KR20010074488A - 정상 인간 피부조직으로부터 유래한 불사화 세포주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (1) 비종양형성적이고, (2) 조직배양에서 높은 비율의 계대후에서 조차 정상 분화 각질세포에 의해 발현되는 단백질 및 효소를 분화 및 발현시키는 경향을 보존하고 (3) 공급물 세포층없이 무혈청 배지내 유기전형적 배양물에서 배양하는 경우, 오르토-각질세포 스트라툼 코르네움을 함유하는 층화 및 분극된 상피를 형성하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스로부터 유래한 적어도 기능성 종양형성 유전자에 의해 불사화되는 인간 각질세포의 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 두개이상의 상이한 레트로바이러스의 기능성 종양형성 유전자를 이용하여 각질세포를 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 불사화된 각질세포를 수득하기 위한 인간 피부 세포의 개선된 불사화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이질성 유전자를 발현시키고 인공피부를 구축하기 위하여 면역학적,약리학적, 광- 및 화학-독성학적 피부반응을 위한 각질세포의 사용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 정상의 인간 피부 조직으로 부터 유래하고, 향상된 분화 특성을 나타내는 새로운 불사화 세포주, 이러한 세포주의 새로운 제조방법 및 이의 다양한 용도, 특히 인공 피부의 제조분야에서의 용도에 관한 것이다.
정상 인간 피부 조직으로부터 유래하는 불사화 세포주의 생산은 이미 기술되어 있다. 통상적으로, 이러한 목적에 사용되는 방법에는 인간 피부 세포의 형질전환, 예컨대 불사화를 전달하는 제제와 함께 실험관에서 배양시키는 각질세포 및 멜라닌세포의 형질전환이 포함된다. 불사화는 실험관에서 장기간동안, 이론적으로는 영구적으로 배양할 수 있는 세포의 생산에 관한 것이다. 이러한 세포는 또한 디자인된 지속성 세포주이다. 이와는 반대로, 비불사화 세포는 단지 실험관에서 한정된 수의 세포분할 동안만 증식할 수 있다. 이러한 불사화 세포는 매우 유익한데, 이는 안정되고 잠재적으로 한정된 특성을 갖는 무제한의 세포원을 제공하기 때문이다. 불사화 세포주 및 불사화 인간 피부 세포주의 생산을 위한 통상적인 제제에는 특히 예컨대, 불사화의 특성을 전달하는 DNA 서열을 함유하는 바이러스, 재조합 바이러스 및 플라스미드를 포함한다.
불사화 인간 세포주를 생산하는 가장 일반적인 방법에는 가능하게는 SimianVirus 40(SV40)의 서열, 좀더 구체적으로는 SV40 의 대(large) T 항원 (T-Ag)의 DNA의 서열을 불사화제로서의 사용이 포함된다. 예컨대, Steinberg et al., J. Cell Phys, 123, 117-125 (1985); US4885238 (Reddel et al.); US4707448 (Major); Stoner et al., Cancer Res., 51, 365-371 (1991); Chopra et al., In vitro Cell Dev. Biol., 30A, 539-546 (1994); Chopra et al., In vitro Cell Dev. Biol., 27A, 763-765 (1991); Christian et al., Cancer Res., 47, 6066-6073 (1987); Rhim et al., Science, 227, 1250-1252 (1985); and Grubman et al., Gastrointest. Liver Physiol., 29, G1060-G1O70 (1994) 에는 SV40 벡터 및 SV40 의 대 T 항원의 서열을 함유하는 벡터의 불사화 인간 세포주의 생산을 위한 사용이 보고되어 있다. 이러한 서열의 도입은 통상적으로 SV40 바이러스 또는 12/SV40 하이브리드-아데노바이러스에 의한 감염 또는 스트론튬 포스페이트의 존재하 공침전시킴으로서 Rous sarcoma 바이러스의 긴 말단 리피트 및 조절 SV40 ori-영역을 함유하는 재조합 플라스미드로 세포를 트랜스펙션시켜 실행한다.(참조 Brash et al., Mol.Cell Biol., 7,2031-2034,1987)
불사화 세포주, 특히 불사화 인간 각질 세포를 제조하기 위한 다른 공지의 방법에는 인간 파필로마 바이러스 (HPV)의 DNA 서열로 세포를 트랜스펙션 또는 감염시키는 것이 포함된다. 예컨대, US5376542(Schlegel) 에는 비종양형성 불사화 인간 세포주의 생산을 위해 HPV-16,18,31,33 또는 35 의 단리된 E6 및 E7 유전자 또는 단지 E7 유전자 만에 의한 인간 상피성 세포의 불사화가 기재되어 있다. 더욱이, Barbosa et al. Oncogene, 4, 1529-1532 (1989);및 Munger et al. J.Virol., 63(10):4417-4421 (1989) 에는 불사화 인간 각질세포의 생산을 위한 HPV-16 및 HPV-18의 E6 및 E7 유전자의 사용이 보고되어 있다. 더욱이, Durst et al., Oncogene, 1, 251-256 (1987) 에는 파필로마 바이러스 16 형에 의한 각질세포의 불사화가 기재되어 있다.
그럼에도 불구하고, 비록 수 많은 그룹들이 불사화 각질세포 세포주 및 이들의 실험관 검정에서의 사용을 기술하였지만, 현 기술의 단계에서 불사화 각질세포세포주는 이들의 사용을 불리하게 만드는 하나이상의 특성을 통상적으로 보이고 있다. 예컨대, 앞서 기술된 불사화 각질세포는 하나이상의 하기 특성을 보인다: (i)분화 마커의 발현, 예컨대 정상적으로 분화된 각질세포에 의해 발현되는 단백질의 발현의 감소 또는 손실, (ii) 조직의 배양에서 변경된 성장의 특성 및 (iii) 스트라툼 코르네움 (stratum-corneum) 파라-각질세포를 갖는 층화 및 분극된 상피의 형성.
이러한 단점을 제거하기 위하여, EP780496 (Societe des Produits Nestle) 는 en sus 새로운 배양배지, SV40 바이러스로부터 유래한 벡터 pLXSHD+SV40(#328) 또는 동일하게 인간 파필로마 바이러스 16 (HPV-16)로 부터 유래한 벡터 pLXSHD+E6/E7 를 사용하는 각질 세포 또는 인간 멜라닌세포의 새로운 불사화 방법이 제안되어 있다. 이런 방식으로 수득한 불사화 세포는 분화 및 단백질 및 효소의 발현 능력을 보존하며, 이것은 배양에서 계대수의 상승후에서 조차 정상적으로 분화된 각질세포 및 멜라닌세포에 의해 발현된다.
그러나, 상기의 기술에도 불구하고, 여전히 좀더 향상된 특성을 갖는 인간불사화 각질세포를 갖는 것이 실제적인 분야에서 매우 필요하다. 이러한 세포는 다양한 용도, 특히 고도로 분화된 피부 세포를 필요로 하는 분석에는 매우 유익할 것이다.
본 발명의 요약
이러한 목적으로 인하여, 본 발명은 하기를 특징으로 하는, 레트로바이러스 기원의 하나이상의 종양형성 기능성 유전자를 이용한 인간 불사화 각질세포 세포주에 관한 것이다:
(1) 비 종양형성,
(2) 조직 배양에서 계대수의 상승후 정상적으로 분화된 각질세포에 의해 발현되는 단백질 및 효소를 분화 및 발현시키는 능력의 보존,
(3) 영양 세포의 층 없이 무혈청 배지에서 유기-전형적 배양물에서 배양하는경우, 스트라툼 코르네움 오르토-각질세포를 갖는 층화 및 분극된 상피를 형성.
본 발명의 또 다른 목적은 정상의 피부 조직으로 부터 유래한 불사화 각질세포 세포주의 새로운 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 이러한 각질세포 세포주의 사용을 위한 방법, 에컨대, 피부반응의 면역학적, 약리학적, 광- 및 화학-독성학적 분석 및 이질성 유전자의 발현을 위한 방법을 제공하는 것이다.
도 1 은 유래된 레트로바이러스 SV40의 구축물, 즉 본 발명의 각질세포를 불사화시키기 위하여 사용하는 플라스미드 pLXSHD+SV40(#328)의 구축물을 보여준다.
도 2 는 파필로마 바이러스 16 의 레트로바이러스의 구축물, 즉 본 발명의 각질 세포를 불사화시키기 위하여 사용하는 플라스미드 pLXSHD+E6/E7 유래의 구축물을 나타낸다.
본 발명은 비-종양형성의 불사화 각질세포 세포주, 즉 예컨대 각 주사시 적어도 2x106세포를 이용하여 동물의 피부하에 주사시 종양을 형성하지 않는 세포주를 제공한다.
또한 이러한 세포주는 상승된 계대수 후에 정상 각질세포에 의해 발현되는 분화의 단백질을 분화 및 발현시키는 능력을 보존한다. 표현 "상승된 계대수" 는 배양에서 10 이상의 계대, 바람직하게는 20 내지 30 이상의 계대, 좀더 바람직하게는 50 이상의 계대, 이론적으로는 비제한된 수의 계대를 나타낸다. 예컨대, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포는 조직의 배양에서 계대수의 상승후에서 조차 케라틴 K1/10, 케라틴 K14, 인볼루크린, 필라그린 및 로리크린으로 구성된 분화 단백질을 발현시킨다.
본 발명의 불사화 각질세포는 비록 동일하지는 않더라도, 정상 각질세포의 프로필에 유사한 사이토크롬 p450(CYP450) 의 프로필을 갖는다. 예컨대, 본 발명의 세포는 CYP450 1A1, 2E1, 2C18 및 3A5 를 발현시킨다. 더욱이, 본 발명의 불사화 각질세포는 페이스 II 의 효소, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 π(GSTπ)를 정상, 비불사화 각질세포에 비교할 수 있는 방식으로 발현시킨다.
더욱이, 본 발명의 불사화 각질세포는 세포 산화 및 염증 반응에 관련된 단백질 및 효소, 예컨대 수퍼옥시디스무타아제 (SOD) 및 I 형의 콜라게나아제 및 포르볼-에스테르로 처리후 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 정상의 분화된 각질세포의 방식과 유사한 또는 동일한 방식으로 발현시킨다. 이러한 주어진 특성으로, 이러한 세포주는 피부 반응의 면역학적, 약리학적, 염증의, 광- 및 화학-독성학적 연구를 위한 매우 흥미로운 재생원의 일례이다.
더욱이, 본 발명의 불사화 각질세포의 주는, 영양 세포의 층 없이(섬유아세포 없이) 무혈청 배지 [예컨대, EGF (5 ng/ml), 비타민 C (38㎍/ml) 및 CaCl2(1.5 mM)로 풍부해진 Biofluids Inc., U.S., 의 배지 NR2]에서 유기전형적 배양물에서 배양하면, 표면 케라틴화 층을 갖는 층화 및 분극된 상피, 통상적으로 오르토-각질세포 모르폴로지를 갖는 소위 스트라툼 코르네움을 형성하며, 이는 스트라툼 코르네툼은 핵세포, 즉 핵을 함유하는 세포가 제거된 것을 의미한다.
불사화 각질세포에 의한 층화 및 분극된 상피의 제조는 통상의 배양 조건하, 즉, 송아지 혈청을 함유하는 배지 및 영양세포의 층을 이용한 기술에 의해 이미 이루어져 있다.(Lechner et al., Virology, 185, 536-571,1991). 그럼에도 불구하고, 불사화 세포는 정상 표면 케라틴화 층을 형성하지 않는다. 예컨대, 파필로마 바이러스 16 또는 18, 또는 E6/E7 에 의해 불사화된 세포주는 매우 비조직화된 상피를 형성하는 것으로 공지되어 있다(Blanton et al., Am. J. Pathol., 138, 673-685, 1991; Hudson et al., J. Virol., 64, 519-526, 1990; McCane et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 7169-7173, 1988; Woodworth et al., Oncogene,7, 619-626,1992).
이와 반대로, EP780496 (Societe des Produits Nestle) 에 기재된 세포주는, 만일 무형청 배지에서 영양세포 층없이 유기-전형적 배양물에서 배양하면, 정상의 표면 케라틴화된 층을 갖으나, 그럼에도 불구하고 파라-각질세포 모르폴로지, 즉 여전히 핵을 갖는 세포를 함유하는 스트라툼 코르네움을 갖는 층화 및 분극된 상피를 형성한다.
본 발명의 불사화 각질세포는 또한 외인성 필수 지방산 (AGE)을 흡수하며, 불포화상태 및 불포화 상태에 완전히 상응하는 AGE 의 사슬의 연장 및 정상 각질 세포의 사슬의 연장을 나타낸다.
통상적으로, 본 발명의 불사화 각질세포는 다음의 공정에 따라 수득할 수 있다 :
(i) 인간 피부의 시료 수득;
(ii) 배양할 수 있는 일차 각질세포를 수득하기 위한 피부 시료의 제조;
(iii) 무혈청 배지, 바람직하게는 세포의 고정 및 성장을 촉진시키는 피복물을 갖는 배양 플레이트상의 배지 NR-3 (EP780496에 기재)에서 상기 일차 각질세포의 배양 (상기 피복물은 파이브로넥틴, SAB 및 I 형 콜라겐으로 구성됨);
(iv) 배양 플레이트상에서 각질세포의 최적의 컨플루언트 성장을 얻기에 충분한 방식의 무혈청 배지의 대체 (플레이트의 피복물은 연속방식으로 유지시킨다);
(v) 배양물에서 각질세포를 멜라민세포로부터 분리시켜 이 분리된 각질세포를 감염 배지, 바람직하게는 배지 NR-3 로, 바람직하게는 유사한 방식으로 피복된 배양 플레이트를 이용하여 트립신 및 EDTA 를 함유하는 조성물로 세포를 처리한후 옮김;
(vi) SV40 바이러스 및 인간 파필로마 바이러스와 같은 둘 이상의 상이한 레트로바이러스의 기능성 종양형성 유전자로 세포를 감염시킴;
(vii) 유사한 방식으로 앞서 피복된 배양 플레이트상의 무혈청의 증식배지에, 바람직하게는 배지 NR-2 또는 NR-3 으로 불사화 각질세포를 옮김 (EP780496 에 기재된 배지, 이 조성물은 본 발명에 참조로 포함되어 있다); 및
(viii) 증식후 불사화된 각질세포를, 고함량의 칼슘(1.5mM) 을 갖는 편의한 분화배지에서 바람직하게는 EGF (5 ng/ml) 및 비타민 C (38 ㎍/ml) 으로 풍부하게된 배지 NR-2 로 불사화 각질세포를 옮김.
상세하게는, 단계 (i)는 통상적으로 정상 인간 도너의 인간 피부 조직의 시료, 예컨대, 외과적 중재 또는 소아과적 중재 동안 수득되는 시료의 수득을 포함한다. 피부 세포의 유일 시료, 즉 피부 세포의 자가 시료의 불사화는 한정된 특성, 예컨대 특정 도너에 특징적인 특정 리셉터의 프로필을 제공하는 불사화 각질세포 세포주의 생산을 가능케한다.
이어서 피부 조직의 시료를 실험관 배양에 적합하도록 단계 (ii)에서 제조한다. 이러한 제조는 바람직하게는 피부 조직의 시료를 처음에 세정하여, 예컨대 배양을 위해 사용하는 배지를 이용하여 실행한다. 바람직하게는, 이러한 작업은 무혈청 배지인 배지 NR-2 에서 실행하며, 이의 정확한 조성은 EP780496 에 기재되어 있고, 이는 정상 각질세포의 배양에 유리한 것으로 보여진다. 세정후, 피부 조직의 시료는 바람직하게는 세이브, 예컨대 더마톰을 이용하여 세이브시킨후 소단편으로 절단시킨다.
이어서 생성된 피부의 절편은 바람직하게는 진피 및 표피로 분리시킨다. 이것은 물질적 및/또는 효소학적 수단에 의해 달성될 수 있다. 예컨대, 이것은 트립신, 예컨대 세포 분리를 유발시키는데 충분한 시간동안, 예컨대 37℃ 의 온도에서 약 30 내지 60 분동안 또는 4℃ 에서 밤새워 EDTA (예컨대 약 0.1%)를 함유하는 트립신 용액 (예컨대 약 0.5%)에서 피부 조직의 시료를 부유시켜 실현시킬 수 있다.
진피를 분리시키고 이어서 표피는 배지에 위치시켜 현탁액을 완성시킨다. 바람직하게는, 현탁액을 완성시키기 위한 배지는 대두 트립신 억제제(SBTI) 의 용액을 함유하며, 이는 트립신을 불활성화시키고 세포의 방출을 유발시키는 통상적으로 약 5 분의 충분한 시간동안 세포와 접촉시킨다. 조직 배양 배지, 바람직하게는 혈청이 제거된 배지 NR-2(EP780496에 기재) 및 필터(예컨대 100 nm 의 필터)를 후속적으로 첨가하여 목적하는 세포, 즉 각질세포를 수득한다.
이어서 단계 (ii) 에서 수득한 생성된 일차 각질세포를 사용하여 무혈청 배지, 바람직하게는 배지 NR-3 (EP780496 에 기재)를 적당한 세포 농도에서, 바람직하게는 약 1.2 x 104세포/cm2의 농도로, 앞서 피복된 배양 플레이트상에 접종시킨다. 그러나, 이러한 세포 농도는 광범위한 범위내에서 변할 수 있다. 배양 플레이트에는 바람직하게는 각질세포의 고착 및 성장을 증가시키는 것으로 입증된 조성물을 함유하는 피복물, 좀더 정확하게는 파이브로넥틴, SAB 및 I 형 콜라겐의 용액이 제공된다.
단계 (iv)에서, 배양 배지는 종종 필요에 따라 최적의 세포 성장을 수득하기위하여 바꿔준다. 바람직하게는, 배지는 약 이틀마다 바꿔준다. 그러나, 이것은 피부 조직의 특정 시료에 좌우되어 변할 수 있다. 거의 총 컨플루언스, 예컨대 약 90% 의 컨플루언스(약 10 내지 14 일후 발생하는 컨플루언스) 을 수득한후 , 각질세포 및 멜라닌세포는 분리시킨다. 이것은 멜라닌세포 및 각질세포에 대하여 어떠한 해로운 영향도 미치지 않고 적당한 세포 분리를 가능케하는 임의의 선택된 수단으로 실현할 수 있다. 예컨대, 이것은 트립신으로 분화 처리하여 실행할 수 있다. 바람직하게는, 멜라닌세포 또는 각질세포는 트립신/EDTA 용액으로 처리한후, 선별 배지로 옮긴다. 각질세포의 경우에는, 세포는 바람직하게는 약 5 내지 10 분동안 트립신/EDTA (0.025 %/0.01 %)의 용액으로 처리한후, 단계 (v) 에서 사용하여 미리 피복된 플레이트 상의 배지 NR-3 에 접종시킨다.
각질세포는 이어서 불사화제로 처리한다. 세포는 또한 불사화를 실행할 때까지, 예컨대 액체 질소에서 냉동시킬 수 있다. 감염 및 불사화는 바람직하게는 둘 이상의 상이한 레트로바이러스의 기능성 종양 형성 유전자, 예컨대 SV40 바이러스의 T-Ag 및 HPV16 의 E6/E7 로 실행할 수 있다. 이러한 유전자의 각각은 독립된 레트로바이러스 구축물, 예컨대 도 1 로 나타내고 Stockshlaeder et el. (GeneBank, accession number M64753; Human Gen. Therapy, 2, 33-39, 1991)에 의해 기술된 레트로바이러스 벡터 pLXSHD+SV40(#328) 및 도 2 에 나타낸 레트로바이러스 벡터 pLXSHD+E6/E7 에 존재할 수 있다
레트로바이러스 벡터 pLXSHD+SV40(#328) 는 다른 서열들중에서 SV40 의 T-Ag 서열, SV40 의 5' 및 3' 장 말단 리피트의 서열, 대장균의 복제, 1 주기의 멀티플클로닝, SV40 의 폴리아데닐화 서열을 가능케하는 pBR322 의 서열을 함유한다.
T 항원을 코딩하는 유전자의 위치에서, 벡터 pLXSHD+E6/E7 는 인간 파필로마 바이러스 16 으로부터 유래된 E6/E7 유전자의 NcoI/CfoI 단편을 함유한다.
불사화후, 이어서 세포는 배양동안 필요한 수로 계대시키고, 이어서 생성된 불사화 세포는 단계 (vii) 동안 증식 배지로 옮긴다. 이러한 전이는 바람직하게는 두번째 계대에서 실행한다. 이 증식 배지는 무혈청 배지, 바람직하게는 배지 NR-2 또는 NR-3 일 수 있다. 불사화 세포는 연속적 방식으로 미리 피복된 배양 플레이트상에서 배양하며, 이 피복물은 파이브로넥틴, SAB 및 I 형 콜라겐의 용액을 함유한다.
증식 배지 (바람직하게는 NR-2) 에서 불사화된 세포의 증식후, 각질세포를 단계 (viii) 에서 정상 및 불사화된 각질세포의 분화를 유발시키는 환경, 바람직하게는 피부에 일반적인 조건의 모조 환경으로 옮겨, 정상의 표면 케라틴화 층을 갖는 층화 및 분극된 상피에서 각질세포의 조직화를 발생시킨다. 이를 위해서, 세포는 약 1.5 mM 의 칼슘, 약 5 ng/ml 의 EGF 및 약 38 ㎍/ml 의 비타민 C를 함유하는 배지 NR-2 와 같은, 고함량의 칼슘을 갖는 무혈청 배지에서 배양시킬 수 있으며, 배양은 액체 공기 인터페이스에서 2 내지 3 주간 플레이트상에서, 예컨대, 12 개의 공동 Falcon No. 3043을 가진 플레이트상에서 실행하며, 각 공동은 인서트 Falcon No. 3180 을 가지며, 여기에서 각질세포는 공기/액체 인터페이스에서 발육된다. 공기는 영양 배지가 제거된 인서트의 내부 공간내 함유된 대기로 구성된다. 액체는 공동에 함유된 영양 배지이고, 배지는 각질세포가 발육되는 인서트의 막을 횡단한다.
본 발명의 불사화 각질세포의 특성과 관련하여, 이것는 완전하게 피부 반응의 면역학적, 약리학적, 광- 및 화학-독성학적 분석에 적합하다. 예컨대, 본 발명의 불사화 각질세포 세포주는 분화된 피부 세포를 필요로 하는 분석, 예컨대 재구성된 피부 조직의 방벽기능 (케라틴화)에 대한 연구, 분화된 각질세포의 신진대사 (지방산의 신진대사, 산화방지제 신진대사) 에 대한 연구, 피부 세포에 대한 자외선의 영향에 대한 연구, 피부 세포에 대한 잠재적 피부 자극 및 피부 감작화제의 영향에 대한 연구, 지질 신진대사, 국부적 치료 및/또는 제노바이오틱제를 가진 배지 (예컨대, 화장오일, 가능한 보호 화장품을 선택하여, 예컨대 광보호제)에 대한 연구, 염증 및 피부 자극에 대한 연구, 등에 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따라 제조된 각질세포 세포주는 잠재적 항암 화합물 및 피부 질환의 치료를 위한 잠재적 화합물을 선택하는데 사용한다. 이것은 통상적으로 세포주는 주어진 기간동안 상기 화합물과 접촉하고, 해로운 영향, 예컨대, 제노톡시서티(genotoxicity)의 측정, DNA-부가물의 형성, 돌원변이유발성, 세포 형질전환 또는 세포독성의 잠재적인 유도의 측정을 의미한다.
더욱이, 본 발명의 불사화 각질세포의 세포주는 돌연변이유발성 검정, 피부 돌연변이제의 선택을 위한 검정, 염색체의 변이제의 확인을 위한 검정, 악성 형질전환에 대한 연구, 세포 생화학 (예컨대 CYP450 의 활성의 검정), 화합물 및 조성물의, 예컨대 염증 및 알러지 반응에 관련된 필수 지방산의 칵테일의 선택에 대한 연구, TNFα를 포함한 콜라게나아제 (염증과 관련) 의 활성 및 인터루킨의 검출에대한 검정에서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 세포주는 스트라툼 코르네움 오르토-각질세포를 형성하는 사실과 관련하여, 이것은 전술한 바와 같은 돌연변이유발성에 대한 연구, 면역학적, 약리학적, 광- 및 화학-독성학적 연구를 위한, 인공 피부의 제조에 특히 매우 적합하다. 이 피부는 본 발명에 따른 각질세포의 상피만으로 구성될 수 있으나, 바람직하게는 또한 예컨대 정상 인간 피부에 대한 더 나은 유사함을 달성하기 위하여 콜라겐, 섬유아세포, 심지어 멜라닌세포를 함유한다.
더욱이, 본 발명의 각질세포 세포주는 재조합 단백질, 예컨대 인간 폴리펩티드 및 단백질을 발현 및 또한 RNA 및 DNA 를 생산할 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 불사화 각질세포 세포주들 중에서, 단지 세포주 DK7-NR 만이 부다페스트 조약하, 예컨대 1998.3.19 일자로 Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M) (25, rue de Docteur Roux, 75724 Paris, France) 에 기탁되었고, 기탁 번호 CNCM I-1996 를 받았다. 이 기탁은 부다페스트 조약하 유효하다. 이러한 세포주의 이용가능성과 관련된 모든 제약은 본 출원 또는 본 출원의 우선권을 주장하는 다른 출원에 대응한 특허의 허여후 최종적으로 해제될 것이다.
본 발명의 다른 특징은 하기의 실시예의 설명으로부터 명맥해질 것이며, 이것들은 본 발명을 설명하기 위하여 주어진 것으로써 본 발명을 제한하지 않는다. 다른 언급이 없는 경우는, 세포의 조작, 벡터의 제조, 세포의 형질전환 및 모든 기타 기술적 공정은 문헌 (Sambrook et al. Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989)에 기술된 프로토콜에 따라 수행한다.
실시예 1 : 세포주의 제조 및 특징
가슴 피부 조직을 취한다. 표피 및 진피 부분을 분리시킨후, 진피를 0.2 x 0.2 mm 의 작은 조각으로 절단하고, 혈청이 있는 6 cm 의 배양 플레이트상에 고정시킨다. Dulbecco (DMEM, 10 % 의 태아 송아지 혈청) 의 최소필수배지를 2 내지 4 시간후 첨가한다. 이 이식물의 배양물을 이어서 섬유아세포의 과성장이 육안으로 판별될 때까지 인큐베이션시킨다. 컨플루언트 섬유아세포의 배양물은 분리 및 증식시켜 냉동 리서브 배양물을 수득한다.
배양 박스에 기관지 세포에 대해 앞서 기재된 "칵테일" 피복물로 연속적인 방식으로 피복된 일차 세포를 접종시킨다.(Lechner et al., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-49 (1985)). 거의 완전한 컨플루언스, 예컨대 약 90 % 의 컨플루언스를 달성한후 (이것은 통상적으로 약 10 내지 14 일후 발생한다), 각질세포 및 멜라닌세포를 분리시킨다. 이를 위하여, 배양물은 트립신/EDTA (0.025 %/O.Ol %)의 용액으로 5 분간 처리하고, 이어서 각질세포로부터 처음에 분리된 멜라닌세포를 수확한다. 이어서 일차 각질세포를 원하는 수의 세포까지 혈청없이 배지 NR-3 에서 기술된 피복 배양 박스 (배지 NR-3 는 멜라닌세포와 비교하여 각질세포의 성장에 우호적이다) 를 이용하여 배양시킨다.
이어서, 바이러스는 세포주에 캡슐화후에 수거하고, 10% 소태아 혈청을 가진 DMEM 배지에서 성장시키는 조건부로, Pfeifer et al. (Meth. Cell Sci., 17, 83-89, 1995) 의 프로토콜에 따라 캡슐화 "패키징 세포주 3T3-섬유아세포"의 세포에 플라스미드 pLXSHD+SV40(#328) 및 pLXSHD+E6/E7 를 트랜스펙션시킨다. 이어서, 각질세포는 바이러스로 감염시켜 불사화를 유발시킨다. 감염동안, Pfeifer et al., 의 문헌에 기재되어 있는 무혈청 PC-1 배지를 또한 사용한다.
불사화후, 불사화된 각질세포는 앞서 피복된 배양 박스를 이용하여 증식 배지 NR-2 또는 NR-3 에 옮긴다. 세포를 원하는 세포수까지 증식시킨후, 이 세포를 정상 및 불사화 각질세포 (NR-2) 의 배양에 적합한 분화 배지로 옮긴다.
불사화 각질세포는 배양물에서 상승된 계대수에서 향상된 세포 성장을 나타냄을 볼 수 있으며, 이는 EP780496 의 세포주에 대하여 기재된 것과 비교될 수 있다.
CYP450, lAl, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 및 2D6 의 발현은 실온에서 (mRNA 발현) DNA 폴리머라아제 사슬 반응으로 정상 및 불사화 각질세포로 구성된 피부 세포에서 분석하였다. 불사화 각질세포에 의해 발현된 CYP450 의 프로필은 특히 정상 각질세포의 프로필과 유사, 심지어는 동일하다.
세포주는 심지어 상승된 계대수에서 조차 비 불사화 세포에 반응하는 것과 동일한 방식으로 벤즈(아)피렌으로 구성된 CYP450 의 유도화제에 반응한다.
분화 마커는 T-Ag, 인볼루크린, 필라그린, 로리크린, 비멘틴 및 케라틴 K4, K7, K8, K10/1, K13, K14, K17, K18 및 K19 에 대한 특정 항체를 이용하여 분석한다. 분화 능력의 실증에 대한 최상의 능력은 세포 주 DK7-NR 에 대하여 실증될 수 있다.
글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 는 웨스턴-블롯 및 노던-블롯으로 분석한다. 각질세포의 모든 세포주는 GST7π에 대한 메신저 RNA 를 강력하게 발현시킨다. 세포주에서 GSTα, GSTμ및 GSTπ에 대한 노출의 프로필은 정상 각질세포의 프로필과 유사하다.
각질세포에 첨가된 AGE 의 불포화 및 신장을 분석 및 비교하기 위하여, 불사화된 각질세포 (및 정상 각질세포) 는 리놀레산 (LA, 15 μmole) 및 리놀렌산 (LN, 15 μmole) 으로 처리한다. 이러한 실험을 위하여, AEG 가 결핍된 배지 NR-2 (Biofluids Inc.)을 사용한다. 세포 배양물은 컨플루언스에 도달한후 처리하고 , 배지로부터 고함량의 칼슘 (1.5mM) 를 함유하는 배지 NR-2 로 옮긴다. 이 세포를 4 일간 AGEs (2 일후 갱신) 로 처리한다. AGE 의 분석은 CCM (박층 크로마토그래피)에 의한 인지질의 추출 및 분리로 실현되며, 지방산의 메틸 에스테르의 정량화는 CGL (크로마토그래피 가스-액체)로 실행한다. LA (20:4n-6 및 22:4n-6) 및 LN (20:5n-3, 22:5n-3 및 22:6n-3)의 불포화 및 신장의 형성은 볼 수 있다. 신진대사 프로필은 정상 각질세포로 관찰시의 프로필과 일치한다.
모든 세포주는 이배성 세포의 간극에서 염색체의 총수의 대부분을 갖는 하이포이배성이다. 분석된 세포는 별개로 다른 세포는 배양물에서 검출되지 않는다. 이러한 결과는 세포주의 순도 및 다른원으로부터 발생하는 임의의 오염원의 부재를 확인시켜준다.
불사화 각질세포의 종양형성성은 털을 깎은 마우스에 피하 주사 (1-2 106 각질세포)하여 측정한다. 시험된 각질세포 및 특히 세포주 DK-7-NR 의 세포주는 털을 깎은 마우스에 종양을 형성하지 않는다.
실시예 2: 상피의 제조
실시예 1 에 따른 세포주의 750,000 세포를 함유하는 배지 NR2 를 제조하고 , 이 배지의 0.5ml 를 인서트 Falcon No. 3180 에 넣고, 이것을 이미 2 ml 의 새로운 배지 NR-2 를 함유하는 플레이트 Falcon No. 3043 의 동공에 위치시키고, 각질세포는 각질세포의 성장에 우호적인 조건하에서 2 일 동안 배양시킨다. 3 일째, 인서트내 함유된 배지를 제거하고 세포는 자유공기에 방치시킨다. 동공내 함유된 배지는 EGF (5ng/ml), 비타민 C (38㎍/ml) 및 CaCl2(1.5mM) 으로 보충된 배지 NR-2 로 매 2 일마다 주기적으로 바꿔준다. 2 내지 3 주후, 배지내 공기-액체 인터페이스에서, 상기와 같은 방식으로 형성된 상피를 수거하고, 피크산으로 고정시키고 모르폴로지를 분석한다.
결과는 각질세포 세포주, 특히, 세포주 DK7-NR 는 층화 및 분극된 상피를 형성하고, 정상 세포와 동일한 입방형 모르폴로지를 가자는 세포를 포함하는 통상적인 소위 스트라툼 바세일을 형성함을 보여준다. 스트라툼 코르네움은 모르폴로지 오르토-각질세포를 나타낸다. 즉, 이것은 핵을 함유하는 세포가 결핍되어 있다. 오르토-각질세포 세포 층의 형성은 현재까지 기타 공지된 불사화 세포주로는 불가능하였다. 예컨대, 동일한 조건하에서, 세포주 DK2-NR (EP780496) 는 스트라툼 코르네움 파라-각질세포를 형성한다. 즉, 코르니화 세포의 층은 여전히 핵을 갖는 세포를 함유한다. 단지 스트라툼 코르네움의 모르폴로지 오르토-각질세포만이 인간피부의 정상 상황을 반영한다. 사실, 스트라툼 코르네움 파라-각질세포는 건선 또는 종양과 같은 질환을 초래하는 표피의 비정상 비대를 특징으로 한다.
실시예 3 : 자극 테스트
실시예 1 에서 수득한 세포주, 특히 세포주 DK7-NR 를 배지 NR-2 에서 배양시킨다. PMA (포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트) 및 UV-B (자외선 B 조사) 으로 구성된 피부 자극제로 처리후 "스트레스 유전자" TNFα(종양 괴사 인자 알파) 의 도입은 노던 방법 및 생물학적 검정으로 분석한다. 결과는 세포주 및 특히 세포주 DK7-NR 은 PMA 및 UV-B 에 반응하고, 상승된 계대수후에서 조차 단백질을 발현시킴을 보여준다.
실시예 4: 인공피부의 구축
인서트 Falcon No. 3180 의 막은 히알론산 (Hyaff 11)의 벤질산 에스테르로 치환시킨다. 인서트의 바닥에는 일차 인간 섬유아세포(0.1 X 106세포의 0.2 ml 배지)를 접종하고, 반응 30 분후, 인서트에는 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 배지 DMEM 를 충진시키고, 인큐베이션은 수 일동안 5% 의 이산화탄소를 함유하는 분위기하에서 37℃ 에서 실행하고, 인서트를 비우고, 세포주 DK7-NR의 750,000 세포를 함유하는 새로운 배지 NR-2 0.5ml 를 공급하고, 인서트는 이미 2 ml 의 새로운 배지 NR-2 를 함유하는 플레이트 Falcon-No. 3043 에 위치시키고, 세포를 각질세포의 성장에 우호적인 조건하에서 2 일동안 배양시킨다. 3 일째, 인서트에 함유된 배지를 제거하고 세포는 자유공기에 방치시킨다. 동공내 배지는 EGF(5ng/ml), 비타민 C (38㎍/ml) 및 CaCl2(1.5 mM) 으로 보충된 배지 NR-2 로 매 2 일마다 주기적으로 바꿔준다. 공기-액체 인터페이스에서 배양 2 내지 3 주후, 정상 피부의 특징을 나타내는 인공 피부의 형성을 관찰할 수 있다.
Claims (15)
- 하기를 특징으로 하는, 레트로바이러스 기원의 하나이상의 기능성 종양 유전자에 의해 불사화된 인간 각질세포 세포주 :(1) 비 종양형성,(2) 배양에서 계대수의 상승후에서 조차 정상의 분화된 각질세포에 의해 발현되는 단백질 및 효소를 분화 및 발현시키는 능력의 보존,(3) 영양 세포의 층 없이 무혈청 배지에서 유기-전형적 배양물에서 배양하는 경우, 스트라툼 코르네움 오르토-각질세포를 갖는 층화 및 분극된 상피를 형성.
- 제 1 항에 있어서, 2 개 이상의 상이한 레트로바이러스의 레트로바이러스 기원의 기능성 종양 유전자를 이용하여 불사화된 인간 각질세포 세포주.
- 제 2 항에 있어서, 기능성 종양 유전자가 SV 40 바이러스 및 인간 파필로마 바이러스 16 으로부터 유래하는 인간 각질세포 세포주.
- 제 3 항에 있어서, 각각의 기능성 종양 유전자는 독립적인 레트로바이러스 구축물내에 포함되는 것을 특징으로 하는 인간 각질세포 세포주.
- 제 4 항에 있어서, 세포주는 부다페스트 조약에 따라 기탁번호 CNCM I-1996을 갖는 세포주 DK7-NR 인 것을 특징으로 하는 인간 각질세포 세포주.
- 하기 단계들로 구성된 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포를 수득하기 위한 개선된 인간 피부 세포의 불사화 방법 :(i) 인간 피부의 시료 분리;(ii) 실험관 배양용 피부 시료 제조;(iii) 이렇게 제조된 인간 피부의 시료로부터 각질세포의 수득 및 세포의 고정 및 성장을 촉진하는, 파이브로넥틴, SAB 및 I 형 콜라겐으로 구성된 피복물이 제공되어 있는 배양 플레이트상의 무혈청 성장배지에 상기 각질세포의 접종;(iv) 배양물내에서 세포의 최적의 컨플루언트 성장을 얻기에 충분한 방식으로 배지를 대체 (플레이트의 피복물은 연속방식으로 유지);(v) 유사한 방식으로 앞서 피복된 배양 플레이트상의 무혈청 선별 배지에 각질세포로 옮김;(vi) 둘 이상의 상이한 레트로바이러스의 기능성 종양 유전자를 이용한 각질세포의 감염;(vii) 유사한 방식으로 피복된 배양 플레이트상에서 불사화된 각질세포의 증식에 적합한 증식배지로 생성된 불사화 각질세포를 옮김;(viii) 유사한 방식으로 피복된 배양 박스상의 고함량의 칼슘을 갖는 분화 배지로 생성된 증식 각질세포를 옮김.
- 제 6 항에 있어서, 기능성 종양 유전자는 SV 40 바이러스 및 인간 파필로마 바이러스 16 으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 각각의 기능성 종양 유전자는 독립적인 레트로바이러스 구축물내에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 사용하는 레트로바이러스 구축물은 벡터 pLXSHD+SV40(#328) 및 pLXSHD+E6/E7 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 단계 (iii), (v) 또는 (vii) 내 무혈청 배지는 배지 NR-3 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 단계 (viii) 내 분화 배지는 1.5mM 이상의 칼슘함량을 갖는 개질된 NR-2 배지인 것을 특징으로하는 방법.
- 피부 반응의 면역학적,약리학적, 광- 및 화학-독성학적 분석 및 이질성 유전자의 발현을 위한 제 1 항에 따른 각질세포의 용도.
- 제 12 항에 있어서, 부다페스트 조약에 따라 기탁번호 CNCM I-1996 을 갖는 세포주 DK7-NR 을 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항에 따른 각질세포 세포주를 함유하는 것을 특징으로 하는 인공피부.
- 제 14 항에 있어서, 부다페스트 조약에 따라 기탁번호 CNCM I-1996 를 갖는 세포주 DK7-NR 를 함유하는 것을 특징으로 하는 인공피부.
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