HU218854B - Új kötőszöveti sejtvonalak emberi csontvelőből és alkalmazásuk - Google Patents

Description

A találmány tárgyát új kötőszöveti sejtvonalak képezik, amelyek a szaporodásukat leállító, a 20 Gy dózist elérő vagy meghaladó ionizáló besugárzás után letapadva maradnak. Ez különösen jól használható táplálósejtekké teszi azokat a táplálóréteg-függő sejtek hosszú időn át történő szaporítása számára.

A vérképző progenitor- és őssejtek fennmaradása és differenciálódása a hosszú időtartamú csontvelőkultúrákban (long-term boné marrow culture=LTBMC) tipikusan egy letapadt, kötőszöveti sejtekből álló funkcionális réteg jelenlététől függ [1-6], A kötőszöveti sejtek pontos szerepe a vérképzésben még nincs teljesen feltárva. A kötőszöveti sejtek azonban fontos forrásai azoknak a közvetítőanyagoknak (mediátoroknak), amelyek az őssejtek ellenőrzött differenciálódásához és szaporodásához szükségesek [7-9], Emellett a kötőszöveti sejtek egy komplex, funkcionális, extracelluláris hálózatot is szolgáltatnak, ami közvetlen sejt-sejt kapcsolatot biztosít a kötőszöveti és az őssejtek között. A heterogén kötőszöveti réteget alkotó sejtek között találunk makrofág sejteket, fibroblasztokat, zsírsejteket és endoteliális sejteket [1-3], ami rendkívül megnehezíti az egyes sejttípusok vérképzésben játszott szerepének vizsgálatát.

Az állandósított csontvelő-kötőszöveti sejtvonalak jól használható eszközt nyújtanak az egyes kötőszöveti funkciók elemzéséhez. Bár számos, spontán halhatatlanná vált patkány-kötőszöveti sejtvonal van leírva [13-15], a hasonló emberi sejtvonalak állandósítására tett próbálkozások kudarcot vallottak [16]. Emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalakat írtak le Thalmeier és munkatársai [41], azonban a közleményben leírt sejtvonalak közül egy sem maradt letapadva besugárzás után.

Az emberi kötőszöveti sejtvonalak állandósításával kapcsolatos problémák néhányát sikerült megoldani a simian vírus (SV40) nagy T-antigénjének génjét kódoló DNS-nek a sejtek genomjába való bejuttatásával [17-21]. Ez különböző géntranszfertechnikákkal valósítható meg, például kalcium-foszfátos precipitációval [17], rekombináns SV40 szerkezetek elektroporációjával [18, 20, 21], és vad típusú SV40 vírusokkal való fertőzéssel [19, 20], Ezeket a kötőszöveti sejtvonalakat használták modellrendszernek a kötőszöveti sejt-őssejt kölcsönhatás vizsgálatához [22-26]. Mindazonáltal az SV40-nel halhatatlanná tett kötőszöveti sejtvonalak táplálórétegként való alkalmazásának az LTBMC-tenyészetekben két súlyos hátránya van. Az első, hogy az SV40-nel halhatatlanná tett sejtek igen gyorsan szaporodnak egészen a századik sejtnemzedékig [27], majd egy jellegzetes krízisen átmenve a sejtek elpusztulnak [19], A második, hogy az SV40-nel halhatatlanná tett sejtek szaporodása nem gátolható besugárzással vagy mitomicin-C-vel anélkül, hogy le ne válnának a tenyésztőpalackról.

Találmányunkban új emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalakat és azok felhasználását írjuk le. Ezek a sejtvonalak nagy sebességgel szaporodnak, és szaporodásuk besugárzással leválás nélkül leállítható. A találmány szerinti sejtvonalak táplálósejtként való felhasználhatóságát azzal bizonyítjuk, hogy képesek támogatni a CD34+ emberi köldökvérőssejtek hosszú időn át történő szaporítását, és a táplálóréteg-függő BL70 sejtvonal klónképző szaporodását.

A találmány tárgyát emberi csontvelőből eredő kötőszöveti sejtvonalak képezik, amelyek azzal jellemezhetők, hogy a sejtvonal sejtjei letapadva maradnak a szaporodásukat gátló besugárzás után is.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy módszer emberi csontvelőből eredő, szaporodásukban gátolt, letapadt kötőszöveti sejtvonal előállítására és az említett kötőszöveti sejtvonal táplálórétegként való felhasználására vérsejtek tenyésztéséhez.

A találmány tárgyát képezik emberi csontvelőből eredő kötőszöveti sejtvonalak, amelyek a genomjukban a simian vírus 40 (SV40) olyan DNS-szekvenciáját tartalmazzák, amely azzal jellemezhető, hogy az S V40 vírus replikációjának indítószakasza hibás. A találmány egy előnyös megvalósításában a volt SV40 géneknek a burokfehérjéket kódoló része hiányzik.

Előnyös továbbá, ha a találmány szerinti kötőszöveti sejtvonal az SV40 vírus DNS-ből legalább a T-antigént kódoló szekvenciákat tartalmazza.

A találmány tárgyát az L87/4 (DSM ACC 2055) és az L88/5 (DSM ACC 2056) jelzésű kötőszöveti sejtvonalak képezik, amelyeket letétbe helyeztünk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, NSZK) gyűjteményében.

Találmányunk tárgyához tartozik még egy találmány szerinti sejtvonal alkalmazása táplálórétegként vérsejtekhez, előnyösen vérképző sejtekhez vagy más elősejtekhez. Emellett a találmány tárgyához tartozik még a találmány szerinti kötőszöveti sejtvonalak felhasználása növekedési faktorok és/vagy citokinek termelésére.

A találmány tárgyához tartozik továbbá a találmány szerinti kötőszöveti sejtvonalak alkalmazása vektorokban klónozott gének kifejezésére, ahol az említett gének az SV40 nagy T-antigénjének kontrollja alatt replikálódnak.

Az ábrák leírása

1. ábra. Az L87/4 és L88/5 kötőszöveti sejtvonalak sugárérzékenysége.

A sejteket 5 χ 10⁵/ml sűrűségben, LTC tápfolyadékban telepítettük 75 cm²-es palackokba, és 5-20 Gy dózissal besugároztuk. A besugárzás után a tápfolyadékot teljesen lecseréltük, és a sejteket 7 napon át inkubáltuk (37 °C, szén-dioxid) LTC tápfolyadékban. A 8. napon meghatároztuk a letapadt és le nem tapadt sejtek számát (A és B), és a sejteket GCT-TM tartalmú agarra telepítettük. Az agaron kifejlődött telepek számát a 14. napon határoztuk meg (C és D).

2. ábra. A BL70 sejtek válasza különböző táplálósejtekre határhígítással vizsgálva.

A BL70 sejteket határhígításos módszerrel telepítettük az L87/4 (körök) és az L88/5 (négyzetek) sejtek jelenlétében (A). A statisztikai analízis szerint a megtelepedés gyakorisága f=13,5 volt az L87/4 sejtek (r=-0,951; y = 0,925) és f=l,5 az L88/5 sejtek (r=-0,990; y=l,04) jelenlétében. Összehasonlításként (B) a megtelepedés gyakorisága f=5,7 volt az MR.C5 sej2

HU 218 854 Β tek (r=-0,996; y=l,OO) és f=2,5 a primer csontvelő kötőszöveti sejtek (r=0,996; y=0,98) jelenlétében.

3. ábra. A köldökvér granulocita-makrofág kötőszöveti sejtek támogatása az L87/4 és L88/5 kötőszöveti sejtvonalak által.

Az L87/4 és L88/5 kötőszöveti sejtvonalakon létrejött, le nem tapadt köldökvérsejteket a tenyésztés második hetétől kezdve hetente összegyűjtöttük, és a vérképző őssejteket metil-cellulózon tenyésztettük tovább. A telepeket (>50 sejt) 14 nappal a telepítés után számoltuk meg. Az ábrán két reprezentatív és független kísérlet eredménye látható.

4. ábra. Interleukin-la-val és/vagy dexametazonnal kezelt L87/4 és L88/5 sejtek G-CSF (granulocitatelepképzés-serkentő faktor), IL-6 (interleukin-6) és GMCSF (granulocita-makrofág telepképzés-serkentő faktor) termelése.

A sejteket 24 órán át inkubáltuk hidrokortizon nélküli LTC tápfolyadékban vagy IL-la-val (10 U/ml), vagy dexametazonnal (10^-6 mól), vagy mindkettővel kiegészített LTC tápfolyadékban. A felülúszó IL-6 aktivitását a 7TD1, G-CSF-aktivitását az NFS60 indikátorsejtvonalakkal határoztuk meg. A felülúszó GM-CSFaktivitását radioimmun módszerrel (R1A) mértük.

5. ábra. A besugárzott L87/4 és L88/5 sejtvonalak GCSF- és IL-6-termelése.

A sejteket LTC tápfolyadékban neveltük a telepek összeolvadásáig, majd 0-20 Gy dózissal besugároztuk. A besugárzás után a tápfolyadékot teljesen lecseréltük, majd 24 óra inkubálás után a sejtmentesített tápfolyadék IL-6- és G-CSF-aktivitását a 4. ábránál leírt módon mértük.

6. ábra. A pSV IN-1 transzfekciós vektor szerkezete Cohen et al., J. Virol. 57, 91-96 (1984) nyomán.

7. ábra. A 6. ábrán bemutatott vektorból származó pUC IN-1 wt transzfekciós vektor szerkezete.

Az SV40 DNS-t a pSVIN-1 plazmidból a Bam/Pst hasítóhelynél kivágva eltávolítottuk belőle az 1988-2533 bázispárok közötti szekvenciát. Ezután az eltávolított SV40 DNS-t a pUC 12 plazmidba klónoztuk a Bam/Pst hasítóhelynél.

A találmány részletes leírása

A szakterületen ismert összes emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalakkal szemben a találmány szerinti sejtvonalaknak a következő előnyei vannak.

a) Homogenitás

Az elsődleges kötőszövettől eltérően a sejtvonalak pontosan meghatározott, egyforma sejtek populációiból állnak. így a különböző személyekből származó elsődleges sejtek használatából eredő kísérleti szóródások ki vannak zárva.

b) Állandóság

Az elsődleges kötőszöveti sejtek és az SV40-nel halhatatlanná tett sejtvonalak véges számú osztódás után kihalnak. A találmány szerinti kötőszöveti sejtvonalak képesek a korlátlan számú osztódásra (a szó valódi értelmében „halhatatlanok”).

c) A szaporodás gátolhatósága besugárzással

Azokban a kísérletekben, amelyekben kötőszöveti sejteket használunk a vérképző őssejtek „táplálóréteg”-eként (táplálósejtekként), a kötőszöveti sejtek szaporodását meg kell gátolni, és ugyanakkor a sejteknek letapadva kell maradniuk a tenyésztőpalackban. A korábban leírt, SV40-nel halhatatlanná tett sejtvonalak a besugárzás után leváltak a felületről, míg a találmány szerinti sejtvonalak beszüntetik növekedésüket, és letapadva maradnak.

d) Vérképző növekedési faktorok termelése

A vérképzés elősejtjeinek szaporodását és differenciálódását a táplálósejtek szabályozzák, egyebek mellett növekedési faktorok termelésével. A találmány szerinti sejtvonalak nagy mennyiségű növekedési faktor termelésére képesek, amely termelőképességet mind besugárzással befolyásolni, mind interleukin-l-gyel serkenteni lehet.

e) A sejtvonalak vírusszaporodás okozta spontán megváltozása kizárt

Más olyan vektorok is használhatók, amelyek legalább az SV40 vírus DNS-ének a T-antigént kódoló szekvenciáját tartalmazzák, és amelyekben az SV40 replikációjának indítószakasza hibás. Emellett olyan vektorok is használhatók, amelyekben az SV40 vírus génjei közül a köpeny fehérjéket kódoló gének hiányoznak. A letapadt, primer, emberi csontvelő eredetű sejtek transzfekciója ilyen SV40 plazmid vektorokkal végezhető el. A transzfekciót liposzómákkal hajtjuk végre. A liposzómákban átvitt DNS eljut a csontvelősejtek magjába, és integrálódik a kromoszomális DNS-be. A vektor integrálódásának helye nem látható előre, azaz véletlenszerű. A sejtek halhatatlanságát a genomjukba integrálódott SV40 T-antigén kifejeződése okozza.

A fenti módon állandósított sejtvonalak halhatatlanok, igen rövid a duplikációs idejük, és homogén sejtpopulációt alkotnak.

Az általunk használt pUC12 és pBR322 vektorok, valamint az SV40 vírus DNS-szekvenciái a kereskedelemben kaphatók.

A találmány szerinti sejtvonalak a szaporodásukat meggátló besugárzás után letapadva maradnak. Ebben az állapotban a sejtek folytatják élettevékenységüket, de többé nem képesek az osztódásra. Nagy mennyiségben termelik a vérképzés növekedési faktorait és/vagy a citokineket.

A kötőszöveti sejtvonalak besugárzását a szakterületen jártasak által jól ismert módszerekkel, például a [21] közleményben leírtak szerint végezhetjük. Rendszerint 5-20 Gy dózisú ionizáló sugárzást alkalmazunk. A besugárzás előtt célszerű letapadni hagyni a sejteket a tenyésztőpalack felületére (bevonatképzés). A besugárzás után a túlélő sejtek (több mint 80%) letapadva maradnak. Az elpusztult sejtek leválnak a felületről, és ezen az alapon könnyen elválaszthatók a találmány szerinti sejtektől, például a tápfolyadék kicserélésével.

A fenti módon kapott letapadt sejtek hosszú időn át életben maradnak, így hordozóként szolgálhatnak a táplálóréteg-függő sejtek, például a vérképzés elősejtjei vagy a keringő vérsejtek tenyésztéséhez. Jellemző módon 7 nap után a letapadt sejtek 90%-a és két vagy három hét múlva 50%-a még mindig él. Tápfolyadékként

HU 218 854 Β (a vérsejtekkel együtt történő tenyésztéshez is) a szakterületen ismert bármilyen, a kötőszöveti sejtek tenyésztéséhez alkalmas tápfolyadékot használhatunk.

A találmány szerinti kötőszöveti sejtek úgy is tekinthetők, mint aktív, membránnal körülvett szubcelluláris fragmentumok forrásai, amelyek a teljes sejtekkel azonos módon serkentik a vérsejtek szaporodását és/vagy differenciálódását. Az ilyen frakciókban szubcelluláris vezikulumok lehetnek, amelyeket például hipotóniás sokkal nyerhetünk, vagy sejtmentes, T-membránnal körülvett vezikulumok, amelyeket például citochalazin-B-vel inkubálva nyerhetünk. Ugyancsak megfelelő a találmány szerinti sejtek egy olyan eluátuma, amelyet például nátrium-kloriddal vagy nátrium-citráttal való inkubálás után kapunk. A találmány szerinti sejtek ilyen frakcióit tovább tisztíthatjuk a szakterületen jártasak által ismert módszerekkel, például kromatográfiás módszerekkel, ahol a frakciók aktivitását (táplálórétegként való alkalmasságát) minden egyes tisztítási lépés után meg kell vizsgálni.

A membránnal körülvett vezikulumok előállítása például Mául et al. [38] módszerével is történhet; az idézett közleményt találmányunkban referenciaként tartjuk számon. Egy másik módszert írtak le Jett et al. [39], akiknek közleményét szintén referenciaként tekintjük. Eszerint a sejteket Earl-pufferrel mossuk, majd három lépésben, 15 percenként glicerint adunk a szuszpenzióhoz a 30 térfogat% végkoncentráció eléréséig. Centrifugáljuk, elvégezzük a sejtoldást, többször centrifugáljuk, és a vezikulumfrakciót feldúsítjuk. A feldúsított frakciókat megvizsgáljuk a vérsejtek - előnyösen vérképző törzssejtek vagy őssejtek - szaporodását támogató tulajdonságra.

A „sejtek szaporodását támogató” kifejezés alatt azt értjük, hogy egy találmány szerinti sejtvonal támogatja a vérsejtek életben maradását és szaporodását, és lehetőleg azok növekedési faktor és/vagy citokintermelését. Eközben a találmány szerinti sejtvonalak sejtjei letapadva kötődnek egy felülethez (előnyösen a tenyésztőpalackhoz). A táplálóréteg-fuggő sejtek megtelepednek ezen a táplálórétegen, és az serkenti szaporodásukat és/vagy differenciálódásukat. A táplálóréteg látja el a vérsejteket növekedési faktorokkal, például citokinekkel és adhéziós molekulákkal.

A „sejtek differenciálódását támogató” kifejezés alatt különösen az olyan sejtek differenciálódásának elősegítését, támogatását értjük, amelyek még nincsenek véglegesen differenciálódva (azaz nem érték még el fejlődésmenetük végállapotát). Ilyen sejttípusok például a pluripotens törzssejtek és a vérképző őssejtek.

Vérsejtek alatt például a vérképző törzssejteket, a vérképző őssejteket vagy a keringő vérsejteket értjük. Ilyen sejttípusok például CD34+ emberi köldökvérőssejtek vagy még a nyiroksejtek is (modellsejtekként a BL70 sejtvonalak [35] ismeretesek), valamint a csontvelőből izolált törzssejtek, az emberi köldökvérből vagy keringő vérből izolált sejtek, és az őssejtek, mint a granulocita-, vörös- vagy makrofágőssejtek.

A tipikus tenyészetek készítésekor 5 χ 10⁵ sejt/ml sűrűségű tenyészeteket telepítünk 75 cm² felületre.

A táplálóréteg-fuggő sejtek tenyésztésének egy előnyös megvalósításában sejtvonalakat tenyésztünk először a teljes fedettség eléréséig, majd besugározzuk azokat. A besugárzás után a tápfolyadékot lecseréljük, és ezzel eltávolítjuk az elpusztult és le nem tapadt sejteket. Az így előkészített sejteket közvetlenül használjuk fel táplálórétegként. Előnyös azonban a sejtek néhány órás inkubálása egy szérummentes tápfolyadékban a felhasználás előtt.

A találmány egy előnyös megvalósításában a találmány szerinti kötőszöveti sejteket a vérképző törzssejtek differenciálódás nélkül történő szaporításának támogatásához használhatjuk fel. Az így történő szaporítás körülményeit Koller, R. M. et al. [40] írták le, akik közleményét találmányunkban referenciaként tartjuk számon.

Az őssejtek differenciálódás nélküli szaporítása különösen jól használható az olyan őssejtek tenyésztésére, amelyeket ex vivő genetikailag módosítottak transzdukció útján. Az így módosított őssejtek génterápiához használhatók. A transzdukció a szakterületen ismert módszerekkel, például retrovírusokkal vagy DNS-sel és liposzómákkal végezhető. Mivel az ilyen transzdukció eredményessége igen alacsony, a felszaporított transzdukált őssejtek nagyon értékesek az ex vivő génterápiában.

A leállított szaporodású, letapadt kötőszöveti sejtek létrehozásánál előnyös, ha a kötőszöveti sejtvonalak sejtjeit a teljes fedettség eléréséig tenyésztjük, és ismételten átoltjuk a kötőszöveti réteget addig, amíg a sejtek el nem érik a szaporodási krízist. Ez általában 25-30 szaporodási ciklus után következik be. Ezután a sejteket - amelyek már csak igen kis arányban vagy lényegében már egyáltalán nem osztódnak - összegyűjtjük például tripszinezéssel, és egy tenyészetet indítunk belőlük friss tápfolyadékkal. Ezután a sejteket a fent leírt módon besugározzuk. A leállított szaporodású kötőszöveti sejtek letapadva maradnak, míg a besugárzástól elpusztult sejtek leválnak, és így egyszerűen eltávolíthatók.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti kötőszöveti sejtvonalak nagy mennyiségű növekedési faktort termelnek. Ez a termelés változó intenzitású (előnyösen 5 és 20 Gy közötti) besugárzással és/vagy IL-l-gyel (5-50 U/ml, előnyösen 5-15 U/ml) és/vagy dexametazonnal (0,5-2xl0“⁶ mol/1) indukálható. A besugárzással végzett indukció általában a granulocitatelepképzés-serkentő faktor (G-CSF) termelésének fokozódását váltja ki (körülbelül 50 ng/ml tápfolyadék értékig, és körülbelül 100 U/ml IL-6-termelést 20 Gy dózis esetén). Az IL-1 emellett a granulocitamakrofág telepképzés-serkentő faktor (GM-CSF) termelését serkenti. A sejtek által ezen a módon termelt növekedési faktorok a szakterületen jártasak által jól ismert módszerekkel tisztíthatok.

A csontvelősejtek transzfekcióját a következő módon végezzük el. A csontvelősejteket 2-3 hétig tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, a hosszú időtartamú tenyésztésre (LTC) szolgáló McCoy 5a tápfolyadékban, amit 12,5% magzati borjúszérummal (FCS), 12,5% lószérummal (HS),

HU 218 854 Β

1% nátrium-hidrogén-karbonáttal, 1% MÉM nem esszenciális aminosavoldattal, 1% L-glutaminnal (200 mmol), 1% penicillin-sztreptomicin oldattal (az összes oldat a Gibco gyártmánya), 10~⁴ mól 3-merkapto-l,2-propándiollal és 10 ⁶ mól hidrokortizonnal egészítünk ki. A tenyésztést a teljes fedettség eléréséig folytatjuk. Egy nappal a transzformáció előtt a letapadt kötőszöveti sejteket tripszinezéssel összegyűjtjük, és 25 cm²-es tenyésztőpalackokba telepítjük 5 χ 10⁵ sejt/ml sűrűségben. A transzformációt cézium-klorid gradiensben tisztított plazmid-DNS-sel végezzük (pSV-INl és pUCIN-lwt).

A transzformációt a Serva útmutatója (IBF Instruction Sheet No. 2942 10) szerint, az alábbi módon végezzük el.

A még nem teljes fedettségű sejteket egyszer mossuk foszfátpufferelt fiziológiás sóoldattal (PBS), egyszer McCoy 5a tápfolyadékkal, és 5-18 órán át inkubáljuk frissen elkészített plazmid/transzfekciós segédanyagok keverékével 8 ml szérummentes tápfolyadékban, 25 cm²-es tenyésztőpalackokban. A transzfekció után a sejteket kétszer mossuk PBS/10% FCS-oldattal, majd LTC tápfolyadékban tenyésztjük a teljes fedettségig. A transzformálódott sejteket a kötőszöveti sejtréteg 1:2 arányú, ismételt ámításával szelektáljuk. Körülbelül 25-30 átoltás után a halhatatlanná tett sejtek egy úgynevezett szaporodási krízisbe jutnak. A krízis túlhaladható, ha az igen lassan vagy egyáltalán nem osztódó sejteket tripszinezéssel leválasztjuk a felületről, és új tenyésztőpalackba tesszük át. Az így kezelt sejtek spontán magukhoz térnek a krízisből, és a halhatatlan sejtek fenotípusát mutatják.

Az L87/4 és L88/5 kötőszöveti sejtvonalak a következő tulajdonságban különböznek egymástól: a T-antigén kifejeződése:

L87/4: alacsony termelés (14. átoltás)

L88/5: erős termelés (14. átoltás) a vírus-DNS integrálódásának helye:

különböző integrálódási helyek a genomban állandó növekedésifaktor-termelés:

L87/4: állandó G-CSF- és IL-6-termelés

L88/5: alacsony szintű állandó G-CSF- és IL-6termelés.

A G-CSF- és IL-6-termelés mindkét sejtvonalban besugárzással indukálható.

A találmány szerinti sejtvonalak használatának néhány fontos példáját az alábbiakban mutatjuk be.

A találmány szerinti kötőszöveti sejtvonalak és előnyösen az L87/4 és L88/5 sejtvonalak minden olyan kísérletben használhatók, amelyekben szaporodásukban táplálóréteg-függő sejteket tenyésztenek. Ilyen az öszszes vérképző őssejt és törzssejt, valamint a csontképzés elősejtjei (oszteoklasztok). Pozitív eredményeket kaptunk a korai szakaszban táplálóréteg-függő, B típusú tumorsejtek (a BL70 sejtvonal) tenyésztésével is az L88/5 és L87/4 sejtvonalakon.

A normál vérképző őssejtek mellett a találmány szerinti sejtvonalak, és előnyösen az L87/4 és L88/5 sejtvonalak felhasználhatók fehérvérűségben szenvedő betegekből származó, rosszindulatúan elfajult csontvelősejtek (CML, AML, ALL) gyógyszerérzékenységének vizsgálatához, aminek különleges jelentősége van az autológ csontvelő átültetésében. A kísérleti eredmények szóródása, ami a különböző vizsgálati személyekből származó primer táplálósejtek használatánál fordul elő, itt ki van zárva.

A táplálósejtekként való felhasználás mellett a találmány szerinti sejtvonalak és előnyösen az L87/4 és L88/5 sejtvonalak számos növekedésifaktor-termelő sejtvonalaként is alkalmazhatók. Ebből a szempontból az L87/4 sejtvonal rendkívül magas G-CSF-termelése és az L88/5 sejtvonal IL-6-termelése nyerhet jelentőséget. Ki lehetett mutatni továbbá egy ez idáig meg nem határozott, erős serkentőaktivitást az L88/5 sejtvonal sejtmentes tápfolyadékából a 7TD1 és NFS60 sejtek szaporodására.

A sejtvonalak alkalmazhatók vektorokban klónozott olyan gének kifejező sejtvonalaiként, amelyek az SV40 vírus nagy T-antigénjének kontrollja alatt replikálódnak. Példaként a COS sejteket említjük meg.

A következő példák találmányunk megértéséhez nyújtanak segítséget. Belátható, hogy a leírt eljárásokon változtatások hajthatók végre anélkül, hogy elhagynánk találmányunk szellemét és oltalmi körét.

1. példa

Hosszú időtartamú, besugárzás utáni táplálókapacitással bíró, állandósított emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalak alapítása

a) Anyagok és módszerek

Csontvelő

A hosszú időtartamú tenyésztéshez és transzfekciós kísérletekhez a csontvelősejteket hematológiai eltérés nélküli betegek frissen csonkolt bordáiból nyertük. Az összes mintát a betegek felvilágosítása utáni beleegyezésükkel, az intézmény etikai bizottságának előírásai szerint vettük.

Hosszú időtartamú tenyésztés (LTC)

A csontvelősejteket a bordából PBS-sel öblítjük ki, és minden további tisztítás nélkül, 2χ 10⁶ sejt/ml sűrűségben telepítjük egy 75 cm²-es tenyésztőpalackba, Dexter-féle hosszú időtartamú csontvelő-tápfolyadékba [az LTC tápfolyadék a McCoy 5a, amit 12,5% előre kiválasztott magzati borjúszérummal (FCS), 12,5% előre kiválasztott lószérummal (HS), 1% nátrium-hidrogénkarbonáttal, 1% nátrium-piruváttal, 0,4% MÉM nem esszenciális aminosavoldattal, 0,8% MÉM esszenciális aminosavoldattal, 1% vitaminoldattal, 1% L-glutaminnal (200 mmol), 1% penicillin-sztreptomicin oldattal (az összes oldat a Gibco gyártmánya), 10 ⁴ mól 3merkapto-l,2-propán-diollal és 10“⁶mol hidrokortizonnal egészítünk ki]. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxidot tartalmazó, párásított atmoszférában inkubáljuk, és hetente cseréljük a tápfolyadék felét.

Az emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalak állandósítása

A csontvelősejteket 2-3 héten át tenyésztjük LTC tápfolyadékban, amíg a kötőszöveti réteg eléri a csaknem teljes fedettséget. A letapadt kötőszöveti sejteket

HU 218 854 Β tripszinezéssel összegyűjtjük, és egy 25 cm²-es tenyésztőpalackba tesszük 5 χ 10⁵ sejt/ml sűrűségben. Céziumklorid gradiensben tisztított plazmidvektorokat, a pSVIN-l-et (kezdőhelyhiányos SV40 genom a pBR322-be klónozva) és pUCIN-l-et (kezdőhelyhiányos SV40 genom a pUC12-be klónozva, a későbbi gének részben eltávolítva) használjuk a transzfekciós kísérletben. A liposzómákkal végzett transzfekciót lényegében a gyártó (Serva, Heidelberg) használati utasítása szerint hajtjuk végre. Röviden, a csaknem teljes fedettségű letapadt sejteket egyszer PBS-sel, egyszer McCoy 5a tápfolyadékkal mossuk, majd 5-18 órán át inkubáljuk frissen elkészített plazmid/transzfekciós segédanyagok keverékével 8 ml szérummentes LTC tápfolyadékban, 25 cm²-es tenyésztőpalackokban. A transzfekció után a sejteket kétszer mossuk PBS/10% FCSoldattal, majd 10 ml LTC tápfolyadékban tenyésztjük a teljes fedettségig. Egy körülbelül 6 hetes látencia után, amikor a transzformált sejtek elkezdik felülnőni a primer kötőszöveti sejteket, 1:2 arányban folyamatosan átoltjuk azokat. A transzformált sejteket LTC tápfolyadékban, 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxidot tartalmazó, párásított atmoszférában inkubáljuk.

Southern biot kísérletek

Legalább 6 átoltás után a transzformált sejtek DNSét cézium-klorid gradiensben megtisztítjuk [28], megfelelően megválasztott enzimekkel emésztjük, és 0,8%os agarózgélben elektroforetizáljuk. A DNS-t Hybond N (Amersham Buchler, Braunschweig) szűrőkre cseppentjük, és az SV40 nagy T-antigénjét kódoló, radioaktivitással jelölt BamHI/pSVIN-1 fragmentummal hibridizáljuk.

Northern biot kísérletek

A transzformált sejtek teljes RNS-tartalmát a guanidinium-izotiocianát extrakciós módszerrel [29] kivonjuk, glioxáljuk, és 1%-os agarózgélben frakcionáljuk (20 pg/csík). Az RNS-t Hybond N szűrőre cseppentjük, és az SV40 nagy T-antigénjét kódoló, radioaktivitással jelölt, a pSVIN-1 plazmidból származó BamHI fragmentummal hibridizáljuk.

A sugárérzékenység vizsgálata

A transzformált sejteket 5 χ 10⁵ sejt/ml sűrűségben, 75 cm²-es tenyésztőpalackokban, LTC tápfolyadékban inkubáljuk 18 órán át. Ezt követően 5-20 Gy dózissal, egy ¹³⁷Cs gamma-sugárforrással (Atomié Energy of Canada, Ontario, Canada) besugározzuk. A besugárzás után a tápfolyadékot teljesen lecseréljük, és a sejteket 7 napon át inkubáljuk LTC tápfolyadékban (37 °C, 5% CO₂). A 8. napon a letapadt és le nem tapadt sejteket tripszinezéssel összegyűjtjük, meghatározzuk a sejtszámot, és a besugárzott sejtek telepképző képességét agartenyészeteken, a telepek 14. napi megszámlálásával határozzuk meg.

A telepképzés vizsgálata

A transzformált kötőszöveti sejtvonalak klónképző potenciáljának meghatározásához a letapadt sejteket tripszinezéssel összegyűjtjük (0,25% tripszin, Gibco), és félszilárd agartenyészetre telepítjük [30]. Röviden, a kötőszöveti sejteket háromszoros ismétlésben, 10⁵ sejt/ml koncentrációban, 0,6% Bacto-agart (Difco, Detroit, Michigan) és 40% előre kiválasztott FCS-t tartalmazó, kétszeres koncentrációjú IMDME-táptalajra (Iscove által módosított Dulbecco-tápfolyadék) telepítjük. A telepek fejlődését 10 térfogat% óriássejttumorserkentő tápfolyadék (GCT-CM; American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) hozzáadásával segítjük elő. A tenyészeteket 14 napon át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, párásított, 5% szén-dioxidot tartalmazó levegőben. A fíbroblaszttelepeket a 14. napon értékeljük egy 32x-es nagyítású inverz mikroszkóppal.

Fenotipizálás immunofluoreszcens festéssel (1. táblázat)

a) Közvetett immunofluoreszcens festés

A tárgylemezeken tenyésztett L88/5 és L87/4 sejteket kalciummentes PBS-sel mossuk, majd 10 percig fixáljuk jéghideg metanol/aceton=l/l arányú keverékkel. A lemez PBS-sel való újbóli leöblítése után a VIIIfaktor-szerű antigént felismerő, hígított nyúlantiszérumot (Behring, 100 pl antiszérum+1,5 ml kalciummentes PBS) rétegezőnk rá. Ezután a lemezeket 37 °Con nedves kamrában inkubáljuk, majd kalciummentes PBS-sel mossuk, és fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt, másodlagos antinyúlantitestet rétegezőnk rá. 30 perces, 37 °C-on végzett inkubálás után a lemezeket kalciummentes PBS-sel lemossuk, glicerin és kalciummentes PBS 1/1 arányú keverékével borítjuk, és fedőlemezzel lefedjük.

b) Immunofluoreszcens festés FACS-analízishez

A tenyésztőpalack felületére letapadt kötőszöveti sejteket kollagenáz (0,1 U/ml) és diszpáz (0,8 U/ml) keverékével végzett emésztéssel (15 perc, 37 °C) felszabadítjuk. A sejteket kalciummentes PBS-sel mossuk, IF-pufferben (kalciummentes PBS, 0,1% nátrium-aziddal és 2% FCS-mal kiegészítve) felszuszpendáljuk, és 4 °C hőmérsékleten, 30 percen át jelöletlen, illetve FITC- és PE-konjugált első antitesttel inkubáljuk. A sejteket ezután kétszer 1 ml IF-pufferrel mossuk, és a jelöletlen első antitesttel kezelt mintákat a fent leírt módon, FITCvagy PE-konjugált második antitesttel kezeljük. Az így megfestett sejteket 1 ml IF-pufferben felszuszpendáljuk, és egy FACScan átfolyós sejtszámlálóval (Becton Dickinson) analizáljuk.

Citokémiai festés a fenotípus meghatározásához (1. táblázat)

A tárgylemezen tenyésztett sejteket kalciummentes PBS-sel mossuk, levegőn szárítjuk, és klór-acetát-észterázzal vagy α-naftil-észterázzal festjük a gyártó (Sigma) használati utasítása szerint.

Határhígítás

Letapadt táplálósejteket telepítünk 96 darab vájt tárgylemezre, hagyjuk fejlődni a teljes boritottságig, majd besugározzuk (MRC5: 50 Gy; BM táplálósejt: 50 Gy; L88/5: 15 Gy; L87/4: 20 Gy) egy i³⁷Cs sugárforrással. Huszonnégy óra múlva BL70 sejteket mosunk kétszer szérummentes tápfolyadékkal, és a 2. ábrán feltüntetett sűrűségekben legalább 24 lemezhez adjuk azokat. A lemezeken hetente kétszer cseréljük, a tápfolyadékot és a telepek növekedését a 40. napig követjük nyomon. Az összes határhígítási kísérletet 5%

HU 218 854 Β

FCS-sel, 2 mmol L-glutaminnal és antibiotikumokkal kiegészített RPMI1640 tápfolyadékban végezzük. A BL70 sejteket ugyanilyen tápfolyadékban tartjuk a besugárzott (50 Gy) MRC5 sejtek jelenlétében. Az MRC5 sejteket a Dulbecco-féle MÉM tápfolyadékban tenyésztjük, amit 10% FCS-sel, 2 mmol L-glutaminnal és antibiotikumokkal egészítünk ki.

Együtt-tenyésztési kísérletek CD34^ emberi köldökvérsejtekkel

A percollon elválasztott mononukleáris köldökvérsejteket előbb anti-CD34, fluoreszcein-izotiocianáttal közvetlenül konjugált monoklonális antitestekkel (Dianova, Hamburg) megfestjük, majd egy FACStarPlus (BD FACS System; Becton Dickinson) sejtszorterrel szétválogatjuk a CD34-kifejeződés erőssége szerint, vagy a CD34-pozitív (CD34+) sejteket elkülönítjük olyan Dynabeads M450-nel, amit közvetlenül mAb BI-3C5 antitesttel burkolunk [34].

A CD34+ köldökvérsejteket 24 vájt tárgylemezre telepítjük (5xl0³ köldökvérsejt/lemez) besugárzott, majdnem teljes fedettségű L87/4 (20 Gy) és L88/5 (15 Gy) kötőszöveti sejtekre, LTC tápfolyadékban. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 5 héten át, a tápfolyadék felét cserélve hetente a második héttől. A le nem tapadt sejteket félszilárd táptalajon, vérképző (BFU-E) és csontvelői (GM-CFC) őssejtek jelenlétében vizsgáljuk meg. Tenyészeteket készítünk 10⁴ le nem tapadt sejt/ml sűrűségű szuszpenziókból IMDM-tápfolyadékban, amiben 30% FCS, 1% BSA, 10 ⁴ mól 3-merkapto-l,2-propándiol, 5% PHALCM, 0,98% metil-cellulóz, 3 U/ml EPO - valamennyi anyag a Terry Fox Laboratories gyártmánya és 100 ng/ml kitligandum van. A tenyészeteket 1 ml tápfolyadékban 35 mm-es szövettenyésztő lemezekre telepítjük, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és a telepeket a 14. napon megszámláljuk.

b) A fiatal, emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalak állandósítása és jellemzőik

Egy 70 éves, hematológiailag eltérés nélküli beteg csontvelősejtjeit 25 cm²-es tenyésztőpalackokban, szokványos LTBMC kultúrában tenyésztjük 3 héten át. A teljes fedettségű kötőszöveti sejtrétegeket egyszer átoltjuk, és lipofekciós technikával vagy a pSV-INl, vagy a pUC-INl plazmidvektorral transzformáljuk. Mindkét plazmid tartalmazza a transzformáló faktorként ismert SV40 T-antigént kódoló szekvenciákat [31, 32]. Tíz passzálható sejtvonalat választottunk ki az elsődleges kötőszöveti sejtekkel szemben mutatott, a transzformációval nyert szaporodási előnyük alapján. Le nem tapadt, az Epstein-Barr-vírus jelenlététől halhatatlanná vált B-sejtek spontán kinövését a tenyésztőpalackok 20%-ában figyeltük meg.

A tíz sejtvonalból ötöt választottunk ki a további vizsgálatok céljára; ezek jelölése L87/4, L88/5, L90/7, L91/8 és L87/12. Az összes sejtvonal fibroblaszt jellegű morfológiát mutat, egy stabilan integrált SV40szerkezetet tartalmaz és Northern biot módszerrel kimutathatóan kifejeződik bennük az SV40 nagy T-antigénje. A plazmidvektor integrálódási helye mind az öt sejtvonalban különböző. Az öt sejtvonal közül három monoklonális, kettő oligoklonális volt 6 passzázs után. Az SV40-nel transzformált sejtvonalak meglehetősen nagy sebességgel szaporodtak a 25-30. passzázsig, majd krízisbe jutottak. Az öt sejtvonal közül kettőt (az L88/5 és L87/4 sejtvonalakat) sikerült megmenteni. Ezeket folytonos tenyészetben tartjuk fenn, amelyek már meghaladták a 70. passzázst (18 hónap). Az összes további kísérletet a monoklonális, krízisen átesett L88/5 és L87/4 sejtvonalakkal folytattuk.

Számos jellemző, köztük az SV40 integrálódási helye, az SV40 T-antigén kifejeződése, a CD68 kifejeződése az L87/4 sejtvonalban és a besugárzásra adott válasz stabilan fennmarad a krízis előtti és utáni sejtekben. A fenti tulajdonságok a krízis utáni sejtekben több mint 30 passzázs után is stabilak. A találmány szerinti sejtvonalak fenntarthatok letapadt, szaporodásukban gátolt sejtrétegként 20 Gy-t elérő besugárzás után. Megjegyzésre érdemes, hogy a sejtek még magasabb ionizáló sugárdózisokat is elviselnek, ha időben CD34+ köldökvérsejteket adunk hozzájuk kis sűrűségben.

Találmányunk egy előnyös megvalósításában a sejtvonalakban kifejeződnek a CD10 és CD13 gének, de nem fejeződnek ki a vérképzési markerek (lásd 1. táblázat). Különösen előnyösek azok a sejtvonalak, amelyekben a CD68 makrofág marker kifejeződik. A találmány szerinti sejtvonalak fenotípusának jellemzőit az 1. táblázatban mutatjuk be.

A találmány szerinti sejtvonalak ugyancsak rendelkeznek a táplálóképességgel a krízis utáni passzázsok során (például a 60. passzázsban). Ezt az bizonyítja, hogy fenntartják a kötőszöveti sejtektől függő BLsejtvonalak (például a BL70) klónképző szaporodását több mint 5 héten keresztül. A BL70 sejtekkel végzett vizsgálat világosan bizonyítja, hogy a sejtvonalak az összes olyan faktort termelik, amelyek a rosszindulatú B-sejtek szaporodásához szükségesek. Ez nem zárja ki annak lehetőségét, hogy olyan további citokineket is termelnek, amelyek más sejttípusok szaporodását és differenciálódását segítik elő. Amint az a PCR-vizsgálatból kitűnik, a találmány szerinti sejtvonalak különböző vérképzési növekedési faktorokat termelnek, köztük olyanokat, mint az IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL—11, KL, LIF, G-CSF, GM-CSF és M-CSF. Ebből a citokinprofilból látható, hogy a találmány szerinti sejtvonalak képesek a normális, primer vérképző őssejtek hosszú időtartamú tenyésztésének fenntartására, például a granulocita-makrofág telepképző sejtek és a CD34+ köldökvérsejt-tenyészetek fejlődésének támogatására.

Az L88/5 és L87/4 kötőszöveti sejtvonalak jellemzése

Fáziskontraszt-mikroszkóppal vizsgálva mindkét kötőszöveti, krízis utáni sejtvonal fibroblasztszerű morfológiát mutat. A sejtek gyorsan, az L88/5 esetében 1 napos, az L87/4 esetében 2 napos kettőződési idővel osztódnak. A sejtvonalak érintkezési gátlást mutatnak, és nem képeznek gócokat folyadéktenyészetekben. Félszilárd agartáptalajokon, 1% GCT-CM jelenlétében a sejtek fibroblasztoidtelepekké szaporodnak.

Mindkét sejtvonalban kifejeződik az SV40 T-antigén, és ugyanazt az SV40 integrációs helyet mutatják a

HU 218 854 Β genomban, mint amilyent a krízis előtti L87/4 és L88/5 sejtekben találtunk. Immunofluoreszcenciával kimutatható, hogy az L87/4 és L88/5 sejtvonalakban kifejeződnek a CD10 és CD13 sejtfelszíni kötőszöveti markerek, de nem fejeződik ki egy sor vérképzősejt-marker (1. táblázat). Ugyanakkor az L87/4 megkülönböztethető az L88/5-től a CD68 makrofágmarker kifejeződése miatt.

Az L88/5 és L87/4 sejtek sugárérzékenysége

Az L88/5 és L87/4 sejteket az „Anyagok és módszerek” fejezetben leírt módon tenyésztjük, és az 5. ábrán feltüntetett módon besugározzuk. Mindkét sejtvonal 15 Gy sugárdózisig besugározható leválás nélkül. Az L88/5 sejtek szaporodása és telepképzése megszűnik a 15 Gy-t meghaladó dózisok hatására, míg az L87/4 sejtek megtartják szaporodó- és telepképző képességüket lágy agaron. Az L87/4 sejteket 20 Gy sugárdózissal kell besugározni, hogy megszűnjön a szaporodás a szuszpenziós tenyészetben, és a telepképzés lágy agaron (1. ábra).

Az L87/4 sejtvonal még magasabb dózisokkal is besugározható leválás nélkül, ha a besugárzott sejtréteghez 24 órán belül kisszámú (5 χ 10³/ml) CD34+ köldökvérsejtet adunk.

Az L88/5 és L87/4 sejtek helyettesítik a fibroblaszt- és csontvelötápláló sejteket

Számos Burkitt-limfóma-sejtvonal csak besugárzott emberi fibroblasztrétegen tenyészthető kis sejtsűrűség és alacsony szérumtartalom esetén. Nagy sejtsűrűségben nem igényelnek táplálóréteget. Táplálórétegként számos primer emberi és rágcsáló-fibroblasztsejt jöhet számításba ebben a rendszerben. Azonban a rendelkezésre álló, SV40-nel állandósított, emberi fibroblasztsejtvonalak közül sok rendszeresen alkalmatlannak bizonyul a Burkitt-limfóma-modell sejtvonalának, a BL70-nek a fenntartására [35], Amint az a 2. ábrán látható, a 15 Gy dózissal besugárzott L87/4 sejtek támogatják a BL70 sejtek telepképző szaporodását, még jobban is, mint a primer, besugárzott csontvelő-kötőszöveti sejtek és az emberi MRC5 fíbroblasztok. A táplálósejtek hiányában két napon belül elpusztuló BL70 sejtek a besugárzott L87/4 és L88/5 táplálósejteken több mint 5 hétig fenntarthatok. A BL70 sejtekkel végzett határhígítási kísérletek grafikus ábrázolása (2. ábra) elsőrendű kinetikára utal. Ez azt bizonyítja, hogy az L88/5 és L87/4 sejtek (éppúgy, mint az MRC5 sejtek vagy a primer csontvelő-kötőszövet) az összes, a BL70 sejtek optimális szaporodásához szükséges faktort biztosítják. Az L87/4 és L88/5 sejtek támogatják az emberi köldökvér-őssejtek hosszú időtartamú szaporodását

Nem teljes fedettségű, besugárzott L87/4 (20 Gy) és L88/5 (15 Gy) sejtekre 24 vájt tárgylemezen CD34+ emberi köldökvérsejteket telepítünk (5 χ 10³ sejt/lemez), és 5 hétig tenyésztjük LTC tápfolyadékban. A tenyésztés 5. hetéig mindkét kötőszöveti sejtréteg támogatja a le nem tapadt köldökvérsejtek szaporodását; a sejtszám maximumát az indítástól számított 2-3 hét múlva figyelhetjük meg. A tenyésztés ideje alatt a le nem tapadt sejtek száma körülbelül a bevitt sejtszám kétszázszorosára emelkedett. Nagyszámú mieloid (GM-CFC, 3. ábra) és eritroid (BFU-E) őssejt eredetű telep volt jelen a le nem tapadt sejtffakcióban 5 héttel a tenyészet indítása után, amint azt a metil-cellulózos telepképzési vizsgálattal kimutattuk.

1. táblázat

Az L87/4 és L88/5 krízis utáni kötőszöveti sejtvonalak fenotípusa

	L87/4	L88/5
c-kit	-	-
HLA-DR	-	-
CDI la, CDllb, CD14, CD23, CD32, CD33, CD34, CD36, CD38, CD56, CD61, CD64
CD10	+	+ +
CD13	+ + + L87/4	+ + + L88/5
CD68	+	-
CD71	+ + +	+ +
VlII-faktor-szerű antigén	-	-
Klór-acetát-észteráz	-	-
a-Naftil-észteráz	-	-
SV40 T-antigén	+ + +	+ + +
Simaizom típusú aktin	-	-
Laminin	-	-
Fibronektin	+ + +	+ + +
Vitronektin	+ + +	+ + +

2. példa

Állandó és változó citokintermelés a találmány szerinti sejtvonalakban A sejtek tenyésztése

Egy sor sejtvonalat és primer sejteket használunk pozitív kontrollként az RNS-analízishez. Ezek a következők: U937 sejtek (ATCC CRL1593, emberi hisztiocitás limfóma), HL60 sejtet (ATCC CCL240, emberi promielocitás leukémia), K562 sejtek (ATCC CCL243, emberi mielocitás leukémia), MelJuso (Dr. Johnsontól, Department of Immunology, LMU, München) és 5637 sejtek (ATCC HTB9, emberihólyag-karcinóma). A sejteket RPMI 1640 tápfolyadékban, 10% FCS jelenlétében, nedveskamrában (37 °C, 5% CO₂) inkubáljuk. Az összes sejtvonalat hetente kétszer oltjuk át.

Az aktivált T-sejtek tenyésztéséhez egészséges önkéntesek perifériás véréből limfocitákat különítünk el percollgradiensben és 10% FCS-sel, 1 térfogat% fitohemagglutininnel és 10 ng/ml forbol-2-mirisztát-13acetáttal kiegészített IMDM-tápfolyadékban inkubáljuk. Nyolc óra inkubálás után a sejteket összegyűjtjük, és az RNS-t guanidinium-izotiocianátos módszerrel [31] extraháljuk.

A primer kötőszöveti sejtrétegeket az 1. példában leírt módon készítjük el.

HU 218 854 Β

Az L87/4 és L88/5 sejtek kezelése IL-ltt-val és dexametazonnal

L87/4 (96. passzázs) és L88/5 (98. passzázs) sejteket telepítünk 2 χ 10⁵/ml sűrűségben 25 cm²-es tenyésztőpalackokba, és 24 órán át inkubáljuk LTC-tápfolyadékban. A tápfolyadékot teljesen eltávolítjuk, és friss, hidrokortizon nélküli LTC-tápfolyadékkal, illetve 10 U/ml IL-la-val vagy 10 ⁶ mól dexametazonnal, vagy mindkettővel kiegészített LTC-tápfolyadékkal pótoljuk. Ezután a sejteket még 24 órán át inkubáljuk (37 °C, 5% CO₂), mielőtt az RNS-t extraháljuk. A tenyészetek felülúszóit összegyűjtjük a citokinbiomeghatározás és radioimmunvizsgálat céljára.

A kötőszöveti citokinekfelszabadulásának biológiai mérése

A kötőszöveti sejtek (L87/4 és L88/5) nyers, kondicionált tápfolyadékát a [36] közleményben leírt módon, szaporodásserkentő hatásra vizsgáljuk. Az IL-6-termelés kimutatására 7TD1 sejteket használunk. A GCSF-aktivitást az igen érzékeny NFS60 leánysejtvonallal mutatjuk ki, A sejtvonalak reakciójának specificitását a megfelelő, semlegesítő antitestek hozzáadásával ellenőrizzük.

A kötőszöveti citokinek felszabadulásának mérése radioimmuneljárással

Az L87/4 és L88/5 sejtek nyers, kondicionált tápfolyadékának IL-Ιβ és GM-CSF koncentrációját a [37] közleményben leírt módon mérjük.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a találmány szerinti két állandó kötőszöveti sejtvonal (azaz az L87/4 és L88/5) egy sor citokint termel, amelyek vélhetőleg közrehatnak az emberi vérképző őssejtek fenntartásában. Ez a citokintermelés részben serkenthető, és részben elnyomható besugárzással vagy glükokortikoidokkal.

IRODALOMJEGYZÉK

1. Dexter, T. M.: Stromal cell associated haemopoiesis. J. Cell Physiol. 1, 87 (1982, suppl.)

2. Allén, T. D., Dexter T. M.: The essential cells of the hemopoietic microenvironment. Exp. Hematol. 12, 517 (1984)

3. Dexter, T. M., Allén T. D., Lajtha L. G.: Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J. Cell Physiol. 91, 335 (1977)

4. Gartner, S., Káplán, H. S.: Long-term culture of humán boné marrow cells. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77, 4756 (1980)

5. Hocking, W. G., Golde, D. W. Long-term humán boné marrow cultures. Blood 56, 117 (1980)

6. Toogood, I. R. G., Dexter, T. M., Allén, T. D., Suda,

T., Lajtha, L. G.: The development of a liquid culture system fór growth of humán boné marrow. Leuk. Rés.

4. 449 (1980)

7. Kaushansky, K., Lin, N., Adamson, J. W.: Interleukin-1 stimulates fibroblasts to synthesize granulocytemacrophage and granulocyte colony-stimulating factors. J. Clin. Invest. 81, 92 (1988)

8. Fibbe, W. E., van Damme, J., Bilau, A., Goselink H. M., Voogt, P. J., van Eeden, G., Ralph, P., Altrock, B. W., Falkenburg J. H. F.: Interleukin-1 induced humán marrow stromal cells in long-term marrow culture to produce granulocyte colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor. Blood 71, 430 (1988)

9. Lee, M., Segal, G. M., Bagby, G. C. J.: Interleukin-1 induces humán boné marrow-derived fibroblasts to produce multilineage hematopoietic growth factors. Exp. Hematol, 15, 983 (1987)

10. Bentley, S. A.: Boné marrow connective tissue and the hematopoietic microenironment. Br. J. Haematol. 50, 1-6(1982)

11. Verfaillie, C., Blakolmer, K., McGlare, P.: Purified primitive humán hematopoietic progenitor cells with long-term in vitro repopulating capacity adhere selectively to irradiated boné marrow stroma. J. Exp. Med. 172, 509-520(1990)

12. Liesveld, J. L., Winslow, J. M., Kempski, M. C., Ryan, D. H., Brennan, J. K., Abboud, C. N.: Adhesive interactions of normál and leukemic humán CB34+ myeloid progenitors: Role of marrow stromal, fibroblast and cytomatrix components. Exp. Hematol. 19, 63-70(1991)

13. Hunt, P., Robertson, D., Weiss, D., Rennick, D., Lee, F., Witte, Ο. N.: A single boné marrow-derived stromal cell type supports the in vitro growth of early lymproid and myeloid cells. Cell 48, 997 (1987)

14. Quesenberry, P., Song, Z., McGratz, E., McNiece, I., Shadduck, R., Waheed, A., Babér, G., Kleeman, E., Kaiser, D.: Multilineage synergistic activity produced by a murine adherent marrow cell line. Blood 69, 827 (1987)

15. Collins, L. S., Dorshkind, K.: A stromal cell line from myeloid long-term boné marrow cultures can support myelopoiesis and lymphopoiesis. J. Immunoi. 138, 1082 (1987)

16. Lanotte, M., Allén, T. D., Dexter, T. M.: Histochemical and ultrastructural characteristics of a cell line from humán boné marrow stroma. J. Cell. Sci. 50, 281(1981)

17. Harigaya, K., Handa, H.: Generation of functional clonal cell lines from humán boné marrow stroma. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 3477 (1985)

18. Novotny, J. R., Duehrsen, U., Welch, K., Laytor., J. E., Cebon, J. S., Boyd, A. W.: Cloned stromal cell lines déri ved from humán Whitlock/Wittetype long-term boné marrow cultures. Exp. Hematol. 18, 775 (1990)

19. Singer, J. W., Charbord, P., Keating, A., Nemunaitis, J., Raugi, G., Wight, T. N., Lopez, J. A., Roth,

G. J., Dow, L. W., Fialkow, P. J.: Simian vírus 40transformed adherent cells from humán long-term marrow cultures: Cloned cell lines produce cells with stromal and hematopoietic characteristics. Blood 70, 64 (1987)

20. Aizawa, S. Yaguchi, M., Nakano, M., Inokuchi, S., Handa, H., Toyama, K.: Establishment of a variety of humán boné marrow stromal cell lines by the recombinant SV40-adenovirus vector. J. Cell. Physiol. 148, 245-251 (1991)

21. Ciuttini, F. M., Martin, M., Salvaris, E., Ashman, L., Begley, C. G., Novotny, J., Maher, D., Boyd,

HU 218 854 Β

A. W.: Support of humán cord blood progenitor cells on humán stromal cell lines transformed by SV40 large T-antigen under the influence of an inducible (metallothionein) promoter. Blood 80, 102-112 (1992)

22. Yang, Y.-C., Tsai, S„ Wong, G. G., Clark, S. C.: Interleukin-1 reguládon of hematopoietic growth factor production by humán stromal fibroblasts. J. Cell. Physiol. 134, 292-96 (1988)

23. Kohama, T., Handa, H., Harigaya, K.: A burstpromoting activity derived from the humán boné marrow stromal cell line KM-102 is identical to the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Exp. Hematol. 16, 603-608 (1988)

24. Nemunaitis, J., Andrews, D. F., Crittender:, C., Kaushansky, K., Singer, J. W.: Response of simian vírus 40 (SV40)-transformed, cultured humán marrow stromal cells to hematopoietic growth factors. J. Clin. Invest. 83, 593-601 (1989)

25. Nemunaitis, J., Andrews, D. F., Mochizuki, D. Y., Lilly, Μ. B., Singer, J. W.: Humán marrow stromal cells: Resporse to interleukin-6 (IL-6) and control of IL-6 expression. Blood 74, 1929-1935 (1989)

26. Slack, J. L., Nemunaitis, J., Andrews III, D. F., Singer, J. W.: Reguládon of cytokine and growth factor gene expression in humán boné marrow stromal cells transformed with simian vírus 40. Blood 75, 2319-2327(1990)

27. Neufeld, D. S., Ripley, S., Henderson, A., Ozer,

H.: Immortalization of humán fibroblasts transformed by origin-defective simian vírus 40. Molecular Biology 7, (8) 2794-2802 (1987)

28. Sambrook, I., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)

29. Chirgwin, J., Przybala, A., MacDonald, R., Rutter, W.: Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)

30. Mergenthaler H.-G., Brühl, P., Dörmer, P.: Kinetics of myeloid progenitor cells in humán micro longterm boné marrow cultures. Exp. Hematol. 16, 145-149 (1988)

31. Kuhar, S., Lehman, J. M.: T-antigen and p53 in pre- and postcrisis simian vírus 40 transformed humán cell lines. Oncogene 6, 1499-1506 (1991)

32. Chang, S.-E.: In vitro transformation of humán epithelial cells. Biochem. Biophys. Acta 823 (3), 161-194 (1986)

33. Andrews III, D.-F., Lilly, B.-M., Tompkins,

K.-C., Singer, W.-J.: Sodium vanadate, a tyrosine phosphatase inhibitor, affects expression of hematopoietic growth factors and extracellular mátrix RNAs in SV40 transformed humán marrow stromal cells. Exp. Hematol. 20, 449-453 (1992)

34. Smeland, E. S., Funderud, S., Kvalheim, G., Gaudemack, G., Rasmussen, A.-M., Rusten, L., Wang, Μ. Y., Tindle, R. W., Blomhoff, Η. K., Egeland, T.: Isolation and characterization of humán hematopoietic progenitor cells: An effective method fór positive selection of CD34⁺ cells. Leukémia 6, 845-852 (1992)

35. Fáik, Η. M., Hültner, L., Milner, A., Gregory, C. D., Bomkamm, G. W.: Irradiated fibroblasts protect Burkitt Lymphoma cells from apoptosis by a mechanism independent of BCL-2. Int. J. Cancer, in press (1993)

36. Mosman, T.: Rapid colorimetric assay fór cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunoi. Methods 65, 55-63 (1983)

37. Mortensen, Β. T., Schifler, S., Pedersen, L. B., Jensen, A. N., Hovgaard, D., Nissen, N. I.: Development and application of a sensitive radioimmunoassay fór humán granulocyte-macrophage colony-stimulating factorable to measure normál concentrations in blood. Exp. Hematol. 21, 1366-1370 (1993)

38. Mául et al.: Technics Insomatic Cell Genetics (1982), Ed. J. W. Shay, Plenum Press, New York

39. Jett et al.: Bioi. Chem 252, 2134-2142 (1977)

40. Koller, M. R. et al.: Large-scale expansion of humán stem and progenitor cells from boné marrow mononuclear cells in continuous perfusion culture. Blood 82 (2), 378-384 (1993)

41. Thalmeier, K. et al.: Establishment and characterization of humán boné marrow stromal cell lines. Exp. Hematology 20, 815 (1992)

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Az L87/4 (DSM ACC2055) és L88/5 (DSM ACC2056) emberi csontvelő-kötőszöveti sejtvonalak.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti sejtvonalak, melyek sejtjei az 5. vagy 6. igénypont szerinti kezelés után letapadva maradnak, amely sejtvonalak a simian vírus 40 DNS-ének szekvenciáit tartalmazzák genomjukban, ahol az SV40 vírus replikációs kezdőhelye hibás, a korai SV40 gének közül a burokfehérjéket kódoló gének legalább egy része hiányzik.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti kötőszöveti sejtvonalak, melyeknek besugárzással kiváltott szaporodásgátlás után interleukin-1-gyei és/vagy dexametazonnal való serkentés hatására G-CSF- (granulocitatelepképzés-serkentő faktor) és IL-6- (interleukin-6) termelése indukálódik.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti sejtvonal, melynek sejtjei táplálórétegként támogatják a vérsejtek szaporodását és/vagy differenciálódását.
5. 5. Eljárás emberi csontvelősejtvonalból származó, szaporodásában gátolt, letapadt kötőszöveti sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy a kötőszöveti sejtvonal sejtjeit a teljes fedettség eléréséig tenyésztjük, az említett sejtekből álló kötőszöveti réteget ismételten átoltjuk, amíg a sejtek elérik a szaporodási krízist, és az igen kis sebességgel vagy lényegében nem osztódó sejteket a hordozófelületről felszabadítva egy új tenyészetbe helyezzük és besugározzuk oly módon, hogy szaporodásgátolttá váljanak.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket a hordozófelületről tripszinezéssel szabadítjuk fel.

   HU 218 854 Β
7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárással nyerhető kötőszöveti sejtek, azzal jellemezve, hogy szaporodásuk gátolt és letapadtak, táplálórétegként serkentik a vérsejtek szaporodását és/vagy egy sejttenyészetben, két héten át legalább 50%-uk életben marad, és szaporo- 5 dásuk nem indítható el újra cinkionok hozzáadásával.
8. 8. A 7. igénypont szerinti sejtek felhasználása táplálóréteg-fiiggő sejtek tenyésztéséhez.
9. 9. Eljárás táplálóréteg-függő sejtek tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy az ilyen sejteket a 7. igénypont szerinti, szaporodásukban gátolt, letapadt kötőszöveti sejtekkel együtt tenyésztjük.
10. 10. Eljárás vérképzési növekedési faktorok termelésére, azzal jellemezve, hogy a termeléshez egy, az 1-4. igénypontok szerinti kötőszöveti sejtvonalat használunk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal besugárzás által szaporodásgátolt.
12. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interleukin-l-et és/vagy dexametazont használunk olyan mennyiségben, hogy a sejtvonal vérképzési növekedésifaktor-termelését ser10 kentse.
13. 13. A 7. igénypont szerinti sejtek felhasználása genetikailag módosított vérképző őssejtek elszaporítására.