LV13763B - Paņēmiens autologu cilmes šūnu populācijas iegūšanai no pieauguša cilvēka ādas dermas audiem - Google Patents

Description

Tehnikas joma

Izgudrojums attiecas uz cilmes šūnu iegūšanu, pavairošanu un raksturošanu, konkrēti uz autologu multipotentu cilmes šūnu iegūšanu no cilvēka ādas dermas, iegūto šūnu pavairošanu un to kvalitātes raksturošanu.

Tehnikas līmenis

Viena no aktuālākajām sociālekomomiskajām problēmām attīstītajās valstīs ir vispārēja iedzīvotāju populācijas novecošana. Kā nozīmīgākās veselības problēmas saistītas ar populācijas novecošanu attīstītajās valstīs ir jāmin sirds- asinsvadu, autoimūnās un neirodeģenratīvās (Alzheimera, Parkinsona) slimības. Šīm patoloģijām nav efektīvu ārstniecības metožu, taču var izmantot cilmes šūnas, lai aizvietotu bojātas šūnas cilvēka organismā. Pēdējos gados cilmes šūnu pētījumi parāda, ka līdz ar zināšanu uzkrāšanos un praktiski orientētu metožu attīstību ir iespējama cilmes šūnu ieviešana medicīnā. Līdz šim veiktie klīniskie izmēģinājumi ar cilmes šūnām ir devuši daudzsološus rezultātus tādu smagu patoloģiju gadījumos kā miokarda infarkts, sirds un periferiālās išēmiskās slimības, ar novecošanu saistītas izmaiņas kaulos un locītavās, asinsvadu sistēmas funkciju pasliktināšanās, autoimūnas saslimšanas, retinopātija, neirodeģeneratīvās slimības u.c.

Cilmes šūnu unikālās spējas transformēties specializētu šūnu veidos tiek izmantota, lai “aizvietotu” bojātas vai deģenerējošās šūnas cilvēka organismā, kā ari stimulēt funkcionāli nepilnvērtīgu šūnu atlabšanu audos/orgānos. Cilvēka audos atrodamās cilmes šūnas (autologās cilmes šūnas) ir pamats orgānu homeostāzei un pašatjaunošanas procesam. Saskaņā ar cilmes šūnu definīciju, tām ir spēja pašatjaunoties orgāna dzīves garumā un tajā pašā laikā veidot augsti diferencētas meitasšūnu populācijas, kuras nodrošina orgāna homeostāzi un funkcionalitāti. Lai gan cilmes šūnu skaits audos ir neliels (to blīvums variē atkarībā no audu tipa nepārsniedzot 1 uz 10 000 šūnām, bet parasti ir daudz zemāks), tās piesaista lielu uzmanību sakarā iespējām, ko sniegtu to potenciālais pielietojums biomedicīnā. Autologām cilmes šūnām ir būtiskas praktiskā pielietojuma priekšrocībasnav audu nesaderības, kā arī bioētikas jautājumi ir reducēti līdz faktam, ka paša organisma šūnas tiek izolētas un nepieciešamības gadījumā, ja tas ir tehnoloģiski iespējami, pavairotas in vitro apstākļos. Autologās cilmes šūnas var tikt klasificētas atkarībā no: audu tipa, no kura tās tiek iegūtas; no meitšūnu diferenciācijas procesa; no gēnu kopuma, ko tās ekspresē. Salīdzinoši nesen tika atklāts, ka vienā audu tipā var būt vairāk nekā viena veida cilmes šūnas. Tā, piemēram, zinātniskie pētījumi liek domāt, ka ādā un tās derivātos ir vismaz trīs viedu cilmes šūnas.

Ņemot vērā to, ka ada ir visvieglāk pieejamais un vislielākais cilvēka orgāns (pieaugušam cilvēkam- no 1.5 līdz 2 m platībā), tai ir būtisks autologu cilmes šūnu avota pielietojuma potenciāls.

Ir zināms mezenhimālo cilmes šūnu audzēšanas paņēmiens (W02007069813 Methods for culturing mesenchymal stem celi and compositions comprising mesenchymal stem celi for reparing skin defects, publ. 21.06.2007). Saskaņā ar šo paņēmienu mezenhimālo cilmes šūnu audzēšanai izmanto zemādas taukus.

Ir zināma metode multipotentu cilmes šūnu iegūšanai no cilvēka ādas derivāta - mata saknes (W02006110806 Multipotent adult stem celis, publ. 19.10.2006.). Šajā patentpieteikumā ir aprakstīta cilmes šūnu iegūšanas un pavairošanas procedūra, kas ietver šūnu suspensijas formēšanu, šūnu audzēšanu apstākļos, kuros multipotentas cilmes šūnas aug un pavairojas adherenti, kā arī multipotento cilmes šūnu identificēšanu un atdalīšanu no audzēšanas kultūras. Minētajā pieteikumā ir izpaustas arī šūnu augšanas vides un augšanas hormoni/piedevas. Tiek piedāvāta embrionālo cilmes šūnu (hESC) augšanas vide, kas sastāv no DMEM/F-12 vides - aptuveni 80% un embrionālo cilmes šūnu seruma aizvietotāja - aptuveni 20%, kā arī aptuveni 200 niM L-glutamīna, aptuveni 0.1 mM [betaj-merkaptoetanola, aptuveni 1% aizvietojamo aminoskābju maisījuma un aptuveni 4 ng/ml bFGF. Iegūtā cilmes šūnu populācija raksturota molekulāri bioloģiski, pievienots cilmes šūnu raksturojošo gēnu ekspresijas profils. Pieteikumā W02006110806 ir aprakstīta metode tādu cilmes šūnu iegūšanai no matu, kuras ekspresē marķierus Nanog, Oct4 un Nestin un diferenciācijas eksperimentos spēj ekpresēt 9 dažādu šūnu līniju marķierus, tādējādi apliecinot to cilmes potenciālu.

Ir zināma metode cilmes šūnu iegūšanai no cilvēka ādas dermas slāņa šūnām fībroblastiem to dediferencējot ar šūnu vides piedevām (US2003185805 Use of stem celis derived from dermal skin, publ. 02.10.2003.). Tiek piedāvāta iegūto šūnu pielietošana bojātu audu reģenerācijas veicināšanai.

Ir zināma metode cilmes šūnu izdalīšanai no ādā esošu matu saknēm un ādas dermas daļas (EP 1718732 Methods of making and using skin-derived stem celis, publ. 08.11.2006.). Ar zināmu paņēmienu iegūtās ādas cilmes šūnas spēj veidot ādas un matu, gan ari citus šūnu veidus.

Ir zināms multipotentu cilmes šūnu izolēšanas no pieauguša zīdītāja ādas dermas paņēmiens (Jean G. Toma et al. Isolation of multipotent adult stem celis from the dermis of mammalian skin, Nature Celi Biology, vol. 3, september 2001, p. 778 - 784).

Zināmu paņēmienu trūkums ir problemātisks to praktiskais pielietojums medicīnas metožu attīstībai atbilstoši Eiropas Savienības normatīvo aktu prasībām. Galvenie cēloņi ir komplicēti šūnu iegūšanas un/vai pavairošanas protokoli to ieviešanai medicīnas tehnoloģijās, kā ari relatīvi neliels iegūto cilmes šūnu skaits metodēs, kuras ir balstītas uz šūnu iegūšanu no matu saknes audiem. Pavairošanas protokoliem šūnu pielietojumam medicīnā ir nepieciešami noteikti reaģenti, kurus ir iespējams ražot atbilstoši normatīvos aktos noteiktām prasībām, t.i. ir jābūt attiecīgi sertificētiem produktiem un to piegādātājiem. Piedāvātais izgudrojums ļauj izmantot vienkāršāku un ekonomiski izdevīgāku šūnu pavairošanas metodi ar reaģentiem, kuri atbilst klīniskā pielietojuma prasībām. Piedāvātais izgudrojums dod iespēju iegūt autologas cilmes šūnas daudzumā, kurš ir adekvāts terapeitiskā pielietojuma vajadzībām, kas ir balstīts uz dotā brīža zināšanām un klīnisko rezultātu izvērtējumu.

Izgudrojuma izpaušana

Izgudrojuma objekts ir medicīnā pielietojamu autologu multipotentu cilmes šūnu iegūšana no cilvēka ādas dermas, iegūto šūnu pavairošana un to kvalitātes raksturošana.

No cilvēka ādas dermas audiem tiek iegūtas cilmes šūnu populācijas ar multipotences īpašībām - in vitro diferenciācijas potenciāls neironālo audu un mezenhimālo audu (osteoblastu, hondrocītu un adipocītu) šūnu veidošanā. Katra individuālā ādas donora cilmes šūnas attiecīgi tiek sauktas par autologām multipotentām cilmes šūnām. Piedāvātais paņēmiens multipotento cilmes šūnu populācijas iegūšanai ietver:

(a) cilmes šūnu, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, audzēšanu apstākļos, kuros multipotentas cilmes šūnas (vismaz 10% šūnu) aug un pavairojas adherenti;

(b) šūnu, kas nav multipotentas cilmes šūnas (kuras nokļūst suspensijā) atdalīšanu. Optimālie apstākļi, kuros multipotentas cilmes šūnas (vismaz 10% šūnu) aug un pavairojas adherenti ir audu vidē, kuru veido kultūru barotnes DMEM (ar glikozi 4.5 g/L, HEPES 25mM, bez piruvāta) vai DMEM un F-12 tilpuma attiecībās 3:1, ar 10 % FCS, penicilīna un streptomicīna (100 u/ml un 100 pg/ml attiecīgi) ar vai bez 4 ng/ml FGF-2 piedevām.

Cilmes šūnas, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, diferenciācijas rezultāta spēj veidot neironiem, osteocītiem, hondrocītiem un adipocītiem atbilstošas šūnas.

Piedāvātais iegūto autologo multipotento cilmes šūnu kvalitātes raksturošanas paņēmiens raksturigs ar to, ka vismaz 95% cilmes šūnām, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, ir sekojoši virsmas marķieri: CD73, CD90 un CD105. Marķieri ir nosākami ar FACS metodi. Šāda marķieru izvēli rekomendē Starptautiska cilmes šūnu pētniecības biedrības (ISSCR- International Society for Stem Celi Reserach) ekspertu ziņojumi.

Autologo multipotento cilmes šūnu multipotenci novērtē veicot neironālo audu un mezenhimālo (osteo, hondro un adipozo) audu diferenciācijas eksperimentu šūnām. Tiek izmantoti sekojoši pozitīvie marķieri: nestīns, tubulins bill, GFAP un OC4 (visi neironu); FABP4 (adipozo); aggrecan (hondro) un osteocalcin (osteo). Šos marķierus nosaka ar imunohistoķīmiju, izmantojot specifiskas monoklonālās antivielas. Papildus tiek izmantotas histoloģiskās krāsošanas metodes: Oil Red O™ (adipozo) un Alcian Blue™ (hondro).

Tālāk izgudrojuma būtība un tā īstenošana tiek paskaidrota ar piemēriem.

Izgudrojuma realizācijas piemēri

1. piemērs

Autologu multipotentu cilmes šūnu saskaņā ar piedāvāto izgudrojumu tika iegūti izmantojot cilvēka ādas dermu. Cilvēka ādas paraugi (l-2cm²), kas iegūti no pēcoperāciju materiāla, saskaņā ar Latvijas Centrālās Ētikas komisijas atļauju, tika ievietoti 50ml centrifugēšanas stobriņā ar sterilu PBS šķīdumu, kam pievienoja fungizonu (0,5pg/ml) un penicilīna, streptomicīna maisījumu (lOOu/ml un 100ņg/ml), un uzglabāti +4°C. Pēc ādas parauga transportēšanas uz laboratoriju, to izņem no transportēšanas šķīduma un ievieto Petri traukā. Ar sterilu skalpeli ādas paraugu sagriež O,5xO,5cm gabaliņos un ievieto 15ml stobriņā ar dispāzi (0,5mg/ml) PBS šķīdumā. Paraugu inkubē dispāzes šķīdumā 2h pie o

C. Laminārā paraugu izņem no dispāzes šķīduma un ievieto Petri platē ar PBS šķīdumu. Ar sterilu pinceti no dermas atdala epidermu. Dermu sagriež mazos gabaliņos un apstrādā ar kollagenāzes XI (50U/ml) šķīdumu barotnē DMEM ar 10% teļa seruma piedevas 2-4h 37 C temperatūrā. Epidermu apstrādā ar 0,25% tripsīna/EDTA maisījumu 2min 37 C temperatūrā, reakciju apstādina ar lml teļa seruma. Epidermas šūnas centrifugē pie 1200 rpm, atsūc virsnogulšņu šķidrumu. Epidermas šūnas izsēj 25cm² šūnu kultūru traukos barotnē DMEM/F12 3:1 ar 10% teļa seruma un antibiotikām penicilīnu un streptomicīnu (lOOu/ml un 100ņg/ml). Dermas apstrādes reakcijas maisījumu filtrē caur 70μ neilona sietu un centrifugē 10 min pie 1500 rpm. Virsnogulšņu šķidrumu atsūc un nogulsnes skalo ar lOml PBS un atkārtoti centrifugē 5 min pie 1500 rpm. Pēc skalošanas šūnām pievieno seruma audu kultūru barotni - DMEM/F12 (attiecībā 3:1) ar 10% teļa serumu un penicilīnu un streptomicīnu (lOOu/ml un 100pg/ml). Šūnām sasniedzot 90% konfluenci, tās tripsinizē un sagatavo audzēšanai - pārsēj 75 cm flakonā, pievienojot 10m! izvēlētās barotnes.

.piemērs

Šūnu tripsinizēšana. Barotnes, tripsīnu un sāļu šķīdumus sasilda ūdens termostatā līdz 37°C. Šūnu flakonu izņem no CO² inkubatora. No šūnu kultivēšanas flakona ar sterilu pipeti atsūc barotni. Šūnas skalo ar sterilu HBSS (T 25 cm² ar 5 ml; T 75 cm² ar 10 ml). Atsūc HBSS un ienes 0,25% tripsīnu-EDTA šādā tilpumā: T 25 cm² - 1 ml, T 75 cm² - 3 ml. Aizskrūvē flakonu un ieliek 37°C temperatūrā uz 2min. Ar mikroskopa palīdzību pārbauda, vai šūnas ir atdalījušās no flakona virsmas. Reakciju apstādina ar teļa serumu, pievienojot norādītajā daudzumā T 25 cm³ - 1 ml, T 75 cm³: 3 ml. Pielej sterilu HBSS, lai kopējais daudzums būtu lOml. Ar sterilu sēro loģisko pipeti paņem vienu pilienu no šūnu suspensijas un atšķaida ar Tripānzilā krāsvielu attiecībā 1:1, pēc tam iepilda šūnu skaitīšanas kamerā (šūnas skaita Gorjajeva kamerā 25 lauciņos, kas atbilst lmm³). Šūnu suspensiju pārnes uz 15ml centrifūgas stobriņiem un centrifuge 5min pie 1200apgr. Virsnogulšņu šķidrumu atsūc ar sterilu pipeti. Nogulsnes atšķaida līdz protokolā paredzētajam daudzumam uz lml. Sūnu skaitu aprēķina pēc formulas X(šūnu skaits imi)⁼ šūnu skaits 25 lauciņos x 10 000.

3. piemērs

Ādas cilmes šūnu audzēšana in vitro. Šūnu suspensiju (pēc izolēšanas no ādas parauga vai tripsinizēšanas) ievieto 25cm² šūnu kultūru traukos un/vai 6-lauciņu platēs 37°C inkubatorā ar 90% mitruma un 5% CO² izvēlētajā barotnē (pārsēj 75 cm² flakonā, pievienojot 10m! barotnes):

barotnē ar serumu - DMEM un F12 tilpuma attiecībā 3:1 ar 10% teļa serumu un penicilīnu un streptomicīnu (lOOu/ml un 100pg/ml), vai barotnē FEB - DMEM un F12 tilpuma attiecībā 3:1 ar 2% seruma aizvietotāja B27, penicilīnu un streptomicīnu (lOOu/ml un 100pg/ml) un augšanas faktoriem: bazālais fibroblastu augšanas faktors (bFGF; 40ng/ml) un epidermas augšanas faktors (EGF, 20ng/ml), vai barotnē LIF - DMEM un F12 tilpuma attiecībā 3:1 ar 2% seruma aizvietotāja B27, antibiotikām un augšanas faktoriem bFGF (40ng/ml) un EGF (20ng/ml) un leikēmijas inhibīcijas faktoru (lOng/ml).

4. piemērs

Proliferācija un imunokrāsošana. Ādas paraugus (l-2cm²), kas iegūti pēc biopsijas vai no pēcoperāciju materiāla, saskaņā ar Latvijas Centrālās Ētikas komisijas atļauju, ievieto 50ml centrifugēšanas stobriņā ar sterilu PBS šķīdumu, kam pievieno fungizonu (0,5pg/ml) un penicilīna, streptomicīna maisījumu (lOOu/ml un 100pg/ml), un uzglabā +4°C. Cilvēka ādas biopsijas vai pēc plastisko operāciju materiāls tiek atbrīvots no zemādas taukiem un saistaudiem. Ādu sadala 1-1.5 cm² gabaliņos un inkubē 50mg/ml Dispāze II (Boehinger Mannheim) DMEM barotnē ar 20 mM Hepes uz ledus 18-22 stundas. Ar pinceti noņem epidermu un visu gabaliņu fiksē formalīnā pH 7.2 (Sigma) uz 2 stundām istabas temperatūrā. Fiksēts epidermas slānis var tik uzglabāts PBS ar 0.2% nātrija azīda ledusskapī 4°C līdz 8 nedēļām, ja šūnu krāsošanu nevar paveikt ātrāk.

Claims (6)

1. Pretenzijas

   1. Paņēmiens multipotento cilmes šūnu populācijas iegūšanai, raksturīgs ar to, ka ietver:

   (a) cilmes šūnu, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, audzēšanu 5 apstākļos, kuros multipotentas cilmes šūnas (vismaz 10% šūnu) aug un pavairojas adherenti;

   (b) šūnu, kuras nav multipotentas cilmes šūnas, atdalīšanu.
2. 2. Paņēmiens saskaņā ar 1 .pretenziju, raksturīgs ar to, ka cilmes šūnu, kas izolētas no

   10 pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, audzēšanu veic vidē, kuru veido kultūru barotnes DMEM vai DMEM un F-12 tilpuma attiecībās 3:1, ar 10% teļa serumu (FCS) un penicilīnu un streptomicīnu (lOOu/ml un 100pg/ml) ar vai bez 4 ng/ml FGF-2 piedevām.
3. 3. Paņēmiens saskaņā ar 1. vai 2. pretenziju, raksturīgs ar to, ka vismaz 95% cilmes

   15 šūnām, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, ir sekojoši virsmas marķieri: CD73, CD90 un CD105.
4. 4. Paņēmiens saskaņā ar 1 .pretenziju, raksturīgs ar to, ka cilmes šūnas, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, diferenciācijas rezultāta spēj veidot neironiem

   20 atbilstošas šūnas.
5. 5. Paņēmiens saskaņā ar 1 .pretenziju, raksturīgs ar to, ka cilmes šūnas, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, diferenciācijas rezultāta spēj veidot osteocītiem atbilstošas šūnas.
6. 6. Paņēmiens saskaņā ar 1 .pretenziju, raksturīgs ar to, ka cilmes šūnas, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, diferenciācijas rezultāta spēj veidot hondrocītiem atbilstošas šūnas.

   30 7. Paņēmiens saskaņā ar 1 .pretenziju, raksturīgs ar to, ka cilmes šūnas, kas izolētas no pieauguša cilvēka ādas dermas vai tās daļas, diferenciācijas rezultāta spēj veidot adipocītiem atbilstošas šūnas.