DE69634363T2 - Vorläufer von normalen neuralen epithelzellen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Isolieren von normalen nichtmenschlichen neuralen Epithelvorläuferzellen, die zu Zellreplikation, -wachstum und langfristigem Kultivieren in vitro in der Lage sind, während sie ihre Fähigkeit zur Differenzierung in vitro und in vivo aufrechterhalten. Die Verfahren zum Isolieren des normalen neuralen Epithelvorläuferzelltyps der vorliegenden Erfindung resultieren in einer im Wesentlichen homogenen Population von nichttransformierten, nichtonkogenen neuralen Epithelvorläuferzellen. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls normale neurale Epithelvorläuferzelllinien, die von einem nichtmenschlichen Säugetier stammen. Die isolierten neuralen Epithelvorläuferzellen der Erfindung können unter Einsatz der hierin beschriebenen Verfahren in Kultur aufrechterhalten und expandiert werden.
  • Beschreibung von Offenbarungen auf dem Gebiet der Erfindung
  • Das Zentralnervensystem bei Säugetieren ist entwicklungstechnisch gesehen von Neuroepithelzellen im Neuralrohr abgeleitet (M. Murphy et al., J. Neurosci. Res. 25, 463–475 (1990); siehe allgemein "Developmental Biology", 4. Auflage; S. Gilbert, Sinauer Associates, Inc. (1994); "Post Implantation Mammalian Embryos: A Practical Approach"; A. J. Copp & D. L. Cockroft (Hrsg.), Oxford University Press, New York (1990)). In vivo wachsen und differenzieren sich Neuroepithelzellen zu verschiedenen Typen von Neuronen- und Gliazellen als Reaktion auf bisher nicht identifizierte Umweltfaktoren. Die Fähigkeit, bestimmte neurale Vorläuferzellen in vitro zu isolieren und aufrechtzuerhalten ist maßgeblich für die Identifikation dieser Faktoren. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, nichtonkogene neurale Zelltypen in frühen embryonalen Entwicklungsphasen zu isolieren und expandieren, maßgeblich für den Erfolg von zellbasierten Therapien, umfassend intrazerebrale Transplantation und Gentransfer (Gage et al., TINS 14, 8328–8333 (1991); Mucke & Rockenstein, Transgene 1, 3–9 (1993); Jiao et al., Brain Res. 575, 143–147 (1992)).
  • Allgemein gesagt gibt es zwei Typen von Zellkulturen zur Aufrechterhaltung und Charakterisierung von Zellen des Säugetier-Nervensystems (J. E. Bottenstein, "Growth and Differentiation of Neural Cells in Defined Media", Cell Culture in the Neurosciences, Bottenstein & Sato (Hrsg.), 3–43 (1985)). Primärkultur umfasst Gewebeexplantat und darauf folgende Kultur entweder der dispergierten Zellen oder des explantierten Gewebes für die finite Lebensdauer der dispergierten Zellen oder des Gewebes. Nach mehreren Tagen in Kultur differenzieren sich die Zellen im Allgemeinen spontan in eine Vielzahl von neuronalen Zelltypen (Cattaneo & McKay, Nature 347, 762–765 (1990)). Der primäre Vorteil von dissoziierten Zellkulturen ist, dass einzelne Zelltypen als Entsprechungen für tatsächliche In-vivo-Zelltypen untersucht werden können ("Developmental Biology of Cultured Nerve, Muscle, and Glia", David Shubert, John Wiley & Sons, Inc. (1984)). Unter Verwendung von Primärkultur können heterogene Zellproben isoliert werden, um repräsentative Zellpopulationen uniformer Phänotypen zu erhalten. Zahlreiche Populationen von Zellen, die aus explantiertem Gewebe gewonnen sind, können sich daher nur bis zu einer begrenzten Anzahl an Wiederholungen teilen, was möglicherweise auf In-vitro-Alterung (L. E. Orgel, Nature 243, 441–445 (1973)) oder auf ungeeignete Kulturbedingungen zurückzuführen ist.
  • Kontinuierliche Zellkultur stellt eine zweite Möglichkeit von In-vitro-Zellkultivierung von Zellen des im Entwicklungsstadium befindlichen Säugetier-Zentralnervensystems dar (J. Bottenstein (1985), s.o.). Kontinuierliche Zellkultivierung birgt den Vorteil von langfristiger Zellkultur und Lagerung. Da die Vermehrung und Differenzierung von Neuroepithelzellen ein programmierter Vorgang in vivo ist und Neuroepithelzellen, die in vitro kultiviert werden, dazu neigen, sich nach einer begrenzten Anzahl an Teilungen spontan zu differenzieren, war langfristige Kultur von Neuroepithelzellen bisher auf virale oder onkogene Transformation angewiesen.
  • Mehrere Forschungsgruppen haben ihren Berichten zufolge multipotente Neuralzelllinien durch retroviralen Gentransfer gebildet (Snyder et al., Cell 68, 33–51 (1992); Ryder et al., J. Neurobiol. 21, 356–375 (1990); Geller & Dubois-Dalq, J. Cell Biol. 107, 1977–1986 (1988); Bartlett, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 3255–3259 (1988); Birren & Anderson, Neuron 4, 189–201 (1990); Evrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3062–3066 (1990); und Frederikson et al., Neuron 1, 439–448 (1988)). Onkogene, die im Allgemeinen verwendet werden, um Zellen aus dem sich entwickelnden Nervensystem zu bilden, umfassen v-myc, SV40-T-Antigen und neu (Frederiksen et al., Neuron 1, 439–448 (1988); Gao & Hatten, Development 120, 1059–1070 (1994)). Die Zelllinien können durch genotypische Änderungen, umfassend die Expression von exogenen Genen wie beispielsweise lacZ (Snyder et al. (1992), s.o.), identifiziert werden. Transformierte Zelllinien können aus Embryonalzellen in verschiedenen Entwicklungsstadien gebildet werden. Snyder et al. bildeten ihre sich unbegrenzt vermehrenden v-myc-Zellen aus der aus Zerebellumzellen gewonnenen äußeren Keimschicht eines 13 Tage alten Embryos (Snyder et al. (1992), s.o.).
  • Andere verwendeten embryonale Karzinom-(EC-)Zellen, um neurale Differenzierung zu untersuchen, da EC-Zellen in großen Mengen erhalten werden und sich in Zellen verschiedener Phänotypen differenzieren können (B. Edde & M. Darmon, "Neural Differentiation of Pluripotent Embryonal Carcinoma Cells", Cell Culture in the Neurosciences, Bottenstein & Sato (Hrsg.), 273–285 (1985)).
  • Virale Transfektion und Onkogentransformation können das Zelldifferenzierungsprogramm in spezifischen Stadien der Differenzierung ins Stocken bringen (Frederiksen et al., Neuron 1, 439–448 (1988)). Diese Verfahren resultieren auch in einer Änderung der Eigenschaften von neuralen Vorläuferzellen. Großes T-Antigen-Onkogen von SV40 verhinderte die Bildung von Körnerzellidentität (Gao & Hatten, Development 120, 1059–1070 (1994)). Aufgrund ihres transformierten Phänotyps und ihres Potentials für invasives Wachstum in vivo sind diese Zellen vermutlich für zellbasierte Therapien nicht geeignet (Jiao et al., Brain Res., 143–147 (1992)).
  • Erst jüngst wurden Hinweise darauf gefunden, dass es möglich sein sollte, die Differenzierung von Neuroepithelzellen ins Stocken zu bringen und ungebrenzte Vermehrung von nicht-transformierten neuralen Maus-Neurovorläuferzellen in serumfreiem Medium, ergänzt mit geeigneten Wachstumsfaktoren, zu ermöglichen (Loo et al., Science 236, 200–202 (1987); Loo et al., J. Neurosci. Res. 28, 101–109 (1991)). Anders als bei Mausembryonalzellen, die in herkömmlichem, Serum-ergänztem Medium kultiviert werden, verlieren diese Zellen ihr Vermehrungspotential nicht, was zu genetisch veränderten Zelllinien führt (Loo et al., Science 236, 200–202 (1987)). Forscher bildeten Zelllinien von 16 Tage alten Embryonen, die einen absoluten Bedarf an abgeleitetem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) aufweisen (Loo et al., J. Cell. Physiol. 139, 484–491 (1989)). Eine sich unbegrenzt vermehrende Gliavorläuferzelllinie (SFME) wurde in Gegenwart von EGF gebildet (Loo et al. (1978), s.o.). Zellen wurden auch aus 10 Tage alten Mausembryonen isoliert, die einen absoluten Bedarf an Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) aufwiesen (Murphy et al., J. Neurosci. Res. 25, 463–475 (1994)).
  • Serumfreie Embryonalzellen, die den Maus-SFME-Zellen ähnlich sind, können von menschlichem Embryonalgehirn in ähnlichen Entwicklungsstadien unter Verwendung von EGF gewonnen werden (Loo et al., J. Neurosci. Res. 28, 101–109 (1991)). Diese Zelllinien, die aus 20–24 Wochen alten menschlichen Embryonen gewonnen worden waren, beendeten jedoch ihre Vermehrung nach etwa 70 Populationsverdoppelungen (Loo et al. (1991), s.o.). Auf EGF reagierende Zellen wurden auch im erwachsenen Säugetier-Zentralnervensystem identifiziert (Reynolds & Weiss, Science 225, 1707–1710 (1992)). Es wurde erkannt, dass EGF das unbegrenzte Wachstum von subventrikulären neuralen Vorläuferzellen aus erwachsenen Mauszellen und neuralen Retinavorläuferzellen unterstützt (Reynolds & Weiss (1992), s.o.).
  • Es wurde gezeigt, dass basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ein potentes Mitogen für bestimmte CNS-Populationen ist (Murphy et al. (1990), s.o.; Cattaneo & McKay (1990), s.o.; Ghosh & Greenberg, Neuron 15, 89–103 (1995); und Vicario-Abejon et al., Neuron 15, 105–114 (1995)). Auch scheint es, dass bFGF und Nervenwachstumsfaktor (NGF) zusammen Vermehrung und Differenzierung von embryonalen Striatumneuronen fördern (Cattaneo & McKay (1990), s.o.). Weder EGF noch FGF unterstützt jedoch Neuroepithelzellen, die aus früheren Entwicklungsstadien kultiviert wurden, wie beispielsweise Neuralrohr von einem 9 Tage alten Rattenembryo.
  • Gute Zellkandidaten für zellbasierte Therapieformen wie beispielsweise intrazerebrale Transplantation und Gentransfer sind im Idealfall frei von genetischen Modifikationen und leicht erhältlich. Weiters weisen gute Kandidaten verlängertes In-vivo-Überleben und nicht-invasives Wachstum auf (Gage et al., TINS 14, 328–333 (1991)). Erst jüngst wurden sich unbegrenzt vermehrende neurale Vorläuferzellen als ein Träger für die örtliche Zufuhr von NGF in das Gehirn verwendet (Martinez-Serrono, Neuron 15, 473–484 (1995)). Die NGF-sekretierenden Zellen exprimierten ein Transgen und sekretierten bioaktiven Nervenwachstumsfaktor in ausreichenden Konzentrationen, um cholinerge Neuronenatrophie in transplantierten Ratten umzukehren (Martinez-Serrono et al. (1995), s.o.). Diese Zellen waren in der Lage, bis zu 10 Wochen nach der Transplantation zu überleben und altersbedingte kognitive Beeinträchtigungen im Modell umzukehren. Eine andere Forschungsgruppe transplantierte menschliches fötales Mittelhirngewebe in den Nucleus caudatus von Patienten mit Parkinson-Krankheit (Spencer et al., New England J. Med. 327, 1541–1548 (1992)). Intrazerebrale Transplantation wurde mit nicht-neuronalen Zelltypen wie Fibroblasten (Gage et al., Trends Neurosci. 14, 328–333 (1991); Gage & Fisher et al., Neuron 6, 1–12 (1991); Fisher, Neurochem. Int. 25, 47–52 (1994)) und Primärmuskelzellen (Jiao et al., 575, 143–147 (1992)) durchgeführt, zum Teil um die Möglichkeit von Tumorwachstum und Helper-Virus-Kontamination zu vermeiden, die unbegrenzt vermehrende Primärneuronalzellen in vivo beeinflussen könnte.
  • Andere verwendeten genetisch veränderte, Polymer-verkapselte Zellen, um in Rattenmodellen menschliches Nervenwachstumsfaktor-Transgenprodukt zuzuführen (Winn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2324–2328 (1994); Hoffman et al., Experimental Neurology 122, 100–106 (1993); Maysinger et al., Neurochem. Int. 24, 495–503 (1994)). Polymer-Einkapselung ermöglicht die Diffusion von Makromolekülen und gestattet Nährstofffreilegung (Winn et al. (1994), s.o.).
  • Snyder et al. zeigten, dass frühe embryonale Vorläuferzellen als Transplantate akzeptiert werden und an der Entwicklung von Mauszerebellum teilnehmen können (Snyder et al., Cell 68, 33–51 (1992)).
  • Aus diesem Grund besteht für zahlreiche verschiedene Zwecke, umfassend zellbasierte Therapien, Bedarf an normalen neuralen Epithelzellen aus einem frühen embryonalen Entwicklungsstadium, die sowohl in vitro als auch in vivo zu Replikation und Expansion in der Lage sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Nun wurde erkannt, dass ein neuraler Vorläuferzelltyp aus nichtmenschlichem embryonalem Säugetierneuralgewebe isoliert werden kann, der zu kontinuierlicher In-vitro-Zellkultivierung in der Lage ist. Dieser Zelltyp, der in serumfreier Kultur aus nichtmenschlichem embryonalem Neuralgewebe isoliert wird, reagiert nicht auf epidermalen Wachstumsfaktor, weist keine Phänotypenaberration aufgrund von viraler Transfektion oder onkogener Transformation auf und kann in kontinuierlicher Kultur aufrechterhalten werden, ohne eine Wachstumskrise, Alterung oder spontane Differenzierung zu erfahren. Dieser Zelltyp wurde als eine neurale Epithelvorläuferzelle (NEP-Zelle) identifiziert, die das Zwischenprodukt Filamentprotein Nestin exprimiert. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Isolieren eines normalen neuralen Epithelvorläuferzelltyps aus einem sich entwickelnden nichtmenschlichen Säugetierembryo bereit.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann, wenn Neuralgewebe aus dem sich entwickelnden nichtmenschlichen Säugetier-Zentralnervensystem im Null-Somit-Entwicklungsstadium, das der Entwicklung eines Rattenembryo am 9. Tag ent spricht, in Gegenwart von embryonalen Schwannschen Zellen oder von mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium kultiviert wird, ein neuraler Epithelvorläuferzelltyp isoliert werden, der in kontinuierlicher Kultur in serumfreiem Medium aufrechterhalten werden kann. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines normalen neuralen Epithelvorläuferzelltyps bereit, umfassend die Schritte des Kultivierens von Neuralgewebe aus einem nichtmenschlichen Säugetierembryo im Null-Somit-Entwicklungsstadium in Gegenwart von embryonalen Schwannschen Zellen oder mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium und des Isolierens der normalen neuralen Epithelvorläuferzellen.
  • Die Erfindung stellt weiters den normalen neuralen Epithelvorläuferzelltyp bereit, der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurde. Die neurale Epithelzelllinie der vorliegenden Erfindung stammt von einem nichtmenschlichen Säugetier. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Neuralrohr von einem Rattenembryo am 9. Tag seiner Entwicklung gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kultiviert. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine neurale Epithelvorläuferzelllinie, abstammend von Ratten, erhalten.
  • Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur langfristigen Kultur, Expansion und Aufrechterhaltung der Zelllinien der vorliegenden Erfindung bereit. Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann der normale neurale Epithelvorläuferzelltyp in langfristigen Kulturen aufrechterhalten werden. Vorzugsweise werden die Zellen auf Platten, die mit Laminin beschichtet sind, oder auf extrazellulären Matrixmaterialien, die Laminin enthalten, kultiviert.
  • Die Erfindung betrifft weiters Zusammensetzungen, die die normalen neuralen Epithelvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung umfassen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel formuliert. In einer Ausführungsform ist das pharmazeutisch annehmbare Vehikel eine ausgeglichene Salzlösung. In einer weiteren Ausführungsform ist das phar mazeutisch annehmbare Vehikel ein festes oder halbfestes, gelatinöses oder viskoses Trägermedium. Bevorzugte gelatinöse Vehikel umfassen Collagen und Hydrogele, gegebenenfalls ergänzt mit den relevanten extrazellulären Matrixproteinen wie beispielsweise Laminin, und können die geeigneten Wachstumsfaktoren umfassen. Solche Zusammensetzungen sind zur Transplantation entweder in das periphere Nervensystem oder in das Zentralnervensystem geeignet.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1A–1F. Neurale Epithelvorläufer-(NEP-)Zellen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren isoliert worden waren, wurden in Gegenwart und Abwesenheit von verschiedenen Faktoren kultiviert. In 1A wurden Zellen in F12/DME, ergänzt mit Rinderhypophysenextrakt (2 μg/ml), Forskolin (5 μM), Insulin (10 μg/ml) und Transferrin (10 μg/ml) (Bahn 4F), oder in demselben Medium, jedoch ohne i) Rinderhypophysenextrakt (Bahn BPE), ii) Forskolin (Bahn For) und iii) Insulin (Bahn Ins), gezüchtet. Die 1B–1E beschreiben die Resultate des Kultivierens von NEP-Zellen in F12/DME, das Rinderhypophysenextrakt (BPE), Insulin, Heregulin (1 nM), Vitamin E (5 μg/ml), Progesteron (3 nM), Transferrin (10 μg/ml) und Forskolin enthielt, in mit Laminin beschichteten Wells in Gegenwart steigender Konzentrationen von Forskolin und Rinderhypophysenextrakt (1B), Insulin (1C), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (1D), Nervenwachstumsfaktor und epidermalem Wachstumsfaktor (1E). NEP-Zellen in 1F wurden in F12/DME, das Rinderhypophysenextrakt (BPE) (2 μg/ml), Insulin (10 μg/ml), Heregulin (1 nM), Vitamin E (5 μg/ml), Progesteron (3 nM), Transferrin (10 μg/ml) und Forskolin (5 μM) enthielt, auf Laminin-beschichteten Platten und in Gegenwart oder Abwesenheit von aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor (PDGF), Interleukin 1B (IL-1B), Interleukin 11 (IL-11), menschlichem Hepatozytenwachstumsfaktor (hHGF) und Neurotrophin 3 (NT-3) kultiviert.
  • 2A–2B. NEP-Zellen wurden in DME/F12, das Insulin, Transferrin, Rinderhypophysenextrakt, Forskolin, Progesteron und Vitamin E umfasste, gezüchtet und den angegebenen Konzentrationen von Heregulin oder transformierendem Wachstumsfaktor β (2A) oder saurem oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (2B) ausgesetzt.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Definitionen
  • Die Bezeichnung "normal", sofern sie in Verbindung mit einem neuralen Epithelvorläuferzelltyp der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf einen Zelltyp, der keine Phänotypenaberration aufgrund von viraler Transfektion oder onkogener Transformation aufweist. Der normale Zelltyp der vorliegenden Erfindung kann in kontinuierlicher Kultur aufrechterhalten werden, ist zu Replikation, Expansion und langfristiger Kultur in vitro in der Lage, während er seine Fähigkeit zur Differenzierung in vitro und in vivo beibehält, ohne eine Wachstumskrise, Alterung oder spontane Differenzierung zu erfahren. Solche Zelltypen sind von Zelllinien zu unterscheiden, die nur nach Infektion mit einem transformierenden Vehikel wie beispielsweise Adenovirus, SV40, ras oder c-myc unbegrenztes Vermehrungspotenial aufweisen und zu langfristiger kontinuierlicher Kultur in der Lage sind. Normale Zelllinien sind nicht-onkogen. Unter nicht-onkogen wird verstanden, dass die Zelle nicht zu Tumoren führt, wenn sie in syngenetische oder immungeschwächte Tiere injiziert wird.
  • Eine "Zelllinie" gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine im Wesentlichen homogene Gruppe oder Population von Zellen, die mittels Kultivieren einer Zellprobe aus einem Gewebe oder Organ gewonnen werden. Unter "im Wesentlichen homogen" wird eine Population von Zellen verstanden, die aufgrund von gemeinsamer/n Abstammung(en) im Allgemeinen phänotypisch und genotypisch identisch sind. Es gilt anzumerken, dass solche uniformen Zellpräparate aufgrund von natürlichen Mutations veränderungen (allelische Variationen), die Veränderungen im Phänotyp in der Zellpopulation verursachen können, unterschiedlich ausfallen können. Solche natürliche Veränderungen sind innerhalb der Definition von "im Wesentlichen homogen" und folglich auch in der Definition von hierin definierten Zelllinien umfasst. Vorzugsweise bedeutet "im Wesentlichen homogen", dass zwischen etwa 90% und 100%, und vorzugsweise 99% bis 100%, der Zellen in der Population identische Zellen sind.
  • "Immortalisierung" ist die Transformation einer Zellkultur in vitro in einen Stamm mit unbegrenztem Wachstumspotential.
  • "Neurale Epithelvorläufer-(NEP-)Zellen" werden durch die Expression. des Zwischenprodukts Filamentprotein Nestin identifiziert (Frederickson & McKay, J. Neurosci. 8, 1444–1151 (1988); Lendahl et al., Cell 60, 585–595 (1990); Cattaneo & McKay, Nature 347, 762–765 (1990); S. Hockfield & R. D. G. McKay, J. Neurosci. 5, 3310–3328 (1995)). Die Expression von Nestin unterscheidet neurale Epithelvorläuferzellen von stärker differenzierten Zellen, die vom Neuralrohr abstammen (Lendahl et al., Cell 60, 585–595 (1990); Reynolds & Weiss, Science 225, 1707–1710 (1992)). Die Zellen werden aus Neuralgewebe isoliert, das in Bezug auf seine Entwicklung dem Neuralrohr eines 9 Tage alten Rattenembryos entspricht. Weder EGF noch FGF sind für NEP-Zellen mitogen, und sie differenzieren sich zu einer Vielzahl neuraler Zelltypen in Gegenwart von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Forskolin.
  • Unter "entsprechender Entwicklung" wird verstanden, dass eine bestimmte Quelle embryonalen Gewebes aus einem sich entwickelnden nichtmenschlichen Säugetierembryo in einem entsprechenden embryonalen Entwicklungsstadium gewonnen wird. Embryonale Entwicklung kann zwischen verschiedenen Spezies mittels des Auftretens unterschiedlicher morphologischer Eigenschaften verglichen werden. Diese kann aufgrund des Gestationsalters unterschieden werden, da sich der Zeitpunkt des Auftretens grundlegender morphologischer Eigenschaften bei verschiedenen Spezies unterscheidet. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird nichtmenschliches embryonales Säugetiergewebe in einem Stadium erhalten, das dem embryonalen Null-Somit-Entwicklungsstadium entspricht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein nichtmenschlicher Säugetierembryo erhalten, der in Bezug auf seine Entwicklung einem Rattenembryo am 9. Tag der embryonalen Entwicklung entspricht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der 9. Tag des Rattenembryos durch zweistündige Paarung männlicher und weiblicher Ratten zwischen 8.00 und 10.00 Uhr und unverzügliches Untersuchen auf einen Paarungspfropfen gemessen. Der Tag, an dem der Paarungspfropfen gefunden wird, wird als Tag Null der Gestation definiert. Bei anderen nichtmenschlichen Säugetierspezies jedoch ist es nicht der Gestationstag, der von Bedeutung ist, sondern das Entwicklungsstadium des Embryos. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung der Ratten-E9-Embryo oder der Embryo einer anderen nichtmenschlichen Spezies im entsprechenden Entwicklungsstadium verwendet. Der Ratten-E9-Embryo befindet sich im Allgemeinen im Null-Somit-Entwicklungsstadium, das durch das Auftreten der Primitivrinne und der Allantois in Verbindung mit der Amnionbildung gekennzeichnet ist. Für entsprechende Entwicklungsstadien bei anderen Säugetierembryonen wird der Leser auf M. H. Kaufman, "Morphological Stages of Post Implantation Embryonic Development", in: Post implantation Mammalian Embryos: A Practical Approach, A. Copp & D. Cockcroft (Hrsg.), Oxford University Press, New York, 81–91 (1990); Downs & Davies 118, 1255–1266 (1993); Fujinaga & Baden, Teratology 45, 661–670 (1992); und R. O'Rahilly & F. Müller, "Developmental Stages in Human Embryos", Carnegie Institution of Washington, Veröffentlichungs-Nr. 637, Carnegie Institute, Washington DC (1987), verwiesen.
  • Eine "Schwannsche Zelle" ist eine Zelle, die von der Neuralleiste abstammt, die in situ eine ununterbrochene Hülle rund um jede Nervenfaser peripherer Nerven bildet. Eine Schwannsche Zelle kann als solche durch Nachweisen der Gegenwart eines oder mehrerer Schwannschen-Zell-Marker wie beispielsweise von saurem Gliafaserprotein (GFAP) oder S100-Protein, z.B. unter Verwendung von Antikörpern gegen diese Marker, identifiziert werden. Weiters weisen Schwannsche Zellen eine charakteristische Morphologie auf, die durch Mikroskopuntersuchung von Kulturen davon nachgewiesen werden kann. Isolierte Schwannsche Zellen können auch aufgrund der Aufrechterhaltung von differenzierten Schwannschen Zell-Funktionen bewertet werden, wie beispielsweise aufgrund der Fähigkeit, sich mit sensorischen Neuronen in Kultur zu assoziieren, oder der Fähigkeit, Myelin oder Myelin-verwandte Proteine wie beispielsweise Po und Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG) zu produzieren. Eine "embryonale Schwannsche Zelle" ist eine Schwannsche Zelle oder ein Vorläufer einer Schwannschen Zelle, die/der aus einem nichtmenschlichen Säugetierembryo isoliert wird, der sich in einem dem Rattenembryo im Stadium vom 14. Tag bis hin zur Geburt entsprechenden Entwicklungsstadium befindet. Vorzugsweise wird die embryonale Schwannsche Zelle aus einem nichtmenschlichem Säugetier in einem Entwicklungsstadium isoliert, das jenem eines Rattenembryos vom 14. Tag bis zum 18. Tag entspricht, und am meisten bevorzugt jenem eines Rattenembryos am Tag 15.
  • Die Bezeichnungen "Zellkulturmedium" und "Kulturmedium" beziehen sich auf. eine Nährlösung, die zum Züchten von Säugetierzellen verwendet wird und typischerweise zumindest eine Komponente aus einer oder mehreren der folgenden Kategorien bereitstellt:
    • 1) eine Energiequelle, üblicherweise in Form eines Kohlenhydrats wie beispielsweise Glucose;
    • 2) alle essenziellen Aminosäuren, und üblicherweise die Grundauswahl von zwanzig Aminosäuren plus Cystin;
    • 3) Vitamine und/oder andere organische Verbindungen, die in geringen Konzentrationen erforderlich sind;
    • 4) freie Fettsäuren; und
    • 5) Spurenelemente, worin Spurenelemente als anorganische Verbindungen oder natürlich vorkommende Elemente definiert sind, die typischerweise in sehr geringen Konzentrationen benötigt werden, üblicherweise im mikromolaren Bereich.
  • Die Nährlösung kann gegebenenfalls wie hierin beschrieben mit einer oder mehreren Komponenten aus jeder beliebigen der folgenden Kategorien ergänzt sein:
    • 1) einem oder mehreren mitogenen Mitteln;
    • 2) Salzen und Puffern wie beispielsweise Calcium, Magnesium und Phosphat;
    • 3) Nucleosiden und Basen wie beispielsweise Adenosin und Thymidin, Hypoxanthin; und
    • 4) Protein- und Gewebehydrolysaten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Zellkulturmedium im Allgemeinen "serumfrei", was bedeutet, dass das Medium im Wesentlichen frei von Serum aus jeglicher Säugetierquelle ist (z.B. fötales Rinderserum [FBS]). Unter "im Wesentlichen frei" wird verstanden, dass das Zellkulturmedium zwischen etwa 0–5 Vol.-% Serum, vorzugsweise zwischen etwa 0–1 Vol.-% Serum, und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0–0,1 Vol.-% Serum, umfasst.
  • Ein "mitogenes Mittel" oder "Wachstumsfaktor" ist ein Molekül, das Mitose des bestimmten Zelltyps, der untersucht wird, stimuliert. Im Allgemeinen fördert das mitogene Mittel oder der Wachstumsfaktor das Überleben und/oder die Vermehrung des Zelltyps in Zellkultur. Beispiele für mitogene Mittel umfassen Rse/Axl-Rezeptoraktivatoren; Aktivatoren von einem oder mehreren Mitgliedern der erbB-Rezeptorfamilie; Mittel, die cAMP-Konzentrationen im Kulturmedium erhöhen (z.B. Forskolin, Choleratoxin, cAMP oder Analoga davon); Adhäsionsmoleküle wie beispielsweise neurales Zelladhäsionsmolekül (N-CAM), Laminin oder Fibronectin; Progesteron; neurotrophe Faktoren wie aus dem Gehirn gewonnener neurotropher Faktor (BDNF) und ziliärer neurotropher Faktor (CNTF); Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6); oder einen Nervenwachstumsfaktor wie beispielsweise NGF-β; aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF); epidermalen Wachstumsfaktor (EGF); Fibroblasten-Wachstumsfaktor wie sauren FGF (aFGF) und basischen FGF (bFGF); transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) wie beispielsweise TGF-α und TGF-β, umfassend TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, umfassend IGF-I, IGF-II und des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I); Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsproteine wie bei spielsweise IGFBP-1, -2, -3, -4, -5 oder -6; und Hormone wie beispielsweise Östrogen, Testosteron, Progesteron, Schilddrüsenhormon und Insulin.
  • "Pharmazeutisch annehmbare" Träger oder Vehikel sind solche, die für Säugetiere, die diesen bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen ausgesetzt werden, nichttoxisch sind. Häufig ist der pharmazeutisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidanzien umfassend Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie beispielsweise Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate umfassend Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie beispielsweise EDTA; Zuckeralkohole wie beispielsweise Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG). Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Vehikel umfassen auch halbfestes, gelatinöses oder viskoses Trägermedium. Beispiele for solche gelatinöse Träger oder Vehikel umfassen Collagen, Collagen-Glykosaminoglykan, Fibrin, Polyvinylchlorid, Polyaminosäure wie beispielsweise Polylysin oder Polyornithin, Hydrogele, Agarose, Dextransulfat und Silicon. Pharmazeutisch annehmbare Vehikel, die zur Transplantation von sich entwickelnden Nervenzellen geeignet sind, können beispielsweise in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 92/03536 gefunden werden.
  • Eine Erkrankung oder Störung des Nervensystems umfasst traumatische Läsionen (z.B. durch physische Verletzungen oder Chirurgie oder durch Druckverletzungen verursacht); ischämische Läsionen (z.B. Gehirn- oder Rückenmarksinfarkt und -ischämie); maligne Läsionen; Infektionsläsionen (z.B. aufgrund eines Abszesses oder in Verbindung mit Infektionen durch menschliches Immunschwächevirus, Borreliose, Tuberkulose, Syphilis oder Herpesinfektion); degenerative Läsionen (z.B. assoziiert mit Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntington-Chorea oder amyotropher lateraler Sklerose); Läsionen, die mit Ernährungskrankheiten oder -störungen assoziiert sind (z.B. Vitamin-B12-Mangel, Folsäure-Mangel, Wernicke-Krankheit, Tabak-Alkohol-Amblyopie, Marchiafava-Bignami-Syndrom und alkoholbedingte Degeneration des Zerebellums); neurologische Läsionen, die mit systemischen Krankheiten assoziiert sind (z.B. assoziiert mit Diabetes, systemischem Lupus erythematodes, Karzinomen oder Sarkoidose); durch toxische Substanzen verursachte Läsionen (z.B. Alkohol, Blei oder Neurotoxin); und Demyelinisierungsläsionen (z.B. assoziiert mit multipler Sklerose, menschlicher Immunschwächevirus-assoziierter Myelopathie, transverser Myelopathie verschiedener Ätiologie, progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie und zentraler pontiner Myelinolyse).
  • Die Bezeichnung "Behandlung" im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließt therapeutische Behandlung sowie prophylaktische Behandlung oder unterdrückende Maßnahmen von bzw. gegen Erkrankungen oder Störungen ein. Somit resultiert im Fall von Alzheimer-Krankheit erfolgreiche Verabreichung eines Mittels vor Ausbruch oder während des Verlaufs der Erkrankung in einer "Behandlung" der Krankheit, unabhängig davon, ob diese mit verzögertem oder verhindertem Ausbruch der Erkrankung verbunden ist oder nicht, sofern mit der Verabreichung ein eindeutiger klinischer Nutzen einhergeht. Solch ein Nutzen kann jeder beliebiger Nutzen sein, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Verringerung einer Nebenwirkung einer anderen Therapie oder Verschwinden eines Symptoms. Beispielsweise wird unter "Behandlung" der Erkrankung die erfolgreiche Verabreichung des Wirkstoffes nach klinischen Anzeichen der Erkrankung zur Bekämpfung der Symptome der Erkrankung verstanden. "Behandlung" umfasst auch die Verabreichung des Wirkstoffes nach dem Auftreten der Erkrankung zur Bekämpfung der Erkrankung. Erfolgreiche Verabreichung des Wirkstoffes nach Entstehung und nachdem sich klinische Symptome entwickelt haben, mit möglichem Rückgang der klinischen Symptome und eventuell einer Verbesserung der Erkrankung, ist ebenfalls in der "Behandlung" der Krankheit inbegriffen.
  • Die Bezeichnung "Säugetier betrifft jegliches nichtmenschliche Säugetier, das als Säugetier klassifiziert ist, umfassend nichtmenschliche Primaten, Rinder, Pferde, Hunde, Schafe und Katzen.
  • Arten der Durchführung der Erfindung
  • Fachleuten wird ersichtlich sein, dass für die In-vitro-Kultur der neuralen Epithelvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung herkömmliche aseptische Zellkulturverfahren in Verbindung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung einzusetzen sind. Die Erfindung wird nun unter Verweis auf diese und auf andere Zellkulturverfahren beschrieben.
  • Zur Isolierung der normalen neuralen Epithelvorläuferzellen (NEP-Zellen) der vorliegenden Erfindung wird Säugetier-Neuralgewebe aus einem nichtmenschlichen Säugetier im Null-Somit-(0-Somit-)Entwicklungsstadium erhalten. Dieses Entwicklungsstadium des Embryos ist durch das Auftreten der Neuralrinne, der sich entwickelnden Allantois und der Amnionbildung gekennzeichnet. Dieses Stadium geht dem Auftreten der ersten Somiten voran und ist im Allgemeinen durch das Auftreten der Neuralplatte zu erkennen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist dieses Stadium in Bezug auf die Entwicklung mit dem neunten Tag der embryonalen Entwicklung einer Ratte gleichzusetzen: Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung Rattenneuralgewebe vom 9. Entwicklungstag des Embryos oder entwicklungstechnisch gesehen gleichwertiges Neuralgewebe von anderen nichtmenschlichen Säugetierspezies verwendet. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird embryonales Neuralgewebe am 9. Tag der Rattenembryoentwicklung zwischen 15.00 und 16.00 Uhr oder hinsichtlich der Entwicklung entsprechendes Neuralgewebe von einer anderen Säugetierspezies verwendet.
  • Fachleute werden erkennen, dass Säugetierembryonen ähnlichen Entwicklungsmustern folgen, die als einzelne morphologische Stadien identifiziert werden können. Die Stadien werden im Großen und Ganzen durch den Tag des Auftretens der be stimmten morphologischen Eigenschaft, wie beispielsweise der Neuralplatte, identifiziert. Der Zeitpunkt des Auftretens grundlegender morphologischer Eigenschaften variiert jedoch von Spezies zu Spezies. Demgemäß wird embryonales Neuralgewebe knapp vor dem Auftreten der ersten Somiten isoliert. Dieses Stadium wird üblicherweise als das "Null-Somit"- oder "0-Somit"-Entwicklungsstadium bezeichnet. Bei der Rattenspezies treten die ersten Somiten zwischen dem 9. und dem 10. Tag der embryonalen Entwicklung auf, und sich entwickelndes Neuralgewebe wird am neunten Entwicklungstag, knapp vor dem Auftreten der ersten Somiten, gewonnen. Die Mausspezies ist der Rattenspezies in Bezug auf ihre Entwicklung hinsichtlich des Auftretens derselben grundlegenden Eigenschaften 1,5 bis 2 Tage voraus. Demgemäß treten bei der Mausspezies die ersten Somiten etwa am achten Tag der Embryonalentwicklung auf. Daher wird bei der Mausspezies Neuralgewebe im Allgemeinen etwa zwischen dem sechsten und etwa dem achten Tag der Mausembryonalentwicklung erhalten.
  • Neuralgewebe, das vom Embryo gewonnen wurde, der in Bezug auf seine Entwicklung dem E9-Rattenembryo entspricht, wird im Allgemeinen aus dem sich entwickelnden Embryo mittels Sezierung unter Verwendung von Verfahren, die für Fachleute üblicherweise erhältlich sind, isoliert. Fachleute auf dem Gebiet der Säugetierentwicklungsbiologie sind in der Lage, das Neuralgewebe unter Verwendung von Standardverfahren auf diesem Gebiet zu identifizieren und zu isolieren. Im Allgemeinen wird mikroskopische Sezierung verwendet, um den Schwanzteil des Embryos abzutrennen, woraufhin das Entfernen des Mesoderms und Endoderms im Entwicklungsstadium folgt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das verbleibende Neuralgewebe verwendet, und vorzugsweise wird das Neuralrohr verwendet.
  • Neuralgewebe und vorzugsweise Neuralrohr vom sich entwickelnden Embryo im Ratten-E9-Stadium oder dem entwicklungstechnisch gesehenen gleichwertigen Stadium wird in Gegenwart embryonaler Schwannscher Zellen, oder vorteilhaft in Gegenwart von Kulturmedium, das aus der In-vitro-Kultur embryonaler Schwannscher Zellen gewonnen wurde, kultiviert. Embryonale Schwannsche Zellen werden mittels der hierin beschriebenen Verfahren oder mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, isoliert. Die embryonalen Schwannschen Zellen können eine Primär- oder Sekundärkultur oder eine sich kontinuierlich fortgepflanzte Linie, wie hierin beschrieben, sein. Darüber hinaus können kontinuierliche embryonale Schwannsche Zelllinien, die mittels viraler Transformation oder Onkogentransfektion erhalten wurden, als eine Quelle für embryonale Schwannsche Zellen oder für mit embryonalen Schwannschen Zellen konditionierte Medien verwendet werden. Alternativ dazu können die embryonalen Schwannschen Zellen ein Schwannom sein, wie es beispielsweise von (Ansselin & Corbeil, In Vitro Cell Dev. Biol. 31, 253–254 (1995); Brockes et al., Brain Res. 277, 389–392 (1979); Morrissey et al., J. Neurosci. 11(8), 2433–2442 (1991); Peulve et al., Exp. Cell. Res. 214, 543–550 (1994); Rutkowski et al., Ann. Neurol. 31, 580–586 (1992); Watabe et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 49, 455–467 (1990)) beschrieben wird. Embryonale Schwannsche Zellen und Verfahren zur Gewinnung dieser Zellen sind Fachleuten bekannt (Messing et al., J. Neurosci. 14, 3533–3539 (1994)). Die gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung Nr. 08/435.436, eingereicht am 10. Mai 1995, beschreibt ein beispielhaftes Verfahren zur Gewinnung von Kulturen embryonaler Schwannscher Zellen.
  • Bei der Gewinnung Schwannscher Zellen oder der Auswahl von Nervengewebe, das Schwannsche Zellen umfasst (z.B. peripheres Nervengewebe), zur Isolierung der Schwannschen Zellen ist es wichtig, dass die Zellen von einem embryonalen nichtmenschlichen Säugetier gewonnen sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine embryonale Schwannsche Zelle aus einem nichtmenschlichen Säugetier in einem Entwicklungsstadium gewonnen, das der Rattenembryonalentwicklung am Tag 14 oder jedem anderen beliebigen Stadium danach bis zum letzten Tag embryonaler Entwicklung entspricht. Vorzugsweise werden Schwannsche Zellen verwendet, die in ihrer Entwicklung dem Rattenembryo am Tag 15 entsprechen. Geeignete Gewebequellen umfassen beispielsweise Ganglien der dorsalen Rückenmarkswurzel.
  • In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung entspricht die Säugetierspezies, aus der die Schwannschen Zellen gewonnen werden, der Spezies, aus der die normalen NEP-Zellen isoliert werden. Hierbei ist jedoch die Übereinstimmung der Spezies kein absolutes Erfordernis. Beispielsweise können embryonale Schwannsche Zellen der Ratte als Quelle embryonaler Schwannscher Zellen zur Isolierung von normalen Maus-NEP-Zellen zusätzlich zu normalen Ratten-NEP-Zellen dienen.
  • In einem beispielhaften Verfahren zum Isolieren embryonaler Schwannscher Zellen wird Nervengewebe aus einem sich entwickelnden Embryo (im Allgemeinen zwischen den Tagen 14 und 20) gewonnen. Eine geeignete Größe für das Ausgangsnervengewebe liegt im Allgemeinen zwischen etwa 1 mg und 1 g. Das Nervengewebe kann vor dem Kultivieren in Medium (z.B. RPMI-1640 [Sigma], Liebovitz-L15- oder Belzer-UW-Lösung) gelagert werden. Prä-Inkubation der embryonalen Schwannschen Zelle kann von Vorteil sein, wenn das Gewebe myelinierte Nerven enthält, um die Demyelinierung der Schwannschen Zellen zu erleichtern. Zur Prä-Inkubation von embryonalen Schwannschen Zellen wird das Nervengewebe wünschenswerterweise mit einem oder mehreren Proteaseenzym(en) ausreichend lang behandelt, um Bindegewebe zu lockern und dadurch Demyelinierung zu fördern. Zahlreiche Proteaseenzyme sind im Handel erhältlich, die für diesen Schritt verwendet werden können, und umfassen beispielsweise Collagenase, Dispase und andere Serinproteasen. Überschüssiges Enzym kann durch vorsichtiges Waschen mit Kulturmedium entfernt werden.
  • Embryonale Schwannsche Zellkultur wird typischerweise auf einer Festphase (z.B. einer Kunststoffgewebe-Kulturschale oder -platte), beschichtet mit extrazellulären Matrix/Ahdäsions-Proteinen wie beispielsweise Laminin, Fibronectin, Polylysin oder Collagen, wobei Laminin bevorzugt ist, durchgeführt. Dies ermöglicht präferenzielle Adhäsion und Migration der Schwannschen Zellen auf die beschichtete Festphase. Die Schwannschen Zellen werden auf den Laminin-beschichteten Kulturplatten in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet.
  • Kulturmedien zur Kultur von embryonalen Schwannschen Zellen sind Fachleuten bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, im Handel erhältliche Me dien wie beispielsweise F12/DME, Ham F10 (Sigma), Minimalmedium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma). Jedes dieser Medien kann, sofern erforderlich, mit Ionen (wie Natrium, Chlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im Mikromolarbereich vorhanden sind) und Glucose oder einer entsprechenden Energiequelle ergänzt sein. Andere Ergänzungen können auch in geeigneten Konzentrationen umfasst sein, die Fachleuten bekannt sind. Das bevorzugte Kulturmedium ist F12/DME (1:1), das 4,5 g/l Glucose, ergänzt mit 15 mM HEPES, pH 7,4, und 1,2 g/l Natriumbicarbonat enthält.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung serumfreie Kulturbedingungen verwendet, wobei das Medium wie zuvor beschrieben ergänzt werden kann, um Wachstum und Expansion der embryonalen Schwannschen Zellen in vitro zu fördern. Die embryonalen Schwannschen Zellen werden vorzugsweise in Schalen (z.B. 100-mm-Petrischalen) in mit geeigneten mitogenen Mitteln ergänztes Kulturmedium platziert. Beispielsweise ist für die embryonale Schwannsche Zelle der Ratte das Kulturmedium vorzugsweise serumfreies Medium, das mit einem oder mehreren mitogenen Mittel(n), umfassend zumindest einen erbB-Aktivator (z.B. Heregulin), Insulin (oder ein IGF), Rinderhypophysenextrakt (Roberts et al., Am. J. Physiol. 3, 415–425 (1990)) und einen Stimulator von cAMP-Produktion (z.B. Forskolin) in den geeigneten Mengenbereichen, ergänzt ist, um Wachstum und Expansion der embryonalen Schwannschen Zellen zu fördern und die Verwendung von Wachstumsfaktoren wie beispielsweise saurem oder basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor und dergleichen zu vermeiden.
  • Daher werden in einem beispielhaften Verfahren zum Isolieren von embryonalen Schwannschen Zellen der Ratte zur Co-Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung Ganglien der dorsalen Rückenmarkswurzel aus E14-Rattenembryonen oder dem Embryo aus anderen Säugetierquellen in einem entsprechenden Entwick lungsstadium isoliert. Saubere dorsale Rückenmarkswurzel-Ganglien werden mit Collagenase/Dispase (Boehringer Mannheim, Katalog-Nr. 1.097.113) bei einer Konzentration von 0,3% etwa 45 Minuten lang inkubiert. Die dorsalen Rückenmarkswurzel-Ganglien werden anschließend saubergespült und durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 1-ml-PipetmanTM dispergiert. Die dispergierten Zellen werden mittels Zentrifugation (1.000 U/min, 5 min) gesammelt, dreimal mit F12/DMEM gewaschen und auf Laminin-beschichtete Platten in F12/DMEM, ergänzt mit rekombinantem menschlichem Insulin (5 μg/ml), Transferrin (10 μg/ml), Progesteron (2 × 10–8 M), Rinderhypophysenextrakt (Roberts et al., s.o.) (10 μg/ml), rekombinantem Heregulin (3 nM, HRG-β1177–224) (Holmes et al., Science 256, 1205–1210 (1992)), Forskolin (5 μM) und α-Tocopherol (5 μg/ml), ausplattiert. Schwannsche Zellen wachsen nach 4 Tagen zu einem zusammenfließenden Monolayer zusammen.
  • Schwannsche Zellen aus den Primärkulturen, die auf dem Lamininsubstrat gezüchtet wurden, werden alle vier Tage in einem Teilungsverhältnis von 1:4 auf Laminin-beschichtete Schalen in Medium übertragen, das mit Progesteron, Insulin, α-Tocopherol, Heregulin, Forskolin und Transferrin sowie Rinderhypophysenextrakt ergänzt ist. Kulturmedien aus der Kultur von embryonalen Schwannschen Zellen werden zu jeder beliebigen Zeit nach Erreichung der Konfluenz von Zellen aus embryonalen Schwannschen Zellkulturen erhalten. Vorzugsweise wird mit Schwannschen Zellen konditioniertes Medium nach etwa 2–4 Tagen und am meisten bevorzugt nach etwa 4 Tagen Kultur gesammelt.
  • Zur Isolierung von embryonalen neuralen Epithelvorläuferzellen durch Co-Kultur mit embryonalen Schwannschen Zellen oder mit mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium wird dispergiertes Neuralgewebe, das wie zuvor beschrieben aus dem Ratten-E9-Embryo oder der nichtmenschlichen Säugetierquelle auf gleichem Entwicklungsniveau gewonnen wurde, in Kultur mit embryonalen Schwannschen Zellen (ESC) oder in Kulturmedium, ergänzt mit mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium (ESCCM), platziert. Co-Kultur des Neuralgewebes mit den ESC kann durch das gemeinsame Platzieren der Zellen in demselben Kulturgefäß auftreten sowie durch Co-Kultur, wobei die Zellen, d.h. ECS und die Zellen des sich entwickelnden Neuralrohrs, durch eine physische Grenze getrennt sind, was den Transport löslicher Faktoren durch eine semipermeable Membran ermöglicht, während physischer Kontakt der Zellen selbst vermieden wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes Kulturgefäß zuvor mit einem geeigneten extrazellulären Matrixprotein wie beispielsweise Laminin beschichtet. Geeignete Kulturgefäße zur Isolierung und Kultur neuraler Epithelvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung umfassen Glas- oder Kunststoffgefäße. Obwohl Glasgefäße verwendet werden können, ist die Festphase im Allgemeinen ein/eine Kunststoff- oder Polystyrol-Gewebekulturgefäß oder -platte wie beispielsweise jene, die üblicherweise für Säugetier-Zellkulturen verwendet werden. Bei der Auswahl des Gewebekulturgefäßes wird berücksichtigt, dass anfänglich geringe Mengen an Zellen kultiviert werden. Im Allgemeinen werden etwa zwischen 100 und 1 × 105 Zellen auf oder in das Gefäß ausplattiert. Dieses Gefäß wird so ausgewählt, dass die Zellen in einem kleinen Volumen, im Allgemeinen in einem Volumen von etwa 100 bis 200 μl, in Kontakt bleiben. Geeignete Gewebekulturgefäße umfassen Kunststoff-96-Well-Platten.
  • Weiters wird die Kunststoffplatte oder das Gewebekulturgefäß normalerweise mit einem extrazellulären Matrix- oder Anlagerungsfaktor beschichtet, der manche oder alle Komponenten der extrazellulären Matrix enthält, sodass die meisten Zellen des sich entwickelnden Wirbeltierorganismus während normaler Entwicklung miteinander in Kontakt stehen. Collagen und Laminin werden im Allgemeinen durch den sich entwickelnden Säugetierneuroblasten produziert. Daher werden extrazelluläre Matrix/Adhäsionsproteine wie Collagene, Glykosaminoglykane, Proteoglykane und Glykoproteine verwendet. Am meisten bevorzugt sind Glykoproteine wie beispielsweise Fibronectin, Laminin, Enatactin und Hyaluronectin. Am meisten bevorzugt ist gemäß der vorliegenden Erfindung Laminin.
  • Das zur Co-Kultur-Isolierung der neuralen Epithelzellen der vorliegenden Erfindung verwendete Medium kann jedes beliebige von im Handel erhältlichen, synthetischen Grundmedium sein. Das Medium wird unter Berücksichtigung der Tatsache ausgewählt, dass sich Grundmedien hinsichtlich ihrer Überleben, Wachstum und Differenzierung fördernden Eigenschaften unterscheiden. Geeignete Kulturmedien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, im Handel erhältliche Medien wie beispielsweise F12/DME, Ham F10 (Sigma), Minimalmedium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma). Darüber hinaus können alle Medien, die in Ham & Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes & Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), der US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; der WO 90/03430; der WO 87/00195; der US-Pat. Re. 30.985; oder der US 5.122.469 beschrieben werden, als Grundkulturmedium verwendet werden, wobei alle Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind. Das bevorzugte Kulturmedium ist F12/DME (1:1).
  • Diese Medien und insbesondere F12/DME können mit Ionen (wie beispielsweise Natrium, Chlorid, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im Mikromolarbereich vorhanden sind) und Glucose oder einer entsprechenden Energiequelle ergänzt sein.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist zur Isolierung von neuralen Epithelvorläuferzellen aus einer Co-Kultur mit embryonalen Schwannschen Zellen oder mit mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium das zuvor beschriebene Grundmedium zusätzlich mit Rinderhypophysenextrakt (Roberts et al., Am. J. Physiol. 3, 415–425 (1990)) zu etwa 0,01 bis etwa 100 μl/ml und vorzugsweise zu etwa 3–5 μl/ml ergänzt. Ein Mittel, das die cAMP-Konzentrationen im Medium erhöht, ist wünschenswerterweise zusätzlich vorhanden. Forskolin ist das bevorzugte solche Mittel, und geeignete Konzentrationen dieses Moleküls liegen im Bereich von 0,1 μM bis 50 μM Forskolin, noch bevorzugter 1 μM bis 20 μM Forskolin, und am meisten bevorzugt bei etwa 5 μM Forskolin. Insulin oder ein IGF (z.B. IGF-1 oder IGF-II) ist für die Co-Kultur auch wünschenswert. Vorzugsweise wird Insulin dem Medium im Bereich von 0,01 μg/ml bis 100 μg/ml, noch bevorzugter von 1 μg bis 10 μg/ml, und am meisten bevorzugt 10 μg/ml, zugesetzt. Weiters kann das Kulturmedium gegebenenfalls ein mitogenes Mittel wie beispielsweise ein Molekül einbinden, das ein Mitglied der erbB-Rezeptorfamilie aktiviert. Heregulin ist der bevorzugte Aktivator, und das menschliche Heregulin-β1177–244-Fragment ist das am meisten bevorzugte mitogene Mittel (Holmes et al., Science 256, 1205–1210 (1990)). Die Konzentration von Heregulin im Medium liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 nM bis 10 nM, noch bevorzugter von 0,1 nM bis 10 nM, und am meisten bevorzugt von 1 nM bis 10 nM. Progesteron kann dem Kulturmedium auch im Bereich von etwa 0,1 nM bis 200 nM, noch bevorzugter von etwa 1 nM bis 100 nM, und am meisten bevorzugt etwa 3 nM, zugesetzt werden. Eine Eisenquelle wie beispielsweise Transferrin kann verwendet werden. Die Konzentration von Transferrin im Medium liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise zwischen etwa 5 μg/ml und 10 μg/ml. Andere optionale Zusätze umfassen Vitamin E (ein Antioxidans und Anti-Transformationsmittel), vorzugsweise im Bereich von 0,1 μg/ml bis 100 μg/ml, noch bevorzugter von 1 μg/ml bis 20 μg/ml, und am meisten bevorzugt von 5 μg/ml bis 10 μg/ml; und chemisch definierte Lipide (Sigma Katalog-Nr. 11.905–11.915), vorzugsweise im Bereich von etwa 1 μl/ml bis 500 μl/ml, noch bevorzugter von 10 μl/ml bis 100 μl/ml, und am meisten bevorzugt von 25 μl/ml bis 50 μl/ml.
  • Eine bevorzugte Medienformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst etwa 5 μg/ml rekombinantes menschliches Insulin, etwa 2 × 10–8 M Progesteron, etwa 10 μg/ml Rinderhypophysenextrakt (Roberts et al., Am. J. Physiol. 3, 415–425 (1990)), etwa 3 nM rekombinantes Heregulin (HRG-β1177–244 [Holmes et al., Science 256, 1205–1210 (1992)]), etwa 5 μM Forskolin, etwa 5 μg/ml Transferrin und etwa 5 μg/ml α-Tocopherol.
  • Kulturbedingungen wie beispielsweise Temperatur, pH, gelöster Sauerstoff (dO2) und dergleichen entsprechen jenen, die im Allgemeinen in Säugetier-Zellkultur verwendet werden und sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt. Im Allgemeinen wird der pH auf ein Niveau zwischen etwa 6,5 und 7,5 unter Verwendung einer Säure (z.B. CO2) oder einer Base (z.B. Na2CO3 oder NaOH) eingestellt. Ein geeigneter Temperaturbereich zum Kultivieren von Säugetierzellen beläuft sich etwa auf zwischen 30 und 38°C, und ein geeigneter dO2-Bereich beläuft sich etwa auf zwischen 5–90% Luftsättigung.
  • Vorteilhafterweise können die Zellen der vorliegenden Erfindung mit mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium anstelle der embryonalen Schwannschen Zellen co-kultiviert und isoliert werden. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das zuvor beschriebene Medium mit Kulturmedium ergänzt, das aus der Kultur von embryonalen Schwannschen Zellen erhalten wurde. Vorzugsweise wird solches konditioniertes Medium aus der Kultur embryonaler Schwannscher Zellen nach etwa 1 bis 4 Tagen nach Beginn einer embryonalen Schwannschen Zellkultur erhalten. Zumindest sollten die embryonalen Schwannschen Zellen Konfluenz erreicht haben, bevor das Kulturmedium geerntet wird. Vorzugsweise wird der Kulturüberstand aus den embryonalen Schwannschen Zellen durch Entfernen der Zellen geerntet. Dies erfolgt im Allgemeinen durch Zentrifugation und/oder Filtration. Das verbleibende Kulturmedium wird als ein Mediumszusatz verwendet.
  • Mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertes Medium, das auf diese Weise erhalten wird, kann im erhaltenen Zustand als ein Mediumszusatz verwendet werden oder es kann zuerst konzentriert werden. Das Konzentrieren erfolgt im Allgemeinen unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Konzentrationsvorrichtung das Zurückhalten von im Wesentlichen allen Proteinsubstanzen ermöglichen soll. Dies bedeutet im Allgemeinen, dass eine Vorrichtung mit einem geringen, Protein-bindenden Molekulargewichts-Cutoff von etwa zwischen 3.000 und 5.000 kDa zu verwenden ist. Diese Konzentration ermöglicht im günstigen Fall Zusätze von geringerem Volumen zum zuvor beschriebenen Medium.
  • Die Menge des mit embryonalen Schwannschen Zellen konditionierten Mediums (ESCCM), das als ein Mediumszusatz verwendet wird, ist keine festgesetzte Menge und variiert mit der Charge des verwendeten konditionierten Mediums. Das ESCCM sollte zumindest in einer Menge vorhanden sein, die ausreichend ist, um das Wachstum der neuralen Epithelzellen der vorliegenden Erfindung zu fördern. Mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertes Medium wird in einem Verhältnis von etwa 1:1 bis etwa 10 : 1 Teilen der zuvor beschriebenen Medienformulierung zu mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium zugesetzt, und vorzugsweise mit etwa 5 Teilen der zuvor beschriebenen Medienformulierung zu etwa 1 Teil ESCCM. Wird ESCCM vor seinem Zusatz als ein Medienzusatz konzentriert, variiert die Menge von ESCCM-Medium, das als ein Zusatz zugesetzt wird, gemäß der Konzentration. Im Fall von zehnfach konzentriertem ESCCM wird ESCCM dem Grundmedium im Bereich von 1 Vol.-% bis etwa 50 Vol.-%, und vorzugsweise zu etwa 30 Vol.-%, zugesetzt.
  • Wird das Neuralgewebe in Co-Kultur mit den embryonalen Schwannschen Zellen platziert, so ist es nicht erforderlich, das Grundmedium mit mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium zu ergänzen. Neuralgewebe wird auf die mit der geeigneten extrazellulären Matrix, der embryonale Schwannsche Zellen zugesetzt wurden, vorbeschichteten Platten ausgestrichen. Die in Co-Kultur verwendete Anzahl embryonaler Schwannscher Zellen variiert mit der Größe des Kulturgefäßes. Eine Menge an embryonalen Schwannschen Zellen, die ausreicht, um einen Monolayer in der Kultur zu bilden, ist ausreichend. Im Allgemeinen ist eine Anzahl an embryonalen Schwannschen Zellen, die bei einer anfänglichen Dichte von etwa 1 bis etwa 5 × 105 Zellen pro cm2 Kulturmedium ausgestrichen werden, ausreichend.
  • Neurale Epithelvorläuferzellen, die aus dem dispergierten Neuralgewebe wie zuvor beschrieben erhalten werden, werden unter Berücksichtigung der Tatsache ausgestrichen, dass die Zellen Zell-zu-Zell-Kontakts bedürfen, um zu überleben. Optimales Zellwachstum wird bei einer anfänglichen Plattierungsdichte von etwa zwischen 0,5 bis etwa 5 × 105 Zellen pro ml erreicht.
  • Unter diesen Bedingungen überleben neurale Epithelvorläuferzellen und vermehren sich, um große Kolonien kompakter Monolayer-Epithelzellen zu bilden, die manche differenzierte Neuronen enthalten, die lange Fortsätze aufweisen.
  • Nach etwa 2–6 Tagen in Kultur, und im Allgemeinen nach etwa 4 Tagen in Kultur, werden Kolonien neuraler Epithelvorläuferzellen, die wie zuvor beschrieben erhalten wurden, von den mit extrazellulärem Matrixprotein beschichteten Platten entfernt und im Medium wie zuvor beschrieben bei einer Dichte von etwa 1–2 × 105 Zellen/ml neu ausplattiert. Die Zellen werden durch Wiederholen dieses Verfahrens in mehreren Zellpassagen subkultiviert. Im Allgemeinen werden 5 bis 6 Passagen durchgeführt.
  • Während dieser Phase enthalten die Kulturen zwei Hauptzelltypen, wovon einer der neurale Epithelvorläuferzelltyp der vorliegenden Erfindung und der andere eine bipolare Schwannsche-Zelle-ähnliche Zelle ist. Die bipolaren Schwannschen Zellen werden durch Entfernen von Heregulin aus dem Kulturmedium aus der Kultur entfernt.
  • Hiernach werden normale neurale Vorläuferzelllinien in Kultur in Medium wie beschrieben, und vorzugsweise in F12/DME, ergänzt mit Forskolin, BPE, Transferrin, Progesteron und α-Tocopherol, aufrechterhalten. Embryonale Schwannsche Zellen oder mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertes Medium sind/ist im Allgemeinen nur erforderlich, um die Zelllinie der vorliegenden Erfindung zu isolieren.
  • Zelllinien, die von Embryonen isoliert werden, können zur langfristigen Lagerung in serumfreiem Medium, das 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glycerin enthält, eingefroren werden.
  • VERWENDUNG
  • Neurale Epithelvorläuferzellen produzieren zahlreiche neurotrophe und neurale Wachstums-fördernde Faktoren (Placek et al., Development 117, 205–218 (1993); Ghosh & Greenberg, Neuron 15, 89–103 (1995)) und reagieren selbst auf zahlreiche Wachstums-fördernde Substanzen. Demgemäß können normale neurale Epithelzellen, die unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren isoliert und kultiviert wurden, verwendet werden, um diese Faktoren zu produzieren und nachzuweisen. Es ist wünschenswert, über Populationen normaler neuraler Epithelvorläuferzellen in Zellkultur zur Isolierung und Detektion von für neurale Epithelvorläuferzellen spezifischen Faktoren, wie beispielsweise als "sonic hedgehog" (SHH) bezeichnete Igelgene (M. Hynes et al., Neuron 15, 34–44 (1994)), zu verfügen. Solche Faktoren sind selbst als Diagnosemittel nützlich oder können als Antigene verwendet werden, um Antikörper für diagnostische Verwendungen zu bilden.
  • Die Zelllinien selbst sind für diagnostische Zwecke nützlich. Beispielsweise können die Zellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Gegenwart verschiedener Wachstums-fördernder Substanzen nachzuweisen. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Zellen verwendet werden, um das Isolieren spezifischer neuraler Epithelwachstums-fördernder Faktoren während des Ablaufs eines Isolierungsverfahrens zu überwachen. Zellbasierte Tests können unter Verwendung der neuralen Epithelvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung einfach angelegt werden. Beispielsweise wird die Synthese von DNA und die Einbindung eines radioaktiv markierten Nucleotids üblicherweise in zellbasierten Tests zur Bestimmung der Reaktionsfähigkeit auf eine bestimmte Probe, die eine Wachstums-fördernde Substanz enthält, verwendet. Solche Zelltests können für die Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit klinisch relevanter Substanzen oder im Laufe einer therapeutischen Behandlung diagnostisch relevant sein.
  • Alternativ dazu können die normalen neuralen Epithelzellen zur rekombinanten Expression und Produktion verschiedener Proteine verwendet werden. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung können die Zelllinien, die mittels der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der eine Nucleinsäuresequenz enthält, die für ein Protein nach Wahl kodiert. Durchschnittlichen Fachleuten ist es möglich, ein geeignetes DNA-Expressionssystem zur Verwendung in Verbindung mit den Zelllinien der vorliegenden Erfindung auszuwählen. Proteine, die auf diese Weise produziert werden, besitzen vorteilhafterweise die bestimmten Glykosylierungsmuster, die für die neurale Epithelvorläuferzelle charakteristisch sind.
  • Ein Vorteil ist auch, über Populationen von nichtmenschlichen Säugetier-NEP-Zellen zur Verwendung in zellbasierten Therapien zu verfügen. Die NEP-Zellen der vorliegenden Erfindung können alleine oder in Kombination mit anderen Zelltypen zur direkten Transplantation in Bereiche von geschädigtem Neuralgewebe zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen des Nervensystems verwendet werden. Die Zellen alleine oder in Kombination mit anderen Zelltypen sorgen für direkte Ersetzung und zusätzliche Unterstützung der Regeneration oder Repopulation einer Nervensystemläsion. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die normalen neuralen Epithelzellen in einem geeigneten pharmazeutischen Vehikel wie hierin beschrieben formuliert. Isolierte NEP-Zellen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die NEP-Zellen umfassen, oder Prothesen, die mit den NEP-Zellen gefüllt sind, können unter Verwendung jedes beliebigen, auf dem Gebiet der Behandlung neurologischer Erkrankungen, wie jener zuvor erwähnten, und insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen oder Störungen umfassend degenerative Läsionen in Verbindung mit Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntington-Chorea oder amyotropher lateraler Sklerose, bekannten Verfahrens in eine Nervensystemläsion eingeführt werden.
  • Die normalen neuralen Epithelzellen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine Repopulation von Bereichen neuronaler Schäden oder Degenerationserscheinungen zu ermöglichen. Diese Art von zellbasierter Therapie ist analog zur unilateralen Transplantation menschlichen fötalen Mittelhirngewebes in den Nucleus caudatus von Patienten mit Parkinson-Krankheit (Spencer et al., New England J. Med. 327, 1541–1548 (1992)). Alzheimer-Krankheit und andere Störungen wie Down-Syndrom, postenzephalitischer Parkinsonismus oder Dementia pugilistica sind durch neuronalen Zellverlust und Veränderungen der neuronalen Morphologie gekennzeichnet (Goldman & Côté, "Aging of the Brain" (199x)). Die neuralen Epithelvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung, die zu In-vivo-Differenzierung und -Integration in der Lage sind, können verwendet werden, um für eine Repopulation von spezifischen Bereichen geschädigten neuronalen Gewebes zu sorgen. Verfahren zur Zufuhr von Zellen in das Gehirn sind im Allgemeinen bekannt und in den Internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 90/06757 und Nr. WO 93/14790 beschrieben.
  • Neuraltransplantation bindet die Transplantation der neuralen Epithelvorläuferzellen in oder auf das Zentralnervensystem eines Wirts oder Empfängers ein. Diese Verfahren umfassen die Transplantation der neuralen Epithelvorläuferzellen innerhalb eines Wirtsgehirns, wie beispielsweise intraparenchymale Transplantation, sowie die Ablagerung der Zellen auf einer Oberfläche im Wirtsgehirn in einem gelatinösen Vehikel wie jene, die zuvor beschrieben wurden. Intraparenchymale Transplantation kann durch Injizieren der neuralen Epithelvorläuferzellen der Erfindung in ein Wirts- oder Rezipientengehirnparenchym erfolgen: Verfahren zur Transplantation von Zellen in ausgewählte Regionen eines Wirtsgehirns sind im Allgemeinen bekannt und umfassen jene, die in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 90/06757 sowie in den darin zitierten Verweisen beschrieben werden.
  • Zur Transplantation werden im Allgemeinen die isolierten neuralen Epithelvorläuferzellen in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel wie beispielsweise einer ausgeglichenen Glucose-Salzlösung suspendiert und in eine vorbestimmte Region des Wirtsgehirns unter Verwendung einer sterilen Mikrospritze injiziert. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transplantation von Zellen, umfassend das Isolieren eines normalen neuralen Epithelzelltyps und das Injizieren oder Transplantieren der normalen neuralen Epithelzelle in oder auf ein Empfängergehirn.
  • In einer besonderen Ausführungsform können die normalen neuralen Epithelzellen verwendet werden, um für neurale Epithelvorläuferzellen spezifische Proteine zur Abgabe von endogenen neurotrophen und neuralen Wachstums-fördernden Faktoren in vivo zu produzieren. Alternativ dazu sind zur Zeit zahlreiche Verfahren zur genetischen Modifikation von Zellen neuralen Ursprungs für die ortsgerichtete Zufuhr biologisch aktiver Proteine erhältlich. Beispielsweise kann im Falle der Alzheimer-Krankheit ein Mangel an Acetylcholin durch die Zufuhr des Acetylcholins unter Verwendung der vorliegenden Zelllinie als Vehikel für die In-situ-Expression des Neurotransmitters behoben werden. Erst jüngst wurden neurale Vorläuferzellen als Träger für Nervenwachstumsfaktor im Gehirn verwendet (Martinez-Serrono, Neuron 15, 473–484 (1995)). Es kann beispielsweise möglich sein, ein Gen, das für ein spezifisches Molekül kodiert, das dafür bekannt ist, Nervenfaserwachstum zu fördern, oder ein Gen für ein spezifisches Wachstumsfaktormolekül, von dem angenommen wird, dass es Neuronalheilung unterstützt oder fördert, einzuführen. Die neuralen Epithelvorläuferzellen können mit einer DNA-Sequenz, die für ein biologisch aktives Protein wie beispielsweise Säugetier-Nervenwachstumsfaktor oder Neurotransmitter kodiert, transfiziert oder infiziert und daraufhin für gesteigerte lokalisierte Produktion des Proteins verwendet werden. Zell- und ortsspezifische Expression spezifischer Moleküle resultiert im Allgemeinen in lokaler Produktion von prophylaktisch und therapeutisch wirksamen Mengen des erwünschten biologisch aktiven Proteins. Verfahren zur Transplantation von Zellen, die ein transfiziertes Genprodukt im Gehirn exprimieren können oder nicht, sind im Allgemeinen in den Internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 93/14790 und WO 93/10234 bereitgestellt.
  • Als Beispiel, das nicht als Einschränkung zu verstehen ist, wird ein rekombinanter retroviraler Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein biologisch relevantes Protein kodiert, verwendet, um die neuralen Epithelvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung in vitro direkt zu infizieren. Die infizierten Zellen können dann unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren dem spezifischen Gewebezielort zugeführt werden, worin diese Verfahren solche umfassen, die üblicherweise verwendet werden, um in Bereichen vermuteter Neuronalschäden Repopulationen zu bewirken, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Jede beliebige Anzahl an retroviralen Konstrukten, die ein biologisch aktives Protein exprimieren, können von Fachleuten gemäß diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden.
  • Wie hierin beschrieben bedeutet die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbar" im Allgemeinen durch eine Aufsichtsbehörde der Bundes- oder Staatsregierung anerkannt oder in der US-Pharmakopöe oder anderen allgemein anerkannten Pharmakopöen zur Verwendung an Tieren, insbesondere an Menschen, eingetragen. Pharmazeutische Formulierungen, umfassend isolierte NEP-Zellen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Vehikel, wie hierin beschrieben, können unter Verwendung der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt werden. Geeignete Formulierungen umfassen biologische Puffer wie beispielsweise Phosphat-gepufferte Salzlösung, Salzlösung, Dulbecco's Medium und dergleichen. Die Formulierung der Wahl kann unter Verwendung einer Vielzahl der zuvor genannten Puffer oder sogar unter Einbindung von Arzneimittelträgern, beispielsweise von pharmazeutischen Konzentrationen von Glucose, Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen vervollständigt werden. Gegebenenfalls kann die pharmazeutische Formulierung ein oder mehrere mitogene Mittel und andere Komponenten (z.B. extrazelluläre Matrixproteine wie beispielsweise Laminin) umfassen. Wird ein gelatinöser Träger als pharmazeutisch annehmbares Vehikel verwendet, können die NEP-Zellen in eine Flüssigphase des Vehikels eingeführt werden, das so behandelt werden kann, dass es fester wird (z.B. kann ein unpolymerisiertes Vehikel zur Polymerisierung veranlasst werden). Beispielsweise können die NEP-Zellen zugesetzt werden, nachdem Collagen, das in Essigsäure löslichgemacht wurde, in H2O durch Zusatz einer geeigneten Base wie beispielsweise NaOH auf einen neutralen pH gebracht und durch Zusatz von Salzen isotonisch gemacht wurde.
  • Die NEP-Zellen können auch in Prothesen oder Vorrichtungen, wie beispielsweise jene, die in der Literatur beschrieben wurden, zugeführt werden. Im Allgemeinen wird ein festes poröses Rohr, gefüllt mit den NEP-Zellen (vorzugsweise in ein gelatinöses Vehikel formuliert), als Prothese verwendet.
  • Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt und dienen nicht als Einschränkung. Die Offenbarungen aller Anführungen in der Beschreibung sind hierin durch Verweis aufgenommen.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Einführung
  • Aufgrund ihres Entwicklungspotentials wurden Neuroepithelzellen von 9 Tage alten Rattenembryonen im 0-Somit-Entwicklungsstadium in einem serumfreien Hormon-ergänzten Medium gezüchtet. Hier wird nun das Isolieren, die Etablierung und die Charakterisierung einer neuroepithelialen Vorläuferzelllinie, die dazu veranlasst werden kann, sich in vitro und in vivo zu neuralen Zelltypen zu differenzieren, dargestellt.
  • Verfahren
  • A. Neuroepithelzellwachstum
  • E9-Ratten-Neuralrohre (0-Somit) wurden unter einem Seziermikroskop unter Verwendung dünner Nadeln seziert. Der Schwanzteil wurde durch Schneiden durch die Mitte des Hassen-Knotens entfernt. Mesoderm und Endoderm wurden nach einer kurzen Inkubation mit Collagenase und Dispase (Boehringer Mannheim, 0,2%, 10 min bei 0°C) entfernt. Die sauberen Neuralrohre wurden 5× durch Transfer von F12/DMEM-Platte zu F12/DMEM-Platte mit 1% BA gewaschen. Die Neuralrohre wurden dann in kleine Aggregate (vorzugsweise 20 bis 50 Zellen in jedem Aggregat) durch vorsichtiges Pipettieren mit gelben Spitzen auf einem 200-μl-PipetmanTM-Pipettierer dispergiert. Vollständige Dispersion sollte hierbei vermieden werden. Die dispergierten Zellen wurden in 96-Well-Multiplatten (bei einer Dichte von 20 Neuralrohren aufgeteilt auf 96 Wells), die mit Anlagerungsfaktoren vorbeschichtet waren, in serumfreiem Medium, ergänzt mit verschiedenen Kombinationen an Wachstumsfaktoren, ausplattiert. Gutes Zellüberleben und -wachstum wurde nur unter Bedingungen, die Rinderhypophysenextrakt (Roberts et al. (1989), s.o.), Insulin, Forskolin enthielten, und entweder bei Co-Kultur mit der embryonalen Schwannschen Zelllinie oder mit konzentriertem, mit Schwannschen Zellen konditioniertem Medium (ESCCM) festgestellt. Unter diesen Bedingungen überlebten manche Vorläuferzellen und vermehrten sich, um große Kolonien kompakter Monolayer-Epithelzellen zu bilden, die manche differenzierte Neuronen enthielten, die lange Fortsätze aufwiesen. Unter anderen Bedingungen starben Zellen innerhalb vier Tage in Kultur.
  • B. Langfristige Kultur
  • Epithelzellkolonien, die sich in der Primärkultur in F12/DME, ergänzt mit 7F (Forskolin (etwa 5 μM), BPE (etwa 10 μg/ml, Insulin (etwa 5 μg/ml), Transferrin (etwa 5 μg/ml), Heregulin (etwa 3 nM), Progesteron (etwa 2 × 10–8 M), α-Tocopherol (etwa 5 μg/ml)) und ESCCM, bildeten, wurden aus dem Substrat mit 0,2% Collagenase/Dispase bei 37°C entfernt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation auf einem Layer von 3% BA von Enzymen freigewaschen und auf Laminin-beschichtete 24-Well-Platten mit F12/DME, ergänzt mit 7F, ausplattiert. Die Zellen wurden auf herkömmliche Weise in 5–6 Passagen desselben Verfahrens subkultiviert. Während dieser Phase enthielten die Kulturen zwei Hauptzelltypen, wovon einer jener der kompakten Epithelzellen ist und der andere jener der bipolaren Zellen ist, die Schwannschen Zellen oder radialen Gliazellen ähnlich sind, die in weiterer Folge durch Entfernen von Heregulin aus dem Kulturmedium und Wachsenlassen der Epithelzellen zu einer höheren Dichte aus der Kultur entfernt wurden. Die Zellen wurden dann in 6F-Medium (7F-Medium ohne Heregulin) auf Laminin-beschichtete Platten übertragen und jede Woche unter Verwendung einer 1:4-Aufteilung passagiert.
  • C. Studien der Zellvermehrung
  • Zellen zwischen den Passagen 25 und 35 wurden in den nachstehend beschriebenen Experimenten verwendet. Die Zellen wurden auf übliche Weise von den Kulturgefäßen entfernt und bei der angegebenen Dichte in Laminin-beschichtete 24-Well-Platten in F12/DME-Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an zu testendem Wachstumsfaktor ausplattiert. Alternativ dazu wurden die Zellen in 6F 24 Stunden lang ausplattiert, und anschließend wurde der zu untersuchende Wachstumsfaktor in unterschiedlichen Konzentrationen in Gegenwart aller anderen Wachstumsfaktoren in 6F zugesetzt. Zellanzahlen wurden unter Verwendung eines Coulter-Zählers nach vollständiger Dispersion der Zellen mit Trypsin-EDTA (Gibco BRL) bei 37°C zumindest 15 Minuten lang gezählt.
  • D. Studien der Zelldifferenzierung:
  • Die Zellen wurden in 6F (Insulin (5 μg/ml), Transferrin (5 μg/ml), α-Tocopherol (5 μg/ml), Progesteron (2 × 10–8 m), Forskolin (5 μM) und Rinderhypophysenextrakt (10 μg/ml)) bei einer 1:8-Aufteilung in Laminin-beschichtete 24-Well-Platten mit F12/DME, ergänzt mit 6F, 48 Stunden lang ausplattiert und anschließend mit F12/DME gewaschen und neuerlich mit frischem Medium, ergänzt mit Insulin, Transferrin und α-Tocopherol, versetzt. Wachstumsfaktoren wie bFGF (rekombinanter menschlicher bFGF, Gibco BRL), aFGF (rekombinanter menschlicher aFGF, Gibco BRL), Forskolin (Calbiochem) und/oder NGF (7,5-S-Maus-NGF, Collaborative Research Inc.) wurden einzeln oder in Kombinationen wie angegeben zugesetzt. Das Medium wurde einmal nach einer 48-stündigen Inkubation mit den jeweiligen Faktoren ersetzt. Die Kulturen wurden zur immuncytochemischen Untersuchung zur angegebenen Zeit mit eiskaltem 1%igem Glutaraldehyd (Ted Pella, Inc.) in einer 3%igen Saccharoselösung auf Eis 30 Minuten lang fixiert. Die fixierten Zellen wurden mit eiskaltem Milli-Q-Wasser gespült, mit Methanol, das 3% H2O2 enthielt, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt und mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit PBS, das 0,2% TRITON X-100TM-Detergens, 5% Ziegenserum und 0,1 M NH4HCO3 enthielt, 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Primärantikörper wurden in Verdünnungspuffer (PBS mit 0,1% TRITON X-100TM-Detergens und 1% BA) verdünnt und mit 250 μl/Well zugesetzt. Inkubation mit Primärantikörpern wurde über Nacht bei 4°C durchgeführt. Überschüssiger Primärantikörper wurde 5× mit dem Verdünnungspuffer gewaschen, und die Zellen wurden anschließend mit geeigneten Enzym-konjugierten Sekundärantikörpern (Anti-Maus-Ig-F(ab)'-alkalischer Phosphatase, Anti-Maus-Ig-F(ab)'-Peroxidase und Anti-Kaninchen-IgG-F(ab)'-Peroxidase, bei Boehringer Mannheim erworben) bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden 5× mit Verdünnungspuffer und 2× entweder mit 0,05 M Natriumacetat, pH 5,0, für Peroxidase-Konjugate oder mit Phosphatase-Substratpuffer gewaschen. Aktivität von spezifisch gebundener Peroxidase wurde mit DAB-H2O2-Lösung, die unter Verwendung des Sigma-Peroxidase-Sets hergestellt wurde, nachgewiesen. Alkalische Phosphatase wurde mit alkalischem Phosphatase-Substrat von Boehringer (NTB/BCIP), verdünnt in Substratpuffer, nachgewiesen. Die Farbentwicklungsreaktion wurde durch sorgfältiges Spülen mit Leitungswasser beendet, und die Muster wurden in Glycerin/PBS (50 : 50) konserviert. Die gefärbten Proben wurden beobachtet, und Mikrofotografien wurden unter Verwendung eines offenen Nikon-Hellfeldmikroskops aufgenommen.
  • E. Immunfluoreszenz
  • Zur Nestin-Immunfluoreszenz wurden Zellen, gezüchtet auf Kammerobjektträgern, in situ mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer, pH 7,0, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Zellen wurden 3× mit PBS gewaschen und mit 5% Ziegenserum in PBS plus –0,2% TRITON X-100TM-Detergens bei 37°C 60 Minuten lang blockiert. Anti-Nestin-Antiserum entstand in Kaninchen gegen die letzten 1.200 Aminosäuren in der Ratten-Nestinsequenz. Das Antiserum wurde zu 1 : 1.000 mit Verdünnungspuffer verdünnt (und mit den Zellen bei 4°C über Nacht inkubiert). Nach 5 Waschschritten mit Verdünnungspuffer (PBS mit 0,1% TRITON X-100TM-Detergens und 1% BA) wurden die Proben mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-F(ab)'-FITC (Boehringer Mannheim) bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Objektträger wurden 5× mit Verdünnungspuffer gewaschen und in 50% Glycerin in PBS versiegelt. Spezifische Immunfluoreszenz wurde beobachtet, und Mikrofotografien wurden unter dem NIKONTM-Auflichtfluoreszenz-Mikroskop aufgenommen.
  • F. Western-Blotting
  • Etwa 106 Zellen wurden direkt in 100 μl Ladungspuffer aufgelöst und 5 min lang auf 95°C erhitzt. Die Probe wurde auf Eis gekühlt und auf ein Minigel (Novex vorgefertigtes SDS-Gel, 4–20%) geladen. Die Probe wurde mit SDS-Elektrophorese bei 75 mA fraktioniert, bis sich die Farbfront dem Ende näherte. Elektrischer Transfer auf Nitrocellulosemembran wurde in Tris-Glysin-Methanol-Puffer bei 100 V 1 Stunde lang durchgeführt. Die Membran wurde mit Wasser gewaschen und durch Inkubation mit 1% BA bei 37°C unter leichtem Schütteln gesättigt. Inkubation von Primärantikörpern (Anti-Nestin-Antiserum 1:1.000, Anti-Neuronen-spezifisches Antiserum 1:1.000) wurde bei 37°C 2 Stunden lang durchgeführt. Überschüssige Primärantikörper wurden mit drei Änderungen des Inkubationspuffers, 10 Minuten pro Änderung, weggewaschen. Die Membran wurde dann mit Anti-Kaninchen-IgG-F(ab)'-Peroxidase 1 Stunde lang inkubiert. Schließlich wurde die Membran mit DAB-H2O2 wie zuvor für die Immuncytochemie beschrieben gefärbt.
  • Ergebnisse
  • Neuroepithelzellen, die aus E9-Rattenembryonen seziert wurden, überlebten unter den meisten serumfreien Bedingungen nur schlecht. Keine Zellen überlebten 4 Tage lang unter Bedingungen, die mit EGF, FGF, IGF und Neurotropinen alleine oder in Kombination ergänzt waren. Signifikantes) Zellüberleben und -vermehrung wurde nur bei jenen Zellen festgestellt, die mit embryonalen Schwannschen Zellen in Gegenwart von Schwannschen-Zellwachstumsmedium co-kultiviert wurden, das Insulin, Transferrin, α-Tocopherol, Progesteron, Forskolin, Rinderhypophysenextrakt und rekombinantes menschliches Heregulin enthielt. Unter diesen Bedingungen vermehr ten sich Epithelzellen rasch und bildeten große Zellkolonien, die die Schwannschen Zellen abstießen oder unter dem Schwannschen-Zell-Monolayer wuchsen. Diese Zellkolonien können nach Subkultur Sekundärkolonien bilden. Der Zusatz von bFGF zu den Sekundärkulturen brachte die Zellen dazu, sich zu langen Fortsätzen auszudehnen, die morphologisch neuronalen Fortsätzen glichen.
  • Um reine Zellen zu erhalten, wurden mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertes Medien (ESCCM) sowie Kulturen mit Trans-Well-Inserts, die Schwannsche Zellen enthielten, getestet. Dies trennt die Schwannschen Zellen von den Neuroepithelzellen durch eine physische Grenze, ermöglicht jedoch zahlreichen Molekülen, die aus Schwannschen Zellen sekretiert werden, durchzudringen. Beide Verfahren führten zum Überleben und zur Vermehrung eines geringen Anteils der Neuroepithelzellen, die große Epithelzellkolonien mit manchen differenzierten Neuronen, die lange Fortsätze aufwiesen, nach 10 Tagen. Keine Zellen überlebten unter Bedingungen ohne ESCCM oder Co-Kultur. Die Zellen, die in Gegenwart von ESCCM gezüchtet worden waren, wurden erfolgreich subkultiviert. Während der ersten 5 bis 6 Passagen umfassten die Kulturen ein Gemisch aus Zelltypen, Epithel-Zelltyp, spiralförmiger, Schwannsche-Zell-ähnlicher Zelltyp und aggregierte kleine Neuronen mit langen und dünnen Fortsätzen. Sekundärkulturen bedurften keines mit Schwannschen Zellen konditionierten Mediums mehr. Der Epithel-Zelltyp wurde angereichert und wurde in darauf folgenden Kulturen durch Entfernen von Heregulin, einem potenten Gliazellen-Mitogen, und durch Aufrechterhalten einer hohen Dichte der Zellen dominant.
  • Diese normalen neuralen Epithelvorläuferzellen erforderten für ihr Überleben und Wachstum Zell-zu-Zell-Kontakt. Das Dispergieren der Kultur zu einzelnen Zellen, auch mit einer kurzen Trypsin-Behandlung, resultierte im Zelltod. Optimales Wachstum wurde erreicht, wenn die Zellen in einer Dichte von 1–2 × 105 Zellen/cm2 ausplattiert wurden. Es wurde eine Populations-Verdoppelungszeit von 50 Stunden berechnet, wobei jedoch die Wachstumsgeschwindigkeit mit einem ausgeprägten Anstieg der Verdoppelungszeit, wenn die Zellen dichter werden, nicht linear ist. Konfluente Kultur erreichte eine Dichte von 106 Zellen/cm2, blieb jedoch stets in Form eines Monolayers. Die Zellen wurden kontinuierlich mehr als 40 Passagen lang (> 80 Populationsverdoppelungen) gezüchtet, und es wurde weder augenscheinliche Veränderung der Zellmorphologie und des Wachstumsprofils noch offensichtliche Zellalterung beobachtet.
  • Zellmorphologie
  • Die Zelllinie wies eine Monolayer-Epithelzellen-Morphologie mit einem hohen Nucleus/Zytoplasma-Verhältnis während der wie beschriebenen, herkömmlichen Subkultur auf. Die meisten Zellen zeigten positive immunfluoreszierende Färbung des Neuralvorläuferzell-spezifischen Zwischenprodukt-Filamentproteins Nestin. Ein Western-Blot von solubilisierten Zellmembranen, gefärbt mit Anti-Nestin-Antikörper, zeigte eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 220 kDa, was mit dem bekannten Molekulargewicht von Nestin übereinstimmt. Ein geringer Anteil (< 5%) zeigte ebenfalls positive Färbung für Neuronen-spezifische Enolase, die im Western-Blot ein Molekulargewicht von 46 kDa aufwies.
  • Wachstumsfaktorreaktion
  • Die NEP-Zelllinie erforderte die Gegenwart von Insulin, Rinderhypophysenextrakt und Forskolin (oder von Choleratoxin oder cAMP-Analoga) zum Überleben und Wachstum. Das Entfernen eines dieser drei Wachstumsfaktoren resultierte in einer starken Abnahme der Zellanzahl (1A). Optimale Konzentrationen dieser Wachstumsfaktoren wurden folgendermaßen bestimmt: 10 μg/ml Insulin, 3–10 μM Forskolin und 0,3 Vol.-% Rinderhypophysenextrakt (1B und 1C). Insulin kann auch durch Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren ersetzt werden. Die Zellen sind auf IGF-1 empfindlicher als auf IGF-II (1D). Wachstumsfaktoren wie PDGF, EGF, Heregulin, Leukozyten inhibierender Faktor (LIF), Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Neurotropine (NGF, NT-3 und BDNF) führten zu keinem Anstieg der Zellanzahl (1E, 1F). Mitglieder der TGFβ-Familie von Wachstumsfaktoren hatten eine Hemmwirkung auf das Zellwachstum (2A). Der Zusatz von TGFβ1 führte zu signifikantem Zelltod (2A). In Abwesenheit von Forskolin und BPE steigerte bFGF das Zellüberleben. Während all die Zellen in F12/DME, das nur mit Insulin ergänzt war, starben, bewirkte der Zusatz von bFGF, dass ein große Anteil der Zellen in Form von flotierenden Zellaggregaten überlebte. Der Zusatz von bFGF in Gegenwart von 7F hemmte jedoch die Zellvermehrung sehr stark und führte nach 24 Stunden der Behandlung zu einer vollständigen Blockierung des Zellwachstums. Im Gegensatz dazu zeigte aFGF nur geringe Wirkung (2B).
  • In-vitro-Differenzierung der NEP-Zelllinie:
  • Um diese Hypothese zu testen, wurden Zellen in Gegenwart von 6F alleine (Insulin, Transferrin, Rinderhypophysenextrakt, Heregulin, Progesteron und α-Tocopherol), von 6F + bFGF oder von 6F + bFGF + Forskofin 48 Stunden lang gezüchtet und anschließend fixiert und für zahlreiche Neuronalmarker immungefärbt. Die Zellen zeigten eine ausgeprägte Veränderung der Morphologie in Gegenwart von bFGF und eine weitere Entwicklung hin zu Neuronal-ähnlicher Morphologie in Gegenwart von bFGF + Forskolin. Diese morphologischen Veränderungen gingen einher mit der erhöhten Expression von neural-spezifischen Markern, die durch Immunhistochemie sichtbar gemacht wurden. Die Anzahl an exprimierenden Zellen und das Ausmaß der Expression von Vimentin und Tubulin β erhöhte sich durch FGF und erhöhte sich weiter durch die Kombination von bFGF und Forskolin. Spezifische Neuronalmarker, wie beispielsweise Map-2, Peripherin und das 160-kd-Neurofilamentprotein (NF 160), wurden ebenfalls induziert, wenn die Zellen morphologisch gesehen stärker differenziert wurden, obwohl diese in verschiedenen Ausmaßen und auf verschiedene Weisen unter den unterschiedlichen Bedingungen exprimiert wurden. Beispielsweise wurde NF 160 nur in manchen Zell/Zell-Kontakten unter den Kontrollbedingungen exprimiert. Mit FGF alleine gab es kontinuierliche Expression an den Kontaktstellen und gewisse zytoplasmatische Expression, während unter den FGF + Forskolin-Bedingungen NF160 an der Zelloberfläche und in den neuralen Extensionen sowie zytoplasmatisch gesehen werden kann. Während Map2 von den meisten Zellen in Gegenwart beider Faktoren exprimiert wird, ist Peripherin nur auf einigen wenigen Zellen vorhanden. Zellen, die beiden Faktoren ausgesetzt werden, exprimieren Proteinkinase c (Pkc) sowie die exzitatorischen Aminosäuren Glutamat und Aspartat. Neuronen-spezifische Enolase, Synaptophysin, und Tau wurden auch in manchen Zellen in den Kulturen induziert. Geringe Konzentrationen an Gliamarkern wie beispielsweise GFAP und Gal-c wurden in manchen Zellen unter manchen Bedingungen induziert. Diese Resultate sind in Tabelle I zusammengefasst.
  • Tabelle I Induktion
    Figure 00420001
  • Beispiel II
  • In-vivo-Injektion und Differenzierung von NEP-Zellen
  • NEP-Zellen wurden wie zuvor beschrieben isoliert und expandiert. Etwa 1 × 105 bis 1 × 106 Zellen wurden aus der Kultur entfernt und in einer ausgeglichenen Salzlösung, die Glucose enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden über eine sterile Mikrospritze in neonatales Rattengehirn injiziert.
  • NEP-Zellen zur Implantation wurden mit dem fluoreszierenden lebensfähigen Zellmarker PKH-26 markiert. Wenn in neonatales Rattengehirn injiziert, ließen die NEP-Zellen mehrere einzelne neurale Zell-Phänotypen entstehen. Zwei Hauptzelltypen mit typischer Morphologie wurden innerhalb der passenden Schicht des Zerebellums identifiziert. Diese Zellen wiesen die Morphologie auf, die für Bergman-Glia- und -Körnerzellen charakteristisch waren. Im Hippocampus integrierten sich die meisten Fluoreszenz-markierten Zellen in die Fascia dentata. Der Großteil dieser Zellen hatte eine für gezahnte Körnerzellen typische Morphologie. Andere Zellen zeigten Neuronal-ähnliche Differenzierung, konnten jedoch durch die Morphologie nicht präzise kategorisiert werden. In der Großhirnrinde sponnen Bündel von Zellfortsätzen die ventrikulare Region hinauf bis an die Oberfläche des Cortex mit Endverzweigungen, die radialen Gliazellfortsätzen glichen. Manche der Zellkörper wurden zurückverfolgt und innerhalb des Seitenventrikels lokalisiert. Integrierte Zellen wurden auch in der linken Hemisphäre gefunden, obwohl Zellen nur in die rechte Hemisphäre des Gehirns injiziert worden waren.
  • Der Großteil der Neuronen, die sich aus den NEP in vitro in Gegenwart von bFGF und Forskolin differenzierten, wiesen Marker auf, die mit einer Cortexneuronenidentität übereinstimmten. Die differenzierten Neuronen exprimierten ein Proteinkinase-C-Isoenzym, das ausschließlich in ZNS-Cortexneuronen exprimiert wird. Weiters akkumulierten diese Neuronen die exzitatorischen Aminosäuren Glutamat und Aspartat in ihrem Zytoplasma und in den Zellfortsätzen. Diese Aminosäuren werden als Neu rotransmitter ausschließlich in Cortexneuronen verwendet. Die Daten zu den In-vitro-Experimenten wurden durch die Ergebnisse aus den In-vivo-Experimenten bestätigt.
  • In Gegenwart von bFGF und Forskolin differenzierten sich die meisten NEP-Zellen zu aminergen Neuronen. Dennoch begann eine geringe Anzahl an Zellen, Cholinacetyltransferase zu exprimieren, ein in der Acetylcholin-Synthese zentrales Enzym. Die Differenzierung von cholinergen Neuronen in der NEP-Linie wurde durch Zusatz von Leukämie inhibierendem Faktor (LIF) verstärkt. Dieses Resultat ist übereinstimmend mit der Induktion von cholinergen Neuronen durch LIF in Neuralleisten-Zellen und Hippocampus-Zellen. Obwohl keine reifen Gliazellen in vitro identifiziert wurden, können sich die NEP-Zellen zu Bergmann-Gliazellen, wenn sie in das Zerebellum injiziert werden, und zu radialen Gliazellen in der Großhirnrinde differenzieren. Insgesamt betrachtet lassen diese Daten darauf schließen, dass die NEP-Zelllinie in einem frühen Stadium der neuroepithelialen Differenzierung angehalten wird und die Fähigkeit, sich je nach den umgebenden Bedingungen zu mehreren verschiedenen Neuronal- und Gliazellen zu differenzieren, beibehält.
  • Hinterlegung von Materialien
  • Die folgende Kultur wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, (ATCC) hinterlegt:
  • Figure 00440001
  • Diese Hinterlegung erfolgte unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und der darunter geltenden Bestimmungen (Budapester Vertrag) durchgeführt. Dies stellt die Aufrechterhaltung lebensfähiger Kulturen 30 Jahre lang nach dem Hinterlegungsdatum sicher. Die Zelllinie wird durch die ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags verfügbar gemacht und ist Gegenstand eines Abkommens zwischen Genentech Inc. und der ATCC, das die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur für die Öffentlichkeit nach Erteilung des entsprechenden US-Patents zusichert.
  • Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung erklärt sich einverstanden, dass, sofern die hinterlegte Kultur sterben oder verlorengehen sollte oder zerstört wird, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, diese unverzüglich nach Bekanntmachung durch ein lebensfähiges Muster derselben Kultur ersetzt wird. Eine Verfügbarkeit der hinterlegten Zellen ist somit nicht als eine Genehmigung zu verstehen, die Erfindung unter Verletzung der Rechte, die unter der Befugnis jeder Regierung gemäß deren Patentrechten zuerkannt werden, zu praktizieren.
  • Die vorangehende formulierte Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die praktische Durchführung der Erfindung zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung ist durch die hinterlegte Kultur in ihrem Schutzumfang nicht eingeschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen zum Zwecke der Veranschaulichung eines Aspekts der Erfindung bereitgestellt wurden und jegliche Kulturen, die diesen in ihrer Funktionsweise entsprechen, im Schutzumfang dieser Erfindung inbegriffen sind. Die Hinterlegung des Materials hierin stellt kein Eingeständnis dar, dass die hierin dargebrachte formulierte Beschreibung ungeeignet ist, die Durchführung jedes beliebigen Aspekts der Erfindung, umfassend die beste Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch dass sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Patentansprüche auf die spezifische Veranschaulichung, die sie darstellt, zu verstehen ist.

Claims (17)

  1. Verfahren zum Isolieren eines normalen neuralen Epithelvorläuferzelltyps, umfassend die folgenden Schritte: a) Kultivieren neuralen Gewebes aus einem nichtmenschlichen Säugetierembryo im Null-Somit-Entwicklungsstadium in Gegenwart von embryonalen Schwannschen Zellen oder von mit embryonalen Schwannschen Zellen konditioniertem Medium; und b) Isolieren der normalen neuralen Epithelvorläuferzellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das neurale Gewebe Neuralrohr ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das neurale Gewebe auf einem festen Träger kultiviert wird, der mit einem Anlagerungsfaktor vorbeschichtet ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Anlagerungsfaktor Laminin ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das neurale Gewebe in serumfreiem Medium kultiviert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das serumfreie Medium Rinderhypophysenextrakt, Insulin und Forskolin umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das serumfreie Medium weiters Progesteron und α-Tocopherol umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Neuralrohr von einem Rattenembryo stammt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Neuralrohr von einem 9 Tage alten Embryo stammt.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, das weiters den Schritt des Trennens der neuralen Epithelvorläuferzellen von anderen Zelltypen umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die normalen neuralen Epithelzellen in serumfreiem Medium ohne Heregulin subkultiviert werden.
  12. Normale neurale Epithelvorläuferzelllinie, isoliert durch das Verfahren nach Anspruch 1.
  13. Normale neurale Epithelvorläuferzelllinie nach Anspruch 12, die eine Rattenzelle ist.
  14. Normale neurale Epithelzelllinie nach Anspruch 13, die in der American Type Culture Collection hinterlegt ist und die Zugriffsnummer CRL 11.993 trägt.
  15. Zusammensetzung, umfassend die Zelllinie nach Anspruch 12 und ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel.
  16. Zusammensetzung, umfassend die Zelllinie nach Anspruch 13 und ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel.
  17. Zusammensetzung, umfassend die Zelllinie nach Anspruch 14 und ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel.
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