CN1171819A - 分泌产生血小板生成素多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了在血小板生成素的产生中有用的DNA构建体。总的来说,所述DNA构建体包含第一DNA片段(其编码连接到血小板生成素多肽上的氨基-末端分泌肽的融合体)和一个或多个附加DNA片段(其有利于第一片段的转录)。所说的分泌肽是天然哺乳动物的t-PA分泌肽或者可以是为增加融合体的蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物t-PA分泌肽。本文也公开了包含这些DNA构建体的培养的真核细胞以及通过采用所述DNA构建体和培养的真核细胞产生血小板生成素多肽的方法。
Description
发明背景
造血是血细胞从骨髓中的多能干细胞发育和分化的过程。这个过程包括复合物和多肽生长因子(细胞因子)通过靶细胞上膜结合的受体相互影响作用。细胞因子的作用导致细胞增殖和分化,同时伴随着对特定的常常是血统特异性的和/或阶段特异性的细胞因子的反应。单细胞型(如血小板)从干细胞的发育可能需要在适当的序列中作用的许多细胞因子的协同作用。
已知的细胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8等)和集落刺激因子(如G-CSF、M-CSF、GM-CSF、红细胞生成素(EPO)等)。通常,白介素作为免疫和炎症反应的介质。集落刺激因子刺激骨髓衍生的细胞的增殖,活化成熟白细胞,另外可形成宿主对炎症、感染和免疫激发反应的整合部分。
已经把各种细胞因子开发为治疗剂。例如,刺激红细胞发育的红细胞生成素可用于治疗由于肾衰竭引起的贫血。用几种集落刺激因子与癌症化疗相结合以促进患者免疫系统的恢复。白介素-2、α-干扰素和γ-干扰素用于某些癌症的治疗。
刺激巨核细胞生成和血小板生成的活性物已在血小板减少的动物体液中鉴别出来,在文献中称为“血小板生成素”(最近由McDonald的Exp.Hematol.16:201-205,1988和McDonald的Am.J.Ped.Hematol.Oncol.14:8-21,1992回顾)。
前不久鉴别了几组蛋白质和/或克隆了一种结合到细胞mpl受体并刺激巨核细胞生成和血小板生成的蛋白质。参见,de Sauvage等,自然369:533-538,1994;Lok等,自然369:565-568,1994;Kaushansky等,自然369:568-571,1994;Wendling等,自然369:571-574,1994和Bartley等,细胞77:1117-1124,1994。有人提议把这种蛋白质称为血小板生成素(Kaushansky等,同上)。
氨基酸序列分析表明成熟的小鼠TPO从SEQ ID NO:2的氨基酸残基45(丝氨酸)延伸到残基379(苏氨酸)。预期的人蛋白质的氨基末端精确地对应于已证明的重组鼠TPO的成熟氨基末端(Lok等,同上),即氨基末端在SEQ IDNO:4的丝氨酸(22),蛋白质延伸到SEQ ID NO:4的氨基酸残基353。TPO易受蛋白水解,并已经以多相的或降解的形式分离(Sauvage等,自然369:533-538,1994;Bartley等,细胞77:1117-1124,1994)。已经发现如25kD的小分子种类在体外是活性的(Bartley等,同上),已经报道了153个氨基酸(Sauvage等,同上)和174氨基酸(Bartley等,同上)的重组人TPO多肽在体外是活性的,其具有全长人cDNA的表达产物,其中cDNA编码353个氨基酸的初级翻译产物(Bartley等,同上)。
血小板生成素看来似乎是蛋白水解的对象,并可以多相的或降解的形式分离(Bartley等,同上;Sauvage等,同上)。因此,尽管至少一些蛋白水解产物具有生物学活性,科技文献中所报道的血小板生成素制剂对于各种分子种类的组合物和相关的活性物不具有明显的特征。然而,很少有工作可确定血小板生成素大规模生产的日期,在本领域中仍需要一种大量地而花费较少的方式生产蛋白质的方法。
发明概述
本发明的一个目的是提供产生血小板生成素的方法。
本发明的另一个目的是提供指导重组血小板生成素从宿主细胞分泌的方法。
本发明的目的还在于提供指导高水平的血小板生成素表达和分泌的DNA构建体。
本发明一方面提供了一种DNA构建体,此构建体包含:(a)编码多肽融合体的第一DNA片段,该融合体包含连接到血小板生成素(TPO)多肽上的氨基末端分泌肽,连接的肽和多肽在其接合处有一个蛋白水解的裂解位点;(b)一个或多个附加DNA片段,这些片段可操作地连接到第一DNA片段上以利于其转录,其中所说的分泌肽选自天然哺乳动物组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)分泌肽和为增加接合处蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物t-PA分泌肽。在一个实施方案中,分泌肽是人t-PA分泌肽。在一个有关的实施方案中,分泌肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸残基序列,其中所说的Xaa(29),Xaa(31)和Xaa(33)分别是任何氨基酸,Xaa(34)是丙氨酸,精氨酸或赖氨酸。在另一个实施方案中,Xaa(29)和Xaa(31)分别是除赖氨酸、精氨酸、或组氨酸外的任何氨基酸。在另一个实施方案中,Xaa(33)是甘氨酸;Xaa(34)是精氨酸或赖氨酸;Xaa(29)和Xaa(31)分别是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或丙氨酸,Xaa(33)是甘氨酸;Xaa(34)是精氨酸;或者Xaa(29)是精氨酸或谷氨酸,Xaa(31)是精氨酸或谷氨酰胺,Xaa(33)是甘氨酸,并且Xaa(34)是精氨酸,其条件是至少Xaa(29)和Xaa(31)之一不是精氨酸。在另一个实施方案中,TPO多肽包含144到335个氨基酸残基。在一个相关的实施方案中,TPO多肽包含144到191个氨基酸残基。在另一个实施方案中,TPO多肽包含选自下组序列的氨基酸序列,所述序列如SEQ ID NO:4所示的从丝氨酸(22)到缬氨酸(173),丝氨酸(22)到精氨酸(185),丝氨酸(22)到天冬酰胺(193)或丝氨酸(22)到谷氨酰胺(235)的序列。
本发明另一方面提供了包含第一DNA片段的DNA构建体,所述DNA片段编码多肽融合体,多肽融合体实质上包含如SEQ ID NO:5中所示的氨基末端分泌肽,其中所说的Xaa(29)是精氨酸或谷氨酸,Xaa(31)是精氨酸或谷氨酰胺,Xaa(33)是甘氨酸,Xaa(34)是连接到144到335个氨基酸的TPO多肽上的丙氨酸或精氨酸,其中所说的第一DNA片段可操作地连接到一个或多个附加DNA片段上以利于其转录。在一个实施方案中,TPO多肽包含144到191个氨基酸残基。在另一个实施方案中,TPO多肽是人TPO多肽。在另一个实施方案中,TPO多肽包含选自下组序列的氨基酸序列,所述序列如SEQ ID NO:4所示的从丝氨酸(22)到缬氨酸(173),丝氨酸(22)到精氨酸(185),丝氨酸(22)到天冬酰胺(193)或丝氨酸(22)到谷氨酰胺(235)的序列。在另一个实施方案中,DNA构建体还包含选择性标记。
第三方面,本发明提供了包含以上公开的DNA构建体的培养的真核细胞。在一组实施方案中,细胞是酵母细胞,如酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。在另一个组实施方案中,细胞是哺乳动物细胞,如啮齿动物细胞或肾细胞。
本发明的第四方面提供了产生血小板生成素多肽的方法,此方法包括培养如上所公开的真核细胞(其中所说的细胞表达第一DNA片段,TPO多肽从细胞中分泌)和选择性地回收TPO多肽。
参照下列详细描述,会明显看到本发明的这些或其它方面。发明详述
在详细地描述本发明前,定义本文所用的术语可能是有用的。
等位变异体:通过突变产生的基因的替代形式或由突变的基因编码的变异多肽。基因突变可以是沉默的(编码的肽无变化),或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。
cDNA:互补DNA,通过信使RNA模板、这样的分子的克隆或扩增拷贝的逆转录制备。互补DNA可是单链或双链。
表达载体:线性或环状DNA分子,该DNA分子包含编码目的多肽的并能可操作地连接到提供其转录的附加片段上的片段。这些附加的片段包括启动子和终止序列。表达载体也可以包含一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA,或包含两者的成分。术语“可操作连接”是指排列片段以使它们协调作用,达到其意定的目的,例如,转录从启动子开始,并通过编码片段进行至终止子。
基因:编码多肽链的染色体DNA片段。基因包括一个或多个编码氨基酸的区域,在某些情况下,这些区域被非编码的“插入序列”(“内含子”)以及侧翼的有利于编码序列转录的非编码区分散开。
信号序列:编码分泌肽的DNA序列。信号序列也称为前导序列、原序列(prepro sequence)、前序列(pre sequence)。分泌肽是对指导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌起作用的氨基酸序列。分泌肽的特征为疏水氨基酸核,典型地(但不是唯一地)在新合成的蛋白质的氨基端发现。通常,分泌肽在分泌期间以一个或多个裂解事件从成熟蛋白质上裂解。这样的分泌肽包含加工位点使得这些分泌肽在通过分泌途径时可以从成熟蛋白质上裂解。在本文中使用的术语“氨基端分泌肽”表示在蛋白质(包括融合蛋白)氨基端产生的分泌肽。
启动子:RNA聚合酶结合及mRNA合成起始的基因部分。
血小板生成素:血小板生成素(TPO)蛋白质通过其特异性结合到同一物种的MPL受体并在活体内刺激血小板生成的能力确定特征。在正常的试验动物中,TPO在开始每日施用之后的10天内可使血小板水平增加100%或更多。术语“血小板生成素多肽”包括全长的血小板生成素分子及其生物学活性部分,这种活性部分是血小板生成素的片段,可表现出完整分子的生物活性性质(受体结合和在活体内刺激血小板生成)。
在本文中,氨基酸通过标准的三字母码阐述,可变氨基酸通过“Xaa”阐述。氨基酸位置由在三字母氨基酸名称后的括号中的数字指定。例如,Ser(22)表示在氨基酸序列位置22的丝氨酸残基,而Xaa(29)表示在序列位置29的可变氨基酸。当序列包含许多可变氨基酸时,尽管每一个可能是不同的氨基酸残基,但每一个都用Xaa阐述。
本发明提供了用于产生重组TPO多肽的方法和其它在这些方法内使用的物质,其中所述多肽从表达它们的宿主细胞、DNA构建体、细胞中分泌。
典型的小鼠和人TPO DNA和氨基酸的序列在SEQ ID NO:1,2,3,4中显示。本领域技术人员会认识到:公开的序列代表单一等位基因,并预期有等位基因变异的存在。公开序列的等位基因变异包括在本发明的范围之内。
本文公开的小鼠和人TPO序列可用于设计克隆另外的编码TPO的多核苷酸的策略和工具。这样,本发明提供了用从多种物种中制备TPO多肽的方法,所述多肽优选的是哺乳动物TPO多肽,包括人、小鼠、大鼠、猪、犬、羊、牛和马的TPO多肽。特别的目的肽是灵长类的TPO多肽,尤其是人TPO多肽。
可按照本发明产生的血小板生成素多肽包括全长的血小板生成素分子以及成熟蛋白质的截短的生物活性片段。通常,这些TPO多肽至少包括分子N-端区的核心“类EPO结构域”(如此命名是由于它和促红细胞生成素的同源性)。这种核心类EPO结构域通过在小鼠TPO的位置51和195的半胱氨酸残基之间(SEQ ID NO:2);人TPO的位置28和172之间(SEQ ID NO:4);以及其它物种的TPOs中的相应残基之间。现在发现:在实验动物中,TPO多肽(如SEQ ID NO:2中从氨基酸残基45(丝氨酸)延伸到氨基酸残基216(天冬酰胺)的小鼠TPO多肽)在促进血小板产生上是活性的。特别优选的TPO多肽列于如下表1中。
表 1
小鼠TPO(SEQ ID NO:2)
半胱氨酸(残基51)—半胱氨酸(残基195)
半胱氨酸(51)—缬氨酸(196)
半胱氨酸(51)—脯氨酸(206)
半胱氨酸(51)—天冬酰胺(216)
半胱氨酸(51)—精氨酸(235)
半胱氨酸(51)—精氨酸(244)
半胱氨酸(51)—精氨酸(249)
半胱氨酸(51)—谷氨酰胺(259)
半胱氨酸(51)—精氨酸(273)
丝氨酸(45)—半胱氨酸(195)
丝氨酸(45)—缬氨酸(196)
丝氨酸(45)—脯氨酸(206)
丝氨酸(45)—丝氨酸(207)
丝氨酸(45)—天冬酰胺(216)
丝氨酸(45)—精氨酸(235)
丝氨酸(45)—精氨酸(244)
丝氨酸(45)—精氨酸(249)
丝氨酸(45)—谷氨酰胺(259)
丝氨酸(45)—精氨酸(273)人TPO(SEQ ID NO:4)
半胱氨酸(28)—半胱氨酸(172)
半胱氨酸(28)—缬氨酸(173)
半胱氨酸(28)—精氨酸(175)
半胱氨酸(28)—精氨酸(185)
半胱氨酸(28)—天冬酰胺(193)
半胱氨酸(28)—精氨酸(198)半胱氨酸(28)—苯丙氨酸(207)半胱氨酸(28)—谷氨酰胺(235)半胱氨酸(28)-精氨酸(266)丝氨酸(22)—半胱氨酸(172)丝氨酸(22)—缬氨酸(173)丝氨酸(22)—精氨酸(175)丝氨酸(22)—精氨酸(185)丝氨酸(22)—天冬酰胺(193)丝氨酸(22)—精氨酸(198)丝氨酸(22)—苯丙氨酸(207)丝氨酸(22)—谷氨酰胺(235)丝氨酸(22)—精氨酸(266)
本领域的技术人员会认识到:可以产生具有在优选的表1所公开的氨基和羧基末端残基之间的末端的分子,并期望其具有生物活性。
血小板生成素多肽可包括通过DNA的天然突变或人工操作产生的一种或多种氨基酸的取代、缺失或添加。这些变化优选地是有关次要性质的,如保守的氨基酸取代,这种取代不能明显地影响蛋白质的折叠或活性(参见表2)。通常参见Ford等的蛋白质的表达和纯化2:95-107,1991,本文一并参考。表 2保守氨基酸取代碱性的:精氨酸
赖氨酸
组氨酸酸性的:谷氨酸
天冬氨酸极性的:谷氨酰胺
天冬酰胺疏水的:亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸芳香族的:苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸分子量小的:甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
TPO中的必需氨基酸可按照本领域中已知的方法鉴别,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,科学244,1081-1085,1989)。在第二种技术中,单个的丙氨酸突变在分子中以每个残基导入,试验产生的突变分子的生物活性(如受体结合,体外或体内的增殖活性)以鉴别对分子活性关键的氨基酸残基。配体受体相互作用的位点也可通过晶体的结构分析测定,如用核磁共振、晶体学或光亲和标记测定。参见,例如,de Vos等,科学255:306-312,1992;Smith等,分子生物学杂志224:899-904,1992;Wlodaver等,FEBS通信309:59-64,1992。
通常,预期细胞因子有4个α螺旋结构,第一个和第四个螺旋在配体受体相互作用中最重要,且在所有螺旋中更保守。参考SEQ ID NO:4中显示的人类TPO氨基酸序列,细胞因子序列的对比表明这些螺旋分别在氨基酸残基29和53、80和99、108和130、144和168(界线是±4个残基)之间。小鼠(SEQ ID NO:2)和其它非人类TPOs的螺旋界限可通过和人类序列的序列对比确定。TPO的其它重要的结构方面包括SEQ ID NO:2的51、73、129和195位置(与SEQ ID NO:4的28、50、106和172位置对应)的半胱氨酸残基。
按照本发明所产生的TPO多肽,其特征在于具有50%,优选地具有60%,更优选地具有至少80%的序列与SEQ ID NO:2所示的、SEQ ID NO:4所示的或它们的物种同系物的序列相对应的部分相同。这类多肽更优选地是至少90%,最优选地是95%或更高与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或它们的物种同系物相同。序列相同的百分数用常规方法测定。参见,例如,Altschul等,Bull.Math.Bio 48:603-616,1986和Henikoff和Henikoff,美国科学院学报89:10915-10919,1992。简言之,使用Henikoff和Henikoff的缺口开口减10(gap opening penalty of 10)、缺口延伸突出减1(gap extension penalty of 1)和“blosum 62”的记分基准(如表3所示)(氨基酸通过标准的单字母码表示)对比两种氨基酸序列以优化序列对比分数。然后计算相同百分率如下:
表3
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
TPO多肽还可以包含一种或多种附加的、非TPO的、共计大约20-25个残基的氨基酸残基,典型地为多肽的氨基末端或羧基末端的延伸端。这种类型的延伸包括,例如,氨基末端甲硫氨酸残基,小接头肽和促进多肽纯化的肽延伸端(如多组氨酸片段,抗原表位或结合结构域)。通常可参见,
Ford等,蛋白质表达和纯化2:95-107,1991,本文一并参考。
如以上提出的,TPO似乎对蛋白水解敏感,全长分子的蛋白水解产物(从cDNA序列推断)已经显示是活性的。然而,由于多肽分泌的低效性,在本发明者的实验室中产生小鼠TPO的尝试只得到有限的成功。发明者发现:通过用SEQ ID NO:5中所示的衍生自人类组织分型的血纤维蛋白溶酶原激活剂(T-PA)的合成分泌肽替代天然TPO信号肽,培养的幼小仓鼠肾(BHK)细胞中可回收的TPO的产量可增加5到10倍。
在本发明中,使用t-PA分泌肽或其衍生物指导TPO的分泌。通常,编码分泌肽-TPO多肽融合体的DNA片段可操作地连接到一个或多个提供其转录的附加的DNA片段上。这些附加DNA片段包含转录启动子。虽然在融合序列下游的载体序列中,转录在许多情况偶然地终止,但把编码分泌肽TPO融合体的DNA序列连接到转录终止子也是优选的。尽管本领域的技术人员承认:在一定系统内,选择性标记可由单独的载体提供,可以通过整合到宿主细胞基因体组进行外源DNA的复制,但载体通常包含一个或多个选择性标记和一个或多个复制起点。启动子、终止子、选择性标记、载体及其它元件的选择是在本领域的普通技术水平内的常规设计。许多这样的元件在文献中已有描述,并可通过商业供给者获得。
为指导TPO多肽进入宿主细胞的分泌途径,把编码分泌肽的DNA序列以正确的阅读框架连接到编码TPO多肽的DNA序列上,以使连接的序列编码融合蛋白。连接的分泌肽和TPO多肽限定(define)一个在它们的接合处(junction)的蛋白水解的裂解位点。通常,本发明使用具有Met-Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Leu-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Ile-His-Ala-Xaa-Phe-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO:5)序列的分泌肽,其中Xaa(29)、Xaa(31)和Xaa(33)分别是任何氨基酸,Xaa(34)是丙氨酸、精氨酸或赖氨酸。使用人类t-PA的野生型分泌肽(其中Xaa(29)和Xaa(31)是精氨酸,Xaa(33)是甘氨酸,Xaa(34)是丙氨酸)时,此肽在提供蛋白水解加工位点的-4和-5位置包含一对精氨酸残基(SEQ ID NO:5的残基31和32)。裂解可发生在这个位点,产生具有三个附加N端氨基酸的TPO多肽。因此,在本发明内,优选的是修饰编码分泌肽的DNA序列以除去这些加工位点,并增加在t-PA和TPO序列的接合点的加工。当不希望受理论的约束时,人们相信分泌肽裂解依赖于激素原转化酶,如酵母KEX2基因产物或哺乳动物酶PC1、PC2和弗林蛋白酶。这类型的酶可识别特征为精氨酸残基在-1和-4位置的裂解位点。裂解可通过-2位置的碱性氨基酸残基(如赖氨酸或精氨酸)促进。因此,在本发明内分泌肽和TPO多肽之间的裂解可以通过在-1和-4位置提供精氨酸残基和在-2位置提供可有可无的碱性氨基酸残基增加。合乎需要的裂解的进一步增加通过用其它的氨基酸(优选地是非碱性氨基酸残基)替代分泌肽中的其它精氨酸残基,尤其在这些氨基酸形成Arg-Xaa-Xaa-Arg基序的地方。在一个优选的实施方案中,SEQ ID NO:5的Xaa(29)和Xaa(31)分别是除赖氨酸、精氨酸和组氨酸之外的任意氨基酸。更优选地,Xaa(29)和Xaa(31)分别是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或丙氨酸。在另一个优选的实施方案中,Xaa(33)是甘氨酸。在另一个优选的实施方案中,Xaa(34)是精氨酸或赖氨酸。特别优选的取代包括Xaa(29)的谷氨酸,Xaa(31)的谷氨酰氨和Xaa(34)的精氨酸。用常规方法(如全部列入本文参考的由Mullis等,美国专利号4,683,195和Mullis等,美国专利号4,683,202公开的聚合酶链式反应)诱变信号序列。
也可以使用非人t-PAs的分泌肽和非人t-PA分泌肽的衍生物。编码各个物种t-PA分泌肽的DNA序列在本领域是已知的,并已由,例如,Rickles等,生物化学杂志263:1563-1560,1988和Feng等,生物化学杂志265:2022-2027,1990公开。这类DNA序列可按照本领域的标准技术作为cDNA或基因组分子克隆并被合成,合成优选地使用自动化设备并应用常规的合成方案。
在本发明内,有这种用途的适合宿主细胞包括任意类型的、可用工程设计以表达异源DNA、可在培养基中生长并具有分泌途径的细胞。尽管原核细胞(如大肠杆菌细胞)能够分泌至少进入周质空间的蛋白质,但在本发明内优选的是使用培养的真核细胞,如真菌细胞,尤其是,培养的哺乳动物细胞。
酵母细胞,尤其是酵母属的细胞,在产生重组TPO多肽中是有用的。酵母细胞在生产人类消费品上已有漫长的历史,而且培养相对便宜。用外源DNA转化酵母细胞并从中产生重组体蛋白质的方法已经公开,例如,Kawasaki,美国专利号4,599,311;Kawasaki等,美国专利号4,931,373;Brake,美国专利号4,870,008;Welch等,美国专利号5,037,743和Murray等,美国专利号4,845,075,本文一并参考。转化的细胞通过用选择性标记测定的表型选择,此表型通常是药物抗性或在缺少特定养分(如亮氨酸)情况下的生长能力。在酵母中使用的一个优选的载体系统是POT1载体系统,此载体系统由Kawasaki等公开(美国专利号4,931,373),它可使得转化的细胞通过在包含葡萄糖的培养基中生长来选择。酵母中使用的适合启动子和终止子包括糖酵解酶基因(参见,例如Kawasaki,美国专利号4,599,311;Kingsman等,美国专利号4,615,974和Bitter,美国专利号4,977,092,本文一并参考)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见,美国专利号4,990,446;5,063,154;5,139,936和4,661,454,本文一并参考。其它酵母,包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉米黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的转化系统在本领域是已知的。参见,例如,Gleeson等,微生物遗传学杂志132:3459-3465,1986;Cregg,美国专利号4,882,279和Stroman等,美国专利号4,879,231。
其它真菌细胞也适于用作宿主细胞。例如,按照McKnight等,美国专利号4,935,349的方法(本文一并参考),可以利用曲霉属细胞。转化枝顶孢霉的方法由Sumino等,美国专利号5,162,228公开,本文一并参考。转化脉孢菌属的方法由Lambowitz,美国专利号4,486,533公开,本文一并参考。
如以上指出的,在本发明内的培养的哺乳动物细胞是优选的宿主。把外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括:磷酸钙介导的转染(Wigler等,细胞14:725,1978;Corsaro和Pearson,体细胞遗传学7:603,1981;Graham和Vander Eb,病毒学52:456,1973)、电穿孔(Neumann等,EMBO杂志1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等,eds,分子生物学最新方法,John wiley和Sons公司,NY,1987)以及阳离子脂类介导的转染(Hawley-Nelson等,Focus 15:7379,1993),本文一并参考。培养的哺乳动物细胞中重组蛋白质的产生已公开,例如,Levinson等,美国专利号4,713,339;Hagen等,美国专利号4,784,950;Palmiter等,美国专利号4,579,821和Ringold,美国专利号4,656,134,本文一并参考。优选的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC号CRL1650)、COS-7(ATCC号CRL 1651)、BHK(ATCC CRL 1632)、BHK570(ATCC号CRL 10314)、293(ATCC CRL 1573;Graham等,病毒遗传学杂志36:59-72,1977)以及中国仓鼠卵巢(例如,CHO-K1;ATCC号CCL61)细胞系。其它适合的细胞系在本领域是已知的,且可从公立的保藏处(如美国典型培养物保藏中心,Rockville,Maryland)获得。通常,强转录启动子(如SV-40或巨细胞病毒的启动子)是优选的。参见,例如,美国专利号4,956,288。其它适合的启动子包括金属硫蛋白基因(美国专利号4,579,821和4,601,978,本文一并参考)的启动子和腺病毒的主要晚期启动子。
药物选择通常用于选择外源DNA插入的培养哺乳动物细胞。这类细胞通常称为“转染子”。在选择性试剂存在的条件下培养的并能把目的基因传给后代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择性标记是编码对抗生素新霉素有抗性的基因。选择在新霉素型的药物(如G-418或其类似物)存在下进行。选择系统也可以用于提高目的基因的表达水平,此过程称为“扩增”。扩增通过在低水平的选择性试剂存在下培养转染子,然后增加选择性试剂的量以选择使导入的基因高水平表达的细胞进行。优选的可扩增的选择性标记是抗氨甲蝶呤的二氢叶酸还原酶。也可使用其它的药物抗性基因(例如潮霉素抗性,多药物抗性,嘌呤霉素乙酰转移酶)。
其它更高级的真核细胞,包括昆虫细胞、植物细胞和禽细胞也可以用作宿主。昆虫细胞的转化和其中外源蛋白质的产生由Guarino等,美国专利号5,162,222;Bang等,美国专利号4,775,624和WIPO出版物WO 94/06463公开,本文一并参考。植物细胞中作为表达基因载体的发根土壤杆菌的用途已由Sinkar等,生物科学杂志(Bangalore)11:47-58,1987综述。
转化或转染的宿主细胞在包含选择的宿主细胞生长所需的养分和其它组分的培养物中按照常规方法培养。各种适合培养基,包括确定成分培养基和复合培养基在本领域是已知的,通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基也可以包含所需要的组分,如生长因子或血清。生长培养基通常通过,例如药物选择或必需养分的缺乏来选择包含外源附加DNA的细胞,其中必需养分由表达载体上进行的和共转染进宿主细胞的选择性标记补充。
按照本发明制备的TPO可使用本领域熟知的方法(如基于蛋白质大小、电荷、溶解性和其它性质的亲和纯化和分离)选择性地回收。当蛋白质在培养的哺乳动物细胞中产生时,优选的是在无血清的培养基中培养细胞,以限制沾染蛋白质的量。收获培养基并分级分离。分级分离的优选的方法包括亲和色谱法,如在固定的MPL受体蛋白质或其配体结合部分或通过使用亲和性标记(例如多组氨酸、物质P或者抗体或其它特异性接合试剂对其有效的其它多肽或蛋白质)层析。特异性裂解位点可由目的蛋白质和亲和标记之间提供。其它色谱法也可使用,如阳离子交换色谱法,阴离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法。
按照本发明制备的TPO可以治疗性地用于任何需要在骨髓中增加细胞增殖的地方,如治疗血细胞减少症,如由再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合症,化疗或先天血细胞减少症引起的血细胞减少症。TPO对增加血小板产生,如在血小板减少的治疗中也是有用的。血小板减少可与可独自作用或共同作用产生各种情况的各种疾病和临床状况有关。降低的血小板计数可源于,例如,血小板产生缺陷、异常的血小板分布、由于大量输血的稀释损失或血小板的异常破坏。例如,用于癌治疗的化学治疗药物可抑制骨髓中血小板祖细胞的发育,引起的血小板减少限制化疗并使输血成为必要。另外,一定的恶性肿瘤可破坏血小板的产生和血小板的分布。用于杀死恶性细胞的放射治疗也杀死血小板祖细胞。血小板减少也可以由药物、新生儿异常免疫或血小板转输异常免疫性引起的各种血小板自身免疫混乱产生。TPO可减少或消除对输血的需要,进而减少血小板异常免疫性的发生。血小板的异常破坏可源于:(1)血管移植物或损伤的组织中增加的血小板消耗;(2)与例如药物诱导的血小板减少、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫疾病、与血液疾病(如与骨髓有关的白血病和淋巴瘤或转移性癌)有关的免疫机制。TPO的其它标记包括再生障碍性贫血和药物诱导的,例如化疗或用AZT治疗HIV感染引起的髓抑制。
血小板减少由增加的出血表明,例如鼻口部或胃肠道以及伤口、溃疡或注射位点渗出的粘膜流血。
用于药学的TPO按照常规方法制备以用于肠胃外,尤其是静脉内或皮下施用。静脉内施用将通过一个或几个小时的典型时期内大丸剂注射或输入进行。通常,药学制剂包括与药学上可接受的载体(如盐水、缓冲盐水、水中的5%葡萄糖或类似物)结合的TPO。制剂还可以包括一种或多种赋形剂、防腐剂、加溶剂、缓冲剂、防止蛋白质在药品表面丢失的清蛋白等等。此外,TPO可与其它细胞因子,尤其是早期作用的细胞因子(如干细胞因子、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF)结合。当利用这类组合治疗剂时,细胞因子可以结合成单一形式的制剂或以分离的制剂施用。制剂方法在本领域是熟知的并已公开,例如,在Reminston的药学科学,Gennaro,ed.,Mack出版公司,Easton PA,1990,本文一并参考。TPO的治疗剂量通常在每天0.1-100μg/千克受疗者体重的范围内,优选的是每天为0.5-50μg/千克,确切的剂量按照公认的标准考虑到治疗的情况的性质和严重性、病人的特点等由临床医生确定。在一定情况下(如当治疗的病人显示出增加的敏感性或需要延长治疗时),指定用每天O.1-20μg/千克的剂量。剂量的确定在本领域的普通技术水平内。通常化疗或骨髓移植后TPO施用长达28天的时期或直到血小板数量>20,000/mm3,优选地>50,000mm3。更普通地,TPO大约在一周或更短的时间,经常为一至三天的时期内施用。TPO治疗的有效量通常是足以在淋巴或骨髓祖细胞的增殖和/或分化中产生临床上显著增加的量,其中淋巴或骨髓祖细胞通过成熟细胞(例如血小板或嗜中性细胞)循环水平的增加表明。这样,继续进行血小板紊乱的治疗直到血小板数目至少达到20,000/mm3,优选地为50,000mm3。TPO也可与其它细胞因子(如IL-3、-6和-11;干细胞因子;促红细胞生成素;G-CSF和GM-CSF)结合施用。在联合治疗的方法中,其它细胞因子的日剂量通常是:EPO≤150U/kg;GM-CSF,5-15μg/kg;IL-3,1-5μg/kg;G-CSF,1-25μg/kg。例如,与EPO的联合疗法在贫血患者中指定用较低的EPO水平。
TPO也是生血细胞发育和分化的体外研究(如阐明细胞分化的机制和测定成熟细胞的血统)的有价值的工具,同时在细胞培养中也发现TPO作为扩增试剂的效用。
TPO也可用于来自体内的,如自体固有的髓培养物的研究。简言之,在化疗前把骨髓从患者中除去,用TPO和一个或多个可有可无的其它的细胞因子结合治疗。然后,化疗后把处理的髓放回患者体内以加速髓的回收。此外,TPO也可用于来自体内的髓的扩展或外围的血液祖细胞(PBPC)。化疗处理前,髓可用干细胞因子(SCF)或G-CSF刺激以释放早期祖细胞进入外周循环。收集这些祖细胞并从外周血液中浓缩,然后,在培养基中用和一个或多个可有可无的其它细胞因子(包括但不限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11)结合的TPO处理,以分化和增殖进高密度的巨核细胞培养物,然后在高剂量的化疗后把此培养物归还到处理的患者中。
以下通过下列非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例实施例1
使用寡核苷酸引物ZC7367(SEQ ID NO:6)和ZC7738(SEQ ID NO:7)和质粒Thr102(在WIPO出版物WO 93/13208中公开)作为模板通过聚合酶链反应修饰人t-PA信号序列。10ng的模板DNA与5μl的2mM dNTPs,5μl的10×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN),0.2μl TaqDNA聚合酶(Boehringer Mannheim),40pmole的每种引物,加水至50μl的溶液结合。混合物在95℃下1分钟、50℃下2分钟、72℃下1分钟温育,进行15个周期,最后在72℃下温育10分钟。DNA用酚/氯仿提取,在-20℃用异丙醇沉淀过夜,重新悬浮在30μl的水中。10μl的DNA用BglII和EcoRI消化。消化的DNA在2.2%的琼脂糖凝胶上电泳。切割对应于124bD的凝胶区域,并置于底部有孔的并垫有培养缸滤器丝棉衬垫的0.5ml微离心管中。微离心管置于一个1.5ml的空试管中,离心混合物(assembly)以从凝胶中提取DNA。把2μl糖原加入提取的液体,盐浓度调节到0.2M NaCl,把DNA通过在-20℃下和乙醇温育过夜沉淀。修饰的序列编码人t-PA分泌肽,其中-7的精氨酸残基用谷氨酸取代,-2的丙氨酸残基用精氨酸取代。
为把BglII位点导入小鼠TPO DNA序列,用PCR诱变处理pZGmp1-1081(按布达佩斯条约于1994年2月14日保藏在美国典型培养物保藏中心,12301Parklawn Drive,Rockville,MD,指定的保藏号为69566)。诱变利用寡核苷酸引物ZC7365(SEQ ID NO:8)和ZC7645(SEQ ID NO:9)进行。使用上述条件,PCR进行20个周期。用酚/氯仿提取DNA,用异丙醇沉淀。
沉淀的DNA重新悬浮在水中,并用PstI和Bg1II消化。313bp片段通过上述的凝胶电泳和离心回收。
为制备表达载体,用EcoRI消化质粒Zem229R(按布达佩斯条约于1993年10月28日作为HB101大肠杆菌转化体保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,指定的保藏号为69566),然后用碱性磷酸酶处理。线性化的载体与t-PA前导序列(EcoRI-BglII)、313bp的PstI-BglII TPO片段以及编码SEQ ID NO:2的150到196的氨基酸残基的PstI-EcoRI片段连接。连接的DNA用来转化感受态的DH10bTM大肠杆菌细胞(GIBCO BRL,Gairsburg,MD),把此大肠杆菌细胞平板接种到包含氨苄青霉素的培养基上培养过夜。
把BHK 570细胞(ATCC CRL 10314)以50,000细胞密度平板接种于24孔平皿中并培养大约15小时。质粒DNA(定名为TPO100,229R)使用WizardTM制剂(Promega公司,Madison,WI)从转化的大肠杆菌细胞中制备。40%的DNA(20μl)使用在水中的2,3-十八碳双烯氧酰-N-[2(精胺碳氧酰氨基)乙基]-N,N-1-丙烷氨基三氟醋酸和十八碳双烯-磷脂酰乙醇胺的3∶1脂质体制剂(LipofectamineTM试剂,GIBCO-BRL)转染进BHK 570细胞。转染子以500nm氨甲蝶呤(MTX)在包含5%加热灭活的胎牛血清(BioWhittaker)、1mM丙酮酸钠(Irvine Scientific,Santa Ana CA)、2mM L-谷氨酰胺(JRHBiosciences,Lexena KS)和25mM HEPES(JRHBioscience)的Dulbeccos改良的Eagles培养基(DME;得自BioWhittaker公司,Walkersville MD或Fred Hutchinson癌研究中心,西雅图,WA)中选择。收集的TPO的平均产量为每天每毫升69,000-92,000个单位(在实施例10中定义)。然后,转染子和单个克隆的集合体在10μM的MTX中扩增,通过稀释来克隆。发现扩增的集合体(pool)产生56,000U/ml/天TPO。
实施例2
构建了表达和分泌全长小鼠TPO的载体。如上所述,TPO100,229R用EcoRI和PstI消化,437bp片段通过凝胶电泳和离心分离。制备编码SEQ IDNo:2的氨基酸150-379的PstI-EcoRI片段,两个片段用以EcoRI消化、碱性磷酸酶处理的Zem229R连接。连接混合物用于转化感受态的大肠杆菌DH10b细胞,然后把此细胞平板接种于包含氨苄青霉素的培养基中并培养过夜。
如上所述,质粒DNA(定名为TPO101.229R)从转化的大肠杆菌细胞中制备并转染进BHK 570细胞。在500nM MTX中所选择的转染子的集合体产生30,000U/ml/天TPO。用10μM MTX扩增的转染子集合体产生88,000U/ml。实施例3
全长小鼠TPO的DNA序列通过PCR诱变处理以用谷氨酰胺残基代替SEQID No:2中197-198位置的精氨酸残基。将诱变的TPO DNA(EcoRI-NotI)连接到EcoRI消化的具有Not I/EcoRI寡核苷酸接头的Zem229R中。产生的质粒称为TPOM3。
质粒TPO100.229R用EcoRI和SalI消化,分离编码t-PA前导序列和SEQID NO:2的氨基酸残基45-76的218bp片段。编码SEQ ID NO:2的77-379氨基酸残基并包括3′非翻译DNA的1188bp片段通过用SalI和EcoRI消化TPOM3制备。这两个片段用以EcoRI消化的并以碱性磷酸酶处理的Zem229R连接。连接混合物用于转化感受态的大肠杆菌DH10bTM细胞,然后把此细胞平板接种于包含氨苄青霉素的培养基上并培养过夜。产生的质粒定名为TPO110.229R
实施例4
为了表达人TPO,在SEQ ID NO:4的氨基酸残基22的密码子位置把BglII位点导入DNA序列。聚合酶链式反应使用作为模板的人TPO cDNA和寡核苷酸引物ZC7907(SEQ ID NO:10)和7693(SEQ ID NO:11)进行。10ng的模板DNA与5μl的2mM dNTPs、5μl的10×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)、0.2μlTaq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)、40pmole的每种引物加水至50μl的溶液结合。混合物在95℃下1分钟、50℃下2分钟、72℃下1分钟温育,进行30个周期,最后在72℃下温育十分钟。
PCR混合物用酚/氯仿提取,DNA用异丙醇沉淀,并重新悬浮在水中。如上所述,重新悬浮的DNA用BglII和PstI消化,回收316bp片段。此片段编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基22-126。
t-PA前导序列通过用EcoRI和BglII消化质粒并用凝胶电泳和离心分离所需的片段(124bp)从TPO100.229R制备。
为构建人TPO表达载体,分离编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基127-353的710bp PstI-EcoRI片段,并与PCR产生的片段、前导序列和以EcoRI消化并用碱性磷酸酶处理的Zem229R连接。连接的DNA用于转化感受态的大肠杆菌DH10bTM细胞。质粒定名为TPO201.229R。
TPO201序列在一种腺病毒的主要晚期启动子控制下置于表达载体中。质粒TPO201.229R用EcoRI消化,分离编码t-PA前导序列和TPO多肽的1149bp片段。这种DNA片段连接到载体pDX中(美国专利号4,959,318公开),此载体通过以EcoRI消化并用碱性磷酸酶处理线性化以构建质粒TPO201.pDX。
用TPO201.pDX和Zem229R转染并在5μM氨甲蝶呤中选择的BHK 570细胞的产量达每天10,000-15,000个单位TPO/ml。实施例5
构建了表达以SEQ ID NO:4的氨基酸残基235为末端的TPO多肽的载体。人TPO DNA序列用PCR诱变处理以导入两个终止密码子以及在氨基酸235密码子之后的EcoRI位点。10ng的模板DNA与5μl的2mM dNTPs、5μl的10×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)、0.2μl的Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)、40pmole的每种引物ZC7910(SEQ ID NO:12)和ZC7878(SEQ ID NO:13),加水至50μl的溶液混合。混合物在95℃下温育1分钟、50℃下2分钟、72℃下1分钟,进行30个循环,最后在72℃下温育10分钟。如上所述从反应混合物中分离DNA,并用PstI和EcoRI消化,回收编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基127-235的334bp片段。把此片段克隆进pIC19H并测序以确证其等同性。
然后制备表达载体。编码t-PA前导序列和SEQ ID NO:4的氨基酸残基22-126的440bp片段从EcoRI+vPstI的TPO201.229R消化物中分离。PCR产生的片段从EcoRI+PstI的pIC19H克隆消化物中分离。两个片段用以EcoRI消化的并用碱性磷酸酶处理的Zem229R连接。连接的DNA用于转化感受态大肠杆菌DH10bTM细胞。此质粒定名为TPO200.229R。
基本如实施例1所述,使用LipfectamineTM把质粒TPO200.229R转染进BHK570。转染前一天,以40,000个细胞/孔的密度把细胞平板接种于24孔平皿上。在500nM MTX中的初始选择后,集中的细胞产生1290U/ml/天TPO。在5μM MTX中扩增后,集中的细胞产生2330U/ml/天TPO。在50μM MTX中扩增的细胞集合体产生4700U/ml/天。
构建了包含腺病毒的主要晚期启动子、t-PA前导序列和人TPO 22-235序列的第二种表达载体。质粒TPO200.229R用EcoRI消化,回收编码t-PA前导序列和人TPO多肽的775bp片段。这种DNA片段连接到以EcoRI消化并以碱性磷酸酶处理以线性化的载体pDX中。连接的DNA转化进入大肠杆菌MC1061细胞。此质粒定名为TPO200.pDX。
TPO200.pDX与Zem229R共转染进入BHK570细胞。在500nM氨甲蝶呤中选择的细胞产量达10,000-15,000单位TPO/ml/天。实施例6
构建了表达以SEQ ID NO:4的氨基酸残基193为末端的TPO多肽的载体。人TPO DNA序列用PCR诱变处理以导入终止密码子以及氨基酸193的密码子之后的EcoRI位点。10ng的模板DNA与5μl的2mM dNTPs、5μl 10×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)、0.2μl Taq DNA聚合酶(BoehringerMannheim)、引物ZC8045(SEQ ID NO:14)和ZC7878(SEQ ID NO:13)各40pmole并加水至50μl的溶液混合。混合物在95℃温育下1分钟、50℃下2分钟、72℃下1分钟温育,进行30个循环,最后在72℃下10分钟。如上所述,DNA从反应混合物中分离,并用PstI和EcoR1消化,回收编码SEQ ID NO:4的氨基酸残基127-193的204bp片段。
为构建表达载体,分离的PCR产物用编码t-PA前导序列和SEQ IDNO:4(实施例5)的氨基酸残基22-126以及用EcoRI消化的并用碱性磷酸酶处理的Zem229R的EcoRI-PstI片段连接。连接的DNA用于转化感受态大肠杆菌DH10bTM细胞。此质粒定名为TPO202.229R。
如上所述,BHK570细胞用TPO202.229R转染并在500nM MTX中选择。集合的(pooled)细胞产生13,110U/ml TPO。在5μM的MTX中扩增后,集合的细胞产生20,850U/ml/天TPO。
把646bp EcoRI插入序列从TPO202.229R除去,并连接到用EcoRI消化并用碱性磷酸酶处理而线性化的pDX中。产生的定名为TPO202.pDX的载体与Zem229R或AAT.229R共转染进BHK570细胞。与TPO202.pDX和AAT.229R共转染并用500nM MTX扩增的细胞产生20,500U/ml/天TPO。在500nM MTX中扩增的TPO202.pDX/Zem229R的共感染产生17,000U/ml/天TPO。实施例7
t-PA前导序列的-5位置的精氨酸残基用谷氨酰胺残基取代。聚合酶链式反应使用作为模板的TPO100.229R、寡核苷酸引物ZC7367(SEQ ID NO:6)和ZC7956(SEQ ID NO:15)以及在实施例6中指定的反应条件下进行。如前所述分离DNA,并用EcoRI和BglII消化,回收编码修饰的t-PA前导序列的124bp片段。
为构建表达载体,把124bp PCR产物与得自以EcoRI消化并用碱性磷酸酶处理的TPO201.229R和Zem229R的BglII-EcoRI的编码TPO的片段连接。用连接的DNA转化感受态的大肠杆菌DH10bTM细胞。此质粒定名为TPO251.229R。
转染前一天,把BHK570细胞以40,000细胞/孔平板接种于24孔平板上。用TPO251.229R转染并在MTX中选择之后,集合的细胞产生1340U/mlTPO。在5μM MTX中扩增后,集合的细胞产生3940U/ml TPO实施例8
构建了表达具有实施例7的修饰的t-PA前导序列的以SEQ ID NO:4的残基235为末端的人TPO多肽的载体。TPO251.229R和TPO200.229R分别以PstI和EcoRI消化。分别回收441bp和335bp片段。两个片段用以EcoRI消化并用碱性磷酸酶处理的Zem229R连接。用连接的DNA转化感受态大肠杆菌MC1061细胞。此质粒定名为TPO250,229R。
把质粒TPO250.229R转染进BHK570细胞。在500nM MTX选择的集合的细胞产生870U/ml/天TPO。在50μM MTX中扩增的细胞集合体产生11,600U/ml/天。
把775bp的EcoRI插入序列从TPO250,229R除去,并与用EcoRI线性化并用碱性磷酸酶处理的pDX连接。产生的载体定名为TPO250.pDX。用TPO250.pDX和Zem229R共转染BHK570细胞。在5μM MTX中扩增的细胞集合体产生21,900U/ml/天TPO。实施例9
构建了表达具有实施例7的修饰t-PA前导序列、以SEQ ID NO:4的残基193为末端的人TPO多肽的载体。TPO251.229R和TPO200.229R中的每一个用PstI和EcoRI消化。分别回收441bp和205bp片段。两片段用以EcoRI消化的并以碱性磷酸酶处理的Zem229R连接。用连接的DNA转化感受态大肠杆菌MCl061细胞。此质粒定名为TPO252,229R。
把质粒TPO252.229R转染进BHK570细胞。在500nM MTX中选择后,集合的细胞产生8500U/ml TPO。在5μM MTX中扩增后,集合的细胞产生31,300U/ml/天。
TPO252序列从质粒TPO252,229R分离,并与EcoRI消化的、碱性磷酸酶处理的pDX连接以构建TPO252.pDX。细胞用TPO252.pDX和Zem229R共转染。在5nM MTX中扩增后,每个克隆产生多达30,000U/ml/天TPO。实施例10
TPO活性单位通过在TPO依赖细胞系上测定致有丝分裂的活性来确定。用小鼠TPO表达载体pZGmp1-1081转染的BHK570细胞系在无血清培养基中生长。收集条件培养基,并使用这种标准溶液作出渐近的致有丝分裂活性曲线。靶细胞是BaF3/MPLRT.1细胞(IL-3依赖性细胞稳定地表达转染的I型小鼠MPL受体;按照布达佩斯条约于1994年9月28日保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,指定的保藏号为CRL 11723)。最大活性的1/2点(16条曲线的平均值)定为50U/ml。计算出起始的标准溶液包含26,600U/ml小鼠TPO。
为制备试验样品,培养物上清液或纯化的蛋白质制剂用添加了57μM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、PSN抗生素混合物、10mMHEPES和10%热的非灭活胎牛血清的RPMI 1840稀释,通常使用8-24倍稀释度。简言之,100μl稀释的试验样品或标准样品和100μl BaF3细胞(最后的细胞数目加到大约为10,000细胞/孔)在96孔平板的孔中混合。内标包括用于小鼠TPO测定的8份100U/ml小鼠TPO的2倍稀释液或用于人TPO测定的8份150U/ml小鼠TPO的2倍稀释液。向每个孔中加入2μl 3H-胸腺嘧啶核甙(1μCi/μl;Amersham),平板在37℃下温育过夜。
将每个平板的各孔的内含物用Packard器转移到滤膜/平板上。滤膜用水洗涤8次,干燥并计数。每个样品孔的TPO活性单位通过和标准曲线比较确定。
从以上所述可知:尽管本文为了例证说明的目的描述了本发明的特定的实施方案,但可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改修饰。因此,本发明的范围除了按照所附的权利要求的范围外不受限制。
序列表(1)一般信息:
(i)申请人:ZymoGenetics,Inc.
1201 Eastlake Avenue East
Seattle
美国98102
(ii)发明名称:分泌产生血小板生成素多肽的方法
(iii)序列数:15
(iv)通讯地址:
(A)收信A:ZymoGenetics,Inc.
(B)街道:1201 Eastlake Avenue East
(C)城市:Seattle
(D)州:WA
(E)国家:美国
(F)邮区代码:98102
(v)计算机可读形式:
(A)介质类类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release1.0#,版本#1.25
(vi)当前的申请数据:
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类号:
(viii)律师/代理人信息:
(A)姓名:Parker,Gary E
(B)登记号:31,648
(C)证书号:94-11PC
(ix)电信信息:
(A)电话:206-442-6673
(B)传真:206-442-6678(2)SEQ ID NO:1信息:
(i)序列特征:
(A)长度:1486个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(ix)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:105..1241
(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC CCTTCTCCAC CCGGACAGAG TCCTTGGCCC ACCTCTCTCC 60CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC CTCC ATG GCC CCA GGA 116
Met Ala Pro Gly
1AAG ATT CAG GGG AGA GGC CCC ATA CAG GGA GCC ACT TCA GTT AGA CAC 164Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr Ser Val Arg His5 10 15 20CTG GCC AGA ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GCG GCC ATG CTT CTT 212Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu
25 30 35GCA GTG GCA AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT GAC 260Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp
40 45 50CCC AGA CTC CTA AAT AAA CTG CTG CGT GAC TCC CAC CTC CTT CAC AGC 308Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser
55 60 65CGA CTG AGT CAG TGT CCC GAC GTC GAC CCT TTG TCT ATC CCT GTT CTG 356Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu
70 75 80CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA 404Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu85 90 95 100CAG AGC AAG GCA CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG 452Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu
105 110 115GGA GTG ATG GCA GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCC TCC TGC CTC TCA TCC 500Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser
120 125 130CTC CTG GGA CAG CTT TCT GGG CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGG GCC CTG 548Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu
135 140 145CAG GGC CTC CTA GGA ACC CAG CTT CCT CTA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 596Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala
150 155 160CAC AAG GAC CCC AAT GCC CTC TTC TTG AGC TTG CAA CAA CTG CTT CGG 644His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg165 170 175 180GGA AAG GTG CGC TTC CTG CTT CTG GTA GAA GGT CCC ACC CTC TGT GTC 692Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys Val
185 190 195AGA CGG ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC AGT ACT TCT CAA CTC 740Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu
200 205 210CTC ACA CTA AAC AAG TTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACG 788Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr
215 220 225AAC TTC AGT GTC ACA GCC AGA ACT GCT GGC CCT GGA CTT CTG AGC AGG 836Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg
230 235 240CTT CAG GGA TTC AGA GTC AAG ATT ACT CCT GGT CAG CTA AAT CAA ACC 884Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr245 250 255 260TCC AGG TCC CCA GTC CAA ATC TCT GGA TAC CTG AAC AGG ACA CAC GGA 932Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly
265 270 275CCT GTG AAT GGA ACT CAT GGG CTC TTT GCT GGA ACC TCA CTT CAG ACC 980Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr
280 285 290CTG GAA GCC TCA GAC ATC TCG CCC GGA GCT TTC AAC AAA GGC TCC CTG 1028Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu
295 300 305GCA TTC AAC CTC CAG GGT GGA CTT CCT CCT TCT CCA AGC CTT GCT CCT 1076Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro
310 315 320GAT GGA CAC ACA CCC TTC CCT CCT TCA CCT GCC TTG CCC ACC ACC CAT 1124Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His325 330 335 340GGA TCT CCA CCC CAG CTC CAC CCC CTG TTT CCT GAC CCT TCC ACC ACC 1172Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr
345 350 355ATG CCT AAC TCT ACC GCC CCT CAT CCA GTC ACA ATG TAC CCT CAT CCC 1220Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro
360 365 370AGG AAT TTG TCT CAG GAA ACA TAGCGCGGGC ACTGGCCCAG TGAGCGTCTG 1271Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr
375CAGCTTCTCT CGGGGACAAG CTTCCCCAGG AAGGCTGAGA GGCAGCTGCA TCTGCTCCAG 1331ATGTTCTGCT TTCACCTAAA AGGCCCTGGG GAAGGGATAC ACAGCACTGG AGATTGTAAA 1391ATTTTAGGAG CTATTTTTTT TTAACCTATC AGCAATATTC ATCAGAGCAG CTAGCGATCT 1451TTGGTCTATT TTCGGTATAA ATTTGAAAAT CACTA 1486(2)SEQ ID NO:2信息:
(i)序列特征:
(A)长度:379个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:蛋白质
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:Met Ala Pro Gly Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr1 5 10 15Ser Val Arg His Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala
20 25 30Ala Met Leu Leu Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala
35 40 45Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His
50 55 60Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser65 70 75 80Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys
85 90 95Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser
100 105 110Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser
115 120 125Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu
130 135 140Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly145 150 155 160Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln
165 170 175Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro
180 185 190Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser
195 200 205Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly
210 215 220Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly225 230 235 240Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln
245 250 255Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
260 265 270Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr
275 280 285Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn
290 295 300Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro305 310 315 320Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu
325 330 335Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp
340 345 350Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met
355 360 365Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr
370 375(2)SEQ ID NO:3信息:
(i)序列特征:
(A)长度:1062个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA(ix)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:1..1059(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 48Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 96Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val
20 25 30CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 144Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
35 40 45CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 192Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
50 55 60GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 240Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65 70 75 80GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 288Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
85 90 95GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 336Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
100 105 110CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 384Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
115 120 125CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 432Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130 135 140CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145 150 155 160CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
165 170 175CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 576Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
180 185 190AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT 624Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
195 200 205GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 672Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
210 215 220TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG 720Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225 230 235 240GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA 768Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly
245 250 255ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG 816Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
260 265 270GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC 864Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
275 280 285CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT 912Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
290 295 300ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC 960Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1008His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
325 330 335CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA 1056Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
340 345 350GGG TAA 1062Gly(2)SEQ ID NO:4信息:
(i)序列特征
(A)长度:353个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:蛋白质
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4:Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val
20 25 30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
35 40 45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
50 55 60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
85 90 95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
100 105 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
115 120 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130 135 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145 150 155 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
210 215 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225 230 235 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly
245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
340 345 350Gly(2)SEQ ID NO:信息:5:
(i)序列特征:
(A)长度:35个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(ix)特征:
(A)名称/关键词:修饰位点
(B)位置:29
(D)其它信息:/注=“这一氨基酸可以是任何氨基酸”。
(ix)特征:
(A)名称/关键词:修饰位点
(B)位置:31
(D)其它信息:/注=“这一氨基酸可以是任何氨基酸”。
(ix)特征:
(A)名称/关键词:修饰位点
(B)位置:33
(D)其它信息:/注=“这一氨基酸可以是任何氨基酸”。
(ix)特征:
(A)名称/关键词:修饰位点
(B)位置:34
(D)其它信息:/注=“这一氨基酸可以是Ala、Arg或Lys”。
(xi)序列描述:SEQ ID NO:5:Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Xaa Phe Xaa Arg
20 25 30Xaa Xaa Arg
352)SEQ ID NO:6信息:
(i)序列特征:
(A)长度:36个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(vii)直接来源:
(B)克隆:ZC7367
(xi)序列描述:SEQ ID NO:6:GTCACCGGG AATTCATCGA TATCTAGATA TTAAGA 36(2)SEQ ID NO:7信息:
(i)序列特征:
(A)长度:43个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(vii)直接来源:
(B)克隆:ZC7738
(xi)序列描述:SEQ ID NO:7:CCTTCAGAT CTGCGTCCTC TTCTGAACTC GGCATGATTA AGA 43(2)SEQ ID NO:8信息:
(i)序列特征
(A)长度:43个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(vii)直接来源:
(B)克隆:ZC7365
(xi)序列描述:SEQ ID NO:8:GCAAGACTAA CTCTGAGATC TCCCGTAGCT CCTGCCATTA AGA 43(2)SEQ ID NO:9信息:
(i)序列特征:
(A)长度:37个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(vii)直接来源:
(B)克隆:ZC7645
(xi)序列描述:SEQ ID NO:9:TGTAGAGGAA GCTGGGTTCC TAGGAGGCCC ATTAAGA 37(2)SEQ ID NO:10信息:
(i)序列特征:
(A)长度:43个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(vii)直接来源:
(B)克隆:ZC7907
(xi)序列描述:SEQ ID NO:10:GCAAGGCTAA CGCTGAGATC TCCGGCTCCT CCTGCTATTA AGA 43(2)SEQ ID NO:11信息:
(i)序列特征
(A)长度:28个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
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(xi)序列描述:SEQ ID NO:11:GGATCCTTGT GAGCTGTGGT CATTAAGA 28(2)SEQ ID NO:12信息:
(i)序列特征:
(A)长度:46个碱基对
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(i)序列特征:
(A)长度:27个碱基对
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(i)序列特征:
(A)长度:43个碱基对
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(i)序列特征:
(A)长度:43个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(vii)直接来源:
(B)克隆:ZC7956
(xi)序列描述:SEQ ID NO:15:GCCTTCAGAT CTGCGTCCTC TTTGGAACTC GGCATGATTA AGA 43
Claims (26)
1.一种DNA构建体,该构建体包含:
编码多肽融合体的第一DNA片段,所述融合体包含连接到血小板生成素(TPO)多肽上的氨基-末端分泌肽,所述连接的肽和多肽限定一个在它们的接合处的蛋白水解的裂解位点;和
一个或多个附加的DNA片段,这些片段可操作连接到所说的第一DNA片段上以利于其转录,其中所说的分泌肽选自:
天然哺乳动物的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)分泌肽;和
为增加接合处蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物t-PA分泌肽。
2.按照权利要求1的DNA构建体,其中所说的分泌肽是人类t-PA分泌肽。
3.按照权利要求1的DNA构建体,其中所说的分泌肽包含SEQ ID NO:5所示的中作为被显示的氨基酸残基的序列,在SEQ ID NO:5中Xaa(29),Xaa(31)和Xaa(33)分别为任何氨基酸,并且Xaa(34)是丙氨酸,精氨酸或赖氨酸。
4.按照权利要求3的DNA构建体,其中Xaa(29)和Xaa(31)分别为除赖氨酸,精氨酸或组氨酸之外的任何氨基酸。
5.按照权利要求3的DNA构建体,其中Xaa(33)是甘氨酸。
6.按照权利要求3的DNA构建体,其中Xaa(34)是精氨酸或赖氨酸。
7.按照权利要求3的DNA构建体,其中Xaa(29)和Xaa(31)分别为天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或丙氨酸;Xaa(33)是甘氨酸;并且Xaa(34)是精氨酸。
8.按照权利要求3的DNA构建体,其中Xaa(29)是精氨酸或谷氨酸,Xaa(31)是精氨酸或谷氨酰胺,Xaa(33)是甘氨酸,并且Xaa(34)是精氨酸,其条件是Xaa(29)和Xaa(31)至少一个不是精氨酸。
9.按照权利要求1的DNA构建体,其中所说的TPO多肽包含144至335个氨基酸残基。
10.按照权利要求1的DNA构建体,其中所说的TPO多肽包含144至191氨基酸残基。
11.按照权利要求1的DNA构建体,其中所说的TPO多肽包含选自下组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到缬氨酸(173);
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到精氨酸(185);
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到天冬酰胺(193);
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到苯丙氨酸(207);和
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到谷氨酰胺(235)。
12.按照权利要求1的DNA构建体,其中所说的TPO多肽是人类TPO多肽。
13.按照权利要求1的DNA构建体,该构建体还包含一个选择性标记。
14.一种DNA构建体,该构建体包含编码实质上包含连接到144至335个氨基酸的TPO多肽上的SEQ ID NO:5所示的氨基-末端分泌肽之多肽融合体的第一DNA片段,在SEQ ID NO:5中Xaa(29)是精氨酸或谷氨酸,Xaa(31)是精氨酸或谷氨酰胺,Xaa(33)是甘氨酸,并且Xaa(34)是丙氨酸或精氨酸,其中所说的第一DNA片段可操作连接到有利于其转录的一个或多个附加的DNA片段上。
15.按照权利要求14的DNA构建体,其中所说的TPO多肽包含144至191个氨基酸残基。
16.按照权利要求14的DNA构建体,其中所说的TPO多肽是人类TPO多肽。
17.按照权利要求14的DNA构建体,其中所说的TPO多肽包含选自下组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到缬氨酸(173);
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到精氨酸(185);
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到天冬酰胺(193);
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到苯丙氨酸(207);和
SEQ ID NO:4的丝氨酸(22)到谷氨酰胺(235)。
18.按照权利要求14的DNA构建体,该构建体还包含一个选择性标记。
19.一种含有DNA构建体的培养的真核细胞,所说构建体包含:
编码多肽融合体的第一DNA片段,所述融合体包含连接到血小板生成素(TPO)多肽上的氨基-末端分泌肽,所述融合序列限定一个在它们的接合处的蛋白水解的裂解位点;和
一个或多个附加的DNA片段,这些片段可操作连接到所说的第一DNA片段上以利于其转录,其中所说的分泌肽选自:
天然哺乳动物的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)分泌肽;和
为增加接合处蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物t-PA分泌肽。
20.按照权利要求19的酵母细胞。
21.按照权利要求20的酵母细胞,其中所说的细胞是啤酒糖酵母细胞。
22.按照权利要求20的酵母细胞,其中所说的细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。
23.按照权利要求19的培养的哺乳动物细胞。
24.按照权利要求23的哺乳动物细胞,该细胞是啮齿动物细胞。
25.按照权利要求23的哺乳动物细胞,该细胞是肾细胞。
26.一种产生血小板生成素多肽的方法,该方法包括以下步骤:
(a)培养含有DNA构建体的真核细胞,所说构建体包含:编码多肽融合体的第一DNA片段,所述融合体包含连接到血小板生成素(TPO)多肽上的氨基-末端分泌肽,所述连接的肽和多肽限定一个在它们的接合处的蛋白水解的裂解位点;和一个或多个附加的DNA片段,这些片段可操作连接到所说的第一DNA片段上以利于其转录,其中所说的分泌肽选自:
天然哺乳动物的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)分泌肽;和
为增加接合处蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物t-PA分泌肽。
其中所说的细胞表达所说的第一DNA片段,并且所说的TPO多肽从所说的细胞分泌;和
(b)选择性地回收所说的TPO多肽。
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