CN1620498A - 用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(es)细胞系的组合物 - Google Patents

用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(es)细胞系的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1620498A
CN1620498A CNA028281144A CN02828114A CN1620498A CN 1620498 A CN1620498 A CN 1620498A CN A028281144 A CNA028281144 A CN A028281144A CN 02828114 A CN02828114 A CN 02828114A CN 1620498 A CN1620498 A CN 1620498A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
composition
lif
c57bl
human mammal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028281144A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100526455C (zh
Inventor
L·斯库恩简斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Thromb X NV
Original Assignee
Thromb X NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/BE2001/000221 external-priority patent/WO2003054169A1/en
Priority claimed from GBGB0220145.7A external-priority patent/GB0220145D0/en
Application filed by Thromb X NV filed Critical Thromb X NV
Publication of CN1620498A publication Critical patent/CN1620498A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100526455C publication Critical patent/CN100526455C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5415—Leukaemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明描述了用于分离、维持或生长多能及具哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的方法。本发明的组合物是指含有下列成分的组合物：1)经表达有限量白血病抑制因子(LIF)的细胞系条件培养基，2)来自被哺乳动物LIF转染的细胞系的条件培养基，以及3)添加了重组兔LIF的培养基。本发明还描述了用于分离、维持或生长成年人干细胞和/或成年早期祖细胞的组合物，优选在无基质及不额外添加LIF和/或细胞因子或生长因子的条件下培养。本发明的培养基可用于培养或制备现在还无法获得的多能和具哺乳动物种系感受态胚胎干细胞。本发明的培养基也可用于培养或制备成年人干细胞和/或成年早期祖细胞。本发明还涉及新型兔LIF、编码兔LIF的核苷酸以及在毕赤酵母表达系统中表达重组兔LIF的方法。

Description

用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(ES)细胞系的组合物
                               发明领域
本发明涉及新型组合物及其在多能干细胞和种系感受态胚胎干细胞的分离、维持或生长中的应用。本发明还涉及用组合物培养产生的ES细胞以及这些ES细胞系在种系传递及制备基因改造的非人动物中的应用。本发明还涉及新型组合物及其在成人干细胞(ASC)的分离、维持或生长中的应用。
                               发明背景
胚胎干细胞
ES细胞系是从胚泡的内细胞团(ICM)中分离出的细胞系，这些细胞在特定条件下可以维持很多代，就是说以一定的时间间隔将这些细胞接种到新的培养皿中其多能性不会丢失。它们能保持正常的核型，外源DNA可以重组(同源的或非同源的)到染色体DNA中，从而使目的基因稳定整合。但是到目前为止，种系传递，即ES基因组传递到下一代也只在某些种系的鼠ES细胞系中完成。
鼠胚胎干细胞的首次分离是于1981年。从那以后，已建立了几种ES细胞系，现在已被广泛而成功地用于在鼠基因组内导入靶向突变及其他基因修饰。现在所用的大多数有种系形成能力的ES细胞系都来自于129品系，其他的ES细胞系来自于另外的几个饲养品系(C57BL/6及其杂交品系)。而且，即使是129品系，ES细胞系最多也只能在30％的外植胚囊中获得，成功率约为10％，与正常的水平接近。
制备嵌合动物最常用的方法是将约10-15个分离的ES细胞注射到宿主胚泡的胚泡腔中，使这些细胞与内细胞团的细胞混和。然后将所得到的嵌合胚泡移植到受体动物体内培养。另外，利用很早期(8-16个细胞)阶段胚胎进行二倍体凝集或四倍体凝集也可以作为ES细胞的宿主。简言之，就是将ES细胞夹在无透明带的早期胚胎之间，培养过夜，然后移植到孵育母体中。这种方法可用于制备嵌合的或完全是ES细胞来源的子代。
尽管这些年来ES细胞的培养及嵌合动物的制备技术已有很大提高，但是ES细胞传过几代后其多能性常常降低，并且完全是ES细胞来源的胎儿(通过四倍体凝集制备)在出生后其存活率显著降低。Nagy等，″Derivation of completely cell culturederived mice from early-passage embryonic stem cells″Proc Natl Acad Sci USA1993；90：8424-8，利用早期几代来源的R1 ES细胞系与四倍体胚胎进行电融合得到凝集体，然后获得了完全是由ES细胞来源的小鼠。但是，这些R1 ES细胞一旦在体外扩增培养就失去了其全能性，因为14代以后来源的ES细胞所产生出的小鼠都无法生存到成年。而且，即使用早期几代的细胞，许多ES-四倍体凝集体在发育成个体前也都死亡了。因此，想要利用晚期传代的ES细胞得到发育正常的ES小鼠是很难实现的，利用基因改造的ES细胞制备ES细胞来源的小鼠好像也是不可能的。
最近，Eggan K等，″Hybrid vigor，fetal overgrowth，and viability of micederived by nuclear cloning and tetraploid embryo Complementation.Proc NatlAcad Sci 2001；98：6209-14证实现在的技术无法利用四倍体凝集的方法从饲养鼠品系的ES细胞获得发育完全的子代。并且发现基因杂合现象是影响通过核克隆或四倍体胚胎互补制备的ES细胞来源的子代存活的一个关键因素。利用任何一种方法制备的培养的ES细胞来源的胎儿都会因为呼吸衰竭而于围产期死亡。与此相对应的是，利用任何一种方法制备的F1 ES细胞来源的幼仔大多数(80-85％)都能存活到成年。但是在另一项研究中却发现ES细胞来源小鼠的出生死亡率与所用的细胞系之间没有明显的相关关系。各种细胞系来源的小鼠都会出现出生后死亡现象，包括那些具有不同遗传背景的细胞系。将1037个注射了各种来源ES细胞的四倍体胚胎移植后得到了34只完全ES细胞来源的仔鼠(3％)。但是只有13只(1％)仔鼠长到成年(AmanoT，Kato Y，Tsunoda Y.Comparison of heat-treated and tetraploid Blastocystsfor the production of completely ES-cell-derived mice.Zygote 2001；9：153-7)。
已经从小鼠之外的其他许多物种中分离出了假定的多能ES细胞，其中包括仓鼠、猪、羊、牛、水貂、大鼠、灵长类、人、鸡、小猿、青鳉和男人(man)。但是只有几个例子(猪、鸡、青鳉)用这些细胞系通过重新注入胚泡培养出了嵌合体动物，但是还远远没有达到种系传递。
从预先植入的兔胚泡中分离多能ES细胞系是Graves KH，Moreadith RW，″Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stemcells from preimplantation rabbit embryos″，Mol Reprod Dev 1993；36：424-33报道的。这些细胞系可以分化成不同类型的细胞，分别属于不同的所有三个胚层(用体外的标准评价其多能性)。最近的研究表明，这些从Dutch Belted品系来源的细胞系在注射到受体New Zealand White品系的胚泡中可以生出具有明显包被色的嵌合体，证明这些细胞在体内也具有多能性。但是还无法达到种系传递。另外的试验表明嵌合体形成的频率低以及无法达到种系传递可能是由于这些ES细胞经过多次传代后已丢失了多能性。
ES细胞在滋养层细胞存在的条件下可以维持在不分化的状态，因为滋养层细胞可以产生各种阻止细胞分化的因子。研究表明有几种细胞因子具有这种效应：DIA/LIF(分化抑制活性/白血病抑制因子)、白细胞介素-6联合可溶性白细胞介素-6受体、白细胞介素-11、抑瘤蛋白M、睫状神经营养因子和心脏营养蛋白。现在发现即使没有滋养层细胞利用这类因子也可以至少将ES细胞维持几代。除了小鼠以外，其他物种的ES细胞技术还处于发展之中，除了小鼠以外还没有公开发表的数据报道能在其他任何物种中达到种系传递。
重组的白血病抑制因子(LIF)现在已被常规添加到培养介质中用于体外培养从哺乳动物细胞中分离的胚胎干细胞(ES)。这种方法见于US 5,166,065，EP 0380646和WO9001541的权利要求，这些专利文献中的方法也是从以前的文献AU1988P109644(出版日期为1988年8月22日(51-53))发展而来的。重组鼠或人LIF蛋白的纯化和cDNA的克隆是基于其能够诱导鼠单核细胞系M1分化成成熟巨核细胞从而失去克隆形成能力。(重组)蛋白或cDNA(鼠或人突变株)见于US 5,187,077(以及其他几个后续专利，直到2001年7月17日出版的US 6,261,548)和EP 285448，这些专利文献也是根据1987年8月2日出版的文献AU1987 PI1209发展而来的。
后来的实验证明LIF与以前所纯化的蛋白和/或生物活性物质具有一致性。Hozumi等人于1980-1986期间的研究纯化出了同质性的因子D，该因子能刺激鼠单核细胞系M1的分化并能抑制其增殖，Tomida M，Yamamoto-Yamaguchi Y，Hozumi M.Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemicM1 cells from conditioned medium or mouse fibroblast L929 cells.J Biol Chem1984；259：10978-82)。随后发现因子D cDNA与LIF的cDNA序列一致(Lowe DG，NunesW，Bombara M，McCabe S，Ranges GE，Henzel W，Tomida M，Yamamoto-YamaguchiY，Hozumi M，Goeddel DV.Genomic cloning and heterologous expression of humandifferentiation-stimulating factor.DNA 1989；8：351-9)。在ES细胞培养基中使用LIF是因为研究发现Buffalo大鼠肝细胞分泌的DIA(分化抑制活性蛋白)可以抑制鼠胚胎干细胞的分化。
随后在cDNA水平和蛋白水平上确定了DIA和LIF的一致性(Smith AG，Heath JK，Donaldson DD，Wong GC，Moreau J，Stahl M，Rogers D.Inhibition of pluripotentialembryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.Nature 1988；336：688-90；Smith AG，Nichols J，Robertson M，Rathjen PD.Differentiationinhibiting activity(DIA/LIF)and mouse development.Devel Biol 1992；151：339-51.)。
在过去十年中重组DNA技术的进展大大促进了基因的分离和操作，任何能想到的新型构建体都可以通过基因工程技术构建出来，例如通过将一个基因的启动子与另一个基因的编码序列相连接，或者通过位点特异性的突变技术。同样，在胚胎操作领域的进展方便了将这些新型外源基因转移到内源性染色体DNA内制备转基因动物。转基因动物可以通过下列方法制备：将DNA注射到受精卵的原核内、将多能胚胎干细胞(ES)注入(基因操作)到宿主“胚胎”内、以及最近所普遍使用的通过核转移将体细胞稳定转染到去核的卵母细胞内。
通过对当前技术的回顾分析发现现在需要一种比较经济的组合物来使ES细胞在传过多代后依然能够维持其多能性及种系传递能力。另外还需要制备具有不同基因背景的转基因鼠品系以及制备其他非人转基因动物。这些动物可用于特定基因生物学效应的研究、治疗性基因产物的药物制备、改良家畜的生产等。
使培养的干细胞保持未分化表型所遇到的困难并不局限在胚胎干细胞。不同谱系的成年干细胞也有失去其分化成不同细胞类型的能力的趋势。对于造血干细胞来说维持其干细胞表型尤其困难。
造血干细胞(缩写为HSC)是从外周血、脐带血或骨髓中分离的细胞，这些细胞可以更新自身并且可以分化成各种特异的细胞。骨髓HSC可以从骨髓中动员出来。HSC可能经历程序性细胞死亡，被称为细胞调亡，通过这种过程细胞发生有害的自我毁灭或非必须的自我毁灭。据认为在每10,000到15,000个骨髓细胞中约有1个干细胞。在血液中每100,000个血细胞约有1个干细胞(Stem cells：scientific progressand future research directions Jun 2001，NIH)。在过去30年中，造血祖细胞/干细胞的移植作为一种治疗方案已取得了确实的临床疗效，并且已经成为了一种治疗多种恶性肿瘤、良性的血液疾病和发育不良而造成的血液系统疾病以及遗传性疾病的标准方案(Dupont B.(1997)in Immunology Reviews，Vol.157，5-12.)。造血干细胞移植在下述治疗方案中取得了特别成功的效果：用高剂量的化疗或放疗摧毁体内现存的病态血细胞或肿瘤，从而限制血液、间质和免疫患者重新生成血液和免疫系统的细胞。将供体的干细胞输注到患者的静脉内，如果移植成功，供体的造血干细胞就能生长，从而恢复受体的骨髓及其血液形成功能。
虽然自体骨髓或外周血干细胞具有广泛的用途，但是在许多情况下需要进行同种异体移植，因为进行自体干细胞移植时会有将恶性细胞转移到恶性疾病患者体内的潜在风险，另外，要找到白细胞抗原(HLA)一致性的同胞常常也很困难。对同种异体骨髓移植的主要限制在于缺少合适的HLA完全相匹配的供体，同时HLA不相配时容易发生移植物抗宿主免疫反应。
由于胎盘血液，也就是大家所熟知的脐带血(UCB)含有较多的HSC、与成年骨髓相比具有较多的髓样前体细胞和红系前体细胞、较大比例的未成熟克隆形成细胞、较小的传播感染疾病的危险以及较高比例的端粒酶，因此利用UCB可以解决许多问题(Mayani H，Lansdorp P.in(1998)Stem Cells.16，153-165)。第一例成功的移植发生于1988年的一个Fanconi贫血患者身上(Gluckman E等，(1989)in N.Engl.J.Med.，321：1174-8)，结果证明人的UCB是一种适宜的HSC替代资源，这一结果促进了在世界范围内建立大规模的脐带血库(Sirchia G.和Rebulla P.(1999)inHaematologica，84：738-747)。脐带血最主要的问题在于每个供体脐带血平均只含有1.5×105个有核细胞，按常规来说也只有1/10的有核细胞能用于成人的骨髓移植(Fasouliotis S.和Schenker J.(1999).Eur.J.Obst.Gynecol.Reprod.Biol.9：13-25)。医生很难从一个产妇的脐带血中分离出超过几百万个UCB HCS，因此其数量太少而无法移植给成年人，成年人所需要的理想的移植数量为每公斤体重(b.w.)7百万到1千万个CD34+细胞，但是这些数量对于儿童来说是足够的，尽管CD34+细胞输注的数量与所得到的移植效率之间常常存在差异。最近有些作者建议移植的阈值应为5×104CD34+CD38-细胞/KG b.w.，在这个阈值以下三线移植动力学明显变慢并且无法预测(Henon PH等，(2001)in J.Biol.Regul.Homeost.Agents.15，62-67)。这种较低数目的NC意味着脐带血的广泛应用受到限制。因此干细胞研究所遇到的主要挑战在于如何找到体外培养条件来改进可移植HCS在体外的长期维持和扩增。这种培养体系的建立是在体外操作和扩增可移植HSC从而用于临床的先决条件，如基因治疗、肿瘤细胞净化以及干细胞移植。
现在还需要适宜的实验室条件来刺激干细胞的扩增而不使其丢失干细胞特性，这样就可以增加一个供体来源的可移植细胞的数量供患者移植。现在已经证明HCS的扩增存在问题，除了用于替代血液和免疫系统以外，科学家在扩展其应用时遇到了障碍。首先，HSC在体外无法增殖(复制自身)和分化(变成其他类型的专业化细胞)(Lagasse E.，Weissman IL.，(2001)in Immunity，14，425-436.)；其次，科学家们还没有一个准确的概念来判断哪些是真正的干细胞。尽管还无法以繁殖的方式在体外无基质的培养基中长期扩增有集落形成能力的细胞，但是继续探索控制造血干细胞增殖和分化的机制有利于开发出不仅可以扩增前体细胞而且可以扩增HSC的培养系统(Verfaillie C.(2002).in Nature immunol.3，314-317)。Lewis I.等，(2001)in Blood 97，3441-3449用含滋养层细胞和细胞因子的非接触培养基扩增HSC来源的CD34+细胞，结果表明这些扩增的细胞移植到NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠体内后可以重新形成集落。Piacibello等，(1997)在Blood89，2644-2653发表的文章结果表明CD34+HSC来源的细胞在无细胞因子的培养基内数量快速下降并且在三周内死亡。Piacibello等，(1999)在Blood 93，11，3736-3749中描述CD34+HSC细胞在含有混合生长因子的无基质扩增基中最多可以扩增到10周，并且移植到亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内后发现还有集落形成能力。因此依然需要找到新型的或替代的添加或不添加生长因子的培养基来扩增成年干细胞或早期祖细胞如HSC。
                               发明概述
本发明涉及用于分离、维持或生长多能干细胞和哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的新型和超级组合物及其应用。
在本发明的第一个方面，涉及用于分离、维持或生长多能干细胞和人或非人哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的组合物，所述组合物含有用于培养特定细胞的条件培养基，其中，所述组合物中含有的白血病抑制因子(LIF)浓度低于2ng/ml，LIF的含量是通过免疫分析方法测定的，如利用能与兔和人LIF发生交叉反应的抗体的ELISA分析方法，例如抗人LIF的鼠单克隆抗体克隆9824.11。LIF的浓度优选小于1ng/ml，更优选的是小于0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml，最优选的是小于0.02ng/ml，所用的分析方法如上所述。组合物可以包含基础细胞培养基，例如而不限于含高糖DMEM的培养基，其中还可以选择添加一种或多种化合物，如非必须氨基酸、谷胺酰胺、还原剂、胎儿血清、新生儿血清或成年血清如胎牛血清。细胞的条件培养基来自永生成纤维细胞如兔成纤维细胞株Rab9(ATTC CRL-1414)。
本发明的另外一个方面涉及用于分离、维持或生长多能干细胞和人或非人哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的组合物，所述组合物含有条件培养基，这种培养基是经被编码LIF的核苷酸序列转染的细胞调节的。所述的核苷酸序列编码哺乳动物的LIF，优选编码兔的LIF。所述的核苷酸序列可以是cDNA序列，但是最好是哺乳动物LIF的基因组序列。转染的细胞系最好能稳定表达LIF编码核苷酸序列。用于转染LIF编码核苷酸序列的细胞可以是任何哺乳动物的细胞，但是优选成纤维细胞，更优选的是兔成纤维细胞系，最优选的是兔Rab9(ATCC CRL 1414)。本发明所用的转染细胞是被兔LIF编码基因组序列稳定转染的兔Rab9成纤维细胞。这种细胞保藏在比利时微生物协调保藏中心(Belgian Coordinated Collection of Microorganisms，Belgium)，保藏号为LMBP 5479CB。组合物可以包含基础细胞培养基，例如而不限于含高糖DMEM的培养基，其中还可以选择添加一种或多种化合物，如非必须氨基酸、谷胺酰胺、还原剂、除胎牛血清之外的胎儿血清、新生儿血清或成年血清如胎马血清、胎山羊血清、胎绵羊血清。
本发明的第三个方面涉及用于分离、维持或生长多能干细胞和人或非人哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的组合物，所述组合物含有经某些特定细胞条件培养基，其中，所述组合物添加了兔LIF、与兔LIF至少具有95％一致性的蛋白或其功能性衍生物。所述的蛋白可用适于蛋白表达的酵母进行表达，如甲基营养酵母毕赤酵母，其中编码所述蛋白的核苷酸序列可以选择以便于得到最佳的序列用于酵母表达系统。本发明所描述的兔LIF是用毕赤酵母细胞系表达的，该细胞系保藏在比利时微生物协调保藏中心，保藏号为MUCL-42925。
组合物可以包含基础细胞培养基，例如而不限于含高糖DMEM的培养基，其中还可以选择添加一种或多种化合物，如非必须氨基酸、谷胺酰胺、还原剂、胎儿血清、新生儿血清或成年血清如胎牛血清。
本发明描述了这些组合物在扩增非人哺乳动物多能胚胎干细胞方面的应用，这些细胞的来源包括而不限于小鼠，更优选的是Mus musculus品系小鼠，如129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有SwissWebster遗传背景的小鼠。
本发明还涉及人或非人哺乳动物的多能胚胎干细胞，这些细胞的来源包括而不限于小鼠，更优选的是Mus musculus品系小鼠，如129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N、DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有Swiss Webster遗传背景的小鼠，这些细胞在本发明的组合物中至少要培养1代。
本发明还涉及转基因非人哺乳动物，其中包括而不限于小鼠，更优选的是Musmusculus品系小鼠，如129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N、DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有Swiss Webster遗传背景的小鼠，这些小鼠都是利用在本发明的组合物中至少培养了1代的胚胎干细胞制备的。
本发明还涉及制备本说明书所描述的组合物、胚胎干细胞和转基因动物的方法。
本发明描述了兔细胞系的条件培养基在扩增胚胎干细胞和制备转基因动物中的应用，这种培养基可用于制备其他非人转基因动物，如非人灵长类动物、猪、绵羊、牛、水貂、马、山羊、绵羊、猫、犬、兔、大鼠、仓鼠以及鼠Mus Muculus之外的啮齿类动物。
本发明还描述了利用胚胎干细胞获得30％或更高外植胚泡的方法。
本发明进一步描述了通过凝集细胞与胚胎干细胞混和获得成年后代的方法，其中，所述胚胎干细胞至少培养了16代。
本发明特别涉及用于分离、维持或生长多能干细胞和哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的新型组合物。组合物包含基础细胞培养基，例如而不限于含高糖DMEM的培养基、非必须氨基酸、谷胺酰胺、还原剂和胎牛血清或其类似物的组合物。所述组合物预先经过稳定的细胞系来调节，例如而不限于兔细胞系Rab9(ATCC CRL-1414)或类似细胞系，这些细胞系能够分泌ES细胞生长和自我更新所必须的因子。未分化状态的维持，如形态学及表面标记指标(存在碱性磷酸酶而缺乏波形蛋白和细胞角蛋白)，要比利用含鼠LIF或兔LIF的标准细胞培养基培养出来的细胞指标重要。
这种组合物中可以选择添加重组白血病抑制因子(LIF)，优选本发明所描述的兔LIF(Rab-LIF)或购买的LIF。组合物中也可以包含抗生素，如青霉素/链霉素和胰岛素。本发明还涉及用于体外培养的ES细胞维持未分化状态的新型兔LIF(Rab-LIF)以及编码Rab-LIF的核苷酸序列。ES培养基中还可以含有其他组分，如白细胞介素、抑瘤蛋白、神经营养因子、干细胞因子和成纤维细胞生长因子。这些因子较特殊的例子是白细胞介素11、人抑瘤蛋白M、人睫状神经营养因子、心脏营养蛋白、白细胞介素6及其受体以及人干细胞因子。本发明还涉及利用这些ES细胞进行种系传递和制备经基因改造的非人动物。
本发明还涉及利用本发明的新型组合物分离、维持或生长原始生殖细胞。
本发明还涉及用于哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞无基质扩增的组合物。例如造血干细胞和成年早期造血祖细胞，用于培养ASC的组合物包含成纤维细胞系的条件培养基。成纤维细胞系优选永生细胞系，更优选的是兔的永生成纤维细胞系，最优选的是Rab9(ATCC CRL1414)细胞系。用于培养ASC的组合物优选不添加细胞因子和/或LIF的。
本发明还涉及利用组合物扩增ASC或早期祖细胞，如HSC。这些HSC包括从脐带血、胎盘血、外周血和骨髓中分离出的CD34+细胞。利用这种组合物，细胞的扩增总量至少要达到25倍。利用所述组合物扩增CD34+细胞至少可以扩增3倍。利用这种组合物扩增的细胞至少要培养15天，在LTC IC检测中呈阳性反应的细胞数至少要增加15倍。
本发明还涉及扩增哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞的方法，所述方法包括分离哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞以及在无基质的条件下培养这些细胞，培养条件中包含本发明的用于培养ASC的组合物。该方法可用于培养造血干细胞和造血祖细胞。该方法在ASC扩增到至少25倍以前、有核细胞扩增到至少10倍以前或者CD34+细胞扩增到至少3倍以前都可以使用。该方法可以一直使用到使扩增的细胞在LTC IC检测中呈阳性反应的数目增加到至少15倍以前。该方法可用于获得扩增的HSC细胞，这些扩增的细胞可在经亚致死剂量照射的NOD/SCID(非肥胖型/重症联合免疫缺陷)小鼠体内形成集落。
本发明还涉及利用经稳定细胞系条件培养基扩增骨髓、胎儿血、脐带血和外周血来源的造血干细胞。组合物包含基础细胞培养基，例如而不限于含高糖DMEM的培养基、非必须氨基酸、谷胺酰胺、reducing agen和胎牛血清或其类似物的组合物。所述组合物预先经过稳定的细胞系来调节，例如而不限于兔细胞系Rab9(ATCC CRL-1414)或类似细胞系，这些细胞系能够分泌造血干细胞生长和自我更新所必须的因子。
本发明参考下面的附图来描述。
附图简述
图1显示的是兔LIF(Rab-LIF)cDNA的核苷酸序列[SEQ.ID.：NO1]及其肽序列[SEQ.ID.：NO2]。
图2显示的是能在毕赤酵母中达到最佳表达的兔LIF cDNA的核苷酸序列[SEQ.ID.：NO3]和氨基酸序列[SEQ.ID.：NO4]。
图3显示的是粘附的C57BL6/N小鼠胚泡的原代细胞(0代)，培养的条件分别为A)添加LIF(1000IU/ml)的浓缩基础培养基；B)添加Rab-LIF(10-20ng/ml)的浓缩基础培养基；C)经Rab9成纤维细胞系调节的基础培养基；D)经Rab9#19成纤维细胞系调节的基础培养基；E)浓缩的基础培养基。
图4显示的是在下列培养基中培养1代的ES细胞克隆的形态：A)添加LIF(1000IU/ml)的浓缩基础培养基；B)添加Rab-LIF的浓缩基础培养基；C)经Rab9成纤维细胞系调节的基础培养基；D)经Rab9#19成纤维细胞系调节的基础培养基；E)浓缩的基础培养基。
图5显示的是HUC来源的CD34+细胞在不同培养基中所扩增出的有核细胞的生长曲线(用原始细胞群的溶胀因子表示)。图例：实线加正方形：经Rab9#19细胞条件培养基；实线加三角：经Rab9细胞条件培养基；实线加圆形：基础ES培养基；虚线加圆形：加细胞因子的基础ES培养基。
图6：HUC来源的CD34+细胞培养物在不同培养基中扩增出的CD34+细胞(用原始CD34+细胞的溶胀因子表示)。图例：实线加正方形：经Rab9#19细胞条件培养基；实线加三角：经Rab9细胞条件培养基。
图7：HUC来源的CD34+细胞培养物在不同培养基中扩增出的LTC-IC阳性细胞(用原始LTC-IC阳性细胞的溶胀因子表示)。图例：实线加正方形：经Rab9#19细胞条件培养基；实线加三角：经Rab9细胞条件培养基。
定义
本发明的 胚胎干细胞(缩写为ES)是指从胚泡阶段胚胎的内细胞团中分离出的细胞或植入后胚胎的原始生殖细胞来源的细胞(原始生殖细胞或胚芽生殖细胞)。ES细胞可在特殊的培养条件下培养许多代而不丢失其多能性。
本发明的 多能是指干细胞能分化成不同类型的细胞和组织，其中包括能支持胚胎发育但其本身不能生成生殖细胞系(精细胞和卵细胞)的细胞和组织。
本发明的 种系形成能力、全能性是指干细胞可以分化成各种类型的细胞和组织，其中包括生殖细胞(精细胞和流卵细胞)。
白血病抑制因子(LIF)是指一种哺乳动物蛋白，最先由Gearing等，(1987)EMBO J.6，3995-4002克隆和测序，该因子可用于胚泡内细胞团来源的未分化胚胎干细胞的分离、维持或生长。LIF也指LIF的剪接变体和一个或多个氨基酸残基突变、插入或被限制性酶切去除的变体，其中LIF变体与野生型LIF的序列一致性至少要有95％，并且能用于胚泡内细胞团来源的未分化胚胎干细胞的分离、维持或生长。
本文所用的 LIF的功能片段是指N端或C端缺失的LIF蛋白，但该片段也能用于胚泡内细胞团来源的未分化胚胎干细胞的分离、维持或生长。
本发明的 “非富含细胞因子和/或LIF”用于ASC是指维持或生长细胞的组合物不含额外的细胞因子或LIF。添加或富含意味着向组合物中补充蛋白形式的细胞因子或LIF。也可指通过短暂或稳定转染用于预先调节培养基的细胞来添加这些化合物。
本文所用的 “成年干细胞”是指从哺乳动物体内分离出来的多能成年干细胞，如啮齿类动物(如小鼠和大鼠)和灵长类动物，尤其是人。成年干细胞可以来源于非胚胎器官或组织，但是具有被诱导分化成中胚层、外胚层和内胚层起源的三种不同类型分化细胞中一种类型细胞的能力。能分离出成年干细胞的器官或组织的例子包括而不限于骨髓、脐带血或胎盘。不同类型的成年干细胞可以分化出不同类型的细胞，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元或少突胶质细胞。
本发明的 “早期成年祖细胞”是指丢失了其来源干细胞的一个或几个标记的细胞，但是还能够分化成许多细胞系，虽然比其来源干细胞所能分化成的细胞系数目少。
“造血干细胞”(缩写为HSC)是指从外周血、脐带血或骨髓中分离出的能自我更新并且能分化成各种专业细胞的细胞。HSC可以增殖分化成红系、中性粒-巨噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴造血系的细胞团。HSC表达CD34、c-kit和thy1，不表达CD38。
细胞系的保藏
表达兔LIF的毕赤酵母细胞系X33(RbL)于2000年7月5日由Thromb-X(Leopoldstraat 1,3000 Leuven，Belgium)保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)，Mycothèque de I’Université Catholique de Louvain(MUCL)PlaceCroix duSud，B 1348 Louvain la Neuve，Belgium，保藏号为MUCL 42925。
表达兔LIF的兔成纤维细胞系(Rab9#19克隆)于2000年8月7日由Thromb-X(Leopoldstraat 1,3000 Leuven，Belgium)保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)，Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35,9000 Gent，Belgium，保藏号为LMBP5479CB。
                               发明详述
本发明涉及利用本文描述的组合物分离、维持或生长多能的和种系感受态哺乳动物胚胎干细胞(ES)系，例如小鼠品系来源的细胞系。
这些经改进的培养条件可用于培养各种具有不同遗传背景的鼠稳定ES细胞，这些细胞具有出色的种系传递能力。该技术也可用于其他种类的非人哺乳动物(兔、猪、牛等)，成为利用靶向性转基因技术在非鼠类动物中进行添加功能或删除功能的基础。
组合物内含有预先用稳定的细胞系调节的基础细胞培养基，这种细胞能分泌ES细胞生长和自我更新所必须的因子。纯化的重组白血病抑制因子(LIF)也可以加到这些组合物中，例如以较低的浓度。
在一个实施方式中，基础细胞培养基是含高糖的Dulbecco改进的Eagle培养基DMEM，添加了非必须氨基酸、谷氨酰胺、β-巯基乙醇和胎牛血清，稳定细胞系是兔成纤维细胞样细胞系Rab9(ATCC CRL-1414)。选择添加的LIF最好是最新发现的兔LIF(Rab-LIF)，它可以帮助体外培养的ES细胞保持未分化状态，利用优选的cDNA序列可以在毕赤酵母中表达这个因子。
细胞分泌到培养基中的LIF可通过定量的免疫分析方法如酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、放射免疫计量分析法(IRMA)、荧光免疫分析法(FIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)或电化学发光免疫分析法(ECL)利用抗LIF的抗体进行测定。在本发明中利用抗兔LIF的单克隆抗体，如鼠抗人LIF单克隆抗体9824.11，进行ELISA是优选的分析方法。这种分析方法的一个例子就是Quantikine人LIF免疫分析法(Cat No DLF00，R&D Systems Minneapolis，MN，USA)。
本发明的组合物所含有的各组分的含量可以是变化的，只要其浓度足以使ES细胞在培养基中维持一个较长时期的未分化状态就可以。本发明的组合物含有成纤维细胞样细胞系的条件培养基，其中包括而不限于磷酸盐缓冲液(PBS)、Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、Iscove改进的Dulbecco培养基、McCoy 5A培养基、Eagle极限必需培养基(MEM)、RPMI 1640、培养基199、MCDB培养基、RPMI、Glasgow极限必需培养基Eagle(GMEM)、DMEM/F-12培养基、Hams F-10营养混合物、Leibovitz’sL15培养基、CMRL培养基、BGJb培养基、Eagle基本培养基(BME)、Brimster’s BMOC-3培养基、William培养基E和McCoy培养基或稍加改变的培养基等。在组合物中还可以加入还原剂如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。
在含有细胞条件培养基的组合物中，如果细胞未转染编码LIF的DNA则培养基中可以加入成年血清、新生儿血清或胎儿血清。但是如果细胞被编码LIF的DNA转染，则所加的血清成年血清或新生儿血清，或者除胎牛血清外的胎儿血清如胎马血清、胎山羊或胎绵羊血清。
本发明的优选组合物的组成如下：每升成纤维细胞样细胞系条件培养基中加入50-120ml胎牛血清、10-25ml非必须氨基酸、2-8μl β-巯基乙醇、0.5-2.5ml胰岛素以及80-130ml基础ES细胞培养基，其中优选的是分别加入8ml胎牛血清、17ml非必须氨基酸、5μl β-巯基乙醇、1.25ml胰岛素。
基础ES细胞培养基含有400-600ml、优选500ml高糖DMEM，0-15ml、优选13ml青霉素/链霉素，10-15ml、优选13ml非必须氨基酸，10-15ml、优选13ml谷氨酰胺，5-10μl、优选6.3μl β-巯基乙醇，50-100ml，优选70ml胎牛血清，优选7.4的中性pH值。
本发明还涉及分离和培养哺乳动物ES细胞以获得多能和种系感受态ES细胞的方法，其中哺乳动物ES细胞的培养至少部分是用本发明及上面所描述的组合物。这种方法包括如下步骤：a)培养胚泡阶段胚胎细胞；b)培养分离出的内细胞团；以及c)在本发明的组合物中定期传代内细胞团的细胞。内细胞团的细胞优选定期传代至少8次。该方法还可以包括制备转基因动物的步骤。
本发明还有一个方面涉及种系感受态胚胎干细胞(ES)。细胞系优选小鼠的细胞系，但是其他动物的细胞系也适用。如果是小鼠细胞系，则细胞系可来源于下列品系小鼠的细胞或组织：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1CaOla、C3H/HeN、C57BL/6Ola、FVB/N、DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有Swiss Webster遗传背景的小鼠。小鼠细胞系优选传过11代或更多代依然具有种系传递能力的。本发明的胚胎干细胞(ES)系的特征是：经过至少10代的传代后细胞依然具有三个胚层的克隆形成能力、碱性磷酸酶染色阳性以及细胞角蛋白18和波形蛋白染色阴性。这些胚胎干细胞系可用于制备嵌合的或ES细胞来源的动物、通过同源重组或非同源重组进行基因修饰、通过种系传递制备基因经修饰的动物、通过受体胚泡内注射胚囊或二倍体、四倍体集合或核转移制备嵌合动物、或用于新型基因的研究及分离以及用于表达或过量表达目的基因。
本发明的组合物在维持不同品系小鼠来源的胚胎干细胞的表型上具有超强的能力。本发明还发现这些新型组合物的特性也适用于除胚胎干细胞外的其他干细胞。
因此，本发明涉及本文所描述的组合物在维持或生长成年干细胞和早期祖细胞中的应用，例如HUC来源的CD34+细胞。
在本发明的一个实施方式中，成年干细胞或早期成年祖细胞可在无基质的条件下在本发明的组合物中维持或生长，所谓无基质的条件是指细胞与滋养层细胞无直接或间接的接触(无接触培养)。本发明用于扩增ASC的组合物首先通过成纤维细胞的调节，较好的是用永生成纤维细胞，更好的是用永生兔成纤维细胞如Rab9细胞系(ATCC CRL-1414)。本发明的结果表面这些组合物比基础ES培养基更适合扩增和培养成年干细胞或早期祖细胞如HSC或造血前体细胞。组合物中还可以添加LIF(LIF蛋白质，或者用于调节培养基的转染细胞所产生的LIF)。但是在一个优选实施方式中，用于培养成年干细胞的组合物不含LIF。一方面，缺少LIF对ASC的增殖能力确实有影响，另一方面，已知LIF的存在会刺激细胞如HSC分化成髓系的细胞。因此不加LIF至少对维持HSC或早期造血祖细胞的未分化特性有正面的作用。
在一个更优选的实施方式中，用于培养ASC的组合物是非浓缩的，就是说没有添加额外的细胞因子或生长因子。加到培养基中用于培养HSC或造血前体细胞的细胞因子或生长因子一般包括FLT3配基、IL-6(白细胞介素)、可溶性的IL-6受体、Tpo(血小板生成素)、SCF(干细胞因子)、白细胞介素-7、白细胞介素8、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白-1α)、MCP(单核细胞趋化蛋白-1)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)。根据本发明，在扩增和培养成年干细胞或早期祖细胞如HSC或造血前体细胞时可以不用添加上述的细胞因子。
因此，在本发明的一个优选实施方式中，培养ASC如HSC所用的组合物既不含LIF，也没有添加细胞因子。
在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物用于维持成年干细胞和早期成年祖细胞的表型。作为一个实施例，本发明描述了组合物在一个较长时间内保持造血干细胞来源的HUC(人脐带血)的干细胞特性的适用性。
根据本发明，成年干细胞和/或早期祖细胞如HSC或早期造血前体细胞至少在分离并培养15天后还可以传代，较好的是在至少培养30天后，更好的是至少培养60天、90天后，甚至180天后依然可以传代。
根据本发明，成年干细胞和/或早期祖细胞如HSC或早期造血前体细胞至少可以扩增10倍，较好的是至少可以扩增25倍，更好的是至少可以扩增40倍、甚至100倍，最好的至少可以扩增1000倍。
根据本发明，CD34+成年干细胞和/或早期祖细胞如HSC或早期造血前体细胞至少可以扩增5倍，较好的是至少可以扩增10倍，更好的是至少可以扩增50倍、甚至250倍，最好的至少可以扩增1000倍。
根据本发明，成年干细胞和/或早期祖细胞如HSC或早期造血前体细胞的扩增潜能至少可以扩增5倍，较好的是至少可以扩增15倍，更好的是至少可以扩增50倍、甚至250倍，最好的至少可以扩增1000倍，所用的分析方法如LTC IC法，该方法可以评价细胞扩增为髓系祖细胞的能力。
这些扩增的ASC如HSC在至少培养15天后移植到经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内，较好的是至少培养28天，更好的是至少培养60天，最好的是至少培养90天。
按照本发明的方法培养的HSC细胞可连续变为第二代NOD/SCID小鼠。
本发明用下列的实施例进行解释和说明，这些实施例并不意味着对本发明的范围的限制。根据本发明，本名誉的技术人员可以对本发明进行修改和改进。
                               实施例
实施例1：重组兔白血病抑制因子(Rab-LIF)的制备。
上述的参考方法和ES细胞培养基可以选择地添加LIF，优选重组Rab-LIF以辅助ES细胞保持未分化状态以及获得种系传递能力。在图1中列出了Rab-LIF的核苷酸序列及其相应的肽序列。
Rab-LIF可用多种方法制备，一般利用生物学家现有的多种分子生物学工具如表达载体中的一种来制备。根据这些方法，将编码Rab-LIF蛋白的DNA分子与编码转录启动子和终止子的DNA分子人工连接在一起构建一个表达盒。然后将含有启动子、终止子盒Rab-LIF编码DNA的DNA分子导入到细胞内制备Rab-LIF蛋白。优选将编码分泌信号的一段DNA连接到Rab-LIF编码DNA上，这样所表达的活性Rab-LIF就可以从细胞内分泌出来。
启动子可以是组成的、可诱导的或组织特异性的，选择何种启动子一般要根据制备Rab-LIF所需要的细胞以及在何种条件下表达。如本文实施例1所描述，重组Rab-LIF用毕赤酵母表达，因此编码Rab-LIF的DNA分子要人工连接上酵母α因子信号肽序列和乙醇氧化酶1(AOX1)启动子。另外，编码Rab-LIF的DNA还可以连接上适当的启动子、增强子或终止子(统称为“调控序列”)以便于在原核细胞或高级的真核细胞如哺乳动物细胞和昆虫细胞内表达。
重组Rab-LIF利用Invitrogen(Carlsbad，CA)的甲基营养毕赤酵母表达系统制备。Rab-LIF基因是从兔基因组文库Lambda DASH II(Stratagene，# 945950)中分离出来的，编码成熟Rab-LIF蛋白的cDNA利用标准方法通过剪接重叠延伸多聚酶链式反应(SOE-PCR)装配。
Rab-LIF cDNA可作为模板进行连续PCR和SOE-PCR反应以便于通过密码子选择得到最适于在毕赤酵母中表达的基因。这种最佳的Rab-LIF cDNA显示在图2中。
PCR反应的引物设计得使成熟的Rab-LIF序列正好和pPICZα载体(Invitrogen)内的α因子分泌信号的阅读框精确融合。这样就可以从转化的毕赤酵母培养上清中分离重组蛋白。这个引物还在成熟Rab-LIF编码序列的前面引入了一个额外的丙氨酸密码子(上述序列的下划线部分)以便于Kex2处理α因子分泌信号。LY-RLIF-PD引物含Not I位点。产物纯化后用XhoI和Not I消化，然后克隆到载体pPICZα的相应位点上得到载体pPICZα-RLIF100。在这个载体中，Rab-LIF的表达是受乙醇氧化酶I(AOXI)强启动子控制的。
在转化毕赤酵母前，载体pPICZα-RLIF100要先用BstX I在5’AOX1非翻译区切开以使其线性化，这样可以使表达模块稳定整合到AOX1位点上。所有在酵母上的操作还可以按照厂家的说明书进行。最后选择毕赤酵母转化子X33(RbL)作为Rab-LIF酵母表达株存放于比利时微生物协调保藏中心，保藏号为MUCL42925。值得注意的是上述的表达盒是稳定整合到染色体上的。X33(RbL)株于2000年7月5日存放于BCCM中心。在毕赤酵母中能达到最佳表达的核苷酸序列也是本发明的一部分。
Rab-LIF cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列是以前所不曾报道的，显示于图1中。核苷酸序列是根据Sanger等人的标准方法确定的。
成熟Rab-LIF蛋白的核酸序列与人LIF序列(Gough等，1988，登录号为M63420和J05436)和鼠LIF序列(Gearing等，1987，登录号为M63419和J05435)进行比较，结果发现人LIF和兔LIF的核酸序列同源性达90％，鼠LIF和兔LIF的核酸序列同源性达77％。而在毕赤酵母中能达到最佳表达的cDNA与鼠LIF的同源性达到61％，与人LIF的同源性达到70％。
实施例2：经Rab9调整的ES细胞培养基的制备。
在本发明的一个实施方式中，连续4天收集经融合的Rab9成纤维细胞单层培养物调节的基础ES细胞培养基，储存起来用于ES细胞的培养。每天用25ml基础ES细胞培养基更换15cm培养皿中的液体。4天后每只15cm培养皿中的细胞按1∶4的比例传代，传代后的第一天将培养弃去。1升条件基础ES培养基(4天收集液体的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必须氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇、1.25ml胰岛素和80ml基础培养基，pH调整到7.4。基础培养基由下列组分构成：500ml高糖DMEM、70ml胎牛血清、13ml青霉素/链霉素、13ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇和13ml非必须氨基酸。浓缩的基础培养基是指额外添加4％(V∶V)胎牛血清的基础培养基。
在另外一个实施方式中，条件基础ES培养基是用标准的方法如滚瓶、细胞工厂或生物反应器大规模制备的。
实施例3：鼠胚胎干细胞(ES)的分离和培养
1.鼠品系和ES细胞
ES细胞来源于下列商品化的鼠品系：129/SvEvTaconic(Taconic，Germantown，NY，USA)；C57BL/6NTacfBr(Taconic)；BALB/cAnNTacfBr(Taconic)；DBA/2NTacfBR(Taconic)；C3H/HeNTac MTVfBe(Taconic)；FVB/NTacfBR(Taconic)；Tac：(SW)fBR，Swiss Webster(Taconic)；129/SvJ(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，USA)；C57BL/6J-HPRT<B-M3>(The Jackson Laboratory)；C57BL/6JOlaHsd(Harlan，Indianapolis，Indiana，USA)；CBA/CaOlaHsd(Harlan)；DBA/1OlaHsd(Harlan)；DBA1LacJ；CD1；BALB/c；MRL；C57BL/6×CBA。
2.鼠ES细胞的分离
ES细胞可从3.5-4.5天大的胚泡阶段的胚胎中分离。收集胚泡，然后接种到包被有被丝裂霉素阻滞的单层鼠胚胎成纤维细胞滋养层的96孔板内，每孔一个胚泡。胚泡附着在单层细胞上，每天用本发明的条件ES细胞培养基(见实施例2)、添加或不添加鼠LIF或Rab-LIF的基础ES培养基、或者用能分泌内源性Rab-LIF的Rab9#19细胞系(见下)调节的ES细胞培养基换液培养。
培养5-6天后，将长出的内细胞团(ICM)选择地从(剩余的)滋养外胚层中取下，经胰蛋白酶-EDTA消化后重新接种到包被有被丝裂霉素阻滞的鼠成纤维细胞的96孔板内。随后逐步将ES细胞接种到较大的培养皿中。利用本发明的条件ES细胞培养基ES细胞可以保持未分化状态20代以上。
成纤维细胞滋养层取自交配后怀孕12.5天的小鼠的胚胎。将小鼠处死后取其子宫，放入含磷酸盐缓冲液(PBS)的培养皿中，将胚胎从子宫中剪下来并将所有的膜去除。然后将胚胎转入含PBS的另一个培养皿中，将胚胎的头和内部器官全部去除，然后用PBS洗涤以去除血液。
然后用2个胰岛素注射器将胚胎磨碎并转入到直径为2-3mm的试管中，在胰蛋白酶-EDTA/MEM溶液(10/90 V/V)中4℃孵育2小时。悬液在于37℃孵育15分钟，然后用5ml的移液管制备单细胞悬液，每180mm的培养皿接种5×106细胞，用25ml滋养层培养基培养。
滋养层培养基含有500ml Dulbecco极限必需培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FCS)、13ml青霉素/链霉素、13ml谷胺酰胺、13ml非必须氨基酸和2.3μl β-巯基乙醇。培养基24小时更换一次以去除碎片。培养2-3天后成纤维细胞可以长成连续的细胞单层。然后用胰蛋白酶消化培养皿，将消化下的细胞接种到2个培养皿中，当细胞长满后，每个培养皿的细胞冷冻到2个小瓶中，-80℃保存过夜，第二天放入液氮中。
3.ES细胞的培养
ES细胞在用丝裂霉素阻滞而发生有丝分裂停止的鼠胚胎成纤维细胞上可以长到亚融合状态。培养皿置于39℃、含5％CO2的湿润环境中培养。ES细胞每2-3天传代一次，接种到新鲜制备的含滋养层细胞的培养皿中。ES细胞用条件ES培养基培养，每天换液。
4.比较
在本发明的一个方面，胚泡来自自然交配的C57BL/6N TacfBr鼠(Taconic)。胚泡用下列培养基培养：a)浓缩的基础培养基；b)添加鼠LIF(1000IU/ml)的浓缩基础培养基；c)添加Rab-LIF(10ng/ml)的浓缩基础培养基；d)添加Rab-LIF(20ng/ml)的浓缩基础培养基；e)经如实施例2描述的Rab9成纤维细胞调节的基础培养基；或f)经Rab9#19成纤维细胞系调节的基础培养基(见下)。
基础培养基由下列组分构成：500ml高糖DMEM、70ml胎牛血清、13ml青霉素/链霉素、13ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇和13ml非必须氨基酸。浓缩的基础培养基是指额外添加4％(V∶V)胎牛血清的基础培养基。
用Rab9成纤维细胞调节的基础培养基是按照实施例2的方法制备的。1升条件基础ES培养基(4天收集液体的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必须氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇、1.25ml胰岛素和80ml基础培养基，pH调整到7.4。这种条件培养基中Rab-LIF的水平(少于20pg/ml)利用检测人LIF的R&D系统(Minneapolis，MN，USA)通过ELISA方法是无法检测到的。
用Rab9#19成纤维细胞调节的基础培养基是按照实施例2所描述的Rab9的方法制备的。1升条件基础ES培养基(4天收集液体的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必须氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇、1.25ml胰岛素和80ml基础培养基，pH调整到7.4。Rab9#19是被兔白血病抑制因子基因稳定转染的Rab9成纤维细胞，利用检测人LIF的R&D系统(Minneapolis，MN，USA)通过ELISA方法检测发现这种细胞每天最多可以将30ng/ml的Rab-LIF分泌到培养基中。
胚泡附着在滋养层上。每天更换培养基。培养大约1周后，将长出的ICM选择地从滋养外胚层中取下，经胰蛋白酶-EDTA消化后重新接种到包被有被丝裂霉素阻滞的鼠成纤维细胞滋养层的96孔板内。随后逐步将ES细胞接种到较大的包被有滋养层测的培养皿中。经过5-10次传代后，计数每种条件下培养的已有的ES细胞数。ES细胞是否保持未分化状态通过免疫组化染色观察是否存在碱性磷酸酶(VectorLaboratories INC.，Burlingame，CA)或波形蛋白和细胞角蛋白(Dako A/S，Denmark)来判断。只有那些含有90％以上未分化细胞的ES细胞系才继续培养。
单纯用浓缩的基础培养基无法分离ES细胞。长出的ICM在第一代之前或第一代期间就快速分化了(图3E和图4E)。
表I：鼠C57BL6/N ES细胞的分离效率
培养基     种植的胚泡数   已建立的ES细胞系数
    数目     ％
浓缩的基础培养基     21     0     0％
添加鼠LIF(1000IU/ml)的浓缩基础培养基     26     6     23％
添加Rab-LIF(10ng/ml)的浓缩基础培养基     21     6     28％
添加Rab-LIF(20ng/ml)的浓缩基础培养基     22     5     23％
经Rab9成纤维细胞调节的基础培养基     35     17     48％
经Rab9#19成纤维细胞系调节的基础培养基     18     9     50％
当鼠LIF或RabLIF加到浓缩基础培养基中时，培养3代后ES细胞的分离效率大约可以提高到25％。利用鼠或兔的LIF分离ES细胞其效率是相似的。当无内源性LIF或额外添加LIF时，利用Rab9条件培养基可以使ES细胞的分离效率提高到大约50％。当基础培养基用分泌内源性Rab-LIF的Rab9#19细胞系进行调节时可以得到相似的ES分离效率。
当胚泡在经Rab9或Rab9#19成纤维细胞系(图3C和D)调节的基础培养基中培养时，内细胞团的生长速度加快。在添加鼠LIF或Rab-LIF的浓缩基础培养基中，可见内细胞团的部分分化或throphectodermal细胞的过度生长(cfr图3A和B)。
经过一代以后，不同培养基中的ES细胞克隆就出现了形态学上的变化。添加鼠LIF或Rab-LIF的浓缩基础培养基(图4A和B)中出现相当扁平的ES克隆，而在经Rab9或Rab9#19成纤维细胞调节的基础培养基中(图4C和D)出现了三胚层的ES细胞克隆。如果用基础培养基，则经过1代后所有的细胞都出现了分化(图4A)。
上述结果是经过3周培养后得到的初步结果。在几个例子中ES细胞培养了3周到2个月。累计频数总结在表II中。
表II：经2个月的培养后鼠C57BL6/N ES细胞分离的最终效率
培养基   种植的胚泡数   已建立的ES细胞系数
  数目   ％
浓缩的基础培养基   21   0   0％
添加鼠LIF(1000IU/ml)的浓缩基础培养基   26   9   34％
添加Rab-LIF(10ng/ml)的浓缩基础培养基   21   8   38％
添加Rab-LIF(20ng/ml)的浓缩基础培养基   22   8   36％
经Rab9成纤维细胞调节的基础培养基   35   18   51％
经Rab9#19成纤维细胞系调节的基础培养基   18   11   61％
在表II中，只有那些至少在10代内能保持未分化状态的ES细胞才被认为是已经建立的ES细胞系。
当鼠LIF、10ng/mlRabLIF或20ng/mlRabLIF加到浓缩基础培养基中时，ES细胞的分离效率分别为34％、38％和36％。利用鼠或兔的LIF分离ES细胞其效率是相似的。当无内源性LIF或额外添加LIF时，利用Rab9条件培养基可以使ES细胞的分离效率提高到51％。当基础培养基用分泌内源性Rab-LIF的Rab9#19细胞系进行调节时ES的分离效率可以达到61％。这些差异(51％对61％)没有统计学意义(x2分析，P＝NS)。
5.其他实施方式
在本发明的第二个例子中，胚泡分别来自于自然交配的FVB/NtacfBR(Taconic，Germantown，NY，USA)小鼠和BALB/cAnNTacfBr(Taconic)小鼠。胚泡用实施例II所描述的Rab9成纤维细胞调节的基础培养基培养。
基础培养基的组成如下：500ml高糖DMEM、70ml胎牛血清、13ml青霉素/链霉素、13ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇和13ml非必须氨基酸。浓缩的基础培养基是指额外添加4％(V∶V)胎牛血清的基础培养基。
用Rab9成纤维细胞调节的基础培养基是按照实施例II的方法制备的。1升条件基础ES培养基(4天收集液体的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必须氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巯基乙醇、1.25ml胰岛素和80ml基础培养基，pH调整到7.4。这种条件培养基中Rab-LIF的水平(少于20pg/ml)利用检测人LIF的R&D系统(Minneapolis，MN，USA)通过ELISA方法是无法检测到的。
表III：从FVB/N和Balb/C小鼠中分离ES细胞的效率
    鼠品系     种植的胚泡数     已建立的ES细胞系数
    数目     ％
    FVB/N     20     8     40
    BALB/c     34     15     44
胚泡附着在滋养层上。每天更换培养基。培养大约1周后，将长出的ICM从滋养外胚层中取下，经胰蛋白酶-EDTA消化后重新接种到包被有被丝裂霉素C阻滞的鼠成纤维细胞滋养层的96孔板内。随后逐步将ES细胞接种到较大的包被有滋养层的培养皿中。培养2后，计数个月后，计数每个品系小鼠来源的已建立的ES细胞数。ES细胞是否具有未分化特征通过免疫化学染色观察是否存在碱性磷酸酶(VectorLaboratories INC.，Burlingame，CA)或波形蛋白和细胞角蛋白(Dako A/S，Denmark)来判断。只有那些在至少10代的培养期间保持未分化状态(含有90％以上未分化细胞)的ES细胞系才被认为是已经建立的ES细胞系。
经Rab9成纤维细胞调节的基础培养基可用于从FVB/N和BALB/c品系小鼠中分离胚胎干细胞。经过2个月的培养后，从FVB/N品系小鼠中建立了8个ES细胞系，从BALB/c品系小鼠中建立了15个ES细胞系。其总的分离效率分别为40％和44％。
实施例4：制备嵌合的和ES细胞来源的动物
ES细胞克隆形成宿主胚胎的种系的能力可通过下列方法检测：将这些ES细胞注射到宿主胚泡内、将ES细胞与桑葚胚期的二倍体胚胎或4细胞的四倍体胚胎聚集，然后按照标准方法将这些嵌合的试验胚胎植入到假孕的受体子宫内。通过饲养所得到的嵌合子代可以检测ES细胞基因组的种系传递能力。
1.ES细胞的胚泡注射
C57BL/6、FVB/N和BALB/c小鼠来源的ES细胞系克隆形成宿主胚胎的种系的能力通过下述过程检验：将这些培养了10代或至少10代的ES细胞注射到宿主胚泡中，然后按照标准方法将这些嵌合胚胎植入假孕的母鼠子宫内。为了易于评价嵌合百分率(即ES细胞基因组在嵌合子代中所占的比例)，将具有彩色包被的ES细胞系(来自C57BL/6N)注射到Swiss Webster的胚泡中，而将具有白色绒毛的ES细胞系(来自BALB/c和FVB/N)与黑色的C57BL/6N胚泡嵌合。然后使高百分率的嵌合体与SwissWebster或C57BL/6N小鼠交配以检测ES细胞基因组的种系传递能力，如果合适的话，可以在F1子代中分离出具有彩色包被的ES细胞系。
胚泡注射所用的是3.5天的胚泡，从超排卵母鼠的子宫内收集胚泡，用M2培养基(Eurogentec，Seraing，Belgium)冲洗后用于注射。超排卵是通过给母鼠先注射7.5I.U.的孕马血清绒毛膜促性腺激素(PMSG，Sigma，St.Louis，MO)，48小时后再注射7.5I.U.人绒毛膜促性腺激素(Pregnyl Organon，Oss，The Netherlands)诱导的。将收集的胚泡用M16培养基(Eurogentec)洗涤，然后再用M16培养基在39℃、5％CO2的空气中培养。
在微注射前两天将ES细胞接种到涂凝胶的空白培养皿上。在注射当天，用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA39℃消化培养皿约2分钟。加入新鲜的条件细胞培养基，用移液管吹打以获得单细胞悬液。离心(1100rpm/min，离心5min)后，将ES细胞重悬到新鲜的条件细胞培养基中，放到39℃的孵箱中孵育。
胚泡注射的过程如下：将15-20个彩色鼠(C57BL/6)ES细胞注射到albino SwissWebster小鼠的胚泡中，或者将15-20个白色小鼠(FVB/N，BALB/c)的ES细胞注射到黑色C57BL/6N小鼠的胚泡内。注射后将胚泡移植到与输精管切除雄鼠交配后假孕2.5天的Swiss Webster母鼠子宫内(每个子宫角7-8个胚泡)。
将11个不同C57BL/6N鼠的ES细胞系注射到Swiss Webster鼠胚泡中，每个C57BL/6N ES细胞系都能产生嵌合小鼠。将高百分率的嵌合体与Swiss Webster鼠交配后检测其种系传递能力发现所有的C57BL/6N ES细胞系都具有种系传递能力。共有9株FVB/N ES细胞系和7株BALB/c ES细胞系注射到C57BL/6N胚泡中。对于FVB/N小鼠来源的和BALB/c来源的每个ES细胞系来说，在将胚泡移植到C57BL/6N小鼠体内后都能生出嵌合小鼠。其中7株FVB/N ES细胞系和5株BALB/c ES细胞系具有种系传递能力。种系传递能力还用了其他的方法检测。
表IV：将C57BL/6N ES细胞注射到Swiss Webster胚泡内制备嵌合小鼠，ES细胞是用Rab9成纤维细胞调节的基础培养基分离和培养的。
  ES细胞系编号   传代数目   注射胚泡的数目   产生子代小鼠的数目   嵌合体数目     种系
  C57BL/6N#3   11   48   10   5
  C57BL/6N#39   10   37   11   6
  C57BL/6N#29   17   36   4   4
  C57BL/6N#6   15   24   2   1
  C57BL/6N#29   22   26   5   5
  C57BL/6N#6   19   34   8   8     F1/1
  C57BL/6N#8   16   44   10   7
  C57BL/6N#24   14   14   1   1
  C57BL/6N#10   17   38   12   6
  C57BL/6N#23   21   42   22   16     F1/2
  C57BL/6N#3   15   32   9   5
  C57BL/6N#11   17   61   14   9
  C57BL/6N#9   10   29   8   3     F1/1
  C57BL/6N#3   14   30   7   5     M1/1
  C57BL/6N#10   19   31   8   4     F1/3 M1/1
  C57BL/6N#19   12   31   4   2     M2/2
  C57BL/6N#10   18   45   16   12     F1/6 M1/3
  C57BL/6N#24   17   36   5   4     M1/2
  C57BL/6N#11   18   45   11   6
  C57BL/6N#3   18   53   8   4     M1/1
  C57BL/6N#9   11   43   9   1
  C57BL/6N#11   18   69   11   11     F1/1
  C57BL/6N#11   19   31   8   1
  C57BL/6N#29   25   32   14   4     M2/2 F1/1
  C57BL/6N#3   19   54   10   3
  C57BL/6N#9   15   27   3   2
  C57BL/6N#29   28   43   17   7     M2/2
  C57BL/6N#3   23   41   15   2     M1/1
  C57BL/6N#11   22   13   6   1
  C57BL/6N#9   18   42   12   1
  C57BL/6N#29   30   49   11   1     F0/1
  C57BL/6N#39   9   103   24   14     M1/1
  C57BL/6N#24   15   31   9   6     M1/1 F2/2
  C57BL/6N#39   12   14   7   3
  C57BL/6N#19   13   56   20   7     M2/2 F1/1
  C57BL/6N#24   14   13   5   5     M1/2
M：通过雄性嵌合体进行种系传递
F：通过雌性嵌合体进行种系传递
表Va：将FVB/N ES细胞注射到C57BL/6胚泡内制备嵌合小鼠，ES细胞是用Rab9成纤维细胞调节的基础培养基分离和培养的。
  ES细胞系编号   传代数目   注射胚泡的数目   产生子代小鼠的数目   嵌合体数目     种系
  FVB/N#7   10   16   7   4     M2/2
FVB/N#28 11 13 8 7(母鼠死亡)
  FVB/N#11   11   30   6    6     M3/3
  FVB/N#2   13   30   6    2     M1/1
  FVB/N#23   14   34   7    4     M2/3
  FVB/N#23   14   45   8    7     M2/2
  FVB/N#3   16   18   3    0
  FVB/N#18   18   16   5    3
  FVB/N#35   15   70   3    3     M1/1
  FVB/N#22   17   58   11    6     M3/4
  FVB/N#7   14   47   21    14     M4/4
  FVB/N#18   24   18   6    1(死亡)
M：通过雄性嵌合体进行种系传递
F：通过雌性嵌合体进行种系传递
表Vb：将BALB/c ES细胞注射到C57BL/6N胚泡内制备嵌合小鼠，ES细胞是用Rab9成纤维细胞调节的基础培养基分离和培养的。
  ES细胞系编号     传代数目   注射胚泡的数目   产生子代小鼠的数目   嵌合体数目     种系
  BALB/c#12     10   30   3   1
  BALB/c#9     11   53   8   5     M2/2
  BALB/c#9     15   61   6   3
  BALB/c#11     16   49   10   8     M1/1
  BALB/c#4     16     36     3     2
  BALB/c#12     18     64     10     9     M0/2 F1/1
  BALB/c#4     20     14     12     7     M1/1
  BALB/c#4     14     30     8     8     M1/1
  BALB/c#11     22     15     6     5     M2/2
  BALB/c#18     12     24     8     3     M1/1
  BALB/c#11     27     36     3     3
  BALB/c#3     17     29     8     8
  BALB/c#4     22     42     13     13     M4/4
  BALB/c#18     18     16     3     1
  BALB/c#18     20     29     8     1
  BALB/c#25     28     14     4     4
  BALB/c#3     24     17     3     1
M：通过雄性嵌合体进行种系传递
F：通过雌性嵌合体进行种系传递
2.ES细胞的二倍体凝集
二倍体凝集方法的操作过程如下：Swiss Webster(白色变种)母鼠先注射孕马血清绒毛膜促性腺激素，44-48小时后再注射5U的人绒毛膜促性腺激素使之超排卵。超排卵的Swiss Webster小鼠在交配后2.5天冲洗其输卵管以收集8细胞晚期阶段的二倍体胚胎。所检测的所有ES细胞系来源的小鼠品系都是有颜色的，这样便于鉴定嵌合子代。
利用Tyrode缓冲液处理这些8细胞阶段的二倍体胚胎以去除其透明带。无透明带的胚胎洗涤后放入M16培养基中。然后使其与一团ES细胞凝集，凝集物在M16的微滴中培养到胚泡阶段，然后将其植入假孕2.5天的Swiss Webster母鼠的子宫角内。
如果生出的子代鼠是黑色的(非白色)，则说明其是ES细胞来源的嵌合体。通过肉眼观察，比较黑色鼠(来源于ES细胞)和白色鼠(来源于白色Swiss Webster胚胎)所占的比例就可以得出嵌合的百分率(来源于ES细胞的子代鼠所占比例)。
3.ES细胞的四倍体克隆
完全由ES细胞来源的胚胎可以通过ES细胞与四倍体宿主胚胎的凝集来实现。2细胞胚胎与ES细胞进行电融合然后再凝集为4细胞四倍体胚胎从而形成嵌合胚胎，然后再将其植入到假孕的受体内。ES细胞无一例外的(几乎所有的)发育成胚胎本身，而四倍体细胞则发育成胚胎的包膜。
为了便于区别ES和四倍体细胞，用于凝集的宿主胚胎来自ROSA26品系，该品系小鼠能够全身表达LacZ，并且持续表达于整个发育阶段直到成年。用人绒毛膜促性腺激素处理ROSA26小鼠使其超排卵，交配后36小时冲洗输卵管以收集晚期2细胞胚胎。
实施例6：体外扩增脐带血来源的造血干细胞
1.脐带血(UCB)的收集
签署知情同意书后，利用UCB库的标准方法收集Gasthuisberg医院(Leuven，Belgium)足月产妇的UCB。收集过程如下：将含35ml枸橼酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤(CPD-A)抗凝剂(Baxter Health Care，Deerfield，IL)的450ml标准采血袋的16号针头插入到产妇胎盘的脐静脉内，通过压力使UCB流到采血袋内。不论何种情况，采集的UCB都必须在采集后24小时内处理。每袋血都取几个血样分别进行常规的血液学分析(Cell-Dyn 3500 System，Abbott)和造血祖细胞的免疫表型分析。
2.单核细胞(MNC)的分离和CD34+的纯化
单核细胞的分离方法如下：将UCB的棕黄层按体积百分比稀释到磷酸盐缓冲液(PBS)(Gibco-BRL，Grand Island，NY))中，加入10ml LymphoprepTM(Nycomed，Oslo，Norway)后可以分层得到30ml部分。将这些样品2000rpm离心20分钟。收集已经去除了红细胞的富含白细胞的中间层细胞，洗涤后利用MACS CD34 Progenitor CellIsolation Kit(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)按照厂家的说明书通过免疫磁珠富集CD34+细胞。简言之，MNC洗涤后重悬到添加0.5％BSA(Fraction V，Sigma)和2mMEDTA的无Ca2+和Mg2+离子的Dulbecco’s PBS中，然后在封闭试剂存在的条件下使细胞与连接有抗CD34抗体的MACS微珠共孵育。标记的细胞通过30mm尼龙筛过滤，然后利用置于强磁场中的高梯度磁性分离柱进行分离。磁性滞留细胞洗脱下来，然后通过流式细胞仪检测其纯度应大于95％。
3.基质滋养层
鼠胎肝细胞系AFT024(由Theunissen博士惠赠)用添加20％FBS(HyClone，Logan，UT)、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和150Mm 2-巯基乙醇(2-ME，SigmaDiagnostics，St Louis，MO)的Dulbecco modified Eagle medium(DMEM，Gibco-BRL，GrandIsland，NY)在33℃培养。将细胞分别传代到150cm2的培养瓶和包被有0.1％凝胶(Speciality Media，Lavalette，NJ)的6孔或96孔培养板(Falcon，BectonDickinson Labware，NJ)中培养；待长满后置于37℃、5％CO2培养箱中使其停止生长。
4.造血干细胞的培养
简言之，将105富集的UCB CD34+细胞接种到6孔板内培养30天，其培养条件如下：
1)在无基质细胞的空白孔内，添加经兔成纤维细胞样细胞系Rab9(ATCC CRL-1414)条件培养基
2)在无基质细胞的空白孔内，添加经兔成纤维细胞样细胞系Rab9#19(Rab9#19是被兔LIF基因组基因稳定转染的兔成纤维细胞系Rab9)条件培养基
3)在无基质细胞空白孔内，添加经兔成纤维细胞样细胞系Rab9#19(LMBP 5479CB)条件培养基
4)在无基质细胞空白孔内，添加含胰岛素的浓缩基础培养基。
5)在无基质细胞空白孔内，添加含胰岛素、20ng/ml人Fl3配基(rhFlt3/Flk2)、20ng/ml重组人IL-6(rhIL-6)、200ng/ml重组人IL-6可溶性受体(rhIL-6 sR)和20ng/ml人血小板生成素(Tpo)的浓缩基础培养基。
细胞因子(人Flt3配基(rhFlt3/Flk2)，人重组IL-6(rhIL-6)，重组人IL-6可溶性受体(rhIL-6 sR)，重组人血小板生成素(Tpo)购自R&D Systems，Minneapolis，MN。
细胞每周更换两次合适的新鲜培养基。每5天采集一些细胞样品进行计数、表型分析和体外分析(LTC-IC)直到第50天。利用胎盘兰排出法确定扩增培养物中总的活细胞数。开始时是将105富集的UCB CD34+细胞接种到6孔板内培养30天。
细胞扩增的结果见表VI和图5。在无基质细胞的空白孔中用Rab9条件培养基培养的细胞经30天的培养后细胞总数可以增加25倍。在无基质细胞的空白孔中用Rab9#19条件培养基培养的细胞扩增指数可达43。
在无基质细胞的空白孔中用含胰岛素而含有或不含有细胞因子混合物的浓缩基础培养基培养的细胞在15天后都发生了分化，全部丢失了其造血于细胞的表型。
表VI：在不同培养基中培养的有核细胞的扩增指数(脐带血样品#40)
  培养基                                培养天数
    5     10     15     20     25     30
  Rab9#19培养基-cyt     0.8     1.38     5.4     17.65     15     43
  Rab9培养基-cyt     1.8     6.1     8.54     17.59     18.99     25.45
  基础培养基-cyt     0.2     0.14     0.48     2.35     0.35     -
  基础培养基+cyt     0.2     1.8     6.75     2.43     1.63     -
表VI和图5说明HSC和HSP在无细胞因子的Rab9或Rab9#19条件培养基中生长得要比在分离和培养ES细胞的基础培养基中好的多。LIF的存在有利于细胞的扩增(Rab9与Rab9#19比较)。
5.荧光激活的细胞分选分离法(FACS)
如上面所描述的首先分离出CD34+细胞，然后分别用FITC标记的CD34抗体(克隆581，Pharmingen，San Jose，CA)和PE标记的CD38抗体(克隆HIT2，Pharmingen，San Jose，CA)在室温下标记15-20分钟。用PBS洗涤细胞两次，然后在配备488nm氩激光发射器的FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。用FITC和PE标记的同种异型对照来设定分析基线。在培养期间每5天取一些样品计数CD34+细胞和CD34+CD38-细胞的数量。
表VII和图6表明经过30天的培养后，在无基质细胞空白孔内用Rab9条件培养基培养的细胞其CD34+细胞的数量大约增加3倍。在无基质细胞空白孔内用Rab9#19条件培养基培养的细胞也能达到相似的效果。
无论是否存在细胞因子混合物，在无基质的空白孔内用添加胰岛素的浓缩基础培养基培养细胞时都很难计数CD34+细胞和CD34+CD38-细胞，因为这些细胞在这种培养基中的扩增能力很弱，无法达到流式细胞分析所要求的细胞数。
表VII：30天的培养期内CD34+细胞的数量(×105细胞)(脐带血样品#40)，bd：检测下限以下，无足够的细胞用于分析。
  培养基5                               培养天数010
  15   20   25   30   Rab9#19培养基   1.98   -   0.61
  0.64   11.18   6.47   6.47   Rab9培养基   1.98   2.42   1.94
  1.24   7.94   6.69   6.84   基础ES培养基+胰岛素   bd   bd   bd
  bdbd   bdbd   bdbd   Bdbd   基础ES培养基+胰岛素+额外的细胞因子   bd   bd   bd
6.LTC-IC测定
原始细胞所占比率的最常用分析方法是长期培养起始细胞分析(LTC-IC)。通过LTC-IC试验原始的造血干细胞可在基质上形成焦点区或“卵圆形区”。通过有限稀释试验可以定量检测这些区域内的原始祖细胞数，这些原始祖细胞在造血支持基质上培养5周后大部分会变成髓系细胞。经过LTC-IC测定发现有部分CD34+细胞表达异源CD38分子。这种分析方法不能检测祖细胞的自我更新能力、多系分化潜能及移植潜能(de Wynter E.，Ploemacher R.E.(2001)in J.Biol.Regul.Homeost.Agents，15：23-7)。
从扩增培养物中分离出CD34+细胞接种到AFT024包被的96孔板中，11复孔中设6个稀释度。培养基为Iscoves modified Dulbecco medium(IMDM)添加12.5％FBS、12.5％马血清(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)、1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素、2ml L-谷氨酰胺(Gibco-BRL)和10-6ml氢化可的松。培养物培养5周，每周更换一半培养基。然后全部弃去培养基，换成甲基纤维素克隆培养基(MethoCultTM GF H4434，Stem Cell technologies)，该培养基含有1.12％甲基纤维素、IMDM、30％FBS、3U/ml促红细胞生成素、50ng/ml重组人干细胞因子、10ng/mlrh GM-CSF、10ng/ml rh IL-3、10-4 M 2-巯基乙醇。
在这种甲基纤维素培养基中培养2周后，观察每个孔中是否长出了造血克隆，分别以阳性和阴性进行计分。然后用Poisson统计学分析方法计算LTC-IC的频率。
培养15天后，在无基质细胞空白孔内用不加细胞因子的Rab9条件培养基培养的细胞LTC-IC的数量增加18倍。而在无基质细胞空白孔内用不加细胞因子的Rab9#19条件培养基培养的细胞只有3.8。条件培养基中不含LIF有利于LTC-IC的长期扩增。
无论是否存在细胞因子混合物，在无基质的空白孔内用添加胰岛素的浓缩基础培养基培养细胞时都很难进行LTC-IC计数分析，因为在这些条件下很难获得足够的细胞。
表VIII：LTC-IC扩增指数(脐带血样品#23)，*：由于生长数量少无法获得足够的细胞数。
 培养基              培养天数
    5     10     15
 Rab9#19培养基     0.95     0.81     3.85
 Rab9培养基     2.2     12     18.4
 基础ES培养基+胰岛素     *     *     *
 基础ES培养基+胰岛素+cyt     *     *     *
表VIII和图7的结果清楚地表明了LIF对扩增细胞分化能力的影响。Rab9培养基由于缺少LIF所以能够使细胞保持分化为髓系细胞的能力。结果还表明这种具有分离和培养ES细胞超级能力的新型Rab9培养基在促进造血干细胞和干细胞前体细胞的生长以及维持其未分化状态中也具有优越的表现。
实施例8：HSC的体内集落形成能力分析
HSC具有自我更新的能力、多系分化能力及在骨髓被毁宿主内形成集落的能力。某些分析方法如长期培养起始细胞分析(LTC-IC)可以检测细胞经长期培养后形成髓系祖细胞的能力。但是，这些方法无法测定祖细胞的自我更新能力、多系形成能力及移植潜能。要评价人HSC的移植能力还需要移植模型。现在已开发出几种异种移植模型，其中包括人化的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病(NOD)-SCID小鼠、Beige-Nude-Xid(BNX)小鼠和免疫前胎羊，如Lewis等，(2001)Blood 97，3441-3449所描述的
NOD-SCID受体。NOD-SCID小鼠饲养在特殊的无病原的环境中，饮用的是酸化的水，吃的是经高压灭菌的食物。每周喂两次每100ml含60mg甲氧苄啶和300mg磺胺甲基异恶唑(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)的水。当小鼠长到6-8周时，用Mark1铯辐射器以57cGy/min的强度照射300-325cGy。照射后24小时通过尾静脉将UCB细胞注射到小鼠体内。细胞的剂量为：25-150×1030天的(即未培养的)CD341细胞或者同样数量的7、14或28天的子代细胞。移植6周后将小鼠脱颈处死。用IMDM 20％FCS冲洗股骨和胫骨收集骨髓，然后利用这些从移植动物体内得到的细胞进行二次移植试验或分析其表型。如果鼠骨髓中的CD451细胞含量超过2％，则将两个股骨和2个胫骨的细胞移植到单个的次级鼠受体中。对供体细胞移植物的评价是通过检测异硫氰酸荧光素(FITC)或peridinin叶绿素(PerCP)标记的人特异性全白细胞抗原CD45(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)来实现的。通过用抗人CD45 PerCP(Becton Dickinson)、抗鼠CD45 FITC(Pharmingen，San Diego，CA)和抗人CD3藻红蛋白(PE)、CD14 PE、CD19 PE、CD33PE或CD34 PE(都来自BectonDickinson)将细胞染色来分析细胞的三色表型。应用合适的同种异型对照。移植的人细胞在鼠体内的克隆形成频率定义为SRC，通过有限稀释法计算。小鼠体内输注的细胞数和移植物数量逐渐增加，经检测人CD451细胞数超过0.5％。SRC频率用Poisson统计学方法计算。
胎羊受体
培养的细胞悬浮于Rab9细胞条件培养基中。50(X组)到100(I组)3 103未培养的CD341细胞或相同数目的培养7天(XI和II组)或14天(XII和III组)的子代细胞注射到预免疫(怀孕57-62天)的胎绵羊受体的羊膜泡内。在某些试验中，抑制后60天处死动物，分析骨髓中的人源细胞。BM也可以作为CD451细胞的来源进行二次移植。
另外，也可以使动物产仔，移植后6个月分析骨髓。对于二次移植来说，人CD451细胞是从移植后60天的I、II和III组的初级受体骨髓中分离出来的。每组中取两只动物分离CD451细胞，分析1其中CD341细胞的含量，然后注射到3只二级胚胎受体内(I组、IV组、II组、V组、III组、VI组)。在移植后60天处死动物，分析骨髓细胞中是否存在人源细胞。这些次级受体的骨髓作为CD451细胞的来源移植到三级受体体内。移植后60天处死动物，分析骨髓细胞中是否存在人源细胞。为了评价受体细胞移植的效果，从浙西移植了人源细胞的胎羊或新生羊中分离骨髓单核细胞通过流式细胞术分析其中是否存在人源细胞。主要步骤如下：利用低渗溶液溶解骨髓中掺杂的红细胞，从而分离出单核细胞。人CD3、CD20、CD33、CD34、CD45和血型糖蛋白A特异性的抗体(Becton Dickinson)连接上FITC或PE。每一样品中标记5-3 105细胞，与适当的非结合的同种异型对照相比较检测每种抗原的表达情况。可以检测到0.2％或更高的表达水平。另外，骨髓单核细胞用添加促红细胞生成素(2IU/ml)、IL-3(5ng/mL)和GM-CSF(5ng/mL)的甲基纤维素(0.4-2 3 105细胞/ml)培养，检测其中形成的人CFU-GM和CFU-Mix。
这些体内分析试验是为了证明HSC在本发明的组合物中培养后依然具有长期植入能力。
                                  序列表
<110>斯路姆-X股份有限公司(Thromb-X)
     L.斯库恩简斯(Schoonjans，Luc)
<120>用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(ES)细胞系的组合物
<130>T 2267 PCT
<150>PCT/BE01/00221
<151>2001-12-21
<150>UK 0220145.7
<151>2002-08-30
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>609
<212>DNA
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(609)
<223>兔白血病抑制因子
<400>1
atg aag atc ttg gcg gca gga gtc gtg ccc ctg ctg ctg gtc ttg cac       48
Met Lys Ile Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His
1               5                   10                  15
tgg aaa ccc ggg gcg ggg agc ccc ctt ccc atc aac ccc gtc aac gcc       96
Trp Lys Pro Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Asn Pro Val Asn Ala
            20                  25                  30
acc tgc aac aca cac cac cca tgc ccc agc aac ctc atg agc cag atc      144
Thr Cys Asn Thr His His Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile
        35                  40                  45
agg agc cag ctg gca cag ctc aat ggc act gcc aac gcc ctc ttt att      192
Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile
    50                  55                  60
ctc tat tac aca gcc caa ggg gag ccg ttc ccc aac aac ctg gac aag      240
Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
ctg tgc ggc ccc aat gtg acg gac ttc ccg ccc ttc cac gcc aac ggc      288
Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly
                85                  90                  95
acg gag aag gtc agg ctg gtg gag ctg tac cgc atc gtc gcc tac ctt      336
Thr Glu Lys Val Arg Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
ggc acc gcc ctg ggc aac atc acc cgg gac cag aag acc ctc aac ccc      384
Gly Thr Ala Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro
        115                 120                 125
acg gcg cac agc ctg cac agc aaa ctc aac gcc acg gcg gac acg ctg      432
Thr Ala His Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu
    130                 135                 140
cgg ggc ctg ctt agc aac gtg ctg tgc cgc ctg tgc agc aag tac cac      480
Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His
145                 150                 155                 160
gtg gcc cac gtg gac gtg gcc tat ggc ccg gac acc tcg ggc aag gac      528
Val Ala His Val Asp Val Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp
                165                 170                 175
gtc ttc cag aag aag aag ctg ggg tgt cag ctg ctg gga aaa tac aag      576
Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys
            180                 185                 190
cag gtc atg gcc gtg ttg gcg cag gcc ttc tag                          609
Gln Val Met Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe
        195                 200
<210>2
<211>202
<212>PRT
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>2
Met Lys Ile Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His
1                   5               10                  15
Trp Lys Pro Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Asn Pro Val Asn Ala
                20                  25                  30
Thr Cys Asn Thr His His Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile
            35                  40                  45
Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile
        50                  55                  60
Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly
                85                  90                  95
Thr Glu Lys Val Arg Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Thr Ala Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro
        115                 120                 125
Thr Ala His Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu
    130                 135                 140
Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His
145                 150                 155                 160
Val Ala His Val Asp Val Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp
                165                 170                 175
Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys
            180                 185                 190
Gln Val Met Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe
        195                 200
<210>3
<211>543
<212>DNA
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(543)
<223>经优化以在毕赤酵母中表达的兔白血病抑制因子
<400>3
gct cca ctt cca atc aac cca gtt aac gct acc tgc aac aca cac cac       48
Ala Pro Leu Pro Ile Ash Pro Val Asn Ala Thr Cys Asn Thr His His
1               5                   10                  15
cca tgc cca tcc aac ttg atg agc cag atc cgt tcc cag cta gca cag       96
Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln
            20                  25                  30
ttg aat ggc act gcc aac gcc ttg ttc atc ttg tac tac aca gcc caa      144
Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln
        35                  40                  45
ggt gag cca ttc cca aac aac ctg gac aag ctg tgc ggc cca aat gtt      192
Gly Glu Pro Phe Pro Asn Ash Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val
    50                  55                  60
acg gac ttc cca cca ttc cac gct aac ggt acc gag aag gtt aga cta      240
Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Val Arg Leu
65                  70                  75                  80
gtt gag ttg tac cgt atc gtg gct tac cta ggc acc gct ctg ggc aac      288
Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu Gly Thr Ala Leu Gly Asn
                85                  90                  95
atc acc cgt gac cag aag acc cta aac cca acg gct cac agc ttg cac      336
Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro Thr Ala His Ser Leu His
            100                 105                 110
agc aaa cta aac gcc acc gcg gac acg ttg cgt ggc ctg ctt agc aac      384
Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn
        115                 120                 125
gtg ctg tgc cgc ctg tgc agc aag tac cac gtg gcc cac gtg gac gtg      432
Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Ala His Val Asp Val
    130                 135                 140
gca tat ggc cca gac acc tct ggc aag gac gtt ttc cag aag aag aag      480
Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys
145                 150                 155                 160
ttg ggt tgt cag ttg ttg ggt aaa tac aag cag gtc atg gcc gtg ttg      528
Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Val Met Ala Val Leu
                165                 170                 175
gct cag gcc ttc tag                                                  543
Ala Gln Ala Phe
            180
<210>4
<211>180
<212>PRT
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>4
Ala Pro Leu Pro Ile Asn Pro Val Asn Ala Thr Cys Asn Thr His His
1               5                   10                  15
Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln
            20                  25                  30
Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln
        35                  40                  45
Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val
    50                  55                  60
Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Val Arg Leu
65                  70                  75                  80
Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu Gly Thr Ala Leu Gly Asn
                85                  90                  95
Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro Thr Ala His Ser Leu His
            100                 105                 110
Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn
        115                 120                 125
Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Ala His Val Asp Val
    130                 135                 140
Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys
145                 150                 155                 160
Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Val Met Ala Val Leu
                165                 170                 175
Ala Gln Ala Phe
            180

Claims (99)

1.一种用于分离、维持或生长哺乳动物多能胚胎干细胞的组合物，所述组合物可使所述干细胞保持在未分化状态至少10代，所述组合物含有细胞的条件培养基，其特征在于，所述组合物含有少于0.5ng/ml的白血病抑制因子(LIF)。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有的白血病抑制因子(LIF)浓度低于0.2ng/ml。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有的白血病抑制因子(LIF)浓度低于0.02ng/ml。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物适用于选自灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗或兔的非人哺乳动物的干细胞。
5.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物适用于选自啮齿类动物的非人哺乳动物的干细胞。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是大鼠属。
7.如权利要求5所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是小鼠属。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的任何品系的小鼠品系：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/10la、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
9.如权利要求7所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的小鼠品系：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
10.如权利要求7所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有129/SvEv或C57BL/6N遗传背景的小鼠。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，所述LIF是人、鼠或兔的LIF。
12.一种用于分离、维持或生长哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的组合物，所述组合物含有细胞的条件培养基，其特征在于，所述组合物含有的白血病抑制因子(LIF)浓度低于2ng/ml。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述LIF是哺乳动物的LIF，如人、鼠或兔的LIF。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有的白血病抑制因子(LIF)浓度低于0.2ng/ml。
15.如权利要求12或13所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有的白血病抑制因子(LIF)浓度低于0.02ng/ml。
16.如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物适用于选自灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗或兔的非人哺乳动物的干细胞。
17.如权利要求12-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物适用于选自啮齿类动物的非人哺乳动物的干细胞。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是大鼠属。
19.如权利要求17所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是小鼠属。
20.如权利要求19所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的任何品系的小鼠品系：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和SwissWebster。
21.如权利要求19所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的小鼠品系：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
22.如权利要求19所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有129/SvEv或C57BL/6N遗传背景的小鼠。
23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中，细胞的条件培养基来自永生成纤维细胞系。
24.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中，细胞的条件培养基来自兔Rab9细胞系(ATCC目录号CRL-1414)。
25.一种用于分离、维持或生长哺乳动物多能胚胎干细胞的组合物，所述组合物可使所述的干细胞保持在未分化状态至少10代，所述组合物含有细胞的条件培养基，所述细胞被编码LIF的DNA转染，其特征在于，所述组合物添加了除胎牛血清以外的血清，如胎马血清、胎绵羊血清、胎山羊血清、新生的哺乳动物血清、成年哺乳动物血清或血清替代物。
26.如权利要求25所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物选自灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗或兔。
27.如权利要求25所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物选自啮齿类动物。
28.如权利要求27所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是大鼠属。
29.如权利要求27所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是小鼠属。
30.如权利要求29所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的任何品系的小鼠品系：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和SwissWebster。
31.如权利要求29所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的小鼠品系：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
32.一种用于分离、维持或生长具有129/SvEv遗传背景的鼠胚胎干细胞至少16代的组合物，所述的胚胎干细胞与四倍体胚胎凝集后可制备出成年非人哺乳动物，所述组合物含有细胞的条件培养基，所述细胞被LIF基因或LIF变体的基因转染，其特征在于，所述组合物添加了除胎牛血清以外的血清，如胎马血清、胎绵羊血清、胎山羊血清、新生的哺乳动物血清、成年非人哺乳动物血清或血清替代物。
33.一种用于分离、维持或生长非人哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的组合物，所述组合物含有细胞的条件培养基，所述细胞被LIF基因或LIF变体的基因转染，所述组合物添加了除胎牛血清以外的血清，如胎马血清、胎绵羊血清、胎山羊血清、新生的哺乳动物血清、成年哺乳动物血清或血清替代物。
34.如权利要求33所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物选自灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗或兔。
35.如权利要求33所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物选自啮齿类动物。
36.如权利要求35所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是大鼠属。
37.如权利要求35所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是小鼠属。
38.如权利要求37所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的任何品系的小鼠品系：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和SwissWebster。
39.如权利要求37所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有下列遗传背景的小鼠品系：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
40.如权利要求37所述的组合物，其中，所述非人哺乳动物是具有129/SvEv或C57BL/6N遗传背景的小鼠品系。
41.如权利要求25-40中任一项所述的组合物，其中，被转染的细胞是永生成纤维细胞。
42.如权利要求25-40中任一项所述的组合物，其中，被转染的细胞是兔Rab9细胞。
43.如权利要求25-40中任一项所述的组合物，其中，所述细胞被编码非人哺乳动物LIF或LIF变体的DNA转染。
44.如权利要求43所述的组合物，其中，所述细胞被编码兔LIF或兔LIF变体的DNA转染。
45.如权利要求43或44所述的组合物，其中，编码LIF或LIF变体的转染的DNA是基因组DNA。
46.如权利要求25-45中任一项所述的组合物，其中，所述细胞系是稳定转染的。
47.如权利要求25-46中任一项所述的组合物，其中，所述细胞系是Rab9克隆#19，该细胞系保藏在BCCM，保藏号为LMBP 5479 CB。
48.如上述任一权利要求所述的组合物，所述组合物添加了一种或多种选自白细胞介素、抑瘤蛋白、睫状神经营养因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子和心脏营养蛋白的化合物。
49.一种组合物，所述组合物含有经Rab9成纤维细胞系调节的培养基。
50.一种组合物，所述组合物含有被编码LIF或LIF变体的DNA转染的细胞的条件培养基，其中，所述被转染的细胞是永生成纤维细胞。
51.如权利要求50所述的组合物，其中，所述DNA编码兔LIF或兔LIF变体。
52.如权利要求50或51所述的组合物，其中，编码LIF或LIF变体的转染的DNA是基因组DNA。
53.如权利要求50-52中任一项所述的组合物，其中，所述细胞系是稳定转染的。
54.如权利要求50所述的组合物，其中，所述细胞系是Rab9克隆#19，该细胞系保藏在BCCM，保藏号为LMBP 5479 CB。
55.一种分离、维持或生长非人哺乳动物多能干细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-11或25-32中任一项所述的组合物中将细胞至少培养1代的步骤。
56.用权利要求55所述方法获得的非人哺乳动物多能胚胎干细胞。
57.一种分离、维持或生长非人哺乳动物种系感受态胚胎干细胞的方法，所述方法包括在权利要求12-24或33-40中任一项所述的组合物中将细胞至少培养1代的步骤。
58.用权利要求57所述方法获得的非人哺乳动物种系感受态胚胎干细胞。
59.来自非人哺乳动物的多能胚胎干细胞，所述非人哺乳动物选自灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔和啮齿类动物，如具有下列遗传背景的大鼠和小鼠：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
60.来自非人哺乳动物的多能胚胎干细胞，所述非人哺乳动物选自具有下列遗传背景的小鼠：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
61.来自非人哺乳动物的种系感受态胚胎干细胞，所述非人哺乳动物选自灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔和啮齿类动物，如具有下列遗传背景的大鼠和小鼠：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
62.来自非人哺乳动物的种系感受态胚胎干细胞，所述非人哺乳动物选自具有下列遗传背景的小鼠：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
63.一种从胚胎干细胞制备转基因非人哺乳动物的方法，所述方法包括在权利要求1-11或25-32中任一项所述的组合物中将细胞至少培养1代的步骤。
64.选自下列一组的转基因非人哺乳动物：灵长类动物、猪、牛、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔和啮齿类动物，如具有下列遗传背景的大鼠和小鼠：129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
65.选自具有下列遗传背景的小鼠的转基因非人哺乳动物：C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
66.一种酵母表达载体，所述载体含有与启动子序列操作性相连的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码兔LIF或其变体，所述变体与兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
67.如权利要求66所述的载体，其中，所述编码兔LIF的核苷酸序列显示在图1[SEQ ID NO1]或图2[SEQ ID NO3]中。
68.如权利要求67所述的载体，其中，所述编码蛋白序列如图1[SEQ ID NO2]或图2[SEQ ID NO4]所描述。
69.如权利要求66-68中任一项所述的载体，其中，所述核苷酸序列与分泌信号序列融合在同一阅读框内。
70.如权利要求69所述的载体，其中，所述载体是pPICZα，分泌信号为α因子分泌信号。
71.被权利要求66-70中任一项所述的核苷酸序列转化的酵母细胞。
72.如权利要求71所述的酵母细胞，其中，所述酵母细胞是甲基营养酵母如毕赤酵母。
73.如权利要求72所述的酵母，所述酵母已保藏在比利时微生物协调保藏中心，保藏号为MUCL-42925。
74.利用重组DNA技术在权利要求71-73中任一项所述的酵母细胞中表达兔LIF或与兔LIF或其功能蛋白片段一致性至少为95％的变体的方法。
75.如权利要求74所述的方法，其中，表达的蛋白分泌到毕赤酵母生长培养基中。
76.一种组合物，所述组合物含有兔LIF或其变体，其中所述变体与兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
77.纯化的兔LIF或其变体，所述变体与兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
78.一种用于分离、维持或生长非人胚胎干细胞的组合物，所述组合物含有纯化的兔LIF或其变体，所述变体与兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
79.一种用于无基质扩增哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞的组合物，所述组合物含有成纤维细胞系的条件培养基。
80.如权利要求79所述的组合物，其中，所述成年干细胞是造血干细胞，早期成年祖细胞是造血前体细胞。
81.如权利要求70或80所述的组合物，其特征还在于，所述组合物是非富含细胞因子和/或LIF的。
82.如权利要求81或中任一项所述的组合物，其中，所述成纤维细胞系是永生的。
83.如权利要求82所述的组合物，其中，所述永生成纤维细胞系是Rab9(ATCCCRL1414)细胞系。
84.如权利要求79-83中任一项所述的组合物在无基质扩增分离的哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞中的应用。
85.如权利要求84所述的应用，其中，所述成年干细胞是造血干细胞，早期成年祖细胞是造血前体细胞。
86.如权利要求85所述的应用，其中，所述分离的造血干细胞或造血前体细胞是人CD 34+细胞。
87.如权利要求85或86所述的应用，其中，所述造血干细胞或造血前体细胞分离自脐带血、胎盘血、外周血和骨髓。
88.如权利要求85-87中任一项所述的应用，其中，所述细胞总数至少可扩增25倍。
89.如权利要求85-87中任一项所述的应用，其中，所述CD34+细胞数至少可以扩增3倍。
90.如权利要求85-87中任一项所述的应用，其中，所述扩增的细胞至少培养15天。
91.如权利要求85-87中任一项所述的应用，其中，在LTC IC测定中呈阳性反应的扩增的细胞数至少要增加15倍。
92.一种扩增哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞的方法，所述方法包括
a)分离哺乳动物成年干细胞或早期祖细胞；
b)在无基质的条件下用权利要求79-83中任一项所述的组合物培养细胞。
93.如权利要求92所述的方法，其中，所述成年干细胞是造血干细胞，早期成年祖细胞是造血前体细胞。
94.如权利要求92所述的方法，其中，采用培养步骤直到至少获得25倍的扩增。
95.如权利要求92所述的方法，其中，采用培养步骤直到有核细胞的数量至少扩增10倍。
96.如权利要求92所述的方法，其中，在扩增的细胞群中CD34+细胞的数量至少要扩增3倍。
97.如权利要求92所述的方法，其中，扩增的细胞群要至少培养15天。
98.如权利要求92所述的方法，其中，在LTC IC测定中呈阳性反应的扩增的细胞数至少要增加15倍。
99.如权利要求92所述的方法，其中，扩增的细胞可在经亚致死剂量照射的NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠中重新形成集落。
CNB028281144A 2001-12-21 2002-12-20 用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(es)细胞系的组合物 Expired - Fee Related CN100526455C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BEPCT/BE01/00221 2001-12-21
PCT/BE2001/000221 WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2001-12-21 Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
GBGB0220145.7A GB0220145D0 (en) 2002-08-30 2002-08-30 Novel compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (ES) cell lines with germline transmission capability
GB0220145.7 2002-08-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1620498A true CN1620498A (zh) 2005-05-25
CN100526455C CN100526455C (zh) 2009-08-12

Family

ID=25661295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028281144A Expired - Fee Related CN100526455C (zh) 2001-12-21 2002-12-20 用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(es)细胞系的组合物

Country Status (9)

Country Link
US (2) US8697444B2 (zh)
EP (1) EP1458852B1 (zh)
JP (1) JP4408371B2 (zh)
CN (1) CN100526455C (zh)
AT (1) ATE501167T1 (zh)
AU (1) AU2002357410A1 (zh)
DE (1) DE60239420D1 (zh)
HK (1) HK1075276A1 (zh)
WO (1) WO2003054170A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635980A (zh) * 2016-11-16 2017-05-10 中国农业大学 一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003054170A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability and for the culture of adult stem cells
EP3354723B1 (en) 2005-08-29 2023-12-13 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
EP2733203B1 (en) 2006-08-02 2018-10-10 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
ES2779048T3 (es) 2009-11-12 2020-08-13 Technion Res & Dev Foundation Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en un estado indiferenciado
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
LT2809150T (lt) 2012-02-01 2019-10-25 Regeneron Pharma Humanizuota pelė, kuri ekspresuoja sunkiąsias grandines, kurių sudėtyje yar vl domenai
US20150135346A1 (en) * 2013-11-09 2015-05-14 Mice With Horns, Llc Materials and methods for making a recessive gene dominant
CN113215097B (zh) * 2021-06-24 2023-03-24 成都中医药大学 一种高比例b7h4阳性脐带间充质干细胞、其培养方法及培养液

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT87133B (pt) 1987-04-02 1992-07-31 Amrad Corp Ltd Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif
DE68928914T2 (de) 1988-08-04 1999-09-09 Amrad Corp. Ltd. (in vitro)-vermehrung von embryonalen stammzellen unter verwendung von leukämie-inhibitionsfaktor (lif)
CA2045126A1 (en) * 1989-01-10 1990-07-11 Nicholas M. Gough Leukaemia inhibitory factor from livestock species and use thereof to enhance implantation and development of embryonic cells
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
WO1997020035A1 (en) * 1995-11-29 1997-06-05 Utah State University Establishment, maintenance, and transfection of totipotent embryonic stem cells from the embryos of domestic animals
JPH1052263A (ja) 1996-05-21 1998-02-24 Rikagaku Kenkyusho 胚性幹細胞
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6458589B1 (en) * 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
US20040053406A1 (en) 2000-06-28 2004-03-18 Luc Schoonjans Pluripotent embryonic stem (es) cell lines, improved methods for their production, and their use for germ line transmission and for the generation of genetically modified animals
WO2003054170A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability and for the culture of adult stem cells
GB0220145D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Thromb X Nv Novel compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (ES) cell lines with germline transmission capability
WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635980A (zh) * 2016-11-16 2017-05-10 中国农业大学 一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法
CN106635980B (zh) * 2016-11-16 2019-09-24 中国农业大学 一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法

Also Published As

Publication number Publication date
HK1075276A1 (en) 2005-12-09
US20090098650A1 (en) 2009-04-16
US20140099710A1 (en) 2014-04-10
US8697444B2 (en) 2014-04-15
US8993323B2 (en) 2015-03-31
EP1458852B1 (en) 2011-03-09
CN100526455C (zh) 2009-08-12
AU2002357410A8 (en) 2003-07-09
AU2002357410A1 (en) 2003-07-09
ATE501167T1 (de) 2011-03-15
DE60239420D1 (de) 2011-04-21
WO2003054170A1 (en) 2003-07-03
JP2005512563A (ja) 2005-05-12
JP4408371B2 (ja) 2010-02-03
EP1458852A1 (en) 2004-09-22
WO2003054170A8 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1123574C (zh) Flt3受体的配体
CN100347293C (zh) 来源于单核细胞的去分化的可程序化干细胞及其制备和应用
CN1090204A (zh) 白细胞介素-4/或白细胞介素-10的新用途及其抗体
US8993323B2 (en) Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (ES) cell lines with germline transmission capability and for the culture of adult stem cells
CN1478145A (zh) 适合人治疗的分化细胞
CN101065400A (zh) 用于治疗性应用的经遗传改变的细胞
CN1630716A (zh) 人胚胎干细胞衍生的造血细胞
CN1237909A (zh) 联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗
CN1416462A (zh) 人多能干细胞生长和分化的技术
CN1171819A (zh) 分泌产生血小板生成素多肽的方法
CN1688340A (zh) 调节t辅助(th)细胞发育和功能的方法和组合物
WO2003054169A1 (en) Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CN1094093A (zh) 祖代b细胞刺激因子
CN1764723A (zh) 白细胞介素－18突变体、其制品及应用
CN1839149A (zh) 能够结合转化生长因子β1(TGF－β1)的肽
CN1406280A (zh) 祖细胞保护因子和相关的方法和产物
CN1656215A (zh) 制备细胞毒性淋巴细胞的方法
CN1929855A (zh) 诱导或调节免疫反应的方法
CN1839202A (zh) 细胞毒性淋巴细胞的制备方法
CN1503677A (zh) 用lp82治疗造血障碍
CN1914324A (zh) 利用同源重组的牛β－酪蛋白基因靶向载体
CN1850974A (zh) 转人α－乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法
CN1124142A (zh) 抑制异戊二烯基蛋白质转移酶表达的寡核苷酸
CN1669405A (zh) 生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法
CN1687425A (zh) 生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1075276

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1075276

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090812

Termination date: 20171220