nie tworzącej guzów. Ponadto Barbosa i in., Oncogene, 4:1529-1532 (1989); i Mϋenger i in., J. Virol., 63 (10): 4417-4421 (1989) opisują zastosowanie genów E6 i E7 HPY-16 i HPV-18 do wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów ludzkich. Ponadto, Dϋrst i in. Oncogene, l, 251-256 (1987) opisują unieśmiertelnione keratynocyty z wirusa brodawczaka typu 16.
Jednakże, o ile liczne grupy donoszą o unieśmiertelnionych liniach komórkowych keratynocytów, i ich zastosowaniu w testach in vitro, uprzednio unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów według stanu techniki wykazywały zwykle jedną albo wiele cech sprawiających, że ich zastosowanie jest niekorzystne. Przykładowo, uprzednio opisywane unieśmiertelnione keratynocyty wykazywały jedną albo więcej z poniższych cech: (i) zmniejszenie albo utratę ekspresji znaczników różnicowania np. białek, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty, i (ii) zmienioną charakterystykę wzrostu w hodowli tkankowej i (iii) tworzenie warstwowego i spolaryzowanego nabłonka, zawierającego parakeratynocyty stratum corneum.
W celu wyeliminowania tych wad w EP 780,469 (Societe des Produits Nestle) zaproponowano nowy sposób unieśmiertelniania keratynocytów albo ludzkich melanocytów przy użyciu en sus nowej pożywki hodowlanej, wektora pLXSHD+SV40 (#328), który pochodzi z wirusa SV40 albo również z wektora pLXSHD+E6/E7, który pochodzi z wirusa brodawczaka ludzkiego 16 (HPV-16). Unieśmiertelnione komórki uzyskane w ten sposób zachowują właściwość różnicowania się i ekspresji białek
PL 201 401 B1 oraz enzymów, które są wyrażane przez normalne zróżnicowane keratynocyty i melanocyty, nawet po znacznej liczbie pasaży w hodowli.
Jednakże, pomimo poprzednich opisów, wciąż istnieje w dziedzinie praktycznej istotna potrzeba ludzkich unieśmiertelnionych keratynocytów mających jeszcze bardziej złagodzone właściwości. Komórki takie byłyby niezwykle korzystne dla wielu zastosowań, w szczególności do analiz, w których potrzebne są wysoko zróżnicowane komórki skóry. Wynalazek dotyczy linii ludzkich keratynocytów unieśmiertelnionej przy użyciu funkcjonalnych genów nowotworowych pochodzących z co najmniej wirusa SV40 i wirusa brodawczaka 16, która (1) nie tworzy guzów;
(2) zachowuje zdolność do różnicowania i ekspresji białek i enzymów wyrażanych przez normalnie zróżnicowane keratynocyty nawet po zwiększonej liczbie pasaży w hodowli, gdzie zwiększona liczba pasaży obejmuje co najmniej 10 pasaży; i (3) tworzy warstwowy i spolaryzowany naskórek zawierający orto-keratynocyty stratum corneum po hodowli w typowej organicznej pożywce bez surowicy i bez warstwy komórek żywicielskich (odżywczych).
Korzystnie każdy funkcjonalny gen nowotworowy jest zawarty w niezależnym konstrukcie retrowirusowym.
Korzystna jest linia DK7-NR o numerze depozytowym CNCM I-1996 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim.
Ponadto wynalazek dotyczy ulepszonego sposobu unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytów, który obejmuje następujące etapy:
(i) wytworzenie próbki otrzymanej z tkanki skóry ludzkiej do hodowli in vitro;
(ii) otrzymanie keratynocytów z tej wytworzonej próbki tkanki skóry i wysianie keratynocytów na pożywkę wzrostową bez surowicy na płytkach hodowlanych dostarczonych z powłoczką fibonektyny, kolagenu typu I i BSA, która ułatwia przyleganie i wzrost komórek;
(iii) wymiana pożywki w sposób wystarczający do otrzymania optymalnego konfluentnego wzrostu komórek w hodowli, nieprzerwanie utrzymując powłoczkę na płytce;
(iv) przeniesienie keratynocytów z pożywki selektywnej bez surowicy na płytki hodowlane powleczone poprzednio w podobny sposób;
(v) zakażanie keratynocytów z zastosowaniem funkcjonalnych genów nowotworowych co najmniej wirusa SV 40 i wirusa ludzkiego brodawczaka 16;
(vi) przeniesienie powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów do pożywki proliferacyjnej bez surowicy odpowiedniej do namnażania unieśmiertelnionych keratynocytów na płytkach hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób;
(vii) przeniesienie powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów na pożywkę różnicującą bez surowicy, o wysokiej zawartości wapnia do pojemników hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób.
Korzystnie każdy funkcjonalny gen nowotworowy jest zawarty w niezależnym konstrukcie retrowirusowym.
Korzystnie zastosowane konstrukty retrowirusowe są wektorami pLXSHD+SV40 (#328) i pLXSHD+E6/E7 zawierają cymi T-Ag SV40, dł ugie sekwencje terminalne 5' i 3' SV40, sekwencje pB322, które umożliwiają replikację E. coli, miejsce wielokrotnego klonowania, sekwencję poliadenylacji SV40 i inne sekwencje, a wektor pLXSHD+E6/E7 zawiera w miejscu genu kodującego antygen T fragment NcoI/CfoI genu E6/E7 pochodzący z wirusa ludzkiego brodawczaka 16.
Korzystnie pożywką bez surowicy w etapie (ii), (iv) lub (vi) jest pożywka NR-3 lub pożywką różnicującą w etapie (vii) jest modyfikowana pożywka NR-2 o stężeniu wapnia co najmniej 1,5 mM.
W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie keratynocytów wedł ug wynalazku do immunologicznych, farmakologicznych, foto i chemio-toksykologicznych analiz reakcji skóry i do wyrażania heterologicznych genów.
Korzystnie stosowana jest linia DK7-NR o numerze depozytu CNCM I-1996 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim.
Wynalazek dotyczy też sztucznej skóry, która obejmuje linię keratynocytów według wynalazku korzystnie linię komórkową DK7-NR o numerze depozytu CNCM I-1996 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim.
PL 201 401 B1
Opis figur
Na Fig. 1 przedstawiono konstrukcję pochodnej poliomawirusa SV40, plazmidu pLXSHD+SV40 (#328) zastosowaną do unieśmiertelnienia keratynocytów według wynalazku.
Fig. 2 przedstawia konstrukcję pochodzącą z wirusa brodawczaków 16, plazmidu pLXSHD+E6/E7 zastosowaną do unieśmiertelnienia keratynocytów według wynalazku.
Wynalazek dotyczy nieonkogennych, unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów, tzn. linii komórkowych, które nie tworzą guzów po wstrzyknięciu pod skórę zwierzęcia, przy zastosowaniu na przykład przynajmniej 2x106 komórek na każde wstrzyknięcie.
Te linie komórkowe zachowują zdolność do różnicowania się oraz wyrażania białek różnicowania wyrażanych przez normalne keratynocyty nawet po zwiększonej liczbie pasaży. Wyrażenie „zwiększona liczba pasaży” w znaczeniu tu stosowanym oznacza przynajmniej 10 pasaży w hodowli, korzystnie przynajmniej 20 do 30 pasaży, jeszcze korzystniej przynajmniej 50 pasaży, zaś teoretycznie nieograniczoną liczbę pasaży. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty wytworzone według wynalazku zachowują zdolność do wyrażania białek różnicowania składających się z keratyny K1/10, keratyny K14, inwolukryny, filagryny i lorikryny nawet po zwiększonej liczbie pasaży w hodowli tkankowej.
Unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wykazują profil cytochromu p450 (CYP450), który jest podobny, jeżeli nie identyczny, z profilem normalnych keratynocytów. Przykładowo, komórki te wyrażają CYP450 1A1, 2E1, 2C18 i 3A5. Ponadto, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają enzymy fazy II, np. transferazę π S-glutationu (GSTn) w sposób porównywalny z normalnymi nieunieśmiertelnionymi keratynocytami.
Ponadto, unieśmiertelnione keratynocyty według niniejszego wynalazku wyrażają białka i enzymy związane z utlenianiem komórkowym i reakcjami zapalnymi, np. dysmutazę nadtlenkową (SOD) i kolagenazę typu I oraz czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α) po traktowaniu estrami forbolu, w podobny albo identyczny sposób jak normalne zróżnicowane keratynocyty. W oparciu o te charakterystyki, te linie komórkowe reprezentują niezwykle stabilne i namnażalne źródło komórek dla badań immunologicznych, farmakologicznych, zapalnych, foto- i chemo-toksykologicznych reakcji skórnych.
Ponadto, linie unieśmiertelnionych keratynocytów według wynalazku tworzą, w hodowli organotypowej w pożywce bezsurowiczej (przykładowo, pożywce NR2, Biofluids, Inc., USA wzbogaconej w EGF (5 ng/ml), witaminę C (38 μg/ml) i CaCl2 (1,5 mM) bez warstwy komórek żywicielskich (bez fibroblastów), warstwowy i spolaryzowany nabłonek o powierzchniowych warstwach skeratynizowanych, tzw. stratum corneum o morfologii orto-keratynocytów, co oznacza, że stratum corneum jest pozbawiona komórek jądrzastych, tj. komórek zawierających jądra.
Preparat warstwowego i spolaryzowanego nabłonka z unieśmiertelnionych keratynocytów uprzednio uzyskano w klasycznych warunkach hodowli, tj. techniką wykorzystującą pożywkę zawierającą surowicę bydlęcą i warstwę komórek żywicielskich (Lechner i in., Virology, 185:536-571, 1991). Mimo to, unieśmiertelnione komórki nie tworzą normalnych powierzchniowo zrogowaciałych warstw. Przykładowo, linie komórkowe unieśmiertelnione wirusem brodawczaków 16 albo 18 albo E6/E7 tworzą, jak wiadomo, bardzo zdezorganizowane nabłonki (Blanton i in., Am. J. Pathol., 138:673-685, 1991; Hudson i in., J. Virol., 64:519-526, 1990; McCane i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7169-7173, 1988; Woodworth i in., Oncogene 7:619-626, 1992).
W przeciwieństwie do powyższego, linie opisane w EP780496 (Societe des Produits Nestle), hodowane w typowej hodowli organicznej w pożywce bezsurowiczej oraz bez warstwy komórek żywicielskich, wytworzyły warstwowy i spolaryzowany nabłonek o normalnych skeratynizowanych warstwach powierzchniowych, ale jednak o morfologii para-keratynocytów, tzn. stratum corneum zawierała komórki wciąż posiadające jądra.
Unieśmiertelnione keratynocyty według niniejszego wynalazku pochłaniają również egzogenne niezbędne kwasy tłuszczowe (AGE) i prezentują stan nienasycenia i przedłużenia łańcuchów AGE doskonale odpowiadające stanowi nienasycenia i przedłużeniu łańcucha normalnych keratynocytów.
Ogólnie, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku można otrzymać sposobem według wynalazku.
Konkretnie, etap (i) zwykle obejmuje uzyskanie próbki tkanki skóry ludzkiej od dawców ludzkich, np. próbki otrzymanej podczas zabiegu chirurgicznego albo pediatrycznego. Unieśmiertelnianie pojedynczej próbki komórek skóry, tj. autologicznej próbki komórek skóry umożliwia wytwarzanie unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów, które wykazują określone cechy, np. profil konkretnego receptora, który jest charakterystyczny dla konkretnego dawcy.
PL 201 401 B1
Próbkę tkanki skóry preparuje się następnie w etapie (i) w taki sposób, który jest odpowiedni do hodowli in vitro. Dokonuje się tego korzystnie przez wstępne płukanie próbki skóry, np. przy użyciu tej samej pożywki, którą stosuje się do hodowli. Korzystnie dokonuje się tego w pożywce NR-2, bezsurowiczej pożywce, której dokładny skład ujawniono w EP 780,496 i która okazała się korzystna do hodowania normalnych keratynocytów. Po płukaniu, próbkę skóry korzystnie goli się, np. dermatomem, a nastę pnie dzieli na mał e kawał ki.
Powstałe skrawki skóry następnie korzystnie rozdziela się na skórę właściwą i naskórek. Można tego dokonać czynnikami fizycznymi i/lub enzymatycznymi. Przykładowo, można to osiągnąć przez trypsynizację, np. przez flotację próbek tkanki skóry w roztworze trypsyny (np. około 0,5%) zawierającym EDTA (np. około 0,1%) przez czas odpowiednio długi do rozdzielenia komórek, np. około 30-60 minut w 37°C albo przez noc w 4°C.
Skórę właściwą oddziela się, a naskórek umieszcza się następnie w pożywce w celu uzyskania zawiesiny. Korzystnie, pożywka do uzyskania zawiesiny zawiera roztwór inhibitora trypsyny z soi (SBTI) i jest umieszczana w kontakcie z komórkami na czas wystarczający, zwykle około 5 minut, do inaktywacji trypsyny i zapewnienia uwalniania komórek. Następnie dodaje się pożywkę do hodowli komórkowej, korzystnie bezsurowiczą pożywkę NR-2 (opisaną w EP 780 496) i filtruje (np. filtr 100 nm) w celu uzyskania żądanych komórek, tj. keratynocytów.
Uzyskane pierwotne keratynocyty wysiewa się na pożywkę bezsurowiczą, korzystnie pożywkę NR-3 (opisaną szczegółowo w EP 780 496), w odpowiedniej gęstości komórek, korzystnie około 1,2x104 komórek/cm2, na uprzednio powleczone płytki hodowlane. Jednakże, gęstość komórek może być zmieniana w szerokim zakresie. Płytki hodowlane są korzystnie powlekane kompozycją, która zwiększa przyleganie i wzrost keratynocytów, konkretnie roztworem fibronektyny, BSA i kolagenu I.
W etapie (iii) pożywkę hodowlaną zmienia się tak często jak wymaga tego optymalizacja wzrostu komórek. Korzystnie, pożywkę zmienia się co około dwa dni. Jednakże, może się to zmieniać w zależnoś ci od konkretnego rodzaju skóry. Po osią gnię ciu niemal cał kowitej zlewnoś ci, np. okoł o 90% zlewności, co zwykle zachodzi po około 10-14 dniach, rozdziela się keratynocyty i melanocyty. Można to osiągnąć dowolnym sposobem pozwalającym na odpowiednie rozdzielenie komórek bez negatywnego wpływu na keratynocyty i melanocyty. Przykładowo, można to osiągnąć przez różnicową trypsynizację. Korzystnie, melanocyty lub keratynocyty traktuje się roztworem trypsyna/EDTA, a następnie przenosi się do pożywki selekcjonującej. W przypadku keratynocytów, komórki korzystnie traktuje się przez około 5-10 minut roztworem trypsyna/EDTA (0,025%/0,01%), a następnie w etapie (iv) wysiewa się w pożywce NR-3 na wcześniej powleczone płytki.
Następnie, keratynocyty traktuje się czynnikiem unieśmiertelniającym. Komórki można również zamrozić, dopóki się ich nie unieśmiertelni, np. w ciekłym azocie. Zakażenie i unieśmiertelnienie jest korzystnie osiągane przez zastosowanie funkcjonalnych genów nowotworowych przynajmniej dwóch wirusów takich jak T-Ag z wirusa SV40 i E6/E7 z HPV16. Każdy z tych genów może występować na niezależnym konstrukcie, przykładowo w wektorze pLXSHD+SV40 (#328), przedstawionym na Fig. 1 i opisanym został przez Stockshlaedera i in., (GeneBank, nr dostępu M64753; Human Gene Therapy, 2:33-39 (1991)) albo w wektorze pLXSHD+E6/E7, który przedstawiono na Figurze 2.
Wektor pLXSHD+SV40 (#328) zawiera między innymi, sekwencję T-Ag z SV40, długie sekwencje LTR 5' i 3'końcowych powtórzeń SV40, sekwencje pBR322, zapewniające replikację w E. coli, miejsce klonowania, sekwencję poliadenylacji SV40.
Wektor pLXSHD+E6/E7 zawiera fragment NcoI/CfoI genu E6/E7 wirusa ludzkiego brodawczaka 16 w miejscu genu kodują cego antygen T.
Po unieśmiertelnieniu, komórki następnie poddaje się koniecznej liczbie pasaży w trakcie hodowli, zaś uzyskane unieśmiertelnione komórki przenosi się do pożywki proliferacyjnej w etapie (vi). Przeniesienie to korzystnie przeprowadza się w trakcie 2 pasażu. Pożywką proliferacyjną może być pożywka bezsurowicza, korzystnie NR-2 albo NR-3. Unieśmiertelnione komórki hoduje się w sposób ciągły na powleczonych wcześniej płytkach hodowlanych, przy czym powleczenie obejmuje znów roztwór fibronektyny, SAB i kolagenu typu I.
Po namnożeniu unieśmiertelnionych komórek w pożywce proliferacyjnej (korzystnie NR-2), przenosi się je w etapie (vii) do pożywki, która zapewnia różnicowanie normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów, korzystnie do pożywki naśladującej warunki występujące powszechnie w skórze, powodując w ten sposób organizowanie się keratynocytów w postaci warstwowego i spolaryzowanego nabłonka o normalnych, powierzchniowych warstwach zrogowaciałych. Korzystnie, komórki można hodować w pożywce bezsurowiczej zawierającej wysokie stężenie wapnia, jak NR-2, korzystnie około
PL 201 401 B1
1,5 mM wapnia, około 5 ng/ml EGF i około 38 ^g/ml witaminy C, przez 2-3 tygodnie na płytkach na granicy cieczy i powietrza, przykładowo na płytkach z 12 studzienkami Falcon Nr. 3043, przy czym każda studzienka posiada wkładkę Falcon Nr. 3180, przy czym keratynocyty rozwijają się na granicy cieczy i powietrza. Powietrze składa się z powietrza atmosferycznego w wewnętrznej przestrzeni wkładki, w której nie ma pożywki odżywczej. Cieczą jest pożywka odżywcza zawarta w studzience i przechodząca przez błonę wkładki, na której rozwijają się keratynocyty.
Unieśmiertelnione keratynocyty mają właściwości, które doskonale nadają się do wykorzystania w badaniach immunologicznych, farmakologicznych, foto- i chemiotoksykologicznych nad reakcjami skórnymi. Przykładowo, unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów według niniejszego wynalazku można zastosować w testach, które wymagają zróżnicowanych komórek skóry, np. badań nad funkcją barierową (rogowacenie) zrekonstruowanej skóry, badań metabolizmu zróżnicowanych keratynocytów (metabolizm kwasów tłuszczowych, metabolizm środków przeciwutleniających), badań dotyczących wpływu promieniowania ultrafioletowego na komórki skóry, badań dotyczących wpływu potencjalnie drażniących skórę substancji i czynników uczulających skórę, badań metabolizmu lipidów, miejscowego zastosowania ksenobiotyków (np. olejów kosmetycznych, przez poszukiwania potencjalnych związków ochronnych, np. fotoochronnych), badań stanu zapalnego i podrażnienia skóry, itp.
Ponadto, linie komórkowe unieśmiertelnionych keratynocytów wytworzone według wynalazku są przydatne do poszukiwania potencjalnych związków antynowotworowych i potencjalnych związków do leczenia chorób skóry. Obejmuje to zwykle eksponowanie linii komórkowej na taki związek przez pewien czas i ocenę czy wywołuje on jakikolwiek niekorzystny efekt, np. genotoksyczność, tworzenia adduktów DNA, mutagenność, transformację komórek albo cytotoksyczność.
Ponadto, linie komórkowe unieśmiertelnionych keratynocytów według wynalazku mogą mieć zastosowanie w testach mutagenezy DNA, testach przesiewowych na mutageny skórne, testach identyfikujących czynniki uszkadzające chromosomy, badaniach transformacji złośliwej, komórkowych badaniach biochemicznych (np. testach aktywacji CYP450), badaniach przesiewowych związków i kompozycji, np. koktajli niezbędnych kwasów tłuszczowych, związanych ze stanem zapalnym i reakcjami alergicznymi, testach aktywacji kolagenazy (w związku ze stanem zapalnym), obejmujących wykrywanie TNFa i interleukiny.
Ponieważ linie według wynalazku tworzą orto-keratynocyty stratum corneum, szczególnie dobrze nadają się do wytwarzania sztucznej skóry, do badań nad mutagennością, badań immunologicznych, farmakologicznych, foto- i chemio-toksykologicznych, wymienionych powyżej. Taka skóra może składać się tylko z naskórka keratynocytów według wynalazku, ale korzystnie obejmuje również kolagen, fibroblasty, a nawet melanocyty, w celu osiągnięcia większego podobieństwa do skóry ludzkiej.
Ponadto, linie komórkowe keratynocytów według wynalazku są zdolne do wyrażania białek rekombinowanych, np. ludzkich białek i polipeptydów, jak również do wytwarzania RNA i DNA.
Spośród unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów według wynalazku zdeponowano jedynie przykładowo linię DK7-NR, na podstawie Traktatu Budapeszteńskiego, 19 marca, 1998 Collection Nationale de Microorganisme (CNCM), 25 rue de Docteur Roux 75724, Paryż, Francja, pod numerem CNCM I-1996. Wszystkie ograniczenia co do dostępności tej linii komórkowej zostaną natychmiast zniesione po wydaniu patentu na niniejsze zgłoszenie albo inne zgłoszenie korzystające z pierwszeństwa tego zgłoszenia.
Inne cechy wynalazku staną się oczywiste na podstawie opisu przykładowych wykonań, które podano w celu zilustrowania wynalazku, nie zaś w celu jego ograniczenia. O ile nie zaznaczono inaczej, manipulowanie komórkami, wytwarzanie wektorów transformowanie komórek i inne procedury techniczne przeprowadzono według protokołów opisanych w publikacji Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
P r z y k ł a d 1: Wytwarzanie i charakterystyka linii komórkowych
Pobrano tkanki skóry sutka. Po oddzieleniu części obejmującej skórę właściwą od naskórka, skórę właściwą pocięto na małe kawałki 0,2x0,2 mm i przytwierdzono do 6 cm płytki hodowlanej z surowicą. Dodano minimalnej pożywki Dulbecco (DMEM, 10% cielęcej surowicy płodowej) po 2-4 godzinach. Hodowlę eksplantatów inkubowano do momentu, gdy stał się widoczny intensywny wzrost fibroblastów. Hodowlę zlewną fibroblastów oddzielono i namnażano w celu uzyskania zamrożonych rezerwowych hodowli.
Pojemniki hodowlane, które powleczono w sposób ciągły „koktajlem” opisanym uprzednio dla komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-49 (1985) zasiedlono komórkami pierwotnymi. Po osiągnięciu niemal całkowitej zlewności, przykładowo 90% zlewności, która pojawia się zwykle
PL 201 401 B1 po okresie około 10 do 14 dni, oddzielono keratynocyty od melanocytów. W tym celu hodowlę traktowano przez 5 minut roztworem trypsyna /EDTA (0,025%/0,01%). Podczas tego traktowania, melanocyty odłączyły się od hodowli keratynocytów i zostały zebrane osobno.
Pierwotne keratynocyty hodowano następnie i namnażano do żądanej liczby komórek w bezsurowiczej pożywce NR-3, stosując opisane powleczone pojemniki hodowlane (pożywka NR-3 promuje wzrost keratynocytów w porównaniu z melanocytami).
Następnie komórki „linii pakującej fibroblastów 3T3” transfekowano plazmidami pLXSHD+SV40 (#328) i pLXSHD+E6/E7 według protokołu Pfeifer i in., (Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995); z takim wyjątkiem, że wirusy zebrano po obudowaniu w linię komórkową, która rosła w pożywce DMEM z 10% FCS). Następnie, keratynocyty zakażono wirusem w celu unieśmiertelnienia. Podczas zakażenia, zastosowano również bezsurowiczą pożywkę PC-1 opisaną w artykule Pfeifer i in. Po unieśmiertelnieniu linie komórkowe przeniesiono do pożywki proliferacyjnej NR-2 albo NR-3, stosując powleczone pojemniki hodowlane. Po namnożeniu komórek do żądanej liczby, komórki przeniesiono do pożywki różnicującej odpowiedniej do hodowania normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów (NR-2).
Można wykazać, że unieśmiertelnione keratynocyty wykazują łagodniejszy wzrost komórkowy przy zwiększonej liczbie pasaży w hodowli, co można porównać do opisanych dla linii komórkowych z EP 780496.
Ekspresję CYP450 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 i 2D6 analizowano w liniach komórkowych skóry składających się z normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów metodą łańcuchowej polimerazy DNA w temperaturze pokojowej (ekspresja mRNA). Profil ekspresji CYP450 w unieśmiertelnionych keratynocytach był szczególnie podobny, nawet identyczny, do normalnych keratynocytów.
Linie komórkowe reagowały na czynnik indukujący CYP450, taki jak benz(a)piren w ten sam sposób jak komórki nieuśmiertelnione nawet po większej liczbie pasaży.
Analizowano znaczniki różnicowania przy użyciu swoistych przeciwciał przeciwko T-Ag, inwolukrynie, filagrynie, lorikrynie, wimentynie i keratynom K4, K7, K8, K10/1, K13, K14, K17, K18 i K19. Najwyższą zdolność prezentowania cech różnicowania wykazano dla linii komórkowej DK7-NR.
Transferazę S-glutationu (GST) analizowano techniką Northern i Western blot. Wszystkie linie keratynocytów silnie wyrażały mRNA dla GSTn. Profil ekspozycji na GSTa, GSTμ i GSTn w liniach komórkowych był podobny do profilu dla normalnych keratynocytów.
W celu analizy i porównania desaturacji i wydłużania dodanego AGE do keratynocytów, unieśmiertelnione (oraz normalne) keratynocyty traktowano kwasem linolowym (LA, 15 ^moli) i kwasem linolenowym (LN, 15 nM). Do tych doświadczeń zastosowano pożywkę NR-2 pozbawioną AEG (Biofluids, Inc.). Hodowle komórkowe traktowano po osiągnięciu zlewności i przenoszono z pożywki na NR-2 z wysokim stężeniem wapnia (1,5 mM). Komórki traktowano AGE przez 4 dni (zmiana po 2 dniach). Analizę AGE wykonano przez ekstrakcję i rozdział fosfolipidów przez TLC (chromatografia cienkowarstwowa) i oznaczenie ilościowe estrów metylowych kwasów tłuszczowych przez CGL (chromatografia gaz-ciecz). Można było wykazać tworzenie produktów desaturacji i wydłużania LA (20:4n-6 i 22:4n-6) oraz LN (20:5n-3, 22:5n-3 i 22:6n-3). Ten profil metaboliczny był zgodny z obserwowanym w normalnych keratynocytach.
Wszystkie komórki były hipodiploidalne z większością zliczeń chromosomów w przedziale komórek diploidalnych. Oprócz analizowanych komórek nie stwierdzono innych komórek w hodowli. Wynik ten potwierdza czystość linii komórkowych i brak zanieczyszczeń pochodzących z innych źródeł.
Zdolność do tworzenia guzów przez unieśmiertelnione keratynocyty określa się przez podskórne wstrzyknięcie (1-2x106 keratynocytów) myszom nagim. Linie badanych keratynocytów, zaś szczególnie DK7-NR nie tworzyły guzów u myszy nagich.
P r z y k ł a d 2: Wytwarzanie naskórka
Przygotowano pożywkę NR-2, zawierającą 750000 komórek linii komórkowej według przykładu 1. W tym celu 0,5 ml tej pożywki umieszczono we wkładkach Falcon Nr 3180, które umieszczono w studzienkach płytek Falcon Nr 3043 zawierających już po 2 ml świeżej pożywki NR-2, keratynocyty hodowano przez 2 dni w warunkach preferujących rozwój keratynocytów. Trzeciego dnia, pożywkę zawartą we wkładkach usunięto, zaś komórki pozostawiono na powietrzu. Pożywkę zawartą w studzienkach zmieniano co 2 dni na pożywkę NR-2 z dodatkiem EGF (5 ng/ml), witaminy C (38 μg/ml) i CaCl2 (1,5 mM). Po 2-3 tygodniach hodowli, na granicy powietrza i cieczy zebrano tworzący się w ten sposób naskórek, utrwalano kwasem pikrynowym i analizowano morfologię.
Wyniki pokazują, że linia komórkowa keratynocytów, w szczególności linia DK7-NR tworzy warstwowy i spolaryzowany naskórek, powszechnie zwany warstwą podstawną, zawierającą komórki
PL 201 401 B1 mające morfologię podobną do sześcianu identyczne z normalnymi komórkami. Warstwa stratum corneum przedstawia morfologię orto-keratynocytów, która jest morfologią pozbawioną komórek z jądrami. Tworzenie warstwy orto-keratynocytów nie było możliwe do tej pory przy użyciu innych unieśmiertelnionych linii komórkowych. Przykładowo, w identycznych warunkach, linia DK2-NR (EP 780496) tworzy stratum corneum z para-keratynocytami, w której warstwa zrogowaciałych komórek wciąż zawiera komórki z jądrami. Jedynie morfologia orto-keratynocytów stratum corneum odzwierciedla normalną sytuację w skórze ludzkiej. W rzeczywistości, para-keratynocyty stratum corneum charakteryzują się nieprawidłową hipertrofią nabłonka, co prowadzi do zaburzeń, takich jak np. łuszczyca albo nowotwór.
P r z y k ł a d 3: Test podrażnienia
Linie komórkowe uzyskane w przykładzie 1, w szczególności DK7-NR, hoduje się w pożywce NR-2. Indukcję „stresu genowego” TNFa (czynnik martwicy nowotworu alfa) po traktowaniu czynnikami drażniącymi skórę, w tym PMA (12-mirystynian-13-octan forbolu) i UV-B (promieniowanie ultrafioletowe B), analizuje się metodą Northern oraz testami biologicznymi. Wyniki pokazują, że linie komórkowe, zaś szczególnie linia DK7-NR, reagują na PMA i UV-B i wyrażają białko TNF-α nawet po zwiększonej liczbie pasaży.
P r z y k ł a d 4: Konstruowanie sztucznej skóry
Błona wkładki Falcon Nr 3180 zastępowana jest arkuszem estru benzylowego kwasu hialuronowego (Hyaff 11). Dno wkładki zasiewa się pierwotnymi ludzkimi fibroblastami (0,1x106 komórek w 0,2 ml pożywki), po 30 minutach wkładkę wypełnia się pożywką DMEM zawierającą 10% cielęcą surowicę płodową, inkubację prowadzi się w 37°C w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przez kilka dni, wkładki opróżnia się i dodaje 0,5 ml świeżej pożywki NR-2 zawierającej 750000 komórek linii komórkowej DK7-NR, wkładki umieszcza się w studzienkach płytek Falcon Nr 3043 zawierających już 2 ml świeżej pożywki NR-2 i komórki hoduje się przez 2 dni w warunkach sprzyjających wzrostowi keratynocytów. Trzeciego dnia, pożywkę zawartą we wkładkach usuwa się i pozostawia komórki na świeżym powietrzu. Pożywkę w studzienkach zmienia się co 2 dni na pożywkę NR-2 uzupełnioną EGF (5 ng/ml), witaminą C (38 μg/ml) i CaCl2 (1,5 mM). Po 2-3 tygodniach hodowli na granicy faz powietrza i cieczy można zaobserwować wytworzenie się sztucznej skóry wykazującej charakterystykę normalnej skóry.
Claims (12)
1. Linia ludzkich kertynocytów unieśmiertelniona przy użyciu funkcjonalnych genów nowotworowych pochodzących z co najmniej wirusa SV40 i wirusa brodawczaka 16, która (1) nie tworzy guzów;
2. Linia komórkowa keratynocytów ludzkich według zastrz. 1, znamienna tym, że każdy funkcjonalny gen nowotworowy jest zawarty w niezależnym konstrukcie retrowirusowym.
(2) zachowuje zdolność do różnicowania i ekspresji białek i enzymów wyrażanych przez normalnie zróżnicowane keratynocyty nawet po zwiększonej liczbie pasaży w hodowli, gdzie zwiększona liczba pasaży obejmuje co najmniej 10 pasaży; i (3) tworzy warstwowy i spolaryzowany naskórek zawierający orto-keratynocyty stratum coroneum po hodowli w typowej ograniczonej pożywce bez surowicy i bez warstwy komórek żywicielskich (odżywczych).
3. Linia komórkowa keratynocytów ludzkich według zastrz. 1, znamienna tym, że jest linią DK7-NR o numerze depozytowym CNCM I-1996 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim.
4. Ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytów, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
(i) wytworzenie próbki otrzymanej z tkanki skóry ludzkiej do hodowli in vitro;
(ii) otrzymanie keratynocytów z tej wytworzonej próbki tkanki skóry i wysianie keratynocytów na pożywkę wzrostową bez surowicy na płytkach hodowlanych dostarczonych z powłoczką fibonektyny, kolagenu typu I i BSA, która ułatwia przyleganie i wzrost komórek;
(iii) wymiana pożywki w sposób wystarczający do otrzymania optymalnego konfluentnego wzrostu komórek w hodowli, nieprzerwanie utrzymując powłoczkę na płytce;
(iv) przeniesienie keratynocytów z pożywki selekcyjnej bez surowicy na płytki hodowlane powleczone poprzednio w podobny sposób;
PL 201 401 B1 (v) zakaż anie keratynocytów z zastosowaniem funkcjonalnych genów nowotworowych co najmniej wirusa SV 40 i wirusa ludzkiego brodawczaka 16;
(vi) przeniesienie powstał ych unieś miertelnionych keratynocytów do po ż ywki proliferacyjnej bez surowicy odpowiedniej do namnażania unieśmiertelnionych keratynocytów na płytkach hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób;
(vii) przeniesienie powstałych unieś miertelnionych keratynocytów na pożywkę różnicującą bez surowicy, o wysokiej zawartości wapnia do pojemników hodowlanych powleczonych poprzednio w podobny sposób.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że każdy funkcjonalny gen nowotworowy jest zawarty w niezależnym konstrukcie retrowirusowym.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że zastosowane konstrukty retrowirusowe są wektorami pLXSHD+SV40(#328) i pLXSHD+E6/E7 zawierającymi T-Ag SV40, długie sekwencje terminalne 5' i 3'SV40, sekwencje pBR322, które umożliwiają replikację E. coli, miejsce wielokrotnego klonowania, sekwencję poliadenylacji SV40 i inne sekwencje, a wektor pLXSHD+E6/E7 zawiera w miejscu genu kodują cego antygen T fragment NcoI/CfoI genu E6/E7 pochodzącego z wirusa ludzkiego brodawczaka 16.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że pożywką bez surowicy w etapie (ii), (iv) lub (vi) jest pożywka NR-3.
8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że pożywką różnicującą w etapie (vii) jest modyfikowana pożywka NR-2 o stężeniu wapnia co najmniej 1,5 mM.
9. Zastosowanie keratynocytów określonych w zastrz. 1 do immunologicznych, farmakologicznych, foto- i chemio-toksykologicznych analiz reakcji skóry i do wyrażania heterologicznych genów.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że stosowana jest linia DK7-NR o numerze depozytu CNCM I-1996 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim.
11. Sztuczna skóra, znamienna tym, że obejmuje linię keratynocytów określoną w zastrz. 1.
12. Sztuczna skóra według zastrz. 11, znamienna tym, że obejmuje linię komórkową DK7-NR o numerze depozytu CNCM I-1996 zgodnie z Traktatem Budapeszteń skim.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98201247 | 1998-04-17 | ||
| PCT/EP1999/002347 WO1999054435A2 (fr) | 1998-04-17 | 1999-04-07 | Lignee de cellules immortalisees derivees de tissus cutanes humains normaux |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL364980A1 PL364980A1 (pl) | 2004-12-27 |
| PL201401B1 true PL201401B1 (pl) | 2009-04-30 |
Family
ID=8233616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL364980A PL201401B1 (pl) | 1998-04-17 | 1999-04-07 | Unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, zastosowanie keratynocytów oraz sztuczna skóra |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6566136B2 (pl) |
| EP (1) | EP1071747B1 (pl) |
| JP (1) | JP4671504B2 (pl) |
| KR (1) | KR20010074488A (pl) |
| CN (1) | CN1299409A (pl) |
| AT (1) | ATE274050T1 (pl) |
| AU (1) | AU756151B2 (pl) |
| BR (1) | BR9909699A (pl) |
| CA (1) | CA2324479C (pl) |
| CZ (1) | CZ20003842A3 (pl) |
| DE (1) | DE69919531T2 (pl) |
| DK (1) | DK1071747T3 (pl) |
| ES (1) | ES2226383T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0101913A3 (pl) |
| IL (1) | IL138417A0 (pl) |
| NO (1) | NO325588B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ506944A (pl) |
| PL (1) | PL201401B1 (pl) |
| PT (1) | PT1071747E (pl) |
| RU (1) | RU2244005C2 (pl) |
| SK (1) | SK286870B6 (pl) |
| WO (1) | WO1999054435A2 (pl) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6368815B1 (en) * | 1999-03-29 | 2002-04-09 | Warner-Lambert Company | Screening of molecules that inhibit human phosphodiesterase 4A produced by non-recombinant cell lines |
| EP1130086A1 (en) * | 2000-02-18 | 2001-09-05 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Genetically engineered keratinocytes and toxicity assay using said keratinocytes |
| IT1316995B1 (it) * | 2000-02-25 | 2003-05-26 | Idi Irccs | Procedimento per ottenere da colture primarie di cheratinociti umanilinee cellulari immortalizzate. |
| WO2002091999A2 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-21 | Geron Corporation | Treatment for wounds |
| DE10255285A1 (de) * | 2002-11-26 | 2004-06-03 | Mcs Micro Carrier Systems Gmbh | Selbst formende Phospholipid-Gele |
| US8669109B2 (en) | 2003-08-19 | 2014-03-11 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Methods of producing proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells |
| DE10338531A1 (de) | 2003-08-19 | 2005-04-07 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Reklonierung von Produktionszellen |
| EP1557085A1 (en) | 2004-01-21 | 2005-07-27 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Mouse model for human psoriasis |
| WO2006047426A2 (en) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions, methods and systems for preparation of a stem cell-enriched cell population |
| ATE547511T1 (de) * | 2004-12-23 | 2012-03-15 | Medimmune Llc | Nichttumorbildende mdck-zellinie zur vermehrung von viren |
| EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| CN105219697A (zh) * | 2014-07-04 | 2016-01-06 | 赫柏慧康生物科技无锡有限公司 | 一种人原代角质细胞分离制备的方法 |
| RU2573938C1 (ru) * | 2014-12-11 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Клеточная линия рака почки человека ibgvat r 27 |
| RU2573940C1 (ru) * | 2014-12-11 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Клеточная линия рака почки человека ibgvat r 6 |
| WO2023123299A1 (en) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | Beijing Theraxyte Bioscience Co., Ltd. | Compositions and methods for culturing stem cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2217285T3 (es) * | 1994-11-08 | 2004-11-01 | Cellfactors Plc | Metodo para producir una linea celular neural humana. |
| AU730222B2 (en) * | 1995-12-21 | 2001-03-01 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof |
| US5811297A (en) * | 1996-03-07 | 1998-09-22 | Amba Biosciences, Llc | Immortalized hematopoietic cell lines, cell system thereof with stromal cells, in vitro, ex vivo and in vivo uses, & in vitro generation of dendritic cells and macrophages |
-
1999
- 1999-04-07 CZ CZ20003842A patent/CZ20003842A3/cs unknown
- 1999-04-07 CA CA002324479A patent/CA2324479C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 HU HU0101913A patent/HUP0101913A3/hu unknown
- 1999-04-07 AT AT99920605T patent/ATE274050T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 BR BR9909699-4A patent/BR9909699A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-04-07 AU AU38135/99A patent/AU756151B2/en not_active Ceased
- 1999-04-07 NZ NZ506944A patent/NZ506944A/en unknown
- 1999-04-07 DE DE69919531T patent/DE69919531T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-07 IL IL13841799A patent/IL138417A0/xx unknown
- 1999-04-07 EP EP99920605A patent/EP1071747B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-07 SK SK1549-2000A patent/SK286870B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 WO PCT/EP1999/002347 patent/WO1999054435A2/fr active IP Right Grant
- 1999-04-07 CN CN99805127A patent/CN1299409A/zh active Pending
- 1999-04-07 RU RU2000129131/13A patent/RU2244005C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 PL PL364980A patent/PL201401B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 ES ES99920605T patent/ES2226383T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-07 JP JP2000544768A patent/JP4671504B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-07 PT PT99920605T patent/PT1071747E/pt unknown
- 1999-04-07 DK DK99920605T patent/DK1071747T3/da active
- 1999-04-07 KR KR1020007011556A patent/KR20010074488A/ko active IP Right Grant
-
2000
- 2000-09-18 US US09/663,645 patent/US6566136B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-06 NO NO20005053A patent/NO325588B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1071747T3 (da) | 2004-11-29 |
| HUP0101913A3 (en) | 2002-06-28 |
| ATE274050T1 (de) | 2004-09-15 |
| NO325588B1 (no) | 2008-06-23 |
| US20020042133A1 (en) | 2002-04-11 |
| SK286870B6 (sk) | 2009-06-05 |
| IL138417A0 (en) | 2001-10-31 |
| ES2226383T3 (es) | 2005-03-16 |
| PT1071747E (pt) | 2004-12-31 |
| EP1071747A2 (fr) | 2001-01-31 |
| JP2003516711A (ja) | 2003-05-20 |
| CZ20003842A3 (cs) | 2001-08-15 |
| SK15492000A3 (sk) | 2001-03-12 |
| AU756151B2 (en) | 2003-01-02 |
| EP1071747B1 (fr) | 2004-08-18 |
| CA2324479C (en) | 2007-12-04 |
| HUP0101913A2 (hu) | 2001-09-28 |
| NO20005053L (no) | 2000-11-29 |
| AU3813599A (en) | 1999-11-08 |
| PL364980A1 (pl) | 2004-12-27 |
| DE69919531T2 (de) | 2005-09-15 |
| WO1999054435A3 (fr) | 1999-12-09 |
| WO1999054435A2 (fr) | 1999-10-28 |
| BR9909699A (pt) | 2002-04-30 |
| DE69919531D1 (de) | 2004-09-23 |
| KR20010074488A (ko) | 2001-08-04 |
| NO20005053D0 (no) | 2000-10-06 |
| CN1299409A (zh) | 2001-06-13 |
| RU2244005C2 (ru) | 2005-01-10 |
| CA2324479A1 (en) | 1999-10-28 |
| NZ506944A (en) | 2003-10-31 |
| JP4671504B2 (ja) | 2011-04-20 |
| US6566136B2 (en) | 2003-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6423540B2 (en) | Immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof | |
| PL201401B1 (pl) | Unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, zastosowanie keratynocytów oraz sztuczna skóra | |
| JP3557172B2 (ja) | 不死化ヒトケラチノサイト細胞系統 | |
| JP2000506374A5 (pl) | ||
| Steinberg et al. | Transformation and immortalization of human keratinocytes by SV40 | |
| JP2010500878A (ja) | ポリマー膜を用いた幹細胞とフィーダー細胞の共培養方法 | |
| Deveney et al. | Establishment of human colonic epithelial cells in long-term culture | |
| US20040229355A1 (en) | Culture medium for long-term culture of hepatocytes | |
| CA2237391A1 (en) | Novel method of culturing human epithelial cells for the identification of cancer therapeutics and diagnostics | |
| Price et al. | Approaches to enhance proliferation of human epidermal keratinocytes in mass culture | |
| Salas-Prato et al. | Attachment and multiplication, morphology and protein production of human fetal primary liver cells cultured in hormonally defined media | |
| MXPA00009558A (en) | Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20100407 |