CN1113096C - 来自人骨髓的新的基质细胞系及其用途 - Google Patents

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Abstract

人骨髓基质细胞系，其特征在于细胞系的细胞，经导致细胞生长被停滞的辐照后，保持贴壁，适于作为饲养层支持血细胞的繁殖。

Description

来自人骨髓的新的基质细胞系及其用途
发明领域
本发明为新的骨髓细胞系，其特征在于以达到并超过20Gy的剂量进行离子辐照后，其生长被停滞，保持贴壁。这使其能特别用作饲养细胞，支持饲养层依赖细胞的长期增殖。
发明背景
造血祖细胞和干细胞在长期骨髓培养物(LTBMC)中的支持和分化关键依赖于贴壁基质细胞功能层的存在[1-6]。造血过程中基质细胞的确切作用还未能完全阐明。然而，基质细胞是祖细胞受控分化和繁殖中所需要的重要的介质源[7-9]。另外基质细胞还提供复杂的功能胞外基质，支持基质和祖细胞间直接的细胞至细胞的接触。这种不同细胞组成的基质层包括巨噬细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞[1-3]，使得很难分析每种细胞类型在造血过程中的作用。
已建立的基质细胞系提供了一种有用的工具用来分析相互独立的基质功能。虽然已公开描述了大量的自发性无限增殖化鼠基质细胞系[13-15]，但要建立相应的人细胞系仍未获得成功[16]。人骨髓基质细胞系还由K.Thalmeier等人所描述[41]。然而，在该文中没有描述经辐照后仍保持贴壁的细胞系。
通过将DNA导入编码SV40大T-抗原细胞基因组[17-21]，已解决了一些有关建立人基质细胞系的问题。这是通过各种基因转移方法实现的，其中包括磷酸钙沉淀[17]，重组SV40的电激[18，20，21]和用SV40野生型病毒感染[19，20]。这些基质细胞系已用作分析基质细胞-祖细胞间相互作用的模式系统[22-26]。然而，SV40-无限增殖化基质细胞系作为在LTBMC中的支持性饲养层的应用还有两个重要缺陷。首先，SV40-无限增殖化细胞能非常迅速地生长至第100代细胞[27]，然后便进入一特有的导致细胞死亡[19]的临界状态。其次，通过辐照或丝裂霉素C的作用而不从培养瓶中脱附，便不能抑制SV40-无限增殖化基质细胞的生长[21]。
本发明描述了新的人骨髓基质细胞系及其用途。这些细胞系能高速度繁殖，并且经辐照其生长被停滞，而不会脱附。通过这些细胞系支持如富含CD34+的人的带状血祖细胞的长期繁殖和饲养层依赖细胞系BL70的核心集团生长，例证了本发明细胞系可作为饲养细胞的功能。
发明概述
本发明提供了来自人骨髓的基质细胞系，其特征在于细胞系的细胞，在受细胞系的生长受到抑制的辐照后，保持贴壁。
本发明进一步提供了一种来自人骨髓的生长被停滞的贴壁基质细胞系的生产方法，以及所述基质细胞系作为血细胞培养饲养层的应用。
本发明提供了来自人骨髓的基质细胞系，在其基因组中含有猿猴病毒40(SV40)的病毒DNA序列，该序列特征在于缺损SV40病毒的复制起点。编码包装蛋白的晚期SV40基因的一部分在本发明一优选实例中是缺失的。
本发明进一步优选的基质细胞系，至少含有猿猴病毒40的病毒DNA序列，其编码T-抗原。
本发明还包括基质细胞系L87/4(DSM ACC 2055)和L88/5(DSMACC 2056)，其保藏于Deutsche Sammlung von Mikro-organismenund Zellkulturen GmbH，Braunschweig，DE。
本发明还提供了本发明的基质细胞系作为血细胞饲养层的应用，尤其是造血细胞或前体细胞，如破骨细胞。本发明另外还提供了本发明的基质细胞系在生产生长因子/细胞因子中的应用。
本发明还包括将本发明的基质细胞系作为克隆于载体上的基因的表达细胞系，所说的基因是在SV40大T-抗原的控制下进行复制的。
附图的简要说明
图示：
图1基质细胞系L87/4和L88/5的辐照敏感性。细胞以5×105/ml的密度铺于75cm2烧瓶中LTC培养基上，并以5～20Gy进行辐照。辐照后培养基被完全换掉，细胞在LTC培养基中温育7天(37℃，5％CO2)。在第8天，确定贴壁细胞和非贴壁细胞的数目(A，B)，并且细胞在含GCT-CM的琼脂上铺平板。第14天统计琼脂培养基上细胞群件数示于图C和D中。
图2BL70细胞对不同饲养细胞的反应的限制性稀释分析
在(A)L87/4细胞(圆圈)或L88/5细胞(方块)存在时，在限制性稀释条件下接种BL70细胞。统计学评价显示，在L87/4细胞存在时频率f＝13.5(r＝-0.951；yo＝0.925)，在L88/5细胞存在时f＝1.5(r＝-0.990；yo＝1.04)。作为对比，(B)显示出在MRC5细胞存在时(星形；f＝5.7；r＝-0.996；yo＝1.00)或在起始骨髓基质存在时(三角形；f＝2.5；r＝-0.996；yo＝0.98)接种BL70细胞的有限稀释分析。
图3基质细胞系L87/4和L88/5对带状血GM-CFCs的供养
培养2周之后每周收集一次产生于基质细胞系L87/4和L88/5上的非贴壁带状血细胞，并在培养骨髓祖细胞的甲基纤维素培养物中进行分析。铺平板后14天对细胞群体(＞50个细胞)计数。结果显示了两个具有代表性和独立性的实验。
图4IL-1α和/或地塞米松处理的L87/4和L88/5细胞的G-CSF、IL-6和GM-CSF的分泌。细胞在不含氢化可的松的LTC培养基  中或补充有IL-1α(10U/ml)或补充有地塞米松(10-6M)或两者均补充的LTC培养基中温育24小时。通过MTT(噻唑蓝)-试验以7TD1测试上清液中IL-6活性，以NFS60指示细胞系测G-CSF活性。通过RIA(放射免疫分析)测定上清液中的GM-CSF活性。
图5辐照的L87/4和L88/5细胞系的G-CSF和IL-6分泌。细胞在LTC培养基中生长至快汇合时以0～20Gy的剂量辐照。辐照后培养基被完全更换，温育24小时后收集细胞上清液，通过MTT-试验测试IL-6活性(7TD1)和G-CSF活性(NFS60)。
图6显示了所用转染载体(pSV IN-1)，来自Cohen等，J.Virol.51(1984)91～96。
图7显示了由上述载体衍生的另一个载体(pUC IN-1wt)。这里SV40-DNA从pSV IN-1的酶切位点Bam/Pst切下来，同时除去了从1988到2533的核酸片段。然后，该缺失的SV40-DNA片段克隆到pUC 12的Bam/Pst的酶切位点。
发明详述
与所有现有技术中的人骨髓基质细胞系不同的是，本发明的细胞系具有下列优点：
a)均一性：
明显区别于原代基质的是，该细胞系由确定的均一的细胞群体组成。因此排除了当使用来自不同先证者的原代细胞时所发生的实验差异性。
b)持久性：
原代基质细胞和大多数SV-40无限增殖化细胞系分裂到一定数目后会死亡。这里所要求的基质细胞系能进行无限制的分裂(即无限增殖化)；
C)辐照抑制生长：
实验中基质细胞用作造血祖细胞的“饲养层”(＝饲养细胞)，必须抑制基质细胞的生长，同时，这些细胞必须贴附在细胞培养皿上。至今所描述的SV-40无限增殖化细胞系经辐照后，会从它们的支持物上脱落分离下来，而这里所要求的细胞系能停止生长并仍保持贴壁；
d)造血生长因子的产生：
饲养细胞通过首先产生生长因子来控制造血前体细胞的生长和分化。这里所要求的细胞系能产生大量的这些生长因子，其中通过辐照及白细胞介素-1的刺激均可影响因子的产生；
e)排除了由于病毒产生而引起的细胞系的自发性的改变。
还可使用其它的载体，其至少含有编码T-抗原的猿猴病毒40的病毒DNA序列并且SV40病毒的复制起点是不正常的。另外，缺失编码包膜蛋白的SV40病毒晚期基因的载体也是适用的。来自人骨髓的原代贴壁细胞在该SV40质粒载体的帮助下被转染。转染以脂质体进行。脂质转染过程中转染的DNA到达骨髓细胞的细胞核并整合入染色体DNA中。这里载体的整合位点是不可预见的，也就是说，这是偶然发生的。整合入细胞基因组的SV40 T-抗原的表达可实现这些细胞的无限增殖化。
以这种方式建立的细胞系是无限增殖化的，培增时间很短，形成均一细胞群体。
所采用的载体pUC 12和pBR 322以及猿猴病毒40的病毒DNA均有市售。
本发明的细胞系，辐照后其生长被停滞，仍保持贴壁。这样细胞仍是可存活的但不再进行分裂。它们产生大量的造血生长因子/细胞因子。
根据本领域熟知的方法，如在[21]中所描述的方法进行基质细胞系的辐照。通常进行离子辐照，剂量为5至20戈瑞(Gy)。辐照前，最好让细胞贴附于所用器皿的表面(汇合成片)。辐照后，存活细胞(多于约80％)仍保持贴壁。杀死的细胞从表面脱落，这样易从细胞中分离出来，例如更换培养基。
这样得到的贴壁细胞能长期存活，使其能支持饲养层依赖细胞的培养，如造血祖细胞或外周血细胞。一般情况下，7天后至少有90％，两或三周后至少50％的贴壁细胞仍是存活的。本领域熟练的人员所熟知的适用于基质细胞的所有培养基均可在此使用(也用于血细胞的共培养)。
本发明的基质细胞还意指其具活性的含膜亚细胞部分，该部分与完整细胞相似能够促进血细胞的繁殖和/或分化。这些部分可以是亚细胞泡囊，例如可通过低渗冲击得到；或可以是无细胞膜泡囊，例如可通过与松胞菌素B温育得到。还有来自本发明细胞的适合的洗脱物，例如于氯化钠和柠檬酸钠温育后可回收而得。本发明细胞的这些部分可进一步使用本领域技术人员熟知的方法纯化，如层析纯化，其中每一纯化步骤后必须检测这些部分(适作饲养层)的活性。
例如根据Maul等人[38]的方法可制备膜泡囊，此处引为参考文献。另一种方法例如由Jett等[39]所描述，此处引为参考文献。在EARL’s缓冲液中清洗细胞后，分三步每15分钟向细胞中加入一次甘油至终浓度为30％。离心后，进行裂解，多次离心，得到富集的泡囊部分。检测该富集部分的支持血细胞繁殖的特性，特别是造血前体细胞或干细胞。
本发明所使用的“支持细胞的繁殖”意指本发明的细胞系支持血细胞的成活、繁殖以及可能由血细胞产生的血液/生长因子/细胞因子。这里，本发明细胞系的细胞是贴壁于表面的(优选培养瓶的表面)。饲养层依赖细胞居于饲养层上，受刺激而生长和/或分化。饲养层供给血细胞生长因子，如细胞因子，和粘着分子。
“支持分化”特别是指支持没最终分化(没有完成整个分化过程)的细胞分化。这类细胞的例子有多能干细胞和血祖代细胞。
血细胞有例如造血干细胞，造血祖细胞或外周血细胞。例子有CD34+人带状-血祖细胞或淋巴细胞(模式细胞为BL70细胞系[35])以及自骨髓分离的干细胞，人脐带状血或外周血祖细胞，如粒细胞，红细胞或巨核细胞祖细胞。
一般地，用于每75cm2容器表面的培养物的细胞密度为5×105个细胞/ml。
在培养饲养层依赖细胞的优选实施例中，本发明的细胞系首先生长直至达到汇合成片，然后被辐照。辐照后，培养基被更换。由此，杀死的和非贴壁细胞也被除去。这样制备的细胞可直接作为饲养层。然而，在使用前最好将细胞在无血清培养基上培养几个小时。
在本发明的优选实施例中，本发明的基质细胞可用来支持造血干细胞的扩展而不分化。扩展的条件描述于M.R.Koller等人[40]的文章中，该文在此引为参考文献。
这种不发生分化的干细胞的扩展尤其对于在体外经转导而发生遗传修饰而得到的干细胞的繁殖是非常有用的。这种修饰的干细胞能用在基因疗法中。根据现有技术，如通过使用逆转录病毒或DNA及脂质体可进行转导。这种转导的产率通常很低，在体外基因疗法中扩展的转导干细胞具有很重要的价值。
从细胞系中制备生长被停滞的贴壁基质细胞，优选对基质细胞系的细胞进行培养直至它们达到汇合成片，并且重复进行基质层的细胞传代直至细胞进入生长临界状态。这通常发生在第25至30代循环之后。然后，收集这些仅以很慢的速率分裂的细胞或基本上不分裂的细胞，如通过胰蛋白酶消化来收集，并以新鲜的培养基将细胞置换于新培养基上。对这些细胞按上述方法辐照。生长被停滞的贴壁基质细胞仍保持贴壁，而经辐照杀死的细胞会脱附，并以这种方式很易除去。
令人惊奇地发现本发明的基质细胞能产生大量的生长因子。通过不同强度的辐照(优选5至20Gy)和/或通过加入IL-1(5至50U/ml，优选5至15U/ml)和/或地塞米松(0.5至2×10-6mol/l)可诱导这种生长因子的产生。辐照的诱导主要导致产生的G-CSF增加(在高达20Gy时约至50ng/ml培养物，产生的IL-6约至100U/ml)。此外，IL-1刺激GM-CSF的产生。细胞以这种方式产生的生长因子可根据本领域技术人员熟知的方法进行纯化。
在骨髓细胞的转染中，进行下列步骤：
骨髓细胞在长期培养基(McCoy’s 5a补充有12.5％的胎牛血清，12.5％的马血清，1％的碳酸氢钠，1％的MEM非必需氨基酸溶液，1％的L-谷氨酰胺(200mM)，1％的青霉素-链酶素溶液—所有溶液得自Gibco，10-4M的α-硫甘油，10-6M的氢化可的松)(5％CO2；37℃)中培养2至3周，直至基质层达到亚汇合状态。在转染前一天，通过胰蛋白酶消化来收集贴壁基质细胞，并于25cm2的培养瓶中以5×105个细胞/ml的细胞密度铺平板。用氯化铯纯化的质粒DNA(psV-IN1和pUCIN-1wt)进行转染。
根据下述步骤进行转染，于Serva公司(IBF Instruction SheetNo.294210)的转染实验说明书一致。
半汇合细胞以PBS洗涤一次，McCoy’s 5a洗涤一次，并与新制备的质粒/转染物(transfectam)混合物在一25cm2的培养瓶中的8ml无血清长期培养基中温育5至18小时。转染后，用PBS/10％FCS两次清洗细胞，并将细胞在LTC培养基中培养至汇合成片。通过以1∶2的比率进行基质层的重复传代来选择被转染的细胞。25至30代后，无限增殖化细胞进入所谓的生长临界期。由于通过胰蛋白酶消化将仅缓慢分裂的细胞或根本不分裂的细胞从其支持物上脱附下来并转换入新的培养瓶中从而排除了这种临界状态。以这种方式处理的细胞能从临界状态自发地恢复过来并呈现无限增殖化的表现型。
下述为基质细胞系L87/4与L88/5的不同性质：
T-抗原的表达：
L87/4：低表达(第14代)
L88/5：强表达(第14代)
病毒DNA的整合位点：
在基因组中不同的整合位点
组分因子的产生：
L87/4：G-CSF和IL-的组分产生
L88/5：G-CSF和IL-6的低组分产生
在两种细胞系中均可以辐照诱导G-CSF和IL-6的产生。
下面是一些有关细胞系用途的重要实施例。
本发明的基质细胞系，优选L87/4和L88/5细胞系可被用于所有实验中，其中，对生长于饲养层依赖层的细胞进行培养，它们是所有的造血前体细胞和干细胞以及骨形成的前体细胞(破骨细胞)。还有早期饲养依赖的B瘤细胞(BL70)在L88/5系及L87/4系上生长的阳性结果。
除了对正常的造血前体细胞的培养外，本发明的细胞系优选细胞系87/4和L88/5还可被用来分析药物作用下的白血病人(CML，AML，ALL)的恶性骨髓细胞，这在自身骨髓移植的方面是非常重要的。这里排除了现有技术中由于使用来自不同试验对象的原代饲养细胞而产生的实验差异性。
除了适用作饲养细胞外，本发明的细胞系优选细胞系L87/4和L88/5可用作大量生长因子的生产细胞系。这里重要的分别是产生极高的G-CSF组分的L87/4和IL-6组分的L88/5。进一步显示了至今尚未确定的L88/5细胞对7TD1-和NFS60细胞在合适培养基(＝细胞培养上清液)中的细胞生长的高刺激活性。
还可用作表达细胞系，用于克隆于在SV40大T-抗原的控制下复制的载体上的基因的表达。例如，这里所指的COS细胞。
下列实施例用于帮助理解本发明，本发明的真正范围述于待批的权利要求书中，在不脱离本发明精神的条件下根据所述步骤做出的改进是可理解的。
                          实施例
实施例1
辐照后具有长期饲养能力的持久人骨髓基质细胞系的建立
a)材料和方法
骨髓
用于长期培养和转染实验的骨髓细胞来自血液正常病人的新切除下的肋骨。所有样品的获得均经事先同意，并且是根据研究伦理委员会(institutional ethics committees)通过的决议而进行的。
长期培养
在磷酸缓冲盐水中(PBS)抽吸从肋骨中分离出骨髓细胞。不再经任何纯化步骤将其在75cm2瓶中(Nunc)以密度2×106细胞/ml铺平板于Dexter-型长期骨髓培养基(LTC培养基：McCoy’s 5a培养基，补充有12.5％的预先选择的胎牛血清(FCS)，12.5％预先选择的马血清(HS)，1％的碳酸氢钠，1％的丙酮酸钠，0.4％的MEM非必需氨基酸溶液，0.8％的MEM必需氨基酸溶液，1％的维生素溶液，1％的L-谷氨酰胺(200mM)，1％的青霉素-链酶素溶液(所有溶液来自Gibco)，10-4M的α-硫甘油，10-6M氢化可的松)。培养物在37℃加湿环境5％CO2下温育，每周改变一半培养基进行饲养。
人骨髓基质细胞系的建立
骨髓细胞在LTC-培养基上培养2～3周，直至基质层达亚汇合。通过胰蛋白酶消化收集贴壁基质细胞，并以5×105个细胞/ml的密度接种在25cm2培养瓶中。CsCl梯度纯化的质粒载体pSVIN-1(克隆于pBR322上的起始区缺损的SV40基因组)和pUCIN-1(克隆于pUC12上的起始区缺损的SV40基因组，晚期基因部分缺失)用于转染实验。基本上根据生产者(Serva，Heidelberg)的转染说明书所描述的方法进行脂质体转染。简而言之，半汇合的贴壁细胞以PBS清洗一次，McCoy’s5a清洗一次，并在25cm2培养瓶中的8ml无血清LTC培养基上与新制备的质粒/转染物混合物一起温育5至18小时。转染后，细胞以PBS/10％FCS清洗两次并于10ml LTC培养基上培养至汇合成片。约六周潜伏期之后，开始在原代基质细胞上长满被转染的细胞并以1∶2的比率进行连续传代。转染细胞被保存在37℃5％CO2的湿度培养箱中的LTC培养基中。
Southern  印迹实验
至少6代细胞之后转染细胞的DNA以CsCl梯度离心来进行纯化[28]，用所选择的酶进行消化并在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。DNA印迹在尼龙膜上(Amersham Buchler，Braunschweig)与经放射性标记的编码SV40大T-抗原的pSVIN-1/Bam HI片段进行杂交。
Northen  印迹实验
用异硫氰酸胍提取法[29]分离出转染细胞的总RNA，进行糖基化(glycoxylated)并在1％琼脂糖凝胶(20μg每样孔)上分级分离。RNA被印迹在尼龙膜上(Amersham Buchler，Brauschweig)，并与经放射性标记的编码SV40大T-抗原的质粒pSVIN-1的Bam HI片段杂交。
放射敏感性分析
转染的细胞在75cm2瓶中LTC培养基上以5×105个细胞/ml的密度涂平板，培养18小时。随后使用铯-137ν射线源(Atomic Energyof Canada，Ontaric，Canada)以5～20Gy进行辐照。辐照后培养基被完全更换，细胞在LTC培养基中(37℃，5％CO2)温育7天。第8天通过胰蛋白酶消化收集贴壁细胞和非贴壁细胞，对细胞进行计数，通过计数第14天琼脂上的细胞群体来测试被辐照细胞的群体形成能力。
群体形成分析
为检验转化的基质细胞系的核心集团生成能力，通过胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶，Gibco)收集贴壁细胞，并在报道[30]的半固体琼脂培养基上铺平板。简而言之，以1×105细胞/ml的浓度将基质细胞一式三份铺平板于等量的0.6％的Bactoagar(Difco，Detroit，Michigan)和加倍强度的Iscove’s改进的Dulbecco’s培养基(IMDME；Gibco)上，其中含有40％预先选择的FCS。用10％(体积/体积)受调节的巨大细胞瘤培养基(GCT-CM；美国典型培养物中心，Rockville，Maryland)刺激群体生长。培养物在加湿环境下5％CO2的空气中37℃温育14天。使用倒置显微镜(32倍放大)第14天计数成纤维细胞群落。
免疫荧光染色检测表型(表1)
a)间接免疫荧光染色
L88/5和L87/4细胞在经无钙PBS(PBSd)洗涤的玻璃片上进行培养，并于冰冷却的甲醇和丙酮的1∶1混合物中固定10分钟。以PBSd清洗玻片后，在玻片上铺一层抗因子VIII-相关抗原的稀释的兔抗血清(Behring；100μl抗血清+1.5ml PBSd)。然后玻片在加湿室中37℃保温30分钟，以PBSd清洗，并在上面铺上FITC标记的二级抗-兔抗体。37℃保温30分钟后，玻片以PBSd洗涤，铺上甘油和PBSd(1∶1)的混合物，并盖上盖。
b)免疫荧光染色进行FACS分析
贴壁基质细胞通过与胶原酶(0.1U/ml)/dispase(0.8u/ml)一起在37℃温育15分钟，从培养瓶中脱附。细胞以PBSd洗涤，悬浮于IF-缓冲液中(含0.1％酸式钠盐和2％FCS)，4℃下以第一抗体标记30分钟，该抗体或是FITC-结合的，PE-结合的或是未标记的。然后以1ml IF-缓冲液洗涤细胞两次，在未标记第一抗体的情况下，细胞上述的另一FITC-或PE-标记抗体进行处理。将染色细胞悬浮于1ml IF-缓冲液中并以FACScan流动血细胞计数仪(Becton Dickinsin)进行分析。
细胞化学染色进行表型分析(表1)
细胞在PBSd洗涤过的空气干燥的玻片上进行培养，并以氯乙酸酯酶或α-萘基酯酶根据生产者(Sigma)的说明书所述方法进行染色。
有限稀释
贴壁饲养细胞接种于96孔板上，生长至汇合成片，并在Cs137源(Atomic Energy of Canada，LTD)中进行辐照(MRC5，50Gy；BM饲养，50Gy；L88/5，15Gy；L87/4，20Gy)。24小时后，以无血清培养基洗涤BL70细胞两次，并以所指定的细胞密度将BL70细胞加入至少24孔板中，板每周补料2次，监测长出的群落至第40天。所有的有限稀释实验均在补充有5％FCS，2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640中进行。BL70细胞在被辐照(50Gy)的MRC5细胞存在的同样培养基中保持。MRC5细胞在补充有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和抗生素的DulbeccosMEM中培养。
与CD34 + 富集的人带状-血细胞的共培养实验
珀可(Percoll)-分离的单核带状-血细胞或用直接结合于异硫氰酸荧光素(FITC)的抗-CD34的单克隆抗体(Dianova，Hamburg)染色，并在FAC StarPlus(BD FACS系统；Becton Dickinson)上分选出高CD34表达的细胞，或使用mAbBI-3C5[34]直接包裹的DynabeadsM-450分离出CD34阳性细胞。
在24孔板(5×103带状-血细胞/孔)中将CD34+带状-血细胞铺平板于LTC培养基中的辐照的半汇合L87/4(20Gy)和L88/5(15Gy)的基质细胞上。培养2周后，培养物在每周改变一半的培养基中37℃保持5周。在半固体培养基中分析非贴壁细胞以检测红细胞(BFU-E)和骨髓细胞(GM-CFC)祖细胞的存在。在IMDM，30％FCS，1％BSA，10-4Mα-硫甘油，5％PHA-LCM，0.98％甲基纤维素，3U/ml EPO(所有物质来自Terry Fox Laboratories)和100ng/ml试剂盒(Ligand)中将培养物与104非贴壁细胞/ml一起铺平板。以1ml体积将培养物铺平板于5％CO2 37℃条件下的35mm组织培养皿中，并在第14天对群体进行计数。
b)早期传代人骨髓基质细胞系的建立和特征
70岁的造血正常的男性病人的BM细胞在25cm2瓶中常规Dexter型LTBMC上培养3周。汇合的基质层传代一次，并通过脂质转染法以pSV-IN1或pUC-IN1质粒载体进行转染。两种质粒均含有编码已知为转化因子的SV40 T-抗原的序列[31，32]。10个可传代的细胞系通过其优于原代基质的生长而被选择出来，并在脂质转染后获得。20％的培养瓶中发现自发长出的非贴壁EBV-无限增殖化B细胞。
选择10个细胞系中的5个细胞系即指定的L87/4、L88/5、L90/7、L91/8和L87/12进行进一步研究。所有细胞系均呈现出成纤维细胞样(fibroblastoid)的形态。含有稳定整合的SV40重组子，并表达了SV40大T-抗原，正如通过Northern印迹所确定的(数据未示出)。每一种细胞系中质粒载体的整合位点不同。5个细胞系中的3个是在第6代之后克隆的，而2个是寡克隆的。SV40转化的细胞系以一个相对高的速率生长25至30代，然后进入临界期。随后对5个细胞系中的两个进行挽救(L88/5和L87/4)。它们可在连续培养基中保持70多代(18个月)。所做的所有进一步实验都是针对克隆的后临界期的L88/5和L87/4细胞系的。
一些参数，包括SV40整合位点，SV40 T-抗原表达，L87/4中CD68的表达以及对辐照作用的反应在临界期前后是稳定保持的。在临界期后它们可稳定支持30多代。本发明的细胞系在以剂量达20Gy辐照后可保持为贴壁的生长被停滞的细胞层。值得注意的是，如果及时以低密度的CD34富集的脐带血细胞补充这些细胞，则即使再高剂量的离子辐照也是可忍受的。
在本发明优选实例中，细胞系显示出CD10和CD13的表达和造血标记未表达(见表2)。尤其优选的是表达巨噬细胞标记CD68的细胞系。图2说明了本发明细胞系的特征表型。
本发明的细胞系在临界期后的传代中(如60代)仍具有饲养能力。通过其能保持基质细胞依赖性的BL细胞系(如BL70)的核心集团产生的细胞繁殖超过5周的时间，从而证明了这一点。BL70的分析清楚地证明了细胞系能产生恶性B细胞繁殖所必需的所有因子。这并不排除下列可能性，即它们还进一步产生细胞因子支持其它类型细胞的生长和繁殖。正如PCR分析所显示，本发明的细胞系产生各种不同的造血生长因子，包括IL-6、IL-7、I L-8、IL-10、IL-11、KL、LIF、G-CSF、GM-CSF和M-CSF。这种细胞因子分布型表明本发明的细胞系能支持正常原代造血祖细胞的长期培养，如来自CD34+富集的带血细胞培养物的GM-CFCs(图6)和BFU-Es的生长。
基质细胞系L88/5和L87/4的特征
通过相差形态学上的方法，两个基质临界期后的细胞系均呈现出成纤维细胞样的形态。细胞迅速分裂，L88/5的倍增时间为1天，L87/4的为2天。细胞呈现接触抑制，在液体培养基中不形成病灶。当在含有1％GCT-CM的半固体琼脂中铺平板时，它们长成成纤维细胞样的群体。
两种细胞系对于SV40 T-抗原的表达均是阳性的，并呈现出与前述临界期前L87/4和L88/5细胞相同的基因组SV40整合位点。正如通过免疫荧光实验所表明的，L87/4和L88/5表达基质细胞表面标记CD10和CD13，而不表达各种造血细胞标记(表1)。不管怎样，通过表达巨噬细胞标记CD68，L87/4可与L88/5区分开来。
L88/5和L87/4细胞的放射敏感性
根据图4所表面的及材料和方法部分中所描述的方法对L88/5和L87/4细胞进行培养并辐照，两种细胞系均可以达15Gy的剂量辐照而不脱附。剂量超过15Gy时L88/5的繁殖和群体的形成便停止，而L87/4细胞仍在软的琼脂上保持其生长能力和形成群体的能力。必须以20Gy剂量辐照L87/4，以使其在悬浮液培养基中的繁殖和软琼脂上的无性繁殖停止(图1)。
如果用少数(5×103/ml)CD34-阳性脐带血细胞在24小时之内补充辐照细胞层，细胞系L87/4可以经受更高的剂量辐照而细胞不脱附。L88/5和L87/4细胞代替成纤维细胞和BM饲养细胞。
许多伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)(BL)细胞系，若其在低血清条件下在低细胞密度时生长，则其依赖于受辐照的人成纤维细胞的饲养层。在高细胞密度时，它们不需要饲养细胞层。可通过一系列的原代的人和啮齿动物的成纤维细胞来提供这种体系的饲养功能。然而几种可获得的，SV40-无限增殖化人成纤维细胞系常常不能支持模式BL系BL70[35]的繁殖。如图2所示，受辐照的(15Gy)L88/5细胞以及受辐照(20Gy)L87/4细胞比原代受辐照的骨髓基质细胞和人MRC5成纤维细胞能更好地支持BL70细胞的核心集团生长。在饲养细胞不存在时两天之内即将死亡的BL70细胞能在受辐照的L87/4和L88/5饲养层上保持长于5周的时间。BL70有限稀释分析(图5)的图示表明了单一碰撞动力学。这表明L88/5和L87/4细胞(以及MRC5细胞或原代BM基质)提供了BL70细胞最佳繁殖的所有必需因子。
L87/4和L88/5细胞支持人带状-血祖细胞的长期造血作用
接种于24孔板的半汇合的受辐照的L87/4(20Gy)和L88/5(15Gy)细胞以CD34+人带血细胞(5×103CD34+细胞/孔)补充，并于LTC培养基中培养5周。至培养5周时，两种基质层均支持非贴壁带状-血细胞的繁殖，在开始培养后2至3周可观察到最多数量的细胞。与加入的带状-血细胞的数目相比，培养期间非贴壁细胞的数量增大了约200倍。至开始培养后第5周，在非贴壁细胞部分存在有大量的骨髓细胞(GM-CFC，图3)和红细胞(BFU-E)祖细胞衍生的群体，正如通过甲基纤维素群体形成分析确定的结果。
实施例2
在本发明细胞系中结构和调节细胞因子的表达
细胞培养
一系列细胞系和原代细胞作为阴性对照来进行RNA分析。能在湿度培养箱(37℃，5％CO2)内RPMI 1640/10％FCS中生长的细胞有：u937细胞(ATCC：CRL 1593；人组织细胞淋巴瘤)HL60细胞(ATCC：CCL240；人前髓细胞白血病)，K562细胞(ATCC：CCL243；人CML)，MelJuso(Dr.Johnson所赠，Department of Immunology；LMU-Munich)，和5637细胞(ATCC：HTB9；人膀胱癌)。所有细胞系每周传代培养2次。
将健康志愿者的外周血单核细胞通过珀可(Percoll)梯度分离并在补充有植物血细胞凝集素(1体积％)和佛波醇12-肉豆蔻酸酯、13-乙酸酯(10ng/ml)的IMDM/10％FCS中温育，以培养活化的T细胞。温育8小时后收集细胞，并以异硫氰酸胍提取法制备RNA[31]。
根据实施例1所述建立原代基质细胞层。L87/4和L88/5细胞暴露于IL-1α和地塞米松
L87/4(第96代)和L88/5(98代)细胞以2×105细胞/ml的密度在25cm2培养瓶(Nunc)中铺平板，在LTC培养基中温育24小时。培养基被全部移走并以不含氢化可的松的新鲜的LTC培养基代替，或以补充有IL-α(10U/ml)或地塞米松(10-6M)的或两者均补充的LTC培养基代替。然后，在提取RNA之前，细胞再温育24小时(37℃，5％CO2)。收集培养上清液，用于细胞因子的生物学测定和RIAs。
以生物测定法进行基质细胞因子释放的定量
测试基质细胞(L87/4；L88/5)的粗制条件培养基，以检验其在如前述的MTT分析中繁殖增强的活性[36]。7TD1细胞用于分析IL-6的产生。通过高度响应的NFS60亚系测定G-CSF活性。通过加入适当的中性抗体检测细胞系响应的特异性。
以RIAs确定基质细胞因子释放的数量
测试L87/4和L87/5细胞的粗制条件培养基，以检测所述的IL-1β和GM-CSF的浓度
总之，本发明的两个持久基质细胞系(如L87/4和L88/5)，其产生一组细胞因子，在保持人造血祖细胞方面，这种产生生长因子的方式由于辐照和糖皮质激素的作用(图4和图5)而被部分强化和部分抑制。
                     表1
临界期后的基质细胞系L87/4和L88/5的表现型
                         L87/4         L88/5c-kit                        -             -HLA-DR                       -             -CD11a，CD11b，CD14，CD23，CD32，CD33，CD34，CD36，CD38，CD56，CD61，CD64             -             -CD10                         +             ++CD13                         +++           +++CD68                         +             -CD71                         +++           ++因子VIII相关抗原             -             -氯乙酸酯酶                   -             -α-萘基酯酶                  -             -SV40 T-抗原                  +++           +++平滑肌型肌幼蛋白             -             -层粘连蛋白                   -             -纤连蛋白                     +++           +++玻连蛋白                     +++           +++
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1.人骨髓基质细胞系L87/4 DSM ACC 2055和L88/5DSM ACC 2056，其特征在于，在基因组中含有猿猴病毒40的病毒基因序列，其中SV40病毒的复制起点缺损，至少部分编码包装蛋白的晚期SV40基因缺失。
2.根据权利要求1的基质细胞系，其特征在于，在辐照作用诱导的生长停滞后，通过以白细胞介素-1和/或地塞米松刺激，在所述细胞系中诱导G-CSF和IL-6的产生。
3.根据前述任一项权利要求的基质细胞系，其特征在于其细胞作为饲养层，支持血细胞的繁殖和/或分化。
4.一种生产来自人骨髓细胞系的生长被停滞的贴壁基质细胞的方法，其特征在于对基质细胞系的细胞进行培养直至它们达到汇合成片，对含有所说细胞的基质层进行重复传代直至细胞进入生长临界期，将分裂缓慢或根本不分裂的细胞从其支持物上移除，转入新的培养基，并在这种方式下辐照使它们生长被停滞。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于通过胰蛋白酶消化来实现细胞从支持物上的除去。
6.根据权利要求1至3的基质细胞系的应用，用于造血生长因子的产生。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于基质细胞系是经辐照作用诱导使生长被停滞的。
8.根据权利要求6的应用，IL1和/或地塞米松存在时，所存在的量保证细胞系中造血生长因子的产生。
9.根据权利要求7的应用，IL1和/或地塞米松存在时，所存在的量保证细胞系中造血生长因子的产生。
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