JP2008508310A - がんおよび自己免疫障害を治療するためのｉｌ−２８およびｉｌ−２９の使用法 - Google Patents

がんおよび自己免疫障害を治療するためのｉｌ−２８およびｉｌ−２９の使用法 Download PDF

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Abstract

IL-28およびIL-29分子を用いてがんおよび自己免疫障害を有する患者を治療するための方法。IL-28およびIL-29分子は、ヒトIL-28またはIL-29分子のポリペプチド配列に相同性を有するポリペプチドならびにIL-28およびIL-29の機能活性を有するポリペプチドに融合したタンパク質を含む。これらの分子は単剤療法としてまたはその他公知のがんおよび/または自己免疫治療法と組み合わせて使用することができる。

Description

発明の背景
サイトカインは一般に、造血系細胞の増殖もしくは分化を刺激するかまたは体内の免疫および炎症応答機構に関与する。造血に影響を及ぼすサイトカインの例は、赤血球の増殖を刺激するエリトロポエチン(EPO)；巨核球系細胞の増殖を刺激するトロンボポエチン(TPO)；および好中球の増殖を刺激する顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である。これらのサイトカインは、貧血症、血小板減少症、および好中球減少症に苦しむ患者における正常な血液細胞レベルの回復、またはがんに対する化学療法の受容において有用である。
インターロイキンは免疫応答を媒介するサイトカインのファミリーである。免疫応答の中枢は、多くのサイトカインおよび抗原に対する適応免疫を生み出すT細胞である。T細胞により産生されるサイトカインは、タイプ1およびタイプ2に分類されている(Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998(非特許文献1))。タイプ1サイトカインには、IL-2、IFN-γ、LT-αが含まれ、そして炎症応答、ウイルス免疫、細胞内寄生体免疫性および同種移植拒絶に関与している。タイプ2サイトカインはIL-4、IL-5、IL-6、IL-10およびIL-13を含み、体液性応答、寄生虫免疫性およびアレルギー応答に関与する。タイプ1とタイプ2との間の共有サイトカインには、IL-3、GM-CSFおよびTNF-αが含まれる。T細胞集団を生成するタイプ1およびタイプ2が異なった型の炎症組織中に選択的に移動することを示すある証拠が存在する。
免疫系は病原体、すなわち細菌、ウイルス、真菌などにより引き起こされる疾患に対する、ならびに身体の自己の細胞および組織の異常増殖により引き起こされる疾患(すなわちがん性の腫瘍)に対する身体の主要な防御である。通常、免疫系は身体の正常細胞または「自己」と外来性病原体または異常細胞もしくは「非自己」とを識別することができる。免疫系が自身の身体に反応することを抑制するプロセスは寛容といわれる。免疫系が「自己」を正常と認識する能力を喪失し、組織または細胞に対するその後の応答が寛容の喪失、つまり自己免疫の状態を引き起こすことがある。自己免疫から起こる病態は多くの場合、深刻な臨床的帰結を有し、世界中で、とりわけ先進国で主要な健康問題の1つである。
そのような自己免疫障害の1例が多発性硬化症(MS)、つまり中枢神経系(CNS)の進行性疾患である。MS患者では、患者自身の免疫系がミエリン、つまり脳および脊椎中の神経線維を取り囲んで絶縁する保護層を破壊する。ミエリン鞘の破壊は神経伝達の混乱および神経線維に対する瘢痕性損傷を引き起こす。この結末が刺痛または知覚麻痺、不明瞭な発語、視覚障害、眩暈などを含め、罹患患者における多数の症状の発現である。疾患の間に、運動の障害につながる四肢の強度喪失が起こり、最も深刻な場合には、手足の麻痺状態にいたる。臨床診断に基づけば、脳または脊椎のどの部分が影響を受けているか、重症度、発病の頻度などに基づき、現在、4つのタイプのMS分類が存在している。
MSに対する現在の療法としては、コルチコステロイド薬(急性発症の症状を軽減するため)、ならびにIFN-βおよびNovantrone(登録商標)のようなその他の薬物が挙げられる。Novantrone(登録商標)は後期MS患者に対し、とりわけその他の療法が効かなかった患者に対し承認されている。Novantrone(登録商標)は大部分の細胞にとって細胞傷害性であり、したがって予測されるように多くの副作用を有し、最大の治療効果に必要とされる用量では有毒である。IFN-βは同様に有毒であり、MS患者における薬物の投与量は限定的である。さらに、これらの薬物の連続使用は同一薬物のさらなる使用に対する患者の感受性を減らし、それによって長期療法としてのこれらの薬物の使用能を制限することが示されている。
治療の観点から、特に興味深いのは、インターフェロンである(インターフェロンに関する概説はDe Maeyer and De Maeyer-Guignard, The Cytokine Handbook, 3rd Edition, Thompson (ed.)中の「Interferons」, pages 491-516 (Academic Press Ltd. 1998)(非特許文献2)によって、およびWalsh, Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology, pages 158-188 (John Wiley & Sons 1998)(非特許文献3)によって提供されている)。インターフェロンは様々な生物学的活性を示し、ある種の自己免疫疾患、特定のがんの治療に、ならびにウイルス、細菌、真菌、および原生動物を含めて、感染性因子に対する免疫応答の増強に有用である。今日までに、6形態のインターフェロンが同定されており、これらは2つの主要な群に分類されている。いわゆる「タイプI」IFNはIFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-δ、およびインターフェロン-τを含む。現在、IFN-γおよびIFN-αの1サブクラスのみがタイプII IFNである。
同じ先祖遺伝子に由来すると考えられるタイプI IFNは、同じ細胞表面受容体によって作用するのに十分な類似構造を保持していた。ヒトIFN-α/β受容体のα鎖は細胞外N末端ドメインを含んでおり、これはクラスIIサイトカイン受容体の特徴を持っている。IFN-γはタイプI IFNとまたはタイプII IFN-αサブタイプと有意な相同性を共有していないが、タイプI IFNといくつかの生物学的活性を共有している。
臨床医はインターフェロンを用いて幅広い状態を治療することにより、そのタンパク質の複合的な活性を巧みに利用している。例えば、IFN-αの1形態は50を超える国々で有毛細胞白血病、腎細胞がん、基底細胞がん、悪性黒色腫、AIDSに関連するカポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、尖圭コンジローマ、慢性B型肝炎、C型肝炎、慢性D型肝炎、および慢性非A型、非B/C型肝炎などの医学的状態の治療に用いることを承認されている。米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)は多発性硬化症、つまり神経系の慢性疾患を治療するためのIFN-βの使用を承認している。IFN-γは慢性肉芽腫性疾患を治療するために使われており、そのなかでインターフェロンは患者の免疫応答を増強して感染細菌性、真菌性、および原生動物性の病原体を破壊している。臨床試験から同様に、IFN-γがAIDS、リーシュマニア症、およびらい腫らいの治療で有用でありうることが示唆されている。
IL-28A、IL-28B、およびIL-29は、タイプIインターフェロンに対し配列相同性をおよびIL-10に対しゲノム相同性を有する最近発見された新たなタンパク質ファミリーを含む。この新たなファミリーは共有PCT出願WO 02/086087(特許文献1)およびSheppard et al., Nature Immunol. 4:63-68, 2003(非特許文献4)で十分に記述されており、この両者は参照により本明細書に組み入れられる。機能的には、IL-28およびIL-29は細胞中で抗ウイルス状態を誘導するその能力がタイプI INFと似ているが、タイプI IFNとは異なり、それらはある種のB細胞系に対し抗増殖活性を示さない。
成熟T細胞は、つまり、抗原またはその他の刺激物により活性化されて、例えば、サイトカイン、生化学的シグナル伝達分子、またはT細胞集団の運命にさらに影響を及ぼす受容体を産生することができる。
B細胞は、B細胞受容体を含むその細胞表面の受容体およびその他の補助分子を介し活性化されて、サイトカインの産生などの、補助細胞機能を行うことができる。B細胞活性化は、腫瘍細胞の免疫原性細胞表面タンパク質に結合し、補体を介した細胞溶解を開始し、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を目的にNK細胞もしくはマクロファージを腫瘍に架橋し、生存を阻むことによりもしくはアポトーシスシグナルを誘導することにより腫瘍細胞増殖を妨害し、またはAPCによる腫瘍抗原の取込みや提示を促進させることにより免疫原性を増大しうる抗体の産生を引き起こす。このように、インビボでのB細胞応答の増強は、抗腫瘍活性を促進させる可能性がある(Blattman et al., Science, 305:200-205 (July 9, 2004)(非特許文献5))。
したがって、腫瘍の誘導または進行に対する生来の宿主防御を増補できる作用物質は、従前の方法による細胞傷害性の副作用なしに、寛解率を増大することや患者の生存性を増強することができる。
本発明は、単剤療法としてまたは化学療法、放射線療法、小分子もしくはその他の生物製剤と組み合わせて使用できるIL-28A、IL-28B、またはIL-29組成物を投与することにより固形腫瘍、リンパ腫、および自己免疫障害を治療するためのそのような方法を提供する。これらのおよびその他の用途は、本明細書中の教示から当業者には明らかなはずである。
PCT出願WO 02/086087 Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998 De Maeyer and De Maeyer-Guignard, The Cytokine Handbook, 3rd Edition, Thompson (ed.)中の「Interferons」, pages 491-516 (Academic Press Ltd. 1998) Walsh, Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology, pages 158-188 (John Wiley & Sons 1998) Sheppard et al., Nature Immunol. 4:63-68, 2003 Blattman et al., Science, 305:200-205 (July 9, 2004)
発明の説明
以下に続く説明のなかで、いくつかの用語が広く使用される。以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。
特別の定めのない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」、「その(the)」および「少なくとも1つの(at least one)」は同じ意味で使用されており、1つまたは2つ以上を意味する。
「親和性タグ」という用語は、第2のポリペプチドに付着されて、第2のポリペプチドの精製もしくは検出を与えうるか、または第2のポリペプチドの基質への付着部位を与えうるポリペプチドセグメントを示すよう本明細書において使用される。主に、抗体またはその他の特異的結合剤が利用可能となる任意のペプチドまたはタンパク質を親和性タグとして使用することができる。親和性タグには、ポリヒスチジン領域、プロテインA (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67;31, 1988)、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985)、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, 1988)、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。一般に、Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を参照されたい。親和性タグをコードするDNAは、商業的供給者(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手できる。
「対立遺伝子変異体」という用語は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の2つまたはそれ以上の代替的形態のいずれかを示すよう本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然に生じ、集団内に表現型多型をもたらすことがある。遺伝子突然変異はサイレント(コードされたポリペプチドの変化がない)であってもよくまたは改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがある。対立遺伝子変異体という用語は同様に、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すよう本明細書において使用される。
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、ポリペプチド内の位置を示すよう本明細書において使用される。文脈上許容される場合、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または一部分に関して近接していることまたは相対的位置を示すよう使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端側に位置するある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置するが、必ずしも全長ポリペプチドのカルボキシル末端にあるとは限らない。
「がん」または「がん細胞」という用語は、それを正常な組織または組織細胞と区別する特徴を保有する新生物に見られる組織または細胞を示すよう本明細書において使用される。そのような特徴のなかには、以下に限定されることはないが、退形成の程度、形状の不規則性、細胞の輪郭の不明瞭さ、核のサイズ、核または細胞質の構造の変化、その他の表現型の変化、がん状態または前がん状態を示す細胞内タンパク質の存在、有糸分裂数の増加、および転移能が含まれる。「がん」に関する単語には、がん腫、肉腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、および硬性がん、悪性転換、新生物などが含まれる。
「相補体/抗-相補体対」という用語は、適切な条件の下で非共有的に会合した、安定な対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補体/抗-相補体対の基本型メンバーである。その他の例示的な相補体/抗-相補体対には、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンもしくはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対などが含まれる。続いて起こる相補体/抗-相補体対の解離が望ましい場合、相補体/抗-相補体対は<109 M-1の結合親和性を有することが好ましい。
「ポリヌクレオチド分子の相補体」という用語は、参照配列と比べて相補的な塩基配列および逆の配向性を有するポリヌクレオチド分子を示す。
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、1つまたは複数の縮重コドン(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に照らして)を含むヌクレオチドの配列を示す。縮重コドンは異なるヌクレオチドトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
「発現ベクター」という用語は、関心対象のポリペプチドをコードするセグメントを、その転写をもたらす付加セグメントに作動可能に連結させて含む、線状または環状のDNA分子を示すよう使用される。そのような付加セグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み、同様に1つまたは複数の複製起点、1つまたは複数の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。発現ベクターは一般的にプラスミドもしくはウイルスDNAに由来し、または両者の要素を含むことができる。
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去されており、したがってその他の異質なまたは不要なコード配列を含まず、遺伝子組換えタンパク質の産生系の中で用いるのに適した形で存在することを示す。そのような単離された分子は、その天然環境から分離されている分子であり、cDNAおよびゲノムクローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常結び付いているその他の遺伝子を含まないが、プロモーターおよびターミネーターなどの天然に存在する5'および3'非翻訳領域を含んでもよい。関連領域の同定は当業者には明らかと考えられる(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985を参照されたい)。
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、血液および動物組織とは別であるような、その生来の環境以外の条件で見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形態では、単離されたポリペプチドは、その他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形態で、すなわち95%を超える純度、より好ましくは99%を超える純度でポリペプチドを供与することが好ましい。このような文脈で使用される場合、「単離された」という用語は、二量体または代替的にグリコシル化されたもしくは誘導体化された形態などの、代替的な物理的形態での同一ポリペプチドの存在を排除しない。
「レベル」という用語はNK細胞、T細胞、具体的には細胞傷害性T細胞、B細胞などのような、免疫細胞のことをいう場合、レベルの増加は細胞数の増加または細胞機能の活性亢進のいずれかである。
「新生物(の)」という用語は、細胞のことをいう場合、特に増殖がコントロール不能であり進行性である組織において、新規な且つ異常な増殖を起こし、結果的に新生物をもたらす細胞を示す。新生物細胞は悪性、すなわち侵襲性および転移性、または良性のいずれかであり得る。
「作動可能に連結される」という用語は、DNAセグメントのことをいう場合、セグメントは、それらがその意図する目的に対し協調的に機能する、例えば、転写がプロモーターで始まり、コードセグメントを経由してターミネーターまで進むように配置されることを示す。
「ポリヌクレオチド」は、5'から3'末端の方向に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖の重合体である。ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを含み、天然源から単離されてもよく、インビトロで合成されてもよく、または天然分子および合成分子の組合せから調製されてもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(「bp」と略される)、ヌクレオチド(「nt」)、またはキロベース(「kb」)として表される。文脈上許容される場合、後者の2つの用語は、一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記述することができる。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全長を示すように用いられており、「塩基対」という用語に等価であると理解されよう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さがわずかに異なってもよいことやその末端は酵素的切断の結果として互い違いであってよく、したがって二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対とならなくてもよいことを当業者は認識すると考えられる。
「ポリペプチド」は、天然によりまたは合成により産生されたかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の重合体である。約10アミノ酸残基に満たないポリペプチドは一般に「ペプチド」といわれる。
「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を与えるDNA配列を含んだ遺伝子の一部分を示すよう当技術分野で認識されている意味で本明細書において使用される。プロモーター配列は遺伝子の5'非コード領域に見られることが多いが、必ずしもそうとは限らない。
「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は糖質基などの、非ペプチド成分を含んでもよい。糖質およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加されることができ、細胞の種類によって異なると考えられる。タンパク質はそのアミノ酸の骨格構造という点で本明細書において定義されており、糖質基などの置換基は一般的に特定されないが、それでもなお存在してもよい。
「受容体」という用語は、生物活性分子(すなわち、リガンド)に結合し、細胞上でリガンドの効果を媒介する細胞会合タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと、典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインとを含む、多ペプチド構造によって特徴付けられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞中のエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体の立体構造変化をもたらす。この相互作用が今度は細胞代謝の変化を引き起こす。受容体-リガンド相互作用に関連した代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解およびリン脂質の加水分解が含まれる。一般に、受容体は膜結合の、細胞質のまたは核の受容体；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β-アドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリトロポエチン受容体およびIL-6受容体)であり得る。
「分泌シグナル配列」という用語は、ポリペプチドを合成する細胞の分泌経路を通じ、より大きなポリペプチドの成分として、より大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を示す。このより大きなポリペプチドは、通常、分泌経路を通じた輸送の間に切断されて、分泌ペプチドが取り除かれる。
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動法)により測定された重合体の分子量および長さは、近似値であることが理解されよう。そのような値が「約」Xまたは「およそ」Xとして表現される場合、Xの表示値は±10%の範囲で正確であることが理解される。
「zcyto20」、「zcyto21」、「zcyto22」は、それぞれヒトIL-28A、ヒトIL-29、およびヒトIL-28Bに対する以前の呼称であり、本明細書において同義的に使用される。IL-28Aのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示されている。IL-29のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4に示されている。IL-28Bのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6に示されている。これらの配列は、参照により本明細書に組み入れられる、同一出願人、ZymoGenetics, Inc.によるPCT出願WO 02/086087で十分に記述されている。
「zcyto24」および「zcyto25」は、マウスIL-28に対する以前の呼称であり、それぞれSEQ ID NO:7、8、9、10に示されている。このポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、参照により本明細書に組み入れられる、同一出願人、ZymoGenetics, Inc.によるPCT出願WO 02/086087で十分に記述されている。
「zcytor19」は、IL-28受容体α-サブユニットに対する以前の呼称であり、SEQ ID NO:11に示されている。このポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、参照により本明細書に組み入れられる、Schering, Inc.を代理するPCT出願WO 02/20569およびZymoGenetics, Inc.に付与されたPCT出願WO 02/44209で記述されている。「IL-28受容体」は、ヘテロ二量体の受容体を形成するIL-28α-サブユニットおよびCRF2-4サブユニットを意味する。
本明細書において引用される全ての参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。
A. IL-28、IL-29およびその受容体
IL-28に言及する場合、この用語はIL-28AとIL-28Bの両方を意味するものとする。以前には、IL-28Aはzcyto20 (SEQ ID NO:1および2)と称されており、これらの用語は本明細書において同義的に使用され、IL-29はzcyto21 (SEQ ID NO: 3および4)と称されており、これらの用語は本明細書において同義的に使用され、およびIL-28Bはzcyto22 (SEQ ED NO:5および6)と称されており、これらの用語は本明細書において同義的に使用される(PCT出願WO 02/086087およびSheppard et al., 前記を参照されたい)。IL-28のマウス相同分子種はzcyto24 (SEQ ID NO:7および8)、zcyto25 (SEQ ID NO:9および10)と以前には称されていた。
野生型IL-28A遺伝子は、SEQ ID NO:2に示される200アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Aのシグナル配列は、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基-25 (Met)からアミノ酸残基-1 (Ala)を含むと予測することができる。IL-28Aの成熟ペプチドはアミノ酸残基1 (Val)で始まる。IL-28Aヘリックスは次のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:2に示される、アミノ酸残基24 (Leu)〜40 (Glu)により定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基58 (Thr)〜65 (Gln)により定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基69 (Arg)〜85 (Ala)により定義され；ヘリックスDはアミノ酸残基95 (Val)〜114 (Ala)により定義され；ヘリックスEはアミノ酸残基126 (Thr)〜142 (Lys)により定義され；およびヘリックスFはアミノ酸残基148 (Cys)〜169 (Ala)により定義される。
野生型IL-29遺伝子は、SEQ ID NO:4に示される200アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-29のシグナル配列は、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:119、またはSEQ ID NO:121のアミノ酸残基-19 (Met)からアミノ酸残基-1 (Ala)を含むと予測することができる。IL-29の成熟ペプチドはアミノ酸残基1 (Gly)で始まる。IL-29はPCT出願WO 02/02627で記述されている。IL-29ヘリックスは次のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:4に示される、アミノ酸残基30 (Ser)〜44 (Leu)により定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基57 (Asn)〜65 (Val)により定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基70 (Val)〜85 (Ala)により定義され；ヘリックスDはアミノ酸残基92 (Glu)〜114 (Gln)により定義され；ヘリックスEはアミノ酸残基118 (Thr)〜139 (Lys)により定義され；およびヘリックスFはアミノ酸残基144 (Gly)〜170 (Leu)により定義される。
野生型IL-28B遺伝子は、SEQ ID NO:6に示される200アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Bのシグナル配列は、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基-21 (Met)からアミノ酸残基-1 (Ala)を含むと予測することができる。IL-28Bの成熟ペプチドはアミノ酸残基1 (Val)で始まる。IL-28Bヘリックスは次のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:6に示される、アミノ酸残基8 (Leu)〜41 (Glu)により定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基58 (Trp)〜65 (Gln)により定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基69 (Arg)〜86 (Ala)により定義され；ヘリックスDはアミノ酸残基95 (Gly)〜114 (Ala)により定義され；ヘリックスEはアミノ酸残基126 (Thr)〜142 (Lys)により定義され；およびヘリックスFはアミノ酸残基148 (Cys)〜169 (Ala)により定義される。
本発明は、結果的にIL-28またはIL-29分子の単一形態の発現をもたらすSEQ ID NO:1、2、3、4、5、および6に示されるIL-28およびIL-29の野生型配列中の突然変異を提供する。形態の多様性は複合的な分子内ジスルフィド結合パターンの結果であると考えられるので、本発明の特定の態様は野生型IL-28およびIL-29配列内のシステイン残基に対する突然変異を含む。IL-28およびIL-29が大腸菌(E. coli)で発現される場合、N末端メチオニンが存在する。例えば、SEQ ID NO:12〜17は、N末端Metが存在する場合のIL-28A、IL-29およびIL-28Bに対するヌクレオチドおよびアミノ酸残基の付番を示す。表1は野生型IL-28A、IL-28BおよびIL-29について分子内ジスルフィド結合されるシステイン対の可能な組合せを示す。
（表１）
Figure 2008508310
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド分子は、野生型IL-28A、IL-29またはIL-28B分子に存在する1つまたは複数のシステインに突然変異を有するが、本明細書において記述されるようないくらかの生物学的活性を保持することができる。表2は例示的なシステイン突然変異、具体的にはセリン(S)へのシステイン(C)の点突然変異を示す。
（表２）
Figure 2008508310
ファミリーの全てのメンバーが同じクラスIIサイトカイン受容体、IL-28Rに結合することが示されている。IL-28α-サブユニットはzcytor19と以前には称されていた。理論により束縛されることを望むわけではないが、これらの分子は同じ経路を介しIL-28R受容体を通じて全てのシグナルを伝えるように思われる。IL-28受容体は、参照により本明細書に組み入れられる、同一出願人によるPCT特許出願WO 02/44209; Sheppard et al., 前記; Kotenko et al., Nature Immunol. 4:69-77, 2003; およびPCT WO/03/040345で記述されている。IL-28RはクラスIIサイトカイン受容体のメンバーであり、これはその細胞外ドメイン中の1つまたは複数のサイトカイン受容体モジュール(CRM)の存在によって特徴付けられる。その他のクラスIIサイトカイン受容体はzcytor11 (同一所有者による米国特許第5,965,704号)、CRF2-4 (GenBankアクセッション番号Z17227)、IL-10R (GenBankアクセッション番号U00672およびNM_001558)、DIRS1、zcytor7 (同一所有者による米国特許第5,945,511号)、および組織因子を含む。IL-28受容体は、インターフェロン-α/β受容体α鎖を除く全ての公知のクラスII受容体のように、その細胞外ドメイン中に1個のクラスII CRMしか持たない。
4ヘリックスバンドルサイトカインは同様に、その構成要素のヘリックスの長さによって分類される。「長いヘリックス」型のサイトカインは一般に、24〜30残基のヘリックスからなり、IL-6、毛様体神経栄養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)およびヒト成長ホルモン(hGH)を含む。「短いヘリックス」型のサイトカインは一般に、18〜21残基のヘリックスからなり、IL-2、IL-4およびGM-CSFを含む。CNTFおよびIL-6を用いた研究から、CNTFヘリックスをIL-6中の等価なヘリックスと交換し、キメラにCTNF結合特性を与えられることが実証された。このように、4ヘリックスサイトカインの機能ドメインは配列同一性に関係なく、構造的相同性に基づいて決定され、キメラ中で機能的統合性を維持できるように思われる(Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999)。したがって、IL-28およびIL-29ポリペプチドは、受容体結合特異性を測定するおよび調節するため、特にその他のインターフェロンとのキメラ融合分子の調製に有用と考えられる。特に興味深いのは、IFN-α、IL-10、ヒト成長ホルモンなどのインターフェロンおよびサイトカイン由来のヘリックスドメインとループドメインを組み合わせた融合タンパク質である。
本発明はIL-28またはIL-29ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含め、ポリヌクレオチド分子を提供する。例えば、本発明は本明細書において開示されるIL-28A C48S、Met IL-28A C49S、IL-28A C50S、Met IL-28A C51S、IL-29 C171SおよびMet IL-29 C172Sポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列を提供する。当業者であれば、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列バリエーションがこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを容易に認識すると考えられる。SEQ ID NO:30、31、32、33、34、および35は、それぞれIL-28A C48S、Met IL-28A C49S、IL-28A C50S、Met IL-28A C51S、IL-29 C171SおよびMet IL-29 C172Sをコードする全てのDNAを包含する縮重DNA配列である。当業者であれば、Tの代わりにUを用いることでSEQ ID NO:30、31、32、33、34、および35の縮重配列が同様に、SEQ ID NO:30、31、32、33、34、および35をコードする全てのRNA配列を供与し、したがって本発明により企図されることを認識すると考えられる。
zcyto20またはIL-28A遺伝子は、SEQ ID NO:2に示される205アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Aのシグナル配列は、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基-25 (Met)からアミノ酸残基-1 (Ala)、またあるいはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基-21 (Met)からアミノ酸残基-1 (Ala)を含む。IL-28Aの成熟ペプチドはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基1 (Val)で始まる。Zcyto20ヘリックスは次のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:2に示される、アミノ酸残基52 (Ala)〜66 (Leu)により定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基78 (Arg)〜87 (Val)により定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基91 (Pro)〜108 (Thr)により定義され；ヘリックスDはアミノ酸残基116 (Val)〜138 (Ser)により定義され；ヘリックスEはアミノ酸残基151 (Thr)〜172 (Lys)により定義され；およびヘリックスFはアミノ酸残基177 (Gly)〜197 (Cys)により定義される。多重アライメントに基づくZcyto20のさらなる解析から、アミノ酸残基37および136；69および197；ならびに71および178 (SEQ ID NO:2に示される)のシステインが分子内ジスルフィド結合を形成するものと予測される。本明細書において記述されるZcyto20のポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基および配列をコードする、対応するポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1に示されるとおりである。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が大腸菌などの原核生物系で発現される場合、分泌シグナル配列は必要とされないことがあり、N末端Metが存在することで、SEQ ID NO:13に示されるようなポリペプチドの発現がもたらされると考えられる。
本発明のIL-28Aポリペプチドは同様に、成熟ポリペプチドの2番目のシステインC2の位置に突然変異を含む。例えば、SEQ ID NO:2のポリペプチドのN末端からのC2はアミノ酸48位の、または大腸菌で発現される場合(例えば、SEQ ID NO:13を参照されたい)には49位(付加的なN末端Met)のシステインである。IL-28Aのこの2番目(IL-28Bのように、7個存在するうち)のシステインすなわちC2を、ジスルフィド結合を形成することのない任意のアミノ酸に、例えば、セリン、アラニン、トレオニン、バリン、またはアスパラギンに突然変異させることができる。本発明のIL-28A C2突然変異体分子は、例えば、SEQ ID NO:19および21に示されるIL-28A C2突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:18および20に示されるポリヌクレオチド分子を含む。本発明のさらなるIL-28A C2突然変異体分子は、SEQ ID NO:36および37に示されるポリペプチドを含む。
IL-28A C2突然変異体に加えて、本発明は同様に、成熟ポリペプチドの3番目のシステインC3の位置に突然変異を含んだIL-28Aポリペプチドを含む。例えば、SEQ ID NO:2のポリペプチドのN末端からのC3は50位の、または大腸菌で発現される場合(例えば、SEQ ID NO:13を参照されたい)には51位(付加的なN末端Met)のシステインである。本発明のIL-28A C3突然変異体分子は、例えば、SEQ ID NO:23および25に示されるIL-28A C3突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:22および24に示されるポリヌクレオチド分子を含む。本発明のさらなるIL-28A C3突然変異体分子は、SEQ ID NO:38および39に示されるポリペプチドを含む。
本発明のIL-28Aポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:1、12、18、20、22および24に示されるIL-28Aポリヌクレオチド分子によってそれぞれコードされる、SEQ ID NO:2、13、19、21、23、25を含む。加えて、本発明は同様に、SEQ ID NO:36、37、38、および39に示されるIL-28Aポリペプチドを提供する。
Zcyto22またはIL-28B遺伝子は、SEQ ID NO:6に示される205アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Bのシグナル配列は、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基-25 (Met)からアミノ酸残基0 (Ala)、またはSEQ ID NO:6のアミノ酸残基-21 (Met)からアミノ酸残基0 (Ala)を含む。IL-28Bの成熟ペプチドはSEQ ID NO:6のアミノ酸残基1 (Val)で始まる。IL-28Bヘリックスは次のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:6に示される、アミノ酸残基8 (Leu)〜41 (Glu)により定義され；ヘリックスBはアミノ酸残基58 (Trp)〜65 (Gln)により定義され；ヘリックスCはアミノ酸残基69 (Arg)〜86 (Ala)により定義され；ヘリックスDはアミノ酸残基95 (Gly)〜114 (Ala)により定義され；ヘリックスEはアミノ酸残基126 (Thr)〜142 (Lys)により定義され；およびヘリックスFはアミノ酸残基148 (Cys)〜169 (Ala)により定義される。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が大腸菌などの原核生物系で発現される場合、分泌シグナル配列は必要とされないことがあり、N末端Metが存在することで、SEQ ID NO:17に示されるようなポリペプチドの発現がもたらされると考えられる。
本発明のIL-28Bポリペプチドは同様に、成熟ポリペプチドの2番目のシステインC2の位置に突然変異を含む。例えば、SEQ ID NO:6のポリペプチドのN末端からのC2はアミノ酸48位の、または大腸菌で発現される場合(例えば、SEQ ID NO:17を参照されたい)には49位(付加的なN末端Met)のシステインである。IL-28Bのこの2番目(IL-28Aのように、7個存在するうち)のシステインすなわちC2を、ジスルフィド結合を形成することのない任意のアミノ酸に、例えば、セリン、アラニン、トレオニン、バリン、またはアスパラギンに突然変異させることができる。本発明のIL-28B C2突然変異体分子は、例えば、SEQ ID NO:123および125に示されるIL-28B C2突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:122および124に示されるポリヌクレオチド分子を含む。本発明のさらなるIL-28B C2突然変異体分子は、SEQ ID NO:131および133に示されるIL-28B C2突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:130および132に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 03/066002 (Kotenko et al.))。
IL-28B C2突然変異体に加えて、本発明は同様に、成熟ポリペプチドの3番目のシステインC3の位置に突然変異を含んだIL-28Bポリペプチドを含む。例えば、SEQ ID NO:6のポリペプチドのN末端からのC3は50位の、または大腸菌で発現される場合(例えば、SEQ ID NO:17を参照されたい)には51位(付加的なN末端Met)のシステインである。本発明のIL-28B C3突然変異体分子は、例えば、SEQ ID NO:127および129に示されるIL-28B C3突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:126および128に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 03/066002 (Kotenko et al.))。本発明のさらなるIL-28B C3突然変異体分子は、SEQ ID NO:135および137に示されるIL-28B C3突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:134および136に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 03/066002 (Kotenko et al.))。
本発明のIL-28Bポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:5、16、122、124、126、128、130、132、134、および136に示されるIL-28Bポリヌクレオチド分子によってそれぞれコードされる、SEQ ID NO:6、17、123、125、127、129、131、133、135、および137を含む。
本発明のZcyto21またはIL-29ポリペプチドは同様に、成熟ポリペプチドの5番目のシステインC5の位置に突然変異を含む。例えば、SEQ ID NO:4のポリペプチドのN末端からのC5は171位の、または大腸菌で発現される場合(例えば、SEQ ID NO:15を参照されたい)には172位(付加的なN末端Met)のシステインである。IL-29のこの5番目のシステインすなわちC5を、ジスルフィド結合を形成することのない任意のアミノ酸に、例えば、セリン、アラニン、トレオニン、バリン、またはアスパラギンに突然変異させることができる。これらのIL-29 C5突然変異体ポリペプチドは、C1 (SEQ ID NO:4のCys15)/C3 (SEQ ID NO:4のCys112)およびC2 (SEQ ID NO:4のCys49)/C4 (SEQ ID NO:4のCys145)のジスルフィド結合パターンを有する。本発明のさらなるIL-29 C5突然変異体分子は、SEQ ID NO:27、29、83、85、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、および161に示されるIL-29 C5突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:26、28、82、84、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、および160に示されるポリヌクレオチド分子を含む。本発明のさらなるIL-29 C5突然変異体分子は、SEQ ID NO:87、89、95、および97に示されるIL-29 C5突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:86、88、94、および96に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 03/066002 (Kotenko et al.))。さらなる、本発明のIL-29 C5突然変異体分子は、SEQ ID NO:103、105、111、および113に示されるIL-29 C5突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:102、104、110、および112に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 02/092762 (Baum et al.))。
IL-29 C5突然変異体に加えて、本発明は同様に、成熟ポリペプチドの1番目のシステインC1の位置に突然変異を含んだIL-29ポリペプチドを含む。例えば、SEQ ID NO:4のポリペプチドのN末端からのC1は15位の、または大腸菌で発現される場合(例えば、SEQ ID NO:15を参照されたい)には16位(付加的なN末端Met)のシステインである。これらのIL-29 C1突然変異体ポリペプチドはしたがって、C2 (SEQ ID NO:4のCys49)/C4 (SEQ ID NO:4のCys145)およびC3 (SEQ ID NO:4のCys112)/C5 (SEQ ID NO:4のCys171)の予測されるジスルフィド結合パターンを有すると考えられる。本発明のさらなるIL-29 C1突然変異体分子は、SEQ ID NO:75、77、79および81に示されるIL-29 C1突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:74、76、78、および80に示されるポリヌクレオチド分子を含む。本発明のさらなるIL-29 C1突然変異体分子は、SEQ ID NO:91、93、99、および101に示されるIL-29 C1突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:90、92、98、および100に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 03/066002 (Kotenko et al.))。さらなる、本発明のIL-29 C1突然変異体分子は、SEQ ID NO:107、109、115、および117に示されるIL-29 C1突然変異体ポリペプチドをそれぞれコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:106、108、114、および116に示されるポリヌクレオチド分子を含む(PCT公報WO 02/092762 (Baum et al.))。
本発明のIL-29ポリペプチドは、例えば、
Figure 2008508310
に示されるIL-29ポリヌクレオチド分子によってコードされる、
Figure 2008508310
を含み、SEQ ID NO:119に示されるシグナル配列またはSEQ ID NO:121に示されるシグナル配列をさらに含み得る。さらなるIL-29ポリペプチドは、SEQ ID NO:40および41を含む。SEQ ID NO:119のシグナル配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO:118として示されている。SEQ ID NO:120のシグナル配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO:121として示されている。
表3は縮重ヌクレオチドの位置を示すようSEQ ID NO:30、31、32、33、34、および35のなかで用いられている1文字コードを記載している。「分解(Resolution)」は、コード文字により示されるヌクレオチドである。「相補体」は、相補的なヌクレオチドに対するコードを示す。例えば、コードYはCまたはTのいずれかを示し、その相補体RはAまたはGを示しており、AがTに相補的であって、GがCに相補的である。
（表３）
Figure 2008508310
所与のアミノ酸に対して可能な全てのコドンを含む、SEQ ID NO:30、31、32、33、34、および35に使用の縮重コドンは、表4に記載されている。
（表４）
Figure 2008508310
当業者であれば、各アミノ酸をコードする可能な全てのコドンを代表する、縮重コドンを決定する際にいくらかのあいまいさが導入されることを認識すると考えられる。例えば、セリンに対する縮重コドン(WSN)は、ある状況では、アルギニン(AGR)をコードすることができ、アルギニンに対する縮重コドン(MGN)は、ある状況では、セリン(AGY)をコードすることができる。同様の関係がフェニルアラニンをコードするコドンとロイシンをコードするコドンとの間に存在する。このように、縮重配列によって網羅される一部のポリヌクレオチドは変異体アミノ酸配列をコードすることもあるが、当業者はSEQ ID NO:19、21、23、25、27、および29のアミノ酸配列を参照することによりそのような変異体配列を容易に同定することができる。本明細書において記述されるように、変異体配列を機能性について容易に試験することができる。
当業者であれば、異なる種が「優先的コドン使用頻度」を示しうることも理解すると考えられる。一般的には、Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982を参照されたい。本明細書において用いられる、「優先的コドン使用頻度」または「優先的コドン」という用語は、当技術分野である特定の種の細胞で最も頻繁に使われる、したがって各アミノ酸をコードする可能なコドンのうちの1つのまたは少数の代表が好まれる、タンパク質翻訳コドンのことを指す(表4を参照されたい)。例えば、アミノ酸トレオニン(Thr)は、ACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされるが、哺乳動物細胞では、ACCが最もよく使われるコドンであり；その他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌では、異なるThrコドンが優先的であり得る。特定の種についての優先的コドンを、当技術分野において公知の様々な方法によって本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。組換えDNAへの優先的コドン配列の導入は、例えば、タンパク質の翻訳を特定の細胞型または種の内部でいっそう効率的にすることで、タンパク質の産生を促進させることができる。したがって、SEQ ID NO:30、31、32、33、34、および35に開示される縮重コドン配列は、当技術分野においてよく使われ本明細書において開示される様々な細胞型および種でのポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先的コドンを含む配列を、様々な種での発現について試験し最適化することができ、本明細書において開示される機能性について試験することができる。
先述のとおり、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを含む。DNAおよびRNAを調製するための方法は、当技術分野において周知である。一般的に、RNAは、多量のIL-28またはIL-29 RNAを産生する組織または細胞から単離される。そのような組織および細胞は、ノザンブロッティング(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980)により、または様々な細胞型由来の馴化培地を標的細胞または組織の活性についてスクリーニングすることにより同定される。活性またはRNA産生細胞もしくは組織が同定されたら、グアニジウムイソチオシアネート抽出、その後CsCl勾配中での遠心分離による単離を利用して全RNAを調製することができる(Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979)。ポリ(A)+ RNAは、AvivおよびLeder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972)の方法を利用して全RNAから調製される。相補DNA (cDNA)は、公知の方法を利用してポリ(A)+ RNAから調製される。別の方法では、ゲノムDNAを単離することができる。IL-28またはIL-29ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは次に、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRにより同定され単離される。
IL-28またはIL-29をコードする完全長のクローンは、従来のクローニング手順により得ることができる。相補DNA(cDNA)クローンが好ましいが、使用目的(例えば、トランスジェニック動物での発現)によっては、ゲノムクローンを使用すること、または少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようにcDNAクローンを改変することが好ましいこともある。cDNAクローンおよびゲノムクローンを調製する方法は周知であって、当業者のレベルの範囲内であり、ライブラリーをプローブするかまたはプライムするために、本明細書において開示される配列、またはその一部分を使用することを含む。IL-28受容体断片に対する抗体、またはその他の特異的な結合パートナーを用いて、発現ライブラリーをプローブすることができる。
当業者であれば、例えば、SEQ ID NO:1、3、および5に開示される配列が、それぞれ、ヒトIL-28およびIL-29バンドの単一対立遺伝子の突然変異を表すこと、ならびに対立遺伝子の変異および選択的スプライシングが起こると予測されることを認識すると考えられる。例えば、WO 02/086087で記述されているように、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸残基169 (Asn)がArg残基であるIL-29変異体が同定されている。そのような対立遺伝子変異体は本発明に含まれる。この配列の対立遺伝子変異体は、標準的な手順にしたがい、異なる個体由来のcDNAまたはゲノムライブラリーをプローブすることでクローニングすることができる。SEQ ID NO:1、3および5に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体は、サイレント突然変異を含むものおよびシステイン突然変異に加えて、突然変異がアミノ酸配列の変化を引き起こすものを含め、本発明の範囲内であり、SEQ ID NO:2、4、および6の対立遺伝子変異体であるタンパク質も同様である。IL-28またはIL-29ポリペプチドの特性を保持する、選択的スプライスされたmRNAから作出されたcDNAは本発明の範囲内に含まれており、そのようなcDNAおよびmRNAによってコードされるポリペプチドも同様である。これらの配列の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体は、当技術分野において公知の標準的な手順にしたがい、異なる個体または組織由来のcDNAまたはゲノムライブラリーをプローブすることでクローニングすることができ、システインまたはシステイン残基をコードするポリヌクレオチドに対する突然変異は本明細書において記述されるように導入することができる。
本発明の態様のなかで、単離されたIL-28をおよびIL-29をコードする核酸分子は、ストリンジェントな条件の下で、
Figure 2008508310
のヌクレオチド配列を有する核酸分子にまたは
Figure 2008508310
に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズさせることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定配列に対する熱融解点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50%が、完璧に適合するプローブにハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度およびpH下での)である。
DNA-DNA、RNA-RNAおよびDNA-RNAなどの、核酸分子の対は、ヌクレオチド配列がある程度の相補性を有するならハイブリダイズすることができる。ハイブリッドは二重ヘリックス中のミスマッチ塩基対を許容できるが、ハイブリッドの安定性はミスマッチの程度によって影響を受ける。ミスマッチハイブリッドのTmは、塩基対ミスマッチ1〜1.5%ごとに1℃低下する。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることで、ハイブリッド中に存在すると思われるミスマッチの程度に対するコントロールが可能になる。ストリンジェンシーの程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇するにつれて、およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて増加する。
これらの条件を特定のポリヌクレオチドハイブリッドで用いるのに適合させることは、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列に対するTmは、標的配列の50%が、完璧に適合するプローブ配列にハイブリダイズすると思われる温度(規定された条件下での)である。Tmに影響を及ぼす条件としては、ポリヌクレオチドプローブのサイズおよび塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、ならびにハイブリダイゼーション溶液中の脱安定化剤の存在が挙げられる。Tmを計算するための多数の方程式は当技術分野において公知であり、DNA、RNAおよびDNA-RNAハイブリッドならびにいろいろな長さのポリヌクレオチドプローブ配列に対し特異的である(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照されたい)。OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN)およびPrimer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)などの配列解析ソフトウェア、ならびにインターネット上のサイトは、所与の配列を解析するのにおよび使用者が規定した基準に基づいてTmを計算するのに利用可能な手段である。そのようなプログラムは同様に、規定された条件下で所与の配列を解析し、適当なプローブ配列を同定することができる。典型的には、50塩基対を上回るいっそう長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたTmよりも約20〜25℃低い温度で行われる。50塩基対を下回るいっそう短いプローブの場合、ハイブリダイゼーションは典型的には、Tmまたは計算されたTmより5〜10℃下回って実施される。これにより、DNA-DNAおよびDNA-RNAハイブリッドに対するハイブリダイゼーションの最高率が可能になる。
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子をストリンジェントな条件の下で、または高度にストリンジェントな条件の下で洗浄して、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去することができる。典型的なストリンジェントな洗浄条件としては、55〜65℃での0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)入りの0.5×〜2×SSC溶液中の洗浄が挙げられる。すなわち、変異体、システイン突然変異体、またはIL-28もしくはIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子は、
Figure 2008508310
のヌクレオチド配列をそれぞれ有する核酸分子(またはその相補体)と、洗浄のストリンジェンシーが55℃で0.1%SDS入りの0.5×SSC、または65℃で0.1%SDS入りの2×SSCを含め、55〜65℃での0.1%SDS入りの0.5×〜2×SSCに同等であるストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイズする。当業者は、例えば、洗浄溶液中のSSCに代えてSSPEを用いることで同等の条件を容易に考え出すことができる。
典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件としては、50〜65℃での0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)入りの0.1×〜0.2×SSC溶液中の洗浄が挙げられる。換言すれば、IL-28またはIL-29ポリペプチドの変異体をコードする核酸分子は、
Figure 2008508310
のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)と、洗浄のストリンジェンシーが50℃で0.1%SDS入りの0.1×SSC、または65℃で0.1%SDS入りの0.2×SSCを含め、50〜65℃での0.1%SDS入りの0.1×〜0.2×SSCに同等である高度にストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイズする。
本発明は同様に、本発明のポリペプチド、例えば、
Figure 2008508310
それぞれに対し実質的に類似の配列同一性を有するIL-28またはIL-29ポリペプチドを提供する。「実質的に類似の配列同一性」という用語は、
Figure 2008508310
にそれぞれ示される配列、またはその相同分子種に対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%、96%、97%、98%、99%、もしくは99.5%を超える配列同一性を含むポリペプチドを示すよう本明細書において使用される。本発明は同様に、本発明のポリペプチドまたはその断片に対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%の、または99.5%を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドを含む。本発明はそのようなポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む。本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、組換えポリペプチドであることが好ましい。別の局面では、本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続的アミノ酸を有する。例えば、本発明のIL-29ポリペプチドは
Figure 2008508310
由来の少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続的アミノ酸を有するポリペプチドに関する。同一性の割合を決定する方法は以下に記述されている。
本発明は同様に2つの判定基準、つまり前述のように、
Figure 2008508310
のアミノ酸配列をそれぞれ有するコードポリペプチドとの間の類似性の判定、および/またはハイブリダイゼーションアッセイを用いて同定できる変異体核酸分子を企図する。そのような変異体は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが55〜65℃で0.1% SDS入りの0.5×〜2×SSCに同等であるストリンジェントな洗浄条件の下で、
Figure 2008508310
のヌクレオチド配列をそれぞれ有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズする核酸分子、あるいは(2)
Figure 2008508310
のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%、96%、97%、98%、99%もしくは99.5%を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。または、変異体は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが50〜65℃で0.1% SDS入りの0.1×〜0.2×SSCに同等である高度にストリンジェントな洗浄条件の下で、
Figure 2008508310
のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズする核酸分子、および(2)
Figure 2008508310
のアミノ酸配列それぞれに対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%、96%、97%、98%、99%もしくは99.5%を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴付けることができる。
本発明は、本明細書において開示されるがんの状態もしくは症状を治療する、予防する、その状態もしくは症状の進行を阻害する、その状態もしくは症状の発症を遅らせる、および/またはその状態もしくは症状の重症度を軽減するあるいはその状態もしくは症状の少なくとも1つを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、コードされるポリペプチドがSEQ ID NO:36〜41の群から選択される配列であるポリヌクレオチドをさらに提供する。
配列同一性の割合は従来の方法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。手短に言えば、10のギャップ開始ペナルティ、1のギャップ伸張ペナルティ、および表5 (アミノ酸は標準的な1文字コードにより示されている)に記載のHenikoff and Henikoff(前記)の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用い、アライメントスコアを最適化するように2つのアミノ酸配列を整列させる。
Figure 2008508310
（表５）
Figure 2008508310
当業者は2つのアミノ酸配列を整列するのに利用できる確立された多くのアルゴリズムが存在することを理解している。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書において開示されるアミノ酸配列と推定上の変異体IL-28またはIL-29のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるのに適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムはPearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)により、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)により記述されている。
手短に言えば、FASTAは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮せず、クエリー配列(例えば、SEQ ID NO:2)および同一性(ktup値が1である場合)または同一性の対(ktup = 2の場合)の密度が最も高い試験配列により共有される領域を同定することによって配列類似性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを用いて全ての対となったアミノ酸の類似性を比較することによって、同一性の密度が最も高い10箇所の領域を再計算し、これらの領域の端部を「トリミング」して最高スコアに寄与するアミノ酸残基だけが含まれるようにする。「カットオフ」値(配列の全長とktup値に基づいた所定の公式で計算した)よりも大きなスコアを有する領域がいくつか存在している場合には、トリミングされた初期の領域を調べて、その領域をつなぎ合わせることでギャップを伴う大まかなアライメントが形成されるかどうかを確認する。最後に、アミノ酸の挿入と欠失を可能にするNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))の変法を用いて、2つのアミノ酸配列のスコアの最も高い領域を整列させる。FASTA解析に好ましいパラメーターは、ktup = 1、ギャップ開始ペナルティ = 10、ギャップ伸張ペナルティ = 1、および置換マトリックス = BLOSUM62である。これらのパラメーターは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)の付録2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル(「SMATRIX」)を変更することによってFASTAプログラムに導入することができる。
上に開示したような比を用い、FASTAを利用して核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列の比較の場合、ktup 値は1から6の範囲、好ましくは3から6まで、最も好ましくは3とし、その他のパラメーターはデフォルトとして設定することができる。
変異体IL-28もしくはIL-29ポリペプチドまたは実質的に類似の配列同一性を有するポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特徴付けられる。これらの変化は軽度のもの、すなわち保存的アミノ酸置換(表6を参照されたい)およびポリペプチドのフォールディングまたは活性に著しく影響を与えないその他の置換；小規模の欠失、典型的には1から約30アミノ酸の欠失；ならびにアミノ末端のメチオニン残基、約20〜25残基までの小さなリンカーペプチド、またはアフィニティータグなどの、アミノ末端またはカルボキシル末端の伸長であることが好ましい。本発明はしたがって、
Figure 2008508310
の対応領域に対し少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、およびより好ましくは少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%または99.5%を超えて同一である配列を含んだポリペプチドを含む。アフィニティータグを含んだポリペプチドは、IL-28およびIL-29ポリペプチドとアフィニティータグとの間にタンパク質分解切断部位をさらに含むことができる。好ましいそのような部位としては、トロンビン切断部位および第Xa因子切断部位が挙げられる。
（表６）
Figure 2008508310
構造的完全性を維持するのに重大な意味を持つ領域またはドメインを含むアミノ酸残基を決定することができる。これらの領域内で、程度の差こそあれ変化に寛容であると考えられる特定の残基および分子全体の三次構造を維持すると考えられる特定の残基を決定することができる。配列構造を解析する方法としては、アミノ酸またはヌクレオチドの高い同一性を有する複数配列のアライメント、二次構造性向、バイナリパターン、相補的パッキングおよび埋もれた極性の相互作用が挙げられるが、これらに限定されることはない(Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995およびCordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996)。一般に、分子に対する改変をデザインするかまたは特定の断片を同定する場合、構造の決定には改変分子の活性を評価することが伴うと考えられる。
アミノ酸配列の変化は、生物学的活性に不可欠な高次構造の破壊を最小限に抑えるようにIL-28またはIL-29ポリペプチドになされる。例えば、IL-28またはIL-29ポリペプチドが1つまたは複数のヘリックスを含む場合には、アミノ酸残基の変化が、ヘリックス形状および立体構造の変化が何らかの重要な機能、例えば、分子のその結合パートナーとの結合を弱めるその他の分子成分を破壊しないようになされると考えられる。アミノ酸配列の変化の影響は、例えば、上記のコンピューターモデリングによって予測することができ、または結晶構造の解析によって判定することができる(例えば、Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995を参照されたい)。当技術分野において周知であるその他の技法では、標準分子(例えば、天然タンパク質)と変異体タンパク質のフォールディングを比較する。例えば、変異体分子および標準分子におけるシステインパターンの比較を行うことができる。質量分析ならびに還元およびアルキル化を利用した化学修飾によって、ジスルフィド結合と関係するまたはそのような関連のないシステイン残基を判定する方法が提供される(Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; およびPatterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994)。改変分子が標準分子と同じシステインパターンを持っていない場合、フォールディングに影響が出るはずであると一般的に考えられている。他の周知のおよび広く受け入れられているフォールディングの測定方法は円二色性(CD)である。改変分子および標準分子がもたらすCDスペクトルを測定し比較することはルーチンである(Johnson, Proteins 7:205-214, 1990)。結晶学はフォールディングおよび構造を解析するための他の周知の方法である。核磁気共鳴(NMR)、消化ペプチドマッピングおよびエピトープマッピングは同様に、タンパク質とポリペプチドとの間のフォールディングおよび構造的類似性を解析するための公知の方法である(Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992)。
SEQ ID NO:2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159または161に示されるIL-28またはIL-29ポリペプチド配列のHopp/Woods疎水性プロファイルを作成することができる(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986およびTriquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998)。このプロファイルはスライド式の6残基ウィンドウに基づいている。埋込まれていたG、S、およびT残基ならびに露出されていたH、Y、およびW残基は無視した。当業者であれば、IL-28またはIL-29ポリペプチドのアミノ酸配列の改変をデザインする場合には、全体の構造的および生物学的プロファイルに支障を来さないように、親水性または疎水性が考慮されるはずであるということを認識している。置換に対し特に興味深いのは、Val、LeuおよびIleからなる群またはMet、Gly、Ser、Ala、TyrおよびTrpからなる群より選択される疎水性残基である。
必須のアミノ酸の同一性をIFN-αとIL-28A、IL-28B、およびIL-29のファミリーメンバー(表1および2に示される)との間の配列類似性の解析から推定することもできる。前述の「FASTA」解析のような方法を用いて、類似性の高い領域を、タンパク質ファミリーのなかで同定し、保存領域に対するアミノ酸配列を解析するために使用する。構造に基づいて変異体ポリヌクレオチドを同定するための代替的アプローチは、IL-28またはIL-29変異体と考えられる遺伝子をコードする核酸分子が、上述の核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を同定する他の方法は、部位特異的変異誘発法またはアラニンスキャニング変異誘発法(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)中のCoombs and Corey, 「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」)などの、当技術分野において公知の手順である。後者の方法では、単一のアラニン変異を分子中の各残基に導入し、得られた分子を以下に開示される生物学的または生化学的活性について試験し、分子の活性にとって重大な意味を持つアミノ酸残基を同定する。同様にHilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)を参照されたい。
本発明は同様に、IL-28またはIL-29ポリペプチドの機能的断片およびそのような機能的断片をコードする核酸分子を含む。本明細書において定義される「機能的な」IL-28もしくはIL-29またはその断片は、その増殖活性または分化誘導活性により、特殊化した細胞機能を誘導するまたは阻害するその能力により、あるいは抗IL-28抗体もしくは抗IL-29抗体またはIL-28受容体(可溶性または固定化された)に特異的に結合するその能力により特徴付けられる。IL-28またはIL-29ポリペプチドの特殊化した活性およびそれらを試験する方法は、本明細書において開示される。本明細書において前述されているように、IL-28およびIL-29ポリペプチドは6ヘリックスバンドルにより特徴付けられる。したがって、本発明は以下を包含する融合タンパク質をさらに提供する：(a)前述のヘリックスの1つまたは複数を含むポリペプチド分子、および(b)これらのヘリックスの1つまたは複数を含む機能的断片。融合タンパク質のその他のポリペプチド部分がIFN-αなどの、別のヘリックスバンドルサイトカインもしくはインターフェロンにより、または融合タンパク質の分泌を亢進する非天然のおよび/もしくは無関係の分泌シグナルペプチドにより役立てられてもよい。
本発明のIL-28またはIL-29ポリペプチドは、完全長のポリペプチド、システイン突然変異体ポリペプチド、生物学的に活性な断片、および融合ポリペプチドを含めて、ポリペプチドをコードする発現ベクターが導入されている細胞を用い従来の技術にしたがって産生させることができる。本明細書において用いられる「発現ベクターが導入されている細胞」とは、外因性DNA分子の導入により直接的に操作されている細胞と、導入されたDNAを含んだその子孫の両方を含む。適当な宿主細胞は、外因性DNAで形質転換または形質導入させることができ且つ培養で増殖させることができる細胞型であり、細菌細胞、真菌細胞、および培養される高等真核細胞を含む。クローニングしたDNA分子を操作するための技術および種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989、およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987により開示されている。
一般的に、本発明のIL-28またはIL-29ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内でのその発現に必要とされる、一般的に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その他の遺伝要素に作動可能に連結される。ベクターは同様に、1つまたは複数の選択可能マーカーおよび1つまたは複数の複製起点を含むことが多いものと思われるが、当業者であれば、ある系内で、選択可能マーカーは他のベクターに与えられてもよく、外因性DNAの複製は宿主細胞のゲノム中への組込みにより与えられてもよいことを認識すると考えられる。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクターおよびその他の要素の選択は、当技術分野における通常の技術の程度内のルーチンのデザインである。多くのそのような要素は、文献に記述されており、商業的供給者を通して入手可能である。
IL-28またはIL-29ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中へ方向付けるため、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる)が発現ベクターに供与される。分泌シグナル配列は、例えば、システイン突然変異体IL-28またはIL-29のもの、例えば、SEQ ID NO:119またはSEQ ID NO:121であってもよく、あるいは別の分泌タンパク質(例えば、t-PA；米国特許第5,641,655号を参照されたい)由来であってもまたは新規に合成されてもよい。分泌シグナル配列はIL-28またはIL-29のDNA配列に作動可能に連結される、すなわち、その2つの配列は、正しい読み枠でつなぎ合わされ、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中へ方向付けるように配置される。分泌シグナル配列は、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置付けられることが多いが、ある種のシグナル配列は、関心対象のDNA配列の他の場所に位置付けられることがある(例えば、Welch et al., 米国特許第5,037,743号；Holland et al., 米国特許第5,143,830号を参照されたい)。
多岐にわたる適当な組換え宿主細胞のなかには、グラム陰性の宿主原核生物が含まれるが、これに限定されることはない。大腸菌の適当な菌株には、W3110株、K12株由来の菌株MM294株、TG-1株、JM-107株、BL21株、およびUT5600株が含まれる。その他の適当な菌株には：BL21(DE3)株、BL21(DE3)pLysS株、BL21(DE3)pLysE株、DH1株、DH4I株、DH5株、DH5I株、DH5IF'株、DH5IMCR株、DH10B株、DH10B/p3株、DH11S株、C600株、HB101株、JM101株、JM105株、JM109株、JM110株、K38株、RR1株、Y1088株、Y1089株、CSH18株、ER1451株、ER1647株、大腸菌K12株、大腸菌K12株RV308、大腸菌K12株C600、大腸菌HB101株、大腸菌K12株C600 Rk -Mk -、大腸菌K12株RR1(例えば、Brown(ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照されたい)が含まれる。その他のグラム陰性の宿主原核生物のなかには、セラチア属(Serratia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、カウロバクター属(Caulobacter)を含めることができる。宿主原核生物のなかには、バチルス属(Bacillus)、例えば、枯草菌(B. subtilis)およびB.チューリンゲンシス菌(B. thuringienesis)、ならびにB.チューリンゲンシス・ソレバ・イスラエレンシス株(B. thuringienesis var. israelensis)のほか、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、例えば、S.リビダンス菌(S. lividans)、S.アンボファシエンス菌(S. ambofaciens)、S.フラジアエ菌(S. fradiae)、およびS.グリセオフスカス菌(S. griseofuscus)のようなグラム陽性生物を含めることができる。枯草菌(Bacillus subtilus)の適当な菌株には、BR151株、YB886株、MI119株、MI120株、およびB170株が含まれる(例えば、Hardy, 「Bacillus Cloning Methods」、DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.)(IRL Press 1985)中を参照されたい)。宿主原核生物中でベクターを増殖させるための標準的な技術は、当業者に周知である(例えば、Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press Inc. 1997)を参照されたい)。1つの態様では、本発明の方法はAmerican Type Culture Collection (ATCC)にATCC＃27325として寄託された、W3110株で発現させたIL-28またはIL-29を使用する。
本発明の発現系を用いたIL-28またはIL-29の大量産生が必要とされる場合、バッチ発酵を使用することができる。一般に、バッチ発酵には、600 nmでの吸光度(OD) 5〜20まで増殖可能とする振盪フラスコ培養にてIL-28またはIL-29を発現する大腸菌株を適当な培地中で増殖させることにより、初期種培養フラスコを調製することが含まれる。適当な培地には、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酵母抽出物、加水分解された動物タンパク質、加水分解された植物タンパク質または加水分解されたカゼインなどの供給源からの窒素が含まれると考えられる。リン酸塩は、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、リン酸またはリン酸ナトリウムから供給される。その他の成分は、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウム、硫酸鉄または塩化第一鉄、および他の微量元素である。増殖培地にフルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、およびグリセロールなどの糖質を添加して、増殖を高めることができる。あるいは、給餌バッチ培養を使用して、高収量のIL-28またはIL-29タンパク質を作出する。IL-28またはIL-29を産生する大腸菌株は、バッチ発酵に植菌するため使用した初期容器に対して記述されている条件に類似の条件下で増殖させる。
発酵後、細胞を遠心分離により収集し、ホモジナイゼーション用緩衝液に再懸濁し、例えば、APV-Gaulinホモジナイザー(Invensys APV, Tonawanda, New York)またはビーズミルもしくは超音波処理器などの、その他の種類の細胞破壊装置でホモジナイズする。あるいは、細胞を発酵槽から直接採取し、APV-Gaulinホモジナイザーでホモジナイズする。洗浄された封入体調製物は、βメルカプトエタノール(10〜100 mM)またはジチオスレイトール(5〜50 mM)などの還元剤を含有する塩酸グアニジン(5〜8 M)または尿素(7〜8 M)を用いて可溶化することができる。この溶液は、Tris緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、HEPES緩衝溶液またはその他の適切な緩衝溶液中で調製することができる。封入体は、ラウリル硫酸ナトリウム(0.1〜2%)を含有する尿素(2〜4 M)で可溶化することもできる。屈折性封入体としてIL-28またはIL-29が蓄積される、形質転換済みの宿主大腸菌から精製IL-28またはIL-29を回収する過程では、細胞を破壊して、封入体を遠心分離により回収する。次に、還元剤を含有する6 M塩酸グアニジン溶液中で封入体を可溶化し、変性させる。次いで、還元されたIL-28またはIL-29をコントロールされた復元段階で酸化する。リフォールディングされたIL-28またはIL-29は、清浄化および不溶性タンパク質の除去を目的にろ過器に通すことができる。次いで、その溶液を清浄化および不溶性タンパク質の除去を目的にフィルターに通す。IL-28またはIL-29タンパク質をリフォールディングし、濃縮した後、リフォールディングされたIL-28またはIL-29タンパク質を希釈緩衝溶液に入れて陽イオン交換カラム上に捕捉させ、疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用して精製する。
培養哺乳動物細胞は、本発明のなかで適当な宿主である。外因性DNAを哺乳動物宿主細胞中へ導入するための方法には、リン酸カルシウムによるトランスフェクション法 (Wigler et al., Cell 14:725,1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション法(Neumann et al., EMBO J. 1:841-5, 1982)、DEAE-デキストランによるトランスフェクション法(Ausubel et al., 前記)、およびリポソームによるトランスフェクション法(Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993)、ならびにウイルスベクター(Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996)が含まれる。培養哺乳動物細胞中での組換えポリペプチドの産生は、例えば、Levinson et al., 米国特許第4,713,339号; Hagen et al., 米国特許第4,784,950号; Palmiter et al., 米国特許第4,579,821号; およびRingold, 米国特許第4,656,134号により開示されている。適当な培養哺乳動物細胞としては、COS-1 (ATCC No. CRL 1650)、COS-7 (ATCC No. CRL 1651)、BHK (ATCC No. CRL 1632)、BHK 570 (ATCC No. CRL 10314)、293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)およびチャイニーズハムスター卵巣(例えば、CHO-K1; ATCC No. CCL 61)細胞系が挙げられる。さらなる適当な細胞系は当技術分野において公知であり、American Type Culture Collection, Manassas, VAなどの公共の寄託所から入手できる。一般的に、SV-40またはサイトメガロウイルス(cytomegalovirus)由来のプロモーターなどの、強力な転写プロモーターが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照されたい。その他の適当なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子由来のもの(米国特許第4,579,821号および同第4,601,978号)およびアデノウイルス(adenovirus)主要後期プロモーターが挙げられる。
一般的に、薬物選択を利用して、外来性DNAが挿入されている培養哺乳動物細胞を選択する。そのような細胞は一般に、「トランスフェクタント」といわれる。選択的薬剤の存在下で培養された細胞であって、関心対象の遺伝子をその子孫に受け渡すことができる細胞は「安定的なトランスフェクタント」といわれる。好ましい選択可能マーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択はG-418などのような、ネオマイシン型の薬物の存在下で行われる。選択系を利用して対象とする遺伝子の発現レベルを増加させることも可能であり、このプロセスは「増幅」といわれる。低レベルの選択的薬剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、その後、選択的薬剤の量を増加させて、導入した遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞を選択することにより、増幅が行われる。好ましい増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼであり、これはメトトレキセートに対する耐性を与える。その他の薬物耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。緑色蛍光タンパク質、またはCD4、CD8、クラスI MHCなどの細胞表面タンパク質、胎盤由来アルカリホスファターゼのような、表現型の変化を導入する他のマーカーを利用して、FACSソーティングまたは磁気ビーズによる分離技術のような手段により、非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を選別してもよい。
植物細胞、昆虫細胞および鳥類細胞を含めて、その他の高等真核細胞を宿主として使用することもできる。植物細胞で遺伝子を発現させるためにベクターとしてアグロバクテリウムリゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を使用することは、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987により概説されている。昆虫細胞の形質転換およびその細胞中での外来性ポリペプチドの産生は、Guarino et al., 米国特許第5,162,222号およびWIPO公報WO 94/06463により開示されている。一般にオートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)に由来する、組換えバキュロウイルス(baculovirus)を昆虫細胞に感染させることができる。King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; およびRichardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照されたい。組換えバキュロウイルスを作製する第2の方法では、Luckow (Luckow, V.A, et al., J Virol 67:4566-79, 1993)が記述しているトランスポゾンに基づく系を利用する。この系はBac-to-Bacキット(Life Technologies, Rockville, MD)として市販されている。この系では、「バクミド(bacmid)」と呼ばれる大型のプラスミドとして大腸菌の中で保持されるバキュロウイルスゲノムの中にIL-28またはIL-29ポリペプチドをコードするDNAを移動させるTn7トランスポゾンを含んだ、トランスファーベクターpFastBac1(商標) (Life Technologies)を利用する。このpFastBac1(商標)トランスファーベクターには、対象とする遺伝子、この場合はIL-28またはIL-29の発現を駆動するためにAcNPVポリヘドリンプロモーターが使われている。しかしながら、pFastBac1(商標)は大いに改変することができる。ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現されており、分泌タンパク質を発現させるのに好都合であることが明らかにされているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Pcor、p6.9またはMPプロモーターとしても公知である)で置換することができる。Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; およびChazenbalk, G.D., and Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995を参照されたい。このようなトランスファーベクターの構築では、短いかまたは長い種類の塩基性タンパク質プロモーターを使用することができる。さらに、天然IL-28またはIL-29分泌シグナル配列を昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列と取り替えたトランスファーベクターを構築することができる。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen, Carlsbad, CA)、またはバキュロウイルスgp67 (PharMingen, San Diego, CA)由来の分泌シグナル配列を構築体に用いて、天然IL-28またはIL-29分泌シグナル配列に置換することができる。さらに、トランスファーベクターは、発現されるIL-28またはIL-29ポリペプチドのC末端またはN末端の位置にエピトープタグ、例えば、Glu-Gluエピトープタグ(Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985)をコードするDNAとインフレーム融合を含むことができる。当技術分野において公知の技術を用いて、IL-28またはIL-29を含んだトランスファーベクターを大腸菌に形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す、分断化されたlacZ遺伝子を含むバクミドについてスクリーニングする。一般的な技術を用いて、組換えバキュロウイルスゲノムを含んだバクミドDNAを単離し、これを使ってスポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞、例えば、Sf9 細胞にトランスフェクトする。IL-28またはIL-29を発現する組換えウイルスを次に産生させる。当技術分野において一般的に用いられる方法により、組換えウイルスのストックを作製する。
この組換えウイルスは宿主細胞、典型的にはツマジロクサヨトウ、スポドプテラフルギペルダ由来の細胞系に感染させるのに使われる。一般的には、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994を参照されたい。別の適当な細胞系はトリコプルシアニ(Trichoplusia ni) (米国特許第5,300,435号)由来のHigh FiveO(商標)細胞系(Invitrogen)である。
酵母細胞を含めて、真菌細胞を本発明のなかで使用することもできる。この点で具体的に対象とされる酵母菌種としては、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、およびピキアメタノリカ(Pichia methanolica)が挙げられる。S.セレビシエ細胞を外因性DNAで形質転換し、組換えポリペプチドをその細胞から産生させる方法は、例えば、Kawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kawasaki et al., 米国特許第4,931,373号; Brake, 米国特許第4,870,008号; Welch et al., 米国特許第5,037,743号; およびMurray et al., 米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は選択可能マーカー、一般に薬物耐性または特定の栄養素(例えば、ロイシン)の非存在下で増殖する能力により判定される表現型によって選択される。サッカロマイセスセレビシエで用いるのに好ましいベクター系は、Kawasaki et al. (米国特許第4,931,373号)により開示されているPOT1ベクター系であり、この系は形質転換細胞をグルコース含有培地中での増殖によって選択可能とする。酵母で用いるのに適したプロモーターおよびターミネーターとしては、糖分解酵素遺伝子(例えば、Kawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kingsman et al., 米国特許第4,615,974号; およびBitter, 米国特許第4,977,092号を参照されたい)およびアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが挙げられる。同様に、米国特許第4,990,446号; 同第5,063,154号; 同第5,139,936号および同第4,661,454号を参照されたい。ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセスラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセスフラギリス(Kluyveromyces fragilis)、ウスチラゴメイデス(Ustilago maydis)、ピキアパストリス、ピキアメタノリカ、ピキアギラーモンジイ(Pichia guillermondii)およびカンジダマルトサ(Candida maltosa)を含めて、その他の酵母用の形質転換系が当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986およびCregg, 米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス(Aspergillus)細胞をMcKnight et al., 米国特許第4,935,349号の方法にしたがって利用してもよい。アクレモニウムクリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、Sumino et al., 米国特許第5,162,228号により開示されている。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換する方法はLambowitz, 米国特許第4,486,533号により開示されている。組換えタンパク質の産生のための宿主としてピキアメタノリカを使用することは、米国特許第5,955,349号、同第5,888,768号および同第6,001,597号、米国特許第5,965,389号、米国特許第5,736,383号、ならびに米国特許第5,854,039号で開示されている。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質を純度80%以上まで、より好ましくは純度90%以上まで、さらにより好ましくは純度95%以上まで精製することが好ましく、とりわけ好ましいのは薬学的に純粋な状態であり、その状態は、混入している高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して純度が99.9%を超え、感染物質および発熱物質がない状態である。精製ポリペプチドまたはタンパク質には、他のポリペプチドまたはタンパク質、特に動物起源のものが実質的にないことが好ましい。
発現された組換えIL-28またはIL-29タンパク質(キメラポリペプチドおよび多量体タンパク質を含む)は従来のタンパク質精製法により、典型的にはクロマトグラフィー技術の組合せにより精製される。一般的には、Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988; およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994を参照されたい。ポリヒスチジン親和性タグ(典型的にはヒスチジン約6残基)を含むタンパク質は、ニッケルキレート樹脂でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えば、Houchuli et al., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988を参照されたい。glu-gluタグを含むタンパク質は、従来の手順にしたがってイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、Grussenmeyer et al., 前記を参照されたい。マルトース結合タンパク質融合体は、当技術分野において公知の方法にしたがいアミロースカラムで精製される。
IL-28またはIL-29ポリペプチドは同様に、排他的な固相合成、部分的な固相法、断片縮合または古典的な溶液合成を含め、当技術分野において公知の方法にしたがい化学合成によって調製することができる。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd edition), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; およびAtherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989を参照されたい。インビトロ合成は、より小さなポリペプチドの調製に特に好都合である。
当技術分野において公知の方法を利用し、IL-28またはIL-29タンパク質を単量体または多量体；グリコシル化または非グリコシル化；ペグ化または非ペグ化；融合タンパク質として調製することができる。IL-28またはIL-29タンパク質は開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもまたは含まなくてもよい。治療法に用いられるIL-28またはIL-29複合体は、薬学的に許容される水溶性重合体成分を含んでもよい。水溶性重合体とのインターフェロンの結合は、インターフェロンの血中半減期を向上させることや、ポリペプチドの免疫原性を低下させることが明らかにされている(例えば、Nieforth et al, Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996)、およびMonkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)を参照されたい)。
適当な水溶性重合体はポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシPEG、モノ-(C1〜C10)アルコキシ-PEG、アリロキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、モノメトキシPEGプロピオンアルデヒド、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモ重合体、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、モノメトキシPEGブチルアルデヒド、PEGブチルアルデヒド、モノメトキシPEGアセトアルデヒド、PEGアセトアルデヒド、メトキシルPEGスクシンイミジルプロピオネート、メトキシルPEGスクシンイミジルブタノエート、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、またはその他の糖質ベースの重合体を含む。適当なPEGは、例えば、5,000ダルトン、12,000ダルトン、20,000ダルトン、30,000ダルトン、および40,000ダルトンを含め、約600から約60,000までの分子量を持ってもよく、それは直鎖状または分枝状であってもよい。IL-28またはIL-29複合体は同様に、そのような水溶性重合体の混合物を含むことができる。
IL-28またはIL-29複合体の1つの例は、IL-28またはIL-29成分およびIL-28またはIL-29成分のN末端に付着されたポリアルキルオキシド成分を含む。PEGは1つの適当なポリアルキルオキシドである。実例として、IL-28またはIL-29はPEGで修飾されてもよく、この過程は「PEG化」として知られている。IL-28またはIL-29のPEG化は、当技術分野において公知のPEG化反応のいずれかにより実行されてもよい(例えば、EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)、および Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)を参照されたい)。例えば、PEG化は反応性ポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応によりまたはアシル化反応により行うことができる。代替的アプローチでは、IL-28またはIL-29複合体は、PEGの末端ヒドロキシまたはアミノ基が活性化リンカーに置き換えられている活性化PEGを縮合することで形成される(例えば、Karasiewicz et al., 米国特許第5,382,657号を参照されたい)。
アシル化によるPEG化には、PEGの活性エステル誘導体をIL-28またはIL-29ポリペプチドと反応させることが通常必要になる。活性化PEGエステルの1例は、N-ヒドロキシスクシンイミドとエステル結合しているPEGである。本明細書において用いられる「アシル化」という用語は、IL-28またはIL-29と水溶性重合体との間の以下のタイプの連結を含む：アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によりPEG化されたIL-28またはIL-29を調製するための方法は、(a) 1つまたは複数のPEG基がIL-28またはIL-29に付着される条件の下でIL-28またはIL-29ポリペプチドをPEG (PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステルなどの)と反応させる段階、および(b) 反応産物を得る段階を通常含むと考えられる。一般的に、アシル化反応に最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび望ましい結果に基づいて決定されると考えられる。例えば、PEG対IL-28またはIL-29の比率が大きくなるほど、ポリPEG化IL-28またはIL-29産物の割合も高くなる。
アルキル化によるPEG化は一般に、還元剤の存在下でPEGの末端アルデヒド、例えば、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、アセトアルデヒドなどの誘導体をIL-28またはIL-29と反応させることを含む。PEG基は-CH2-NH2基を介してポリペプチドに付着されることが好ましい。
還元的アルキル化を介してモノPEG化産物を産生する誘導体化では、誘導体化に利用できる異なるタイプの第1級アミノ基の反応性の違いを巧みに利用する。典型的には、反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のN末端残基のα-アミノ基との間のpKaの相違を巧みに利用可能にするpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、タンパク質への、アルデヒドなどの反応基を含んだ水溶性重合体の付着がコントロールされる。重合体との結合は、リジン側鎖のアミノ基などの他の反応基の大幅な修飾がなくともタンパク質のN末端で主に起こる。
単重合体IL-28またはIL-29複合体分子の実質的に均一な集団を産生する還元的アルキル化は、(a) IL-28またはIL-29のアミノ末端のα-アミノ基の選択的修飾を可能とするのに適したpHで還元的アルキル化条件の下、IL-28またはIL-29ポリペプチドを反応性PEGと反応させる段階、および(b) 反応産物を得る段階を含むことができる。還元的アルキル化に用いられる還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは還元的アルキル化の初期過程で形成されるシッフ塩基だけを還元できるべきである。好ましい還元剤は水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランを含む。
単重合体IL-28またはIL-29複合体の実質的に均一な集団の場合、還元的アルキル化反応条件は、IL-28またはIL-29のN末端との水溶性重合体成分の選択的付着を可能にするものである。そのような反応条件は一般に、リジンアミノ基とN末端のα-アミノ基との間のpKaの相違をもたらす。pHは同様に、使われるタンパク質に対する重合体の比率に影響を及ぼす。一般に、pHが低ければ、タンパク質に対していっそう大過剰の重合体が望ましいと考えられる。N末端α-基の反応性が低いほど、最適な条件を達成するのにより多くの重合体が必要になるからである。pHが高ければ、より多くの反応基を利用できるので、重合体：IL-28またはIL-29は同じくらい大きい必要はない。典型的には、pHは3〜9、または3〜6の範囲内に入ると考えられる。考慮すべき別の要因は水溶性重合体の分子量である。一般に、重合体の分子量が高くなるほど、タンパク質に付着されうる重合体分子の数は少なくなる。PEG化反応の場合、典型的な分子量は約2 kDa〜約100 kDa、約5 kDa〜約50 kDa、約12 kDa〜約40 kDa、または約20 kDa〜約30 kDaである。IL-28またはIL-29に対する水溶性重合体のモル比は一般に、1:1〜100:1の範囲である。典型的には、IL-28またはIL-29に対する水溶性重合体のモル比は、ポリPEG化の場合には1:1〜20:1、およびモノPEG化の場合には1:1〜5:1である。
インターフェロンおよび水溶性重合体成分を含む複合体を産生するための一般的な方法は、当技術分野において公知である。例えば、Karasiewicz et al., 米国特許第5,382,657号、Greenwald et al., 米国特許第5,738,846号、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996)、Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)を参照されたい。PEG化された種は透析法、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、サイズ排除クロマトグラフィー法などのような、標準的な精製法を利用して非複合体化IL-28またはIL-29ポリペプチドから分離することができる。
本発明のIL-28またはIL-29分子は、IL-28受容体に特異的に結合することおよび/または抗腫瘍薬として作用することができる。IL-28受容体へのIL-28またはIL-29ポリペプチドの結合は、確立されたアプローチを用いてアッセイすることができる。ヨードビーズ(Pierce, Rockford, IL)を製造元の指示にしたがって使用し、IL-28またはIL-29をヨウ素化することができ、次に125I-IL-28または125I-IL-29を下記のように使用することができる。
第1のアプローチでは、非標識IL-28またはIL-29を含め、可能な結合競合体の存在下または非存在下で、125I-IL-28または125I-IL-29 50ナノグラムをIL-28受容体ヒトIgG融合タンパク質1000 ngと混ぜ合わせることができる。特異性の対照としてその他のサイトカイン受容体ヒトIgG融合体を代用して、同じ結合反応を行うこともできよう。4℃でインキュベーション後、プロテイン-G (Zymed, SanFransisco, CA)を反応に加えて、受容体-IgG融合体およびそれらに結合した任意のタンパク質を捕捉し、反応液を4℃でさらに1時間インキュベートする。次いでプロテイン-Gセファロースを回収し、PBSで3回洗浄し、結合した125I-IL-28または125I-IL-29をγ線計数器(Packard Instruments, Downers Grove, IL)により測定する。
第2のアプローチでは、プレートに結合した受容体との125I-IL-28または125I-IL-29の結合を分子が阻害する能力をアッセイすることができる。1 g/mLの受容体溶液100 μlをプレート中で一晩インキュベートすることにより、細胞外のリガンド結合ドメインに相当するIL-28受容体の断片を96ウェルプレートのウェルに吸着させることができる。第2の形態では、受容体-ヒトIgG融合体を、融合タンパク質のヒトIgG部分に対して作製された抗体でコーティングされている96ウェルプレートのウェルに結合させることができる。受容体でのプレートのコーティングに続いて、プレートを洗浄し、SUPERBLOCK (Pierce, Rockford, IL)でブロッキングし、再び洗浄する。IL-28、IL-29、IL-28およびIL-29を含む潜在的な結合競合体の濃度増加を伴うかまたは伴わない、一定濃度の125I-IL-28または125I-IL-29を含有する溶液、この溶液100 μlをプレートの適切なウェルに加える。4℃で1時間のインキュベーションに続いて、プレートを洗浄し、結合した125I-IL-28または125I-IL-29の量を計数(Topcount, Packard Instruments, Downers grove, IL)により測定する。125I-IL-28または125I-IL-29の結合の特異性は、これらの結合アッセイで用いられる受容体分子によりおよび阻害剤として用いられる分子により定義することができる。
ペグ化に加えて、ヒトアルブミンを本発明のポリペプチドに遺伝的にカップリングさせて、その半減期を引き延ばすことができる。ヒトアルブミンはヒト循環系の中で最も多い天然に存在する血中タンパク質であり、体内の循環血液中に20日間を超えてとどまっている。研究によって、ヒトアルブミンに遺伝的に融合された治療用タンパク質がいっそう長い半減期を有することが明らかにされている。ペグ化と同様に、IL28またはIL29アルブミン融合タンパク質は、現在利用可能な治療に比べて類似のまたはさらに高い有効性および安全性で、より好都合な投与スケジュールを与える長時間作用性の治療選択肢を患者に提供することができる(米国特許第6,165,470号; Syed et al., Blood, 89(9):3243-3253 (1997); Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1904-1908 (1992); およびZeisel et al., Horm. Res., 37:5-13 (1992))。
上記のペグ化およびヒトアルブミンと同様に、ヒトIgG分子のFc部分を本発明のポリペプチドに融合させることができる。得られた融合タンパク質はFc成分によって増大した循環血中半減期を有することができる(米国特許第5,750,375号、米国特許第5843,725号、米国特許第6,291,646号; Barouch et al., Journal of Immunology, 61:1875-1882 (1998); Barouch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(8):4192-4197 (April 11, 2000); およびKim et al., Transplant Proc., 30(8):4031-4036 (Dec. 1998))。
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、遺伝子操作された抗体を含めて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、F(ab')2およびFab断片などのその抗原結合断片、一本鎖抗体などを含む。ヒト以外の抗体はヒト以外のCDRをヒトのフレームワークおよび定常領域に合体させることで、またはヒト以外の可変ドメイン全体を組み入れる(任意で露出残基の置換によりそれらをヒト様の表面で「覆って」もよく、得られるのは「ベニヤ(veneered)」抗体である)ことでヒト化されてもよい。場合によっては、ヒト化抗体は適切な結合特性を増強するために、ヒト可変領域フレームワークドメイン内にヒト以外の残基を保持してもよい。抗体のヒト型化を通じて、生物学的半減期が増大される可能性があり、ヒトへの投与時の有害な免疫応答の可能性が低下する。当業者は特異的なおよび異なる定常ドメイン(すなわち、異なるIgサブクラス)を有するヒト化抗体を作出して、特定の抗体定常ドメインと関連する種々の免疫機能を亢進するかまたは阻害することができる。抗体は、それらがIL-28またはIL-29のポリペプチドまたはタンパク質に、対照の(IL-28およびIL-29以外の)ポリペプチドまたはタンパク質に対する結合親和性よりも少なくとも10倍高い親和性で結合するならば、特異的に結合すると定義される。当業者はモノクローナル抗体の親和性を容易に測定することができる(例えば、Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949を参照されたい)。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製するための方法は、当技術分野において周知である(例えば、Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる)。ポリペプチド免疫原は完全長の分子またはその一部分であってもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」であるならば、そのような部分は免疫付与のため高分子担体(キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイドなどの)に都合よくつなぎ合わされてもまたは連結されてもよい。
当業者に公知の様々なアッセイを利用して、IL-28またはIL-29ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出することができる。例示的なアッセイはUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999で詳述されている。そのようなアッセイの代表例は、同時免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイを含む。
インビトロおよびインビボでの診断的使用を含め、ある種の用途の場合には、標識抗体を利用することが好都合である。適当な直接的タグまたは標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などが挙げられる。間接的タグまたは標識は、媒介物としてビオチン-アビジンまたはその他の相補体/抗-相補体対の使用を特徴とすることができる。本発明の抗体は同様に、薬物、毒素、放射性核種などに直接的にまたは間接的に結合されてもよく、これらの複合体はインビボでの診断的または治療的用途(例えば、細胞増殖の阻害)に使われてもよい。一般的には、Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56:1324-1330, 1996を参照されたい。
患者への薬学的製剤の投与は局所、吸入、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下腔内、局所カテーテルを通じたかん流による、または直接的な病巣内注射による投与とすることができる。治療用タンパク質を注射により投与する場合、投与は持続注入によるまたは単回もしくは複数回ボーラスによる投与であってもよい。一般に、薬学的製剤はIL-28またはIL-29ポリペプチドを生理食塩水、緩衝生理食塩水、5%デキストロース水溶液、または同様のものなどの、薬学的に許容される媒体と併せて含むと考えられる。製剤は、1つまたは複数の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどをさらに含んでもよい。調剤の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995で開示されている。IL-28またはIL-29ポリペプチドは全量の約10〜100 μg/mlの濃度で使われるのが好ましいと思われるが、1 ng/ml〜1000 μg/mlの範囲の濃度が使われてもよい。創傷治癒の促進の場合などの、局所投与の場合、タンパク質は創傷部1 cm2当たり0.1〜10 μgの範囲で用いられるが、正確な用量は治療される状態の性質および重症度、患者の体質などを考慮に入れて、許容されている基準に準じ臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベルの範囲内である。投薬は治療の期間にわたり連日または断続的である。静脈内投与は1時間から数時間の典型的な時間にわたるボーラス注射または注入によると考えられる。徐放性製剤を利用することもできる。一般的に、IL-28またはIL-29の治療的有効量は、造血機能もしくは免疫機能の臨床的に有意な変化、罹患率の有意な低下、または有意に増大した組織学的スコアなどの、治療状態の臨床的に有意な変化をもたらすのに十分な量である。
例として、薬学的製剤は、本発明のIL-28またはIL-29ポリペプチドを含む容器を含んだキットとして供給されてもよい。治療用ポリペプチドを単回もしくは複数回用量向けの注射可能な溶液の形態で、または注射前に再構成される無菌粉末として供与することができる。あるいは、そのようなキットは治療用ポリペプチドの投与のために乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生器、またはネブライザを含むことができる。そのようなキットは薬学的組成物の適応症および用法に関する書面情報をさらに含んでもよい。さらに、そのような情報は、IL-28またはIL-29ポリペプチド製剤がIL-28またはIL-29ポリペプチドに対し既知の過敏性を有する患者で禁忌であるという記述を含んでもよい。
B. がんを治療するためのIL-28およびIL-29の使用
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、インターフェロン-αに類似した抗ウイルス効果を有することが明らかにされている(WO 04/037995を参照されたい)。インターフェロンは自己免疫疾患、尖圭コンジローマ、慢性C型肝炎、膀胱がん、子宮頸がん、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、慢性B型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスに感染している患者におけるカポジ肉腫、悪性黒色腫、有毛細胞白血病、および多発性硬化症の治療用に米国で承認されている。さらに、IL-28およびIL-29ポリペプチドは細胞増殖を阻害することにより、アテローム性動脈硬化などの、動脈硬化の形態を治療するのに使われてもよい。したがって、本発明はそのような状態を治療するため、および網膜症を治療するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28またはIL-29ポリペプチド、融合タンパク質、およびその断片の使用を企図する。本発明は、例えば、B細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病を含む、リンパ増殖性障害と関連する状態もしくは症状を治療するため、予防するため、その状態もしくは症状の進行を阻害するため、その状態もしくは症状の発症を遅らせるため、および/またはその状態もしくは症状の少なくとも1つを軽減するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28およびIL-29タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの使用を提供する。さらに、本発明は、腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん(例えば、小細胞肺がん、扁平上皮細胞がん、腺がんおよび大細胞がんなどの非小細胞肺がん、ならびに中皮腫)、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択されるそれらのがんと関連する状態もしくは症状を治療するため、予防するため、その状態もしくは症状の進行を阻害するため、その状態もしくは症状の発症を遅らせるため、および/またはその状態もしくは症状の重症度を軽減するためもしくはその状態もしくは症状の少なくとも1つを阻害するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28およびIL-29タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの使用をさらに提供する。
インターフェロンは同様に、培養細胞による抗原の発現を誘導することが明らかにされている(例えば、Auth et al., Hepatology 18:546 (1993)、Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994)、Girolomoni et al., Eur. J. Immunol. 25:2163 (1995)、およびMaciejewski et al., Blood 85:3183 (1995)を参照されたい)。この活性は新たな腫瘍関連抗原をインビトロで同定する能力を増強する。さらに、ヒト腫瘍抗原の発現レベルを増進するインターフェロンの能力から、インターフェロンは免疫療法に対する補助療法で有用とできるかまたは腫瘍抗原に対する抗体を用いて免疫シンチグラフィーを増強できることが示唆される(Guadagni et al., Cancer Immunol. Immunother. 26:222 (1988); Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994))。このように、本発明は免疫療法に対するアジュバントとしてまたは腫瘍抗原に対する抗体を用いて免疫シンチグラフィーを向上するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28またはIL-29タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの使用を含む。
腫瘍の進行および転移に対するIL-28またはIL-29ポリペプチドの活性および効果をインビボで測定することができる。腫瘍の進行に対するポリペプチド、化合物またはその他の処置の影響を研究するためにいくつかの同系マウスモデルが開発されている。これらのモデルでは、培養で継代された腫瘍細胞を、腫瘍ドナーと同じ系統のマウスに移植している。この細胞は、レシピエントマウス中で類似の特徴を有する腫瘍に発生すると考えられ、転移もこのモデルのいくつかに生じると思われる。本発明者らの研究に適当な腫瘍モデルのなかには、特に、Lewis肺ガン細胞(ATCC番号CRL-1642)およびB16黒色腫細胞(ATCC番号CRL-6323)が含まれる。これらはどちらもインビトロで容易に培養され且つ操作される、C57BL6マウスと同系の、一般的に使用される腫瘍系である。これらの細胞系のいずれかの移植から生ずる腫瘍は、C57BL6マウスの肺への転移能を有する。Lewis肺ガンモデルが最近、血管形成阻害因子を同定するためにマウスで使用されている(O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994)。C57BL6/Jマウスは、組換えタンパク質、アゴニストもしくはアンタゴニストを毎日注射するか、または組換えアデノウイルスを1回注射するかのいずれかにより、実験薬剤で処置される。この処置から3日後に、細胞105〜106個を背面皮膚下に移植する。または、移植前に、細胞自体に組換えアデノウイルス、例えばIL-28およびIL-29を発現するアデノウイルスを感染させてもよく、その結果、そのタンパク質が全身的にではなく、腫瘍部位にまたは細胞内に合成される。マウスは通常、5日以内に目に見える腫瘍を発症する。この腫瘍は最大で3週間までの期間、増殖させることができ、その間に、対照処置群ではその腫瘍は1500〜1800 mm3の大きさに達する可能性がある。実験の間中、腫瘍の大きさおよび体重を注意深くモニターする。殺処理時に、腫瘍を肺および肝臓とともに切除し、その重さを量る。肺の重量は、転移性腫瘍組織量とよく相関することが示されている。さらなる尺度として、肺表面の転移を計数する。切除した腫瘍、肺および肝臓は、当技術分野において公知のおよび本明細書に記述の方法を用いて、組織病理学検査、免疫組織化学、およびインサイチュー・ハイブリダイゼーションに向けて調製する。腫瘍が脈管構造を強化するおよび転移を起こす能力に対する、問題としている発現ポリペプチド、例えば、システイン突然変異体IL-28およびIL-29の影響をこのように評価することができる。さらに、アデノウイルスを利用するほかに、移植細胞にIL-28およびIL-29を一過性にトランスフェクトすることができる。安定的なIL-28またはIL-29トランスフェクタントの利用およびインビボでIL-28またはIL-29の発現を活性化する誘導可能なプロモーターの利用は、当技術分野において公知であり、この系で用いて、転移の誘導を評価することができる。さらに、精製されたIL-28またはIL-29馴化培地をこのマウスモデルに直接注射することができ、それ故、この系で使用することができる。一般的な参考文献については、O'Reilly MS, et al., Cell 79:315-328, 1994; およびRusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995を参照されたい。
本発明は
Figure 2008508310
の群から選択されるポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの進行を阻害する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの進行を阻害する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの発症を遅らせる方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの発症を遅らせる方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの重症度を軽減する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの重症度を軽減する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹、寝汗、不明熱、体重減少、および極度の疲労の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹、寝汗、不明熱、体重減少、および極度の疲労の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが背痛、身長低下、貧血、腎臓障害、反復性呼吸器感染症、および高カルシウム血症の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが背痛、身長低下、貧血、腎臓障害、反復性呼吸器感染症、および高カルシウム血症の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位、嚥下困難、呼吸または発話の問題、口内の麻痺感、鼻血、持続性の耳痛、難聴、および口内または頸部の腫脹または瘤の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
本発明は同様に、
Figure 2008508310
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位、嚥下困難、呼吸または発話の問題、口内の麻痺感、鼻血、持続性の耳痛、難聴、および口内または頸部の腫脹または瘤の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
Figure 2008508310
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
皮膚に生じる主に4タイプの悪性黒色腫が存在する。これらは皮膚黒色腫として知られている：
表在拡大型黒色腫は最もよく見られるタイプの黒色腫である。約10分の7 (70%)がこのタイプである。それらは中年の人々に多く生じる。女性では最もよく見られる場所は脚上であるが、男性では胴体、具体的には背部によく見られる。それらは皮膚表面のいたる所に拡がることで始まる傾向があり、これは放射状増殖期として知られている。黒色腫がこの時期に除去されれば、回復の見込みが非常に高い。黒色腫が除去されなければ、それは皮膚層中のさらに奥底に向かって増殖し始めると考えられる。ひいては、黒色腫が血流またはリンパ系の中を身体の他の部分にまで拡がる危険性がある。結節型黒色腫は胸部または背部に生じることが最も多い。これは中年の人々に最もよく見られる。これは除去されなければ、皮膚中のさらに奥底に向かってかなり急速に増殖する傾向がある。このタイプの黒色腫は皮膚表面の残部上に隆起することが多く、瘤のような感触がする。これはとても暗い褐色から黒色または黒色になることがある。悪性黒子型黒色腫は顔面に、特に高齢者に最もよく見られる。これはゆっくり増殖し、発症するのに数年かかることがある。末端性黒色腫は手のひら、足の裏または足の爪の周りに見られることが多い。その他の非常に稀有なタイプの皮膚黒色腫としては、メラニン欠乏性黒色腫(この場合には黒色腫はその色素を喪失し、白色領域として現れる)および線維形成性黒色腫(これは線維性瘢痕組織を含む)が挙げられる。悪性黒色腫は皮膚以外の身体の部分から生じることがあるが、これは極めて稀有である。影響を受ける可能性がある身体の部分は眼、口、爪の下部(爪下黒色腫として知られる)、外陰部もしくは膣組織、または内部的にである(cancerbacupインターネットウェブサイト)。
大部分の黒色腫は正常な皮膚の外観の変化から始まる。これは異常な新しい黒子のように見える。3分の1未満が既存の黒子に生じる。黒子と黒色腫の違いを見分けるのは難しいこともあるが、次のチェックリストを役立てるように用いることができる。これはABCDリストとして公知である。非対称性- 普通の黒子は形状が通常対称的である。黒色腫は不規則的または非対称的になる可能性が高い。境界線- 黒子は、はっきりした規則的な境界線を持つことが多い。黒色腫は辺縁がギザギザの不規則的な境界線を持つ可能性がより高い。色- 黒子は一様な褐色であることが多い。黒色腫は2つ以上の色を持つ傾向がある。それらは黒色、赤色、ピンク色、白色または青みがかった色合いの混ざった様々に変わる色合いの褐色になりうる。直径- 黒子は通常、鉛筆のとがっていない末端(直径で約6 mm)よりも大きくはない。黒色腫は直径が7 mmを超えることが多い。正常な黒子は皮膚から隆起されることがありおよび/または有毛であるかもしれない。痒み、痂皮形成または出血も黒色腫では生じるかもしれない- これらはあまり見られない徴候であるが、無視されるべきではない(cancerbacupインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をHermans et al., Cancer Res. 2003 Dec 1;63(23):8408-13; Ramont et al., Exp Cell Res. 2003 Nov 15;291(1):1-10; Safwat et al., J Exp Ther Oncol. 2003 Jul-Aug;3(4):161-8; およびFidler, I.J., Nat New Biol. 1973 Apr 4;242(118):148-9で記述されているものに類似のマウス黒色腫モデルで評価することができる。
慢性骨髄性白血病(CML)は、成人に主に影響を及ぼす稀有なタイプのがんである。これは顆粒球(白血球の主なタイプの1つ)のがんである。CMLでは、あまりにも多くの顆粒球が産生され、それらは未成熟で適切に働くことができないのに血中に放出される。未成熟な白血球は芽球として知られる。その他のタイプの血球の産生も乱される。通常、白血球は自身を規則正しく統制された方法で修復し再生するが、慢性骨髄性白血病では、この過程はコントロールが利かなくなり、細胞は分裂し続け、異常に成熟する。この疾患は非常にゆっくり発症することが多く、その疾患が「慢性」骨髄性白血病と呼ばれる所以である(cancerbacupインターネットウェブサイト)。
CMLはゆっくり発症する(進行する)ので、その初期で検出するのは困難である。別の理由で血液検査が行われる場合にだけ、これが発見されることがある。CMLの症状は漠然で非特異的であることが多く、骨髄中の異常な白血球数の増加と正常な血球数の低下により引き起こされ、つまり腹部左側の膨満感または柔らかい瘤である。これは、CMLでは、脾臓が肥大化しうるためである。脾臓は腹部左側の肋骨の直下にある臓器である。これは血液をろ過し、使い古された赤血球を除去する。脾臓の腫脹は胃に圧力をもたらすこともあり、これが消化不良や食欲不振につながる可能性があり、疲労を感じる人や、赤血球の欠如(貧血)が原因で青ざめて見える人もおり、血中の血小板数の低下が原因で出血しやすいまたはあざができやすいと気付く人もいるかもしれない。通常よりもあざができやすい他に、特殊なタイプのあざが見られることがある。これは、脚上にまたは口内によく見られる小さな血液様の斑点からなり、点状出血と呼ばれる。女性はその生理がずっと重くなるのが分かるかもしれない。しかしながら、これらの症状および徴候は稀有であり、全身性の痒みに気付く人もいるかもしれない。慢性骨髄性白血病はあらゆる年齢層で起こりうるが、中高年者や高齢者に影響を及ぼすことがいっそう多い。慢性骨髄性白血病は小児では稀有である(cancerbacupインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をRen, R., Oncogene. 2002 Dec 9;21(56):8629-42; Wertheim et al., Oncogene. 2002 Dec 9;21(56):8612-28; およびWolff et al., Blood. 2001 Nov 1;98(9):2808-16で記述されているものに類似のマウス慢性骨髄性白血病モデルで評価することができる。
非ホジキンリンパ腫はリンパ系のがんの一種である。2つの主なタイプのリンパ腫が存在する。一方はホジキン病と呼ばれる(最初にこれを報告したHodgkin博士にちなんで付けられた)。もう一方は非ホジキンリンパ腫と呼ばれる。異なる約20タイプの非ホジキンリンパ腫が存在する。ホジキン病のほとんどの症例では、Reed-Sternberg細胞として知られる特定の細胞が生検中に見られる。この細胞はその他のリンパ腫では通常見られず、したがってそれらは非ホジキンリンパ腫と呼ばれる。これには極めて大きな違いがあるとは思われないかもしれないが、ホジキン病の治療と非ホジキンリンパ腫の治療はまるで異なりうるので、それは重要である(cancerbacupインターネットウェブサイト)。
多くの場合、非ホジキンリンパ腫の最初の徴候は頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹である。その他の症状としては以下のいずれかを挙げることができる：寝汗または不明の高温(熱)；食欲不振、不明の体重減少および極度の疲労；小児では咳または息切れが出始めることがある。小児らは腹痛を訴えることもあり、またはあなた方は自分の子の腹部にある瘤、持続的な身体中の皮膚の痒みに気付くかもしれない(cancerbacupインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をAnsell et al., Leukemia. 2004 Mar;18(3):616-23; De Jonge et al., J Immunol. 1998 Aug 1;161(3):1454-61; およびSlavin et al., Nature. 1978 Apr 13;272(5654):624-6で記述されているものに類似のマウス非ホジキンリンパ腫モデルで評価することができる。
尿細管の細胞のがん性変化を伴う腎臓がんの1形態、腎細胞がんは、成人に最も多く見られるタイプの腎臓がんである。その細胞ががん化する理由は分かっていない。喫煙歴は腎細胞がんを発症する危険性を大いに高める。腎細胞がんを発症する危険性の増大を遺伝で受け継いだ人もいるかもしれず、腎臓がんの家族歴は危険性を高める。フォン・ヒッペル・リンドウ病、つまり脳の毛細血管に影響を及ぼす遺伝性疾患を有する人々は、腎細胞がんを発症することも多い。治療に透析を必要とする腎臓疾患も腎細胞がんを発症する危険性を高める。最初の症状は通常、血尿である。時には、両方の腎臓が含まれる。このがんは、ほとんどの場合には肺およびその他の臓器に容易に転移しまたは拡がり、約3分の1の患者は診断の時点で転移がある(Medline Plus Medical Encyclopediaインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をSayers et al., Cancer Res. 1990 Sep 1;50(17):5414-20; Salup et al., Immunol. 1987 Jan 15;138(2):641-7; およびLuan et al., Transplantation. 2002 May 27;73(10):1565-72で記述されているものに類似のマウス腎細胞がんモデルで評価することができる。
子宮頸は、膣内に開口する子宮の頸部である。子宮頸がん腫とも呼ばれる子宮頸がんは、子宮頸の表面の異常細胞から発症する。子宮頸がんは、女性に影響を及ぼす最も多く見られるがんの1つである。子宮頸がんに先立って、子宮頸の表面の細胞の形成異常、前がん性の変化が通常起きる。これらの異常細胞は浸潤がんに進行しうる。いったんがんが現れると、これは4つの病期を通じて進行しうる。病期はがんの拡散の範囲により定義される。がんが拡散しているほど、それだけ治療は広範囲になる可能性が高い。2つの主なタイプの子宮頸がんが存在する：(1) 扁平上皮型(類表皮がん)：これは最もよく見られるタイプであり、子宮頸がんの約80%〜85%を占めている。このがんは性感染症により引き起こされうる。そのような性病の1つがヒト乳頭腫ウイルスであり、これは性器いぼを引き起こす。がん性腫瘍が子宮頸の上や中で増殖する。このがんは一般に、子宮頸の表面で始まり、パップスメアにより初期で診断されうる。(2) 腺がん：このタイプの子宮頸がんは子宮頸管内の子宮頸管腺中の組織から発症する。初期子宮頸がんは通常、症状を引き起こさない。このがんは通常、パップスメアおよび骨盤内診察により検出される。これが、あなた方が性的に活発になったらすぐにパップスメアおよび骨盤内診察を受け始めるべきであるという理由である。性交経験がない健常な若い女性は、18歳までに最初の年1回の骨盤内診察を受けるべきである。後期の子宮頸がんは月経の間、性交後、または閉経後などの、予期せぬ時に異常な膣出血または血染めの排泄物をもたらす。異常な膣排泄物は濁るかまたは血の混じることがあり、あるいは悪臭を有する粘液を含むことがある。進行期のがんは痛みを引き起こしうる(University of Michigan Health Systemインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をAhn et al., Hum Gene Ther. 2003 Oct 10;14(15):1389-99; Hussain et al., Oncology. 1992;49(3):237-40; およびSengupta et al., Oncology. 1991;48(3):258-61で記述されているものに類似のマウス子宮頸がんモデルで評価することができる。
大部分の頭頸部のがんは、がん腫(具体的には扁平上皮細胞がん)と呼ばれるタイプのものである。頭頸部のがん腫は、口、鼻、咽喉もしくは耳の内層、または舌を覆う表層を形成する細胞で始まる。しかしながら、頭頸部のがんはその他のタイプの細胞から発症することがある。リンパ腫はリンパ系の細胞から発症する。肉腫は、筋肉、軟骨または血管を構成する支持細胞から発症する。黒色腫は、眼や皮膚に色を与えるメラノサイトと呼ばれる細胞から始まる。頭頸部がんの症状は、そのがんがある場所に依存するはずであり、例えば、舌のがんはいくらかの言語不明瞭を引き起こすことがある。最もよく見られる症状は、数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位；嚥下困難、または咀嚼時もしくは嚥下時の痛み；持続性の騒がしい呼吸、不明瞭な発語またはしわがれた声などの、呼吸または発話の問題；口内の麻痺感；持続性の鼻詰まり、または鼻血；持続性の耳痛、耳鳴り、または難聴；口内または頸部の腫脹または瘤；顔または上顎の痛みであり；煙草を吸うまたは噛む人では、前がん性の変化が口の内層に、または舌の上に生じることがある。これらはしつこい白斑(白斑症)または赤斑(紅斑症)として出現しうる。それらは通常、無痛であるが、痛むこともあり、出血するかもしれない(Cancerbacupインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をKuriakose et al., Head Neck. 2000 Jan;22(1):57-63; Cao et al., Clin Cancer Res. 1999 Jul;5(7):1925-34; Hier et al., Laryngoscope. 1995 Oct;105(10):1077-80; Braakhuis et al., Cancer Res. 1991 Jan 1;51(1):211-4; Baker, S.R., Laryngoscope. 1985 Jan;95(1):43-56; およびDong et al., Cancer Gene Ther. 2003 Feb;10(2):96-104で記述されているものに類似のマウス頭頸部腫瘍モデルで評価することができる。
甲状腺乳頭がんおよび濾胞性甲状腺がんは、全ての甲状腺がんの80〜90パーセントを占める。両タイプとも甲状腺の濾胞細胞から始まる。大部分の甲状腺乳頭がんおよび濾胞性甲状腺がんは、ゆっくり増殖する傾向がある。それらが早期に検出されれば、大部分は成功裏に治療されうる。甲状腺髄様がんは甲状腺がん症例の5〜10パーセントを占める。これは濾胞細胞ではなく、C細胞で発生する。甲状腺髄様がんは、これが身体の他の部分に拡がる前に発見され治療されれば、よりコントロールし易い。未分化甲状腺がんは最も少ないタイプの甲状腺がんである(症例のほんの1〜2パーセント)。これは濾胞細胞で発生する。このがん細胞はかなり異常であり、認識するのが困難である。このタイプのがんは通常、コントロールするのがとても難しい。このがん細胞がとても早く増殖し拡散する傾向があるためである。早期甲状腺がんは症状を引き起こさないことが多い。しかしがんが増殖するにつれて、症状としては以下を挙げることができる：のど仏に近い頚部の最前部における、瘤、もしくは小結節；嗄声もしくは普通の声での発話困難；とりわけ頚部でのリンパ節の腫れ；嚥下もしくは呼吸困難；または咽頭もしくは頚部の痛み(国立がん研究所(National Cancer Institute)のインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をQuidville et al., Endocrinology. 2004 May;145(5):2561-71 (マウスモデル); Cranston et al., Cancer Res. 2003 Aug 15;63(16):4777-80 (マウスモデル); Zhang et al., Clin Endocrinol (Oxf). 2000 Jun;52(6):687-94 (ラットモデル); およびZhang et al., Endocrinology. 1999 May;140(5):2152-8 (ラットモデル)で記述されているものに類似のマウスまたはラット甲状腺腫瘍モデルで評価することができる。
脳組織で始まる腫瘍は、脳の原発性腫瘍として知られる。原発性脳腫瘍は、細胞のタイプまたはそれらが始まる脳の部分にしたがって名付けられている。最もよく見られる原発性脳腫瘍は神経膠腫である。それらは膠細胞で始まる。多くのタイプの神経膠腫が存在する。(1) 星状細胞腫- この腫瘍は、星状細胞と呼ばれる星形の細胞から発生する。成人では、星状細胞腫は大脳で発生することが最も多い。小児では、それらは脳幹、大脳、および小脳に生ずる。グレードIIIの星状細胞腫は未分化星状細胞腫と呼ばれることもある。グレードIVの星状細胞腫は多形性膠芽腫と呼ばれることが多い。(2) 脳幹神経膠腫- この腫瘍は脳の最下部に生ずる。脳幹神経膠腫は幼児および中年成人で診断されることが最も多い。(3) 上衣細胞腫- この腫瘍は、脳室または脊髄中心管の内側を覆う細胞から発生する。それらは小児および若年成人で最も多く見られる。(4) 乏突起膠腫- この稀有な腫瘍は、神経を覆い保護する脂肪質の物質を作出する細胞から発生する。これらの腫瘍は大脳に生ずることが多い。それらはゆっくり増殖し、周辺脳組織の中に拡がらないことが多い。それらは中年成人で最も多く見られる。脳腫瘍の症状は腫瘍のサイズ、タイプ、および位置に依る。腫瘍が神経を圧迫するかまたは脳の特定の領域に損傷を与えると、症状が引き起こされる可能性がある。脳が肥大するかまたは脳液が頭蓋骨内で増加すると、同様に症状が引き起こされる可能性がある。以下は脳腫瘍で最も多い症状である：頭痛(午前中に悪いことが多い)；悪心または嘔吐；発語、視力、または聴力の変化；平衡または歩行の問題；気分、性格、または集中力の変化；記憶障害；筋肉の引きつりまたは単収縮(発作またはけいれん)；および腕または脚のしびれまたはうずき(国立がん研究所(National Cancer Institute)のインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をSchueneman et al., Cancer Res. 2003 Jul 15;63(14):4009-16; Martinet et al., Eur J Surg Oncol. 2003 May;29(4):351-7; Bello et al., Clin Cancer Res. 2002 Nov;8(11):3539-48; Ishikawa et al., Cancer Sci. 2004 Jan;95(1):98-103; Degen et al., J Neurosurg. 2003 Nov;99(5):893-8; Engelhard et al., Neurosurgery. 2001 Mar;48(3):616-24; Watanabe et al., Neurol Res. 2002 Jul;24(5):485-90; およびLumniczky et al., Cancer Gene Ther. 2002 Jan;9(1):44-52で記述されているものに類似の神経膠腫動物モデルで評価することができる。
多発性骨髄腫はがんの一種である。これは、形質細胞と呼ばれるある種の白血球に影響を及ぼす。がんが形質細胞を冒す場合、身体はこれらの細胞をますます多く産生し続ける。不必要な形質細胞、つまりすべて異常でかつすべて全く同じ細胞は、骨髄腫細胞と呼ばれる。骨髄腫細胞は骨髄の中におよび骨の硬質な外側部分の中に集まる傾向がある。それらはたった1つの骨の中に集まり、形質細胞腫と呼ばれる、単一の塊、または腫瘍を形成することがある。しかしながら、ほとんどの場合、骨髄腫細胞は多くの骨の中に集まり、多くの腫瘍を形成して、その他の問題を引き起こすことが多い。これが起こる場合に、この疾患は多発性骨髄腫と呼ばれる。骨髄腫細胞は骨髄の中におよび骨の硬質な外側部分の中に集まる傾向がある。それらはたった1つの骨の中に集まり、形質細胞腫と呼ばれる、単一の塊、または腫瘍を形成することがある。しかしながら、ほとんどの場合、骨髄腫細胞は多くの骨の中に集まり、多くの腫瘍を形成して、その他の問題を引き起こすことが多い。これが起こる場合に、この疾患は多発性骨髄腫と呼ばれる。多発性骨髄腫を有する人々は異常に多い数の同一の形質細胞を有するので、その人々は非常に多くの1種の抗体も有する。これらの骨髄腫細胞および抗体は、いくつかの深刻な医学的問題を引き起こしうる：(1) 骨髄腫細胞は数が増えるにつれて、それらは骨を損ない弱体化し、痛みや時には骨折を引き起こす。骨痛は患者が動くことを困難にしうる；(2) 骨が損なわれると、カルシウムが血中に放出される。これは高カルシウム血症、つまり非常に多くの血中カルシウムをもたらすかもしれない。高カルシウム血症は食欲不振、悪心、のどの渇き、疲労、筋衰弱、情動不安、および錯乱を引き起こしうる；(3) 骨髄腫細胞は骨髄が正常な形質細胞および免疫系にとって重要なその他の白血球を形成するのを妨げる。患者は感染症や疾患に対抗することができないかもしれない；(4) がん細胞は同様に、新たな赤血球の増殖を抑制し、貧血を引き起こすかもしれない。貧血を有する患者は異常に疲れまたは脱力感を覚えるかもしれない；ならびに(5) 多発性骨髄腫患者はその腎臓に深刻な問題を抱えるかもしれない。過剰な抗体タンパク質およびカルシウムは、腎臓が血液を適切にろ過し浄化するのを妨害しうる。多発性骨髄腫の症状は、疾患がいかに進行しているかに依る。疾患の最も初期には、症状がないかもしれない。症状が実際に生じる場合、患者はたいてい背部または肋骨に、骨痛を有することが多い。患者は同様に、骨折、衰弱、疲労、体重減少、または反復性感染症を有するかもしれない。疾患が進行している場合、症状としては悪心、嘔吐、便秘、排尿の問題、および脚の衰弱またはしびれを挙げることができる(国立がん研究所のインターネットウェブサイト)。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をOyajobi et al., Blood. 2003 Jul 1;102(1):311-9; Croucher et al., J Bone Miner Res. 2003 Mar;18(3):482-92; Asosingh et al., Hematol J. 2000;1(5):351-6; およびMiyakawa et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 9;313(2):258-62で記述されているものに類似の多発性骨髄腫マウスモデルで評価することができる。
腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果をヒト小/非小細胞肺がん異種移植モデルで評価することができる。手短に言えば、ヒト腫瘍を免疫不全マウスに移植し、これらのマウスをIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質単独であるいは腫瘍増殖を評価することで処置の効力を実証するように利用できるその他の薬剤との併用で用いて処置する(Nemati et al., Clin Cancer Res. 2000 May;6(5):2075-86; およびHu et al., Clin Cancer Res. 2004 Nov 15;10(22):7662-70)。
アポトーシスの強力な誘導因子Apo2L/TNF関連のアポトーシス誘導リガンド(TRAIL)は、これが正常細胞と比べて形質転換細胞でアポトーシスを選択的に誘導することから、潜在的な腫瘍特異的がん治療薬として刺激的な期待をもたらした。インターフェロン(IFN)はTRAIL発現の重要な調節因子であり、したがってこのリガンドはウイルス感染および悪性転換に対する監視で重要な役割を果たすように思われる。Fiorucci et al., Curr Pharm Des. 2005;11(7):933-44。IL-28およびIL-29は同様に、TRAILの重要な制御因子であるように思われる(実施例41を参照されたく、そこではTRAILがIL-29により上方制御されている)。
C. 自己免疫障害を治療するためのIL-28およびIL-29の使用
本発明は
Figure 2008508310
の群から選択されるポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、自己免疫障害と関連する状態もしくは症状を治療する、予防する、その状態もしくは症状の進行を阻害する、その状態もしくは症状の発症を遅らせる、および/またはその状態もしくは症状の少なくとも1つを軽減する方法であって、自己免疫障害が多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
1. 関節リウマチ
関節リウマチは、身体の免疫応答が身体自身のタンパク質、具体的にはコラーゲン、つまり多くの組織、とりわけ関節の基礎となるタンパク質に向けられる自己免疫障害である。こうして生じたコラーゲンに対する免疫応答は、関節破壊の原因となる。長期にわたると患者は手足を動かすことができなくなり、関節や膝に激痛を覚える。関節炎患者の血清中ではTNFα(tumor necrosis factor)の量とコラーゲンに対する抗体量が増加するが、このどちらも慢性疾患の指標というだけでなく疾患の病態にも寄与する(Smolen and Stein+er G, Nat. Rev. Drug Discov., 2:473-488, 2003; Firestein, Nature 423:356-361, 2003.)。さらに、この疾患はCD4+ T細胞により惹起され媒介される。DCはCD4+ T細胞にコラーゲンを抗原として提示する。コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、ヒトの場合に見られるこの疾患をかなりの程度まで反映している関節リウマチのマウスモデルである(Moore, Methods Mol. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol., 56:12-34, 2002)。CFAに乳化させたコラーゲンを尾基部に2回投与してマウスに免疫する。この結果、足に腫脹が生じ、この腫脹は一定期間にわたって増大し、目視評価とキャリパーによる測定が可能である。IL-28A、IL-28B、またはIL-29をコラーゲン免疫マウス群に投与し、疾患スコアに対する効果を評価する。IL-28A、IL-28B、およびIL-29による足部スコアと足部腫脹の阻害は、進行中の自己免疫応答に対するその阻害効果を示すものである。
2. 炎症性腸疾患
炎症性腸疾患(IBD)として知られる、免疫制御不全に起因する腸内の炎症は、2つの大きな疾患定義、つまりクローン病(CD)と潰瘍性大腸炎(UC)に特徴付けられる。一般的に、CDはTh1応答の制御の不全が原因であると思われており、UCはTh2応答の制御の不全が原因であると考えられている。複数のサイトカイン、ケモカイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼは、IBD患者由来の炎症病変部で上方制御されることが明らかにされている。これらにはIL-1、 IL-12、 IL-18、 IL-15、 TNF-α、 IFN-γ、 MIP1α、 MIP1β、およびMIP2が含まれる。現在のところREMICADE(登録商標) (Centocor, Malvern, PA)は、CD患者を治療する際に疾患そのものを標的とするよう成功裏に用いられている唯一の薬物であり、その他の治療は患者の生活の質を一般に向上させる。IBDに関連する自己免疫応答のIL-28A、IL-28B、およびIL-29による阻害は、マウスDSSモデル、マウスTNBSモデル、マウスCD4+CD45Rbhiモデル、マウスmdr 1a-/-モデルおよびマウス移植片対宿主病(GVHD)腸炎症モデルなどの、IBDモデルで実証されている(Stadnicki A and Colman RW, Arch Immunol Ther Exp 51:149-155, 2003; Pizarro TT et al., Trends in Mol Med 9:218-222. 2003)。ヒトIBDの実験モデルの1つは、齧歯類へのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の経口投与である。DSSは、ヒトでの組織学的所見に幾分似た特徴を有する急性と慢性の両方の潰瘍性大腸炎を誘発する。DSSにより誘発される大腸炎は、腸内細菌、マクロファージおよび好中球に影響し、T細胞およびB細胞の役割は小さい(Mahler et al., Am. J. Physiol. 274:G544-G551, 1998; Egger et al., Digestion 62:240-248, 2000)。TNBS誘発大腸炎はTh1媒介性疾患と考えられており、したがってヒトでのUCよりもCDに似ている。トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を様々な用量(系統依存的)でマウスに直腸内注入して、Th1様サイトカインIL-12、IL-18およびIFNγの分泌を伴う、抗原(TNBS)特異的なT細胞応答を誘発する。大腸炎は、炎症部位への抗原特異的T細胞、マクロファージおよび好中球の動員を伴う(Neurath et al., Int. Rev. Immunol., 19:51-62, 2000; Dohi T et al., J. Exp. Med. 189:1169-1179, 1999)。別の比較的新しい大腸炎モデルは、SCIDマウスへのCD4+CD45RBhi移入モデルである。CD4+ T細胞はCD45Rbの発現に基づき2種に大別することができる。CD4+CD45RBhi細胞はナイーブT細胞と考えられるが、CD4+CD45Rbloは制御性T細胞と考えられる。同系SCIDマウスへのCD4+ T細胞全体の移入では大腸炎の症状が誘発されない。しかしながら、CD4+CD45RBhi T細胞のみがSCIDマウスに注射されれば、マウスは3〜6週間かけて大腸炎を発症する。ナイーブT細胞に加えてCD4+CD45Rblo制御性T細胞を同時移入することで大腸炎が阻害されることから、制御性T細胞が免疫応答の制御に重要な役割を果たしていることが示唆される(Leach et al., Am. J. Pathol., 148:1503-1515, 1996; Powrie et al., J. Exp. Med., 179:589-600, 1999)。このモデルは、IL-28A、IL-28B、およびIL-29がマウスで寛容原性DCを生み出すその能力を介しT制御性機能を上方制御することによって大腸炎を阻害することを実証すると考えられる。骨髄移植に付随する、臨床的に関連のある大腸炎モデルはGVHD誘発大腸炎である。移植片対宿主病(GVHD)は、免疫不適格性の、組織適合性レシピエントのエフェクター細胞で発症し、その細胞が増殖して宿主細胞を攻撃する。同種骨髄移植を受けた患者または重篤な再生不良性貧血患者はGVHDの危険性がある。マウスでもヒトでも、下痢はこの症候群の共通した深刻な症状である。ヒトでは結腸と小腸の両方の疾患が認められている。マウスGVHD誘発大腸炎モデルは、ヒトで見られるような類似の組織学的疾患を示す。したがって、これらのマウスモデルを利用して、GVHDに対する大腸炎阻害薬の効力を評価することができる(Eigenbrodt et al., Am. J. Pathol., 137:1065-1076, 1990; Thiele et al., J. Clin. Invest., 84:1947-1956, 1989)。
3. 全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス(SLE)は、偏在性の自己抗原(抗dsDNA)に対する慢性的なIgG抗体産生を特徴とする免疫複合体関連の障害である。SLEの影響は特定臓器に局在化するというより、むしろ全身性である。多数の染色体座がこの疾患に関連しており、抗dsDNA抗体や糸球体腎炎などの、疾患の様々な局面に寄与すると考えられる。CD4+ T細胞は、マウスSLEモデルにおいて積極的な役割を果たすことが明らかにされている(Horwitz, Lupus 10:319-320, 2001; Yellin and Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 2000)。CD8+ T細胞の役割は明確には定義されていないが、「サプレッサー」CD8+ Tの機能が狼瘡患者では損なわれていることを示唆する証拠がある(Filaci et al., J. Immunol., 166:6452-6457, 2001; Sakane et al., J. Immunol., 137:3809-3813, 1986)。
ヒトSLE患者およびマウスモデル由来の血清をIL-28A、IL-28B、およびIL-29活性についてアッセイする。IL-28A、IL-28B、またはIL-29を用いて培養後のヒトSLE患者由来のPBLにおけるCD8+ T細胞サプレッサー活性をインビトロで評価する。SLE患者由来のCD8+ T細胞のサプレッサー活性は、抗CD3誘導性の自己PBMCの増殖を阻害するその能力により評価する。阻害機能は、培養物中のIFNγおよびIL-6の分泌と相関する。IL-28A、IL-28B、またはIL-29処置患者由来の培養物におけるIFNγおよびIL-6の増加から、いっそう高いサプレッサー活性が示唆され得る(Filaci et al., J. Immunol. 166:6452-6457, 2001)。
4. 乾癬
乾癬は慢性の炎症性皮膚疾患であり、増殖性表皮角化細胞やCD4+記憶T細胞、好中球およびマクロファージを含む、浸潤性単核球と関連する(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996)。環境抗原が疾患の病態の開始や原因に重要な役割を果たすと現在では考えられている。しかしながら、乾癬の病態を媒介すると思われるのは自己抗原に対する寛容の喪失である。樹状細胞およびCD4+ T細胞は、病態をもたらす免疫応答を媒介する抗原の提示と認識で重要な役割を果たすと思われる。CD4+CD45RB移入モデルに基づく乾癬のモデルが最近になって開発された(Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672 (2002))。乾癬誘導細胞を注射されているマウスにIL-28A、IL-28B、またはIL-29を投与し、臨床スコア(皮膚疾患)に対する効果を評価し、IL-28A、IL-28B、およびIL-29の有益な効果を明らかにする。
IL-28A、IL-28B、またはIL-29はインターフェロン-α(IFN-α、例えば、PEGASYS(登録商標)、PEG-INTRON(登録商標)、INFERGEN(登録商標)、Albuferon-Alpha(商標))、インターフェロン-β(IFN-β、例えば、AVONEX(登録商標)、BETASERON(登録商標)、REBIF(登録商標))、インターフェロン-γ(IFNγ、例えば、ACTIMMUNE(登録商標))、NOVANTRONE(登録商標)、ENBREL(登録商標)、REMICADE(登録商標)、LEUKINE(登録商標)、APO2L/TNF関連のアポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、IL-21およびIL-2などの薬剤を含む自己免疫および/またはがんで既に用いられているその他の薬剤との併用で投与することができる。IL-28A、IL-28B、およびIL-29に関する至適用量の確立および投与計画は、IL-28A、IL-28B、およびIL-29の薬物動態研究および薬力学研究、動物モデルでの有効用量の決定、ならびにIL-28A、IL-28B、およびIL-29の毒性の評価を含め、様々な手段により行われる。その後、霊長類で行われる直接的な薬物動態測定や治験を利用して、患者での生物学的応答を達成するのに十分な大きさおよび持続時間のものである血漿IL-28A、IL-28B、およびIL-29レベルを達成する患者での理論的用量を予測することができる。
本発明を、以下の非限定的な例によりさらに説明する。
実施例
実施例1
哺乳動物発現プラスミド
zcyto20およびzcyto21を含む発現プラスミドは、相同組換えを介して構築された。zcyto20およびzcyto21 cDNAの断片は、PCR増幅を利用して作出された。PCRのプライマーは以下の通りであった：
zcyto20/pZMP21: zc40923およびzc43152、それぞれSEQ ID NO:42および43；ならびにzcyto21/pZMP21: zc40922およびzc43153、それぞれSEQ ID NO:72および73。
PCR反応混合物を1%アガロースゲルで泳動し、関心対象のサイズに相当するバンドをQIAquick(商標) Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA)によりゲルから抽出した。
プラスミドpZMP21は、これをBglIIで切断し、PCRインサート断片との組換えに使用した。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、およびコード配列の挿入用の複数の制限部位を有する発現カセット；大腸菌の複製起点；SV40プロモーター、複製のエンハンサーおよび起点、DHFR遺伝子、ならびにSV40ターミネーターを含む哺乳動物の選択可能マーカー発現ユニット；ならびにS.セレビシエでの選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARS配列を含んだ哺乳動物発現ベクターである。これはpZP9 (アクセッション番号98668の下で、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託された)からpRS316 (アクセッション番号77145の下で、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託された)から取った酵母遺伝要素、ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)要素、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを用いて構築された。
コンピテント酵母(S.セレビシエ)細胞100マイクロリットルをインサートDNA 10 μlおよび上記の切断済みpZMP21ベクター100 ngと個別に混ぜ合わせ、この混合物を0.2 cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物に0.75 kV (5 kV/cm)、∞オーム、および25 μFの電源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)設定を用いて電気パルスをかけた。1.2 Mソルビトール600 μlをキュベットに加え、この酵母混合物を2枚のURA-Dプレートに100 μlおよび300 μlの分割量で蒔き、30℃でインキュベートした。約72時間後、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体をH2O 1 mlに再懸濁し、短時間スピンして、酵母細胞をペレット状にした。細胞ペレットを溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mMトリス、pH 8.0、1 mM EDTA) 0.5 mlに再懸濁した。酸洗浄されたガラスビーズ250 μlおよびフェノール-クロロホルム300 μlを含有するエッペンドルフチューブに溶解混合物500マイクロリットルを加え、これを3分間ボルテックスし、エッペンドルフ遠心機中で最大速度にて5分間スピンした。水相300マイクロリットルを新しいチューブに移し、DNAをエタノール(EtOH) 600 μlおよび3 M酢酸ナトリウム30 μlで沈殿させ、引き続き最大速度で30分間の遠心を行った。DNAペレットをTE 30 μlに再懸濁した。
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(MC1061)の形質転換は、酵母DNA調製物5 μlおよび細胞50 μlを用いて行った。細胞に2.0 kV、25 μF、および400オームで電気パルスをかけた。エレクトロポレーションに続いて、SOC (2% Bacto (商標) Trypton (Difco, Detroit, MI)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 1 mlを加え、その後、2枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標)アガー(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)に50 μlおよび200 μlの分割量で蒔いた。
各構築体に対し3クローンのインサートを配列解析に供し、各構築体に対し、正確な配列を含む1クローンを選択した。さらに大量のプラスミドDNAは、市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)を製造元の使用説明書にしたがって用い単離した。正確な構築体をzcyto20/pZMP21およびzcyto21/pZMP21と名付けた。
実施例2
CHO細胞での哺乳動物構築体の発現
zcyto20/pZMP21およびzcyto21/pZMP21の構築体200 μgを37℃で3時間 Pvu I 200単位を用いて消化し、その後、IPAで沈殿させて、1.5 mL遠心管中でスピンダウンした。上清をペレットからデカント除去し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機中14,000 RPMで10分間スピンし、上清をペレットから吸引除去した。その後、ペレットを無菌環境中でPF-CHO培地750 μlに再懸濁し、60℃で30分間インキュベートさせた。CHO細胞をスピンダウンし、DNA-培地液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションした：950 μF、高電気容量、および300 V。その後、PF-CHO培地を用いてキュベットの内容物を取り出し、25 mLにまで希釈し、125 mL振盪フラスコに入れた。このフラスコを振盪機上で37℃、6% CO2のインキュベーターに入れて、120 RPMで振盪させた。
実施例3
zcyto20-CHOタンパク質の精製および分析
A. Zcyto20-CHOタンパク質の精製
組換えzcyto20 (IL-28A)タンパク質は、DXB11-CHO細胞系のプールから産生された。培養物を収集し、培地を0.2 μmフィルターにより滅菌ろ過した。
zcyto20-CHOタンパク質の精製は、Poros HS 50カラム(Applied Biosystems, Framingham, MA)、Monolithic WCXカラム(Isco, Inc., Lincoln, NE)、ToyoPearl Butyl 650Sカラム(TosoH, Montgomeryville, PA)、およびSuperdex 75カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)の逐次的使用により達成された。Poros 50 HSカラムに負荷する前に、DXB111-CHO由来の培地をpH 6.0に調整した。カラムを50 mM MES (2-モルホリノエタンスルホン酸)、100 mM NaCl、pH 6で洗浄し、結合タンパク質を60%の50 mM MES、2 M NaCl、pH 6までの10カラム容量(CV)の直線勾配を用いて溶出した。溶出した画分を収集し、SDS-PAGEによりクマシー染色を用いてzcyto20タンパク質の存在を確認した。このzcyto20タンパク質を含む画分をプールし、再蒸留水を用いて約20 mSの伝導度にまで希釈し、Monolithic WCXカラムに負荷した。カラムを93%の50 mM MES、100 mM NaCl、pH 6、および7%の50 mM MES、2 M NaCl、pH 6で洗浄した。結合タンパク質を7%〜50%の50 mM MES、2 M NaCl、pH 6の25 CVの直線勾配を用いて溶出した。溶出した画分を収集し、SDS-PAGEによりクマシー染色を用いてzcyto20タンパク質の存在を確認した。zcyto20タンパク質を含む画分をプールし、1 M硫酸アンモニウムにまで調整し、ToyoPearl Butyl 650Sカラムに負荷した。Zcyto20を硫酸アンモニウムの逓減的勾配により溶出し、純粋なzcyto20を含む画分をプールし、Superdex 75カラムへの注入を目的に濃縮した。ゲルろ過カラムからのzcyto20タンパク質含有画分をプールし、濃縮し、0.2 μmフィルターに通してろ過し、-80℃で凍結した。最終精製タンパク質の濃度をBCAアッセイ(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)およびHPLC-アミノ酸分析により測定した。
B. zcyto20-CHOタンパク質のSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング分析
SDS-PAGE (Nupage 4〜12%ビストリス, Invitrogen, Carlsbad, CA)およびzcyto20-CHOタンパク質に交差反応する一次抗体としてウサギ抗zcyto21-CEE-BV IgGを用いたウエスタンブロットにより、組換えzcyto20タンパク質を分析した。ゲルをInvitrogen社のXcell IIミニセル(Carlsbad, CA)を用いて電気泳動し、Invitrogen社のXcell IIブロットモジュールを機器マニュアルに提供されている使用法にしたがって用い0.2 μmのニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に転写した。転写は25 mMトリスベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含有する緩衝液中50分間500 mAで行った。この膜を10%脱脂粉乳の1×PBS液で10分間ブロッキングし、次いで一次抗体の2.5%脱脂粉乳含有1×PBS液を用いてプローブした。ブロットを振盪させながら室温で1時間標識した。二次抗体標識のため、ブロットをPBSで3回各10分間洗浄し、次いでヤギ抗ウサギIgG-HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を用いて1時間プローブした。ブロットを1×PBSで3回各10分間洗浄し、SuperSignal(登録商標) ULTRA試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)の1:1混合液を用いて発色させ、Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Germany)を用いてシグナルを捕捉した。
C. タンパク質精製および分析の概要
CHO培地から精製されたzcyto20タンパク質は非還元条件下、4〜12%ビストリスゲルでおよそ20 kDaに二重線および約38 kDaに少ない三重線の二量体として主に移動した。それらはみな、還元条件下では単一の20 kDaのバンドにまとまった。MSペプチドマッピングにより、ジスルフィド結合に関して2つの異性体の混合物およびO-結合型グリコシル化部位の存在が示唆された。
実施例4
zcyto21-CHOタンパク質の精製および分析
A. Zcyto21-CHOタンパク質の精製
組換えzcyto21は安定なDXB11-CHO細胞系から産生された。培養物を収集し、培地を0.2 μmフィルターにより滅菌ろ過した。疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーに先立ち、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組合せから始めることにより、タンパク質を馴化培地から精製した。Poros 50 HSカラム(Applied Biosystems, Framingham, MA)に負荷する前に、DXB111-CHO培地をpH 6.0に調整した。カラムを1×PBS、pH 6で洗浄し、結合タンパク質を5×PBS、pH 8.4で溶出した。溶出した画分を収集し、SDS-PAGEによりクマシー染色を用いてzcyto21タンパク質の存在を確認した。その後、この画分を13 mSの伝導度にまで希釈し、そのpHを8.4に調整し、Poros 50 HQカラム(Applied Biosystems, Framingham, MA)に通した。次いで、zcyto21タンパク質を含有する素通り画分(flow-through)を硫酸アンモニウムで約127 mSに調整し、Toyopearl Phenyl 650Sカラム(TosoH, Montgomeryville, PA)に負荷した。Zcyto21タンパク質を硫酸アンモニウムの逓減的勾配により溶出し、純粋なzcyto21を含む画分をプールし、Superdex 75カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)への注入を目的に濃縮した。最終精製タンパク質の濃度をBCAアッセイ(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)およびHPLC-アミノ酸分析により測定した。
B. zcyto21-CHOタンパク質のSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング分析
SDS-PAGE (Nupage 4〜12%ビストリス, Invitrogen, Carlsbad, CA)および一次抗体としてウサギ抗zcyto21-CEE-BV IgGを用いたウエスタンブロットにより、組換えzcyto21タンパク質を分析した。ゲルをInvitrogen社のXcell IIミニセル(Carlsbad, CA)を用いて電気泳動し、Invitrogen社のXcell IIブロットモジュールを機器マニュアルに提供されている使用法にしたがって用い0.2 μmのニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に転写した。転写は25 mMトリスベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含有する緩衝液中50分間500 mAで行った。この転写ブロットを10%脱脂粉乳の1×PBS液で10分間ブロッキングし、次いで一次抗体の2.5%脱脂粉乳含有1×PBS液を用いてプローブした。ブロットを振盪させながら室温で1時間標識した。二次抗体標識のため、ブロットをPBSで3回各10分間洗浄し、次いでヤギ抗ウサギIgG-HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を用いて1時間プローブした。ブロットを1×PBSで3回各10分間洗浄し、SuperSignal(登録商標) ULTRA試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)の1:1混合液を用いて発色させ、Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Germany)を用いてシグナルを捕捉した。
C. タンパク質精製および分析の概要
CHO培地から精製されたzcyto21タンパク質は還元および非還元の両条件下、4〜12%ビストリスゲルで2本またはそれ以上のおよそ28 kDaのバンドとして移動した。MSペプチドマッピングにより、ジスルフィド結合に関して2つの異性体の混合物ならびに1つのN-結合型グリコシル化部位およびいくつかのO-結合型グリコシル化部位の存在が示唆された。
実施例5
IL-29型の同定
精製されたIL-29プール由来のピーク画分を、シークエンシンググレードのトリプシン(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)をおよそpH 6.3のリン酸緩衝液中で用い37℃で一晩消化して、ジスルフィド再構成を抑えた。各消化物を四重極飛行時間ハイブリッド型質量分析計(Micromass, Milford MA)にインライン連結された逆相HPLC (Agilent, Palo Alto, CA)により分析した。スペクトルを収集し、質量対電荷比から質量に変換し、IL-29のトリプシン消化から生じる全ての理論的なペプチドおよびジスルフィド結合ペプチドの組合せと比較した。還元前後のスペクトルを適切な質量の帰属と比較することにより、ジスルフィドをIL-29のジスルフィド結合ペプチドに帰属した。画分＃20由来の材料物質はS-グルタチオニルシステインとして観測されたC171とともにジスルフィドパターンC15-C112およびC49-C145 (全てSEQ ID NO:4を参照されたい)を示した。画分＃51由来の材料物質はS-グルタチオニルシステインとして観測されたC15とともにジスルフィドパターンC49-C145およびC112-C171 (SEQ ID NO:4を参照されたい)を示した。
実施例6
大腸菌発現プラスミド
発現ベクターpTAP237の構築
プラスミドpTAP237は相同組換えによりpTAP186のSma I部位にPCR生成リンカーを挿入することで生成された。プラスミドpTAP186はプラスミドpRS316 (サッカロマイセスセレビシエ・シャトルベクター)ならびにpMAL-c2、つまりpKK223-3に由来し、tacプロモーターおよびrrnBターミネーターを含む大腸菌発現プラスミドから得られた。プラスミドpTAP186は、Sma I部位が破壊されているカナマイシン耐性遺伝子を含み、酵母ARS-CEN6およびURA3配列に隣接するNot IおよびSfi I部位を有しており、Not Iを用いた消化によるプラスミドからのその除去が容易である。PCR生成リンカーにより、pTAP186の発現カプラー配列を合成RBS II配列に置き換えた。それはSEQ ID NO:44および45に示される、それぞれ、オリゴヌクレオチドzc29,740およびzc29,741の各100 pmol、ならびにSEQ ID NO:46および47に示される、それぞれ、オリゴヌクレオチドzc29,736およびzc29,738の各およそ5 pmolから調製された。これらのオリゴヌクレオチドは94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃30秒間を10サイクル、その後4℃に浸漬のPCRにより結合された。得られたPCR産物を2倍量の100%エタノールを用いた沈殿によって濃縮した。Sma Iで消化されたレシピエントベクターpTAP186に組入れるために用いられるようペレットを水10 μLに再懸濁して、合成RBS II配列を含む構築体を産生した。PCR生成リンカーおよそ1 μgおよびSma Iで消化されたpTAP186 100 ngをともに混合し、コンピテント酵母細胞(S.セレビシエ)に形質転換した。酵母を次いで-URA Dプレートに蒔き、約72時間室温で放置した。その後、単一プレート由来のUra+形質転換体をH2O 1 mLに再懸濁し、短時間スピンして、酵母細胞をペレット状にした。細胞ペレットを溶解緩衝液0.5 mlに再懸濁した。DNAを回収し、大腸菌MC1061に形質転換した。SEQ ID NO:44および45に示される、それぞれオリゴヌクレオチドzc29,740およびzc29,741を各20 pmol用いて上記に開示されているコロニーPCRにより、クローンをスクリーニングした。アガロースゲルで正確なサイズのバンドを示すクローンを配列解析に供した。正確なプラスミドをpTAP237と名付けた。
実施例7
IL-29システイン突然変異体のコドン最適化
A. IL-29野生型発現構築体のコドン最適化生成
天然ヒトIL-29遺伝子配列は、大腸菌株W3110では十分に発現されなかった。IL-29のコード配列で使われるコドンの検討から、その配列はCAI値が0.206に等しく大腸菌で使用頻度が最も低いコドンを過剰に含むことが示唆された。CAIは同義語コドンの偏りの統計的尺度であり、タンパク質産生のレベルを予測するのに使用することができる(Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95, 1987)。高度に発現されるタンパク質をコードする遺伝子は、高いCAI値(＞0.6)を持つ傾向がある一方で、低いCAI値(≦0.2)を有する遺伝子によってコードされるタンパク質は一般に非効率的に発現される。このことから大腸菌でIL-29の産生が低いことの理由が示唆された。さらに、稀有なコドンが遺伝暗号の後半に密集しており、翻訳失速、翻訳の早期終了、およびアミノ酸の誤取込みの可能性が高くなる(Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):494-500, 1995)。
ある種の稀有なtRNAのレベルが宿主内で増やされると、遺伝子が稀有なコドンを含んだタンパク質の発現レベルが劇的に改善されうることが明らかにされている(Zdanovsky et al., Applied Enviromental Microb. 66:3166-3173, 2000; You et al,. Biotechniques 27:950-954, 1999)。pRAREプラスミドは、大腸菌でめったに使われない幾つかのコドンに対するtRNAをコードする遺伝子(argU、argW、leuW、proL、ileXおよびglyT)を保有する。これらの遺伝子はその天然プロモーターのコントロール下にある(Novy, 前記)。pRAREとの同時発現は大腸菌でのIL-29の産生を増強し、およそ200 mg/Lをもたらす。これらのデータは、IL-29をコードする遺伝子をより適切なコドン使用頻度を使って再合成することで、大量のIL-29の発現用に改善されたベクターが得られることを示唆している。
コドン最適化済のIL-29コード配列は、16種の重複オリゴヌクレオチド、
Figure 2008508310
から構築された。これらの重複オリゴヌクレオチドのプライマー伸長後のPCR増幅によって、コドンが大腸菌での発現用に最適化された完全長のIL-29遺伝子が産生された。最終PCR産物を酵母相同組換えにより発現ベクターpTAP237に挿入した。発現構築体を酵母から抽出し、コンピテント大腸菌MC1061に形質転換した。カナマイシンに耐性のクローンをコロニーPCRにより同定した。陽性クローンを配列決定により検証し、その後に産生宿主菌株W3110に形質転換した。最適化済のIL-29配列を有する発現ベクターをpSDH184と命名した。得られた遺伝子は大腸菌で非常によく発現された。新たな構築体での発現レベルは250 mg/L前後にまで増加した。
B. コドン最適化済のzcyto21 C172Sシステイン突然変異体発現構築体の作出
zcyto21 C172Sシステイン突然変異体を作出するために使われた戦略は、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)に基づく。プライマーは製造元の指示に基づいてC172S突然変異を導入するようデザインされた。これらのプライマーをZG44,340 (SEQ ID NO:58)およびZG44,341 (SEQ ID NO:59)と名付けた。QuikChange Mutagenesisの使用説明書にしたがいPCRを行って、zcyto21 C172Sシステイン突然変異体を作出した。同一の50 μlの反応液5つを用意した。1反応当たりpSDH175 (酵母ベクターの骨格配列を欠く) DNA 2.5 μlを鋳型として使用した。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを作成した：10×PCR緩衝液30 μl、ZG44,340 125 ng (27.42 μl)、ZG44,341 125 ng (9.18 μl)、dNTP 6 μl、Pfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA) 6 μl、および水206.4 μl。このカクテル47.5 μlを各反応液に等分した。PCR条件は次の通りであった：95℃30秒間を1サイクル、その後95℃30秒間、55℃1分間、68℃7分間を16サイクル、その後68℃7分間を1サイクル、および4℃維持で終了。5つのPCR反応液の全てを1本のチューブにまとめた。製造元の使用説明書の通り、制限酵素Dpn I 5 μlをPCR反応液に加え、37℃で2時間インキュベートした。10% 3 M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールを加えることで、DNAを沈殿させた。沈殿は-20℃で20分間行われた。DNAを14,000 rpmで5分間スピンし、ペレットを高速真空乾燥した。DNAペレットを水20 μlに再懸濁した。PCRから生じたDNAを大腸菌株DH10Bに形質転換した。DNA 5 μlをElectroMAX DH10B細胞(Invitrogen) 40 μlと混合した。次いで、細胞およびDNA混合物を1.75 kV、100 Ω、および25 μFに設定されたBio-Rad Gene Pulser II (商標)により0.1 cmのキュベット(Bio-Rad)中でエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を37℃で1時間増殖させた。混合物をLB + 25 μg/mlのカナマイシンプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。10クローンをzcyto21 C172Sインサートの存在についてスクリーニングした。QIAprep (商標) Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いてDNAを10クローンの全てから単離し、制限酵素Xba IおよびPst Iを用い切断することによりインサートの存在について分析した。9クローンがインサートを含んでおり、これらを配列決定して、zcyto21 C172S突然変異が導入されていることを確実にした。クローンを配列検証し、その後にpSDH188と名前を付けた。
実施例8
大腸菌IL-29発現構築体
野生型配列を含むIL-29のDNA断片はPCRを用いて単離した。41塩基対(bp)のベクターフランキング配列およびIL-29のアミノ末端に対応する24 bpを含んだプライマーzc41,212 (SEQ ID NO:60)、ならびにzcyto21インサートを含むベクターの3'末端に対応する38 bpを含んだプライマーzc41,041 (SEQ ID NO:61)を反応で使用した。PCR条件は次の通りであった：94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃1分間を25サイクル、その後4℃浸漬。分析のためPCRサンプルのうちの少量サンプル(2〜4 μL)を1×TBE緩衝液を用いて1%アガロースゲルで泳動したところ、予想されたおよそ500 bp断片のバンドが見られた。反応液100 μLのうちの残存容量を無水エタノール200 μLで沈殿した。上記に開示されるようにSma Iで切断されたレシピエントベクターpTAP238に組入れるために用いられるようペレットを水10 μLに再懸濁して、zcyto21をコードする構築体を産生した。正確な配列を有するクローンをpTAP377と名付けた。クローンpTAP377をNot 1/Nco 1 (37℃で1時間、DNA 10 μl、buffer 3 New England BioLabs 5 μl、Not 1 2 μL、Nco 1 2 μL、水31 μL)で消化し、T4 DNAリガーゼ緩衝液で再連結した(先の消化物7 μL、5×緩衝液2 μL、T4 DNAリガーゼ1 μL)。この段階により酵母配列CEN-ARSを除去して、ベクターを簡素化した。pTAP337 DNAをPvu 2およびPst 1で診断的に消化して、酵母配列が存在しないことを確認した。過剰コピーの稀有な大腸菌tRNA遺伝子を保有する宿主菌株である大腸菌株W3110/pRAREに、P/taP377 DNAを形質転換した。
実施例9
大腸菌IL-28A発現構築体
zcyto20の野生型配列(SEQ ID NO:1に示される)を含むDNA断片はPCRを用いて単離した。41 bpのベクターフランキング配列およびzcyto20のアミノ末端に対応する24 bpを含んだプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)、ならびにzcyto20インサートを含むベクターの3'末端に対応する38 bpを含んだプライマーzc43,437 (SEQ ID NO:63)。PCR条件は次の通りであった：94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃1分間を25サイクル、その後4℃浸漬。分析のためPCRサンプルのうちの少量サンプル(2〜4 μL)を1×TBE緩衝液を用いて1%アガロースゲルで泳動したところ、予想されたおよそ500 bp断片のバンドが見られた。反応液100 μLのうちの残存容量を無水エタノール200 μLで沈殿した。上記に開示されるようにSma Iで切断されたレシピエントベクターpTAP238に組入れるために用いられるようペレットを水10 μLに再懸濁して、zcyto20をコードする構築体を産生した。正確な配列を有するクローンをpYEL7と名付けた。これをNot 1/Nco 1 (37℃で1時間DNA 10 μl、buffer 3 New England BioLabs 5 μl、Not 1 2 μL、Nco 1 2 μL、水31 μL)で消化し、T4 DNAリガーゼ緩衝液で再連結した(先の消化物7 μL、5×緩衝液2 μL、T4 DNAリガーゼ1 μL)。この段階により酵母配列CEN-ARSを除去して、ベクターを簡素化した。再連結されたpYEL7 DNAをPvu 2およびPst 1で診断的に消化して、酵母配列が存在しないことを確認した。PYEL7 DNAを大腸菌株W3110/pRAREに形質転換した。
実施例10
zcyto21 C172Sシステイン突然変異体発現構築体
zcyto21 C172Sシステイン突然変異体(SEQ ID NO:28)を作出するために使われた戦略は、QuikChange (登録商標) Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)に基づく。プライマーは製造元の指示に基づいてC172S突然変異を導入するようデザインされた。これらのプライマーをZG44,327およびZG44,328 (それぞれSEQ ID NO:64および65)と名付けた。QuikChange Mutagenesisの使用説明書にしたがいPCRを行って、zcyto21 C172Sシステイン突然変異体を作出した。同一の50 μlの反応液5つを用意した。1反応当たりpTAP377 (酵母ベクターの骨格配列を欠く) DNA 2.5 μlを鋳型として使用した。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを作成した：10×PCR緩衝液30 μl、ZG44,327 (SEQ ID NO:64) 125 ng (27.42 μl)、ZG44,328 (SEQ ID NO:65) 125 ng (9.18 μl)、dNTP 6 μl、Pfu Turboポリメラーゼ(Strategene) 6 μl、および水206.4 μl。このカクテル47.5 μlを各反応液に等分した。PCR条件は次の通りであった：95℃30秒間を1サイクル、その後95℃30秒間、55℃1分間、68℃7分間を16サイクル、その後68℃7分間を1サイクル、および4℃維持で終了。5つのPCR反応液の全てを1本のチューブにまとめた。製造元の使用説明書の通り、制限酵素Dpn I 5 μlをPCR反応液に加え、37℃で2時間インキュベートした。10% 3 M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノール(Aaper Alcohol, Shelbyville, KY)を加えることで、DNAを沈殿させた。沈殿は-20℃で20分間行われた。DNAを14,000 rpmで5分間スピンし、ペレットを高速真空乾燥した。DNAペレットを水20 μlに再懸濁した。PCRから生じたDNAを大腸菌株DH10Bに形質転換した。DNA 5 μlをElectroMAX DH10B細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 μlと混合した。次いで、細胞およびDNA混合物を1.75 kV、100 Ω、および25 μFに設定されたBio-Rad Gene Pulser II (商標)により0.1 cmのキュベット(Bio-Rad, Hercules, CA)中でエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を37℃で1時間増殖させた。混合物をLB + 25 μg/mlのカナマイシンプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。10クローンをIL-29インサートの存在についてスクリーニングした。QIAprep (商標) Spin Miniprep Kit (Qiagen)を用いてDNAを10クローンの全てから単離し、制限酵素Xba I (Roche)およびPst I (New England Biolabs)を用い切断することによりインサートの存在について分析した。9クローンがインサートを含んでおり、これらを配列決定して、zcyto21 C172S突然変異が導入されていることを確実にした。クローン(isolet＃6)を配列検証し、その後にpSDH171と名前を付けた。類似の戦略を実践してzcyto21 C15S突然変異体を作出することができる。
実施例11
zcyto20 C49Sシステイン突然変異体発現構築体
zcyto20 C49Sシステイン突然変異体のコード配列は、重複PCRにより作出された(SEQ ID NO:20)。野生型IL-28A配列(SEQ ID NO:1)の最初の187塩基は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc45,399 (SEQ ID NO:66)を用いPCR増幅によって作出された。塩基105〜531の第二のDNA断片は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45,398 (SEQ ID NO:68)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いPCR増幅によって作出された。プライマーzc45,399 (SEQ ID NO:66)およびzc45,398 (SEQ ID NO:68)には、49位のシステインをセリンに換えた特定の改変配列が含まれていた。これらの2つのPCR産物を混ぜ合わせ、オリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いて重複PCR増幅した。最終PCR産物を酵母相同組換え(Raymond et al. Biotechniques. Jan. 26(1):134-8, 140-1, 1999)により発現ベクターpTAP238に挿入した。発現構築体を酵母から抽出し、コンピテント大腸菌DH10Bに形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによりスクリーニングした。陽性クローンを配列決定により検証し、その後に産生宿主菌株W3110/pRAREに形質転換した。zcyto20 C49Sシステイン突然変異体のコード配列を有する発現構築体をpCHAN9と命名した。
実施例12
zcyto20 C51Sシステイン突然変異体発現構築体
zcyto20 C51Sシステイン突然変異体のコード配列は、重複PCRにより作出された(SEQ ID NO:24)。野生型IL-28A配列の最初の193塩基は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc45,397 (SEQ ID NO:63)を用いPCR増幅によって作出された。塩基111〜531の第二のDNA断片は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45,396 (SEQ ID NO:70)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いPCR増幅によって作出された。プライマーzc45,397 (SEQ ID NO:69)およびzc45,396 (SEQ ID NO:70)には、51位のシステインをセリンに換えた特定の改変配列が含まれていた。これらの2つのPCR産物を混ぜ合わせ、オリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いて重複PCR増幅した。最終PCR産物を酵母相同組換え(Raymond et al. 前記)により本発明者らの社内発現ベクターpTAP238に挿入した。発現構築体を酵母から抽出し、コンピテント大腸菌DH10Bに形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによりスクリーニングした。陽性クローンを配列決定により検証し、その後に産生宿主菌株W3110/pRAREに形質転換した。zcyto20 C50Sシステイン突然変異体のコード配列を有する発現構築体をpCHAN10と命名した。
実施例13
大腸菌でのIl-28A、IL-29およびCysからSerへのシステイン突然変異体の発現
別の実験では、実施例6〜9に記述される発現ベクターの各々を用いて形質転換された大腸菌を0.01% Antifoam 289 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)、30 μg/mlカナマイシン、35 μg/mlクロラムフェニコール入りのSuperbroth II培地(Becton Dickinson, San Diego, CA) 100 mLに植菌し、37℃で一晩培養した。植菌液5 mLを2 L培養フラスコ中の同一培地500 mLに加え、培養物のOD600が4に達するまでフラスコを37℃にて250 rpmで振盪させた。その後、IPTGを1 mMの終濃度にまで加え、振盪をさらに2.5時間続けた。細胞を4℃で10分間4,000×gにて遠心分離した。後で使用するまで、細胞ペレットを-80℃で凍結した。
実施例14
IL-28のリフォールディングおよび精製
A. 封入体調製
ヒト野生型IL-29は前述のように大腸菌株W3110で封入体として発現された。流加発酵由来の細胞ペレットを50 mMトリス, pH 7.3に再懸濁した。懸濁液を8000 psiで3回APV-Gaulinホモジナイザー(Invensys APV, Tonawanda, New York)に通した。不溶性の材料物質を15,000 gで30分間の遠心分離により回収した。このペレットを50 mMトリス、1% (v/v) Triton X100、pH 7.3および4 M尿素で連続的に洗浄した。その後、封入体を室温で1時間50 mMトリス、6 M塩酸グアニジン、5 mM DTTに分散させた。この材料物質を次に15,000 gで1時間遠心分離した。この段階の上清には、還元された可溶性IL-29が含まれる。
B. リフォールディング
可溶化されたIL-29を50 mMトリス、pH 8、0.75 Mアルギニン、0.05% PEG3350、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、0.4 mM KCl、10 mM NaCl、4 mM還元グルタチオン、0.8 mM酸化グルタチオンに撹拌しながら室温で徐々に希釈した。このリフォールディング緩衝液中のIL-29の終濃度は0.1 mg/mlであった。リフォールディング混合物を室温で一晩放置した。その後、濃縮酢酸を用いてこの懸濁液のpHを5に調整した。懸濁液を次いで、0.2 μmフィルターに通してろ過した。リフォールディング混合物のRP-HPLC分析により、2本の顕著なピークが示された。
C. 精製
リフォールディング混合物を50 mM NaOAcによってpH 5にインライン希釈(1:2)し、Pharmacia SP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラム(North Peapack, NJ)に負荷した。カラムを50 mM NaOAc、400 mM NaCl、pH 5の3カラム容量で洗浄した。結合したIL-29を50 mM NaOAc、1.4 M NaCl、pH 5で溶出させた。固体(NH4)2SO4を陽イオン交換段階の溶出プールに、(NH4)2SO4の終濃度が0.5 Mとなるように加えた。次いで、この材料物質をToyoPearl Phenyl 650S HICカラム(Tosoh Biosep, Montgomery, PA)に負荷した。次に、カラムを50 mM NaOAc、1 M (NH4)2SO4、pH 5の3カラム容量で洗浄した。50 mM NaOAc、1 M (NH4)2SO4、pH 5から50 mM NaOAc、pH 5までの10カラム容量の直線勾配を利用して、結合したzcyto21を溶出させた。画分を溶出液から集めた。2本の顕著なピークがこの段階で観測された。溶出画分のRP-HPLC分析を行った。2つのジスルフィド結合異性体に相当する2つの産物がPBS、pH 7.3への最後の緩衝液交換の後に得られた。
実施例15
IL-29システイン突然変異体のリフォールディングおよび精製
実施例3に記述されているように、IL-29の精製により2つのジスルフィド結合異性体を得た。HIC FPLC段階を利用して、2つの形態を分離した。この分離はベースライン分割されなかった。実質的に純粋な異性体(>95%)を得るために厳格な「ピークカット(Peak Shaving)」が用いられなければならなかった。この段階の、ひいてはその過程全体の収率が悪化した。最終の収率はC15-C112形態およびC112-C171形態のそれぞれに対し8%および9%であった。CHOおよびバキュロウイルス(BV)系で産生された野生型IL-29も類似の現象を示した。異性体のC15-C112形態はジスルフィド結合パターンがタイプI IFNのものと相同であることが立証された。C15-C112形態は同様に、ISREアッセイでC112-C171形態よりも30倍高い生物活性を実証した(以下を参照されたい)。
zcyto21 Cys172Ser突然変異タンパク質のリフォールディングおよび精製
zcyto21 C172Sポリペプチド(SEQ ID NO:29)の封入体調製、リフォールディングおよび精製は、本質的にIL-29野生型(SEQ ID NO:4)のものと同じである。突然変異タンパク質のリフォールディング混合物のRP-HPLC分析では、野生型IL-29のC15-C112形態に相当する顕著なピーク1本しか示されなかった。その後のHICクロマトグラフィーにより、単一のピークしか示されていない。したがって、厳格な「ピークカット」を利用する必要はなかった。その過程全体の最終の収率は50%に近い。zcyto21 Cys172Serポリペプチド(SEQ ID NO:29)は、実施例16で示されるISREアッセイでの野生型IL-29のC15-C112形態に等しい生物活性を示した。
実施例16
肝臓およびリンパ球サブセットでのIL-28RA mRNAの発現
IL-28RAに対するmRNAの分布をさらに調べるため、SDS 7900HTシステム(Applied Biosystems, CA)を用いて半定量RT-PCRを行った。各サンプルに対する全RNA 100 ngおよび遺伝子特異的プライマーを用いて、一段階RT-PCRを行った。Bjab RNAを用い各プライマーセットについて標準曲線を作成し、全てのサンプル値をHPRTに対し正規化した。IFNAR2およびCRF2-4に対する正規化値も示される。
（表７）B細胞およびT細胞は有意なレベルのIL-28RA mRNAを発現する。樹状細胞および大部分の単球では低いレベルが見られる。
Figure 2008508310
表8に示されるように、正常な肝臓組織および肝臓由来の細胞系は実質的なレベルのIL-28RAおよびCRF2-4のmRNAを示す。
（表８）
Figure 2008508310
表9に示されるように、初代気道上皮細胞は豊富なレベルのIL-28RAおよびCRF2-4を含む。
（表９）
Figure 2008508310
表10に示されるように、IL-28RAは、正常および罹患肝臓検体に存在し、C型肝炎およびB型肝炎に感染した検体由来の組織で発現が増加している。
（表１０）
Figure 2008508310
表11〜15に示されるように、IL-28RAは正常B細胞、Bリンパ腫細胞系、T細胞、Tリンパ腫細胞系(Jurkat)、正常および形質転換リンパ球(B細胞およびT細胞)ならびに正常ヒト単球において検出可能である。
（表１１）
Figure 2008508310
（表１２）
Figure 2008508310
（表１３）
Figure 2008508310
（表１４）
Figure 2008508310
（表１５）
Figure 2008508310
実施例17
マウスIL-28はマウスB細胞に増殖抑制効果を及ぼさない
MACS磁気ビーズを用いてCD43+細胞を枯渇させることで、マウスB細胞を2つのBalb/C由来脾臓(7月齢)から単離した。精製されたB細胞をLPS、抗IgMまたは抗CD40モノクローナル抗体とともにインビトロで培養した。マウスIL-28またはマウスIFNαを培養物に加え、3H-チミジンを48時間の時点で加え、3H-チミジンの取込みを72時間の培養後に測定した。
IFNαは10 ng/mlで、LPSまたは抗IgMのいずれかで刺激されたマウスB細胞による3H-チミジンの取込みを阻害した。しかしながら、IL-28は、1000 ng/mlを含め任意の試験濃度で3H-チミジンの取込みを阻害しなかった。対照的に、mIFNαおよびマウスIL-28は両方とも抗CD40 MAbで刺激されたマウスB細胞による3H-チミジンの取込みを増加させた。
これらのデータは、マウスIL-28がIFNaとは異なり、高濃度でさえも増殖抑制活性を示さないことを実証している。さらに、zcyto24は抗CD40 MAbの存在下で増殖を促進させる。この結果から、マウスIL-28が高濃度でさえもマウスB細胞に対し増殖抑制活性を示さないという点で、マウスIL-28がIFNαとは異なることが例証される。さらに、マウスIL-28は抗CD40モノクローナル抗体の存在下で増殖を促進させる。
実施例18
骨髄増殖アッセイ
新鮮なヒト骨髄単核細胞(Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.)をαMEM、10%FBS、50マイクロモルβ-メルカプトエタノール、2 ng/ml FLT3L中37℃で2時間プラスチックに付着させた。非付着細胞を、その後、1000 ng/ml IL-29-CEE、100 ng/ml IL-29-CEE、10 ng/ml IL-29-CEE、100 ng/ml IFN-α2a、10 ng/ml IFN-α2aまたは1 ng/ml IFN-α2aの存在下または非存在下でαMEM、10%FBS、50マイクロモルβ-メルカプトエタノール、2 ng/ml FLT3L中25,000〜45,000個の細胞/ウェル(96ウェル組織培養プレート)に蒔いた。これらの細胞を様々なサイトカインとともにインキュベートして、骨髄由来造血細胞の増殖または分化について試験した(20 ng/ml IL-2、2 ng/ml IL-3、20 ng/ml IL-4、20 ng/ml IL-5、20 ng/ml IL-7、20 ng/ml IL-10、20 ng/ml IL-12、20 ng/ml IL-15、10 ng/ml IL-21またはサイトカインの添加なし)。8〜12日後、Alamar Blue (Accumed, Chicago, Ill)を20マイクロリットル/ウェルで添加した。プレートを37℃、5%COで24時間さらにインキュベートした。プレートをFmax (商標)プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.)に載せ波長544 (励起)および590 (発光)で、SoftMax (商標) Proプログラムを用い測定した。Alamar Blueは細胞の代謝活性に基づいて蛍光分析による読出しをもたらし、したがって、陰性対照に比べた細胞増殖の直接的測定である。
IFN-α2aは全ての試験条件下で骨髄増殖の有意な阻害を引き起こした。対照的に、IL-29はIL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21の存在下でまたはサイトカインの添加なしで骨髄細胞の増殖に有意な効果がなかった。骨髄細胞増殖のわずかな阻害がIL-2またはIL-15の存在下で見られた。
実施例19
可溶性受容体(zcytoR19/CRF2-4)を用いたIL-28およびIL-29シグナル伝達の阻害
A. シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを利用して、zcyto20、zcyto21およびzcyto24シグナル伝達に対するzcytor19-Fc4ホモ二量体およびzcytor19-Fc/CRF2-4-Fcヘテロ二量体可溶性受容体の阻害特性を示すことができる。zcytor19受容体を過剰発現するヒト胚性腎臓(HEK)細胞にルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を駆動するインターフェロン刺激応答配列(ISRE)を含むレポータープラスミドをトランスフェクトする。リガンド(zcyto20 (SEQ ID NO:2)、zcyto21 (SEQ ID NO:15)、zcyto24 (SEQ ID NO:8)を含む)を用いてのトランスフェクト細胞の刺激後のルシフェラーゼ活性は、可溶性受容体とのリガンドの相互作用を反映している。
B. 細胞トランスフェクション
zcytor19を過剰発現する293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした：DMEM 2ミリリットル＋10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ18時間前に293細胞700,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、pISRE-ルシフェラーゼDNA (Stratagene) 1マイクログラムおよびpIRES2-EGFP DNA (Clontech) 1マイクログラムを、DMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 6マイクロリットルに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293細胞に30分後に加えた。24時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから取り除き、96ウェルマイクロタイタープレート中におよそ細胞25,000個/ウェルで蒔き直した。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5%FBSに交換した。
C. シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った：DMEM＋0.5%FBS中37℃で18時間インキュベーションの後、トランスフェクト細胞を10 ng/ml zcyto20、zcyto21またはzcyto24および10マイクログラム/mlの以下の可溶性受容体で刺激した；ヒトzcytor19-Fcホモ二量体、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4-Fcヘテロ二量体、ヒトCRF2-4-Fcホモ二量体、マウスzcytor19-Igホモ二量体。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後に照度計で相対発光単位(RLU)を測定した。得られる結果は、PBSのみの存在下でのシグナル伝達に対する可溶性受容体の存在下でのリガンド誘導性のシグナル伝達の阻害割合として示される。表16は、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4ヘテロ二量体の可溶性受容体が、zcyto20、zcyto21およびzcyto24誘導性のシグナル伝達を対照の16〜45%阻害できることを示している。ヒトzcytor19-Fcホモ二量体の可溶性受容体もzcyto21誘導性のシグナル伝達を45%阻害することができる。huCRF2-4-Fcまたはmuzcytor19-Igホモ二量体の可溶性受容体では有意な効果は見られなかった。
（表１６）可溶性受容体によるリガンド誘導性のインターフェロン刺激応答配列(ISRE)シグナル伝達の阻害割合
Figure 2008508310
実施例20
IL-28およびIL-29によるインターフェロン刺激遺伝子の誘導
A. ヒト末梢血単核細胞
新たに単離されたヒト末梢血単核細胞をIL-29 (20 ng/mL)、IFNα2a (2 ng/ml) (PBL Biomedical Labs, Piscataway, NJ)の存在下で、または培地のみで増殖させた。細胞を6、24、48、または72時間インキュベートし、その後、全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。Taqman One-Step RT-PCR Master Mix (登録商標)試薬および遺伝子特異的プライマーを製造元(Applied Biosystems, Branchburg, NJ)により推奨されるように利用し、全RNA 100 ngをOne-Step Semi-Quantitative RT-PCR (登録商標)の鋳型として用いた。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表17は、IL-29が、試験された全ての時点でヒト末梢血単核細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
（表１７）
Figure 2008508310
B. 活性化ヒトT細胞
ヒトT細胞はPan T-cell Isolation (登録商標)キットを製造元(Miltenyi, Auburn, CA)の使用説明書にしたがって用い、新たに収集された末梢血単核細胞から陰性選択により単離された。T細胞を、その後、プレートに結合した抗CD3、可溶性抗CD28 (0.5 ug/ml) (Pharmingen, San Diego, CA)およびインターロイキン2 (IL-2; 100 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN)で5日間活性化し増殖させて、洗浄し、その後、IL-2とともにさらに5日間増殖させた。活性化および増殖の後、細胞をIL-28A (20 ng/ml)、IL-29 (20 ng/ml)または培地のみで3、6、または18時間刺激した。全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。One-Step Semi-Quantitative RT-PCR (登録商標)を上記の実施例で記述されているように行った。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表18は、IL-28およびIL-29が、試験された全ての時点で活性化ヒトT細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
（表１８）
Figure 2008508310
C. 初代ヒト肝細胞
2人の別個のドナー(Cambrex, Baltimore, MDおよびCellzDirect, Tucson, AZ)由来の新たに単離されたヒト肝細胞をIL-28A (50 ng/ml)、IL-29 (50 ng/ml)、IFNα2a (50 ng/ml)、または培地のみで24時間刺激した。刺激後、全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。One-step semi-quantitative RT-PCRを上記の実施例で前述されているように行った。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表19は、IL-28およびIL-29が24時間の刺激後に初代ヒト肝細胞でインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
（表１９）
Figure 2008508310
D. HepG2およびHuH7：ヒト肝臓肝細胞がん細胞系
HepG2およびHuH7細胞(ATCC NOS. 8065, Manassas, VA)をIL-28A (10 ng/ml)、IL-29 (10 ng/ml)、IFNα2a (10 ng/ml)、IFNB (1 ng/ml) (PBL Biomedical Piscataway, NJ)、または培地のみで24または48時間刺激した。別個の培養では、HepG2細胞を20 ng/mlのMetIL-29C172S-PEGまたはMetIL-29-PEGで上記のように刺激した。全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。全RNA 100 ngをone-step semi-quantitative RT-PCRの鋳型として前述のように用いた。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表20は、IL-28およびIL-29が24および48時間後にHepG2およびHuH7肝臓肝細胞がん細胞系においてISG発現を誘導することを示している。
（表２０）
Figure 2008508310
（表２１）
Figure 2008508310
示されるデータは24時間の培養後の20 ng/mlの、IL-29のmetIL-29-PEGおよびmetIL-29C172S-PEGバージョンを表す。
示されるデータはHPRTに対し正規化されており、非刺激細胞に比べた倍誘導として示されている。
実施例21
IL-28、IL-29、metIL-29-PEGおよびmetIL-29C172S-PEGはマウス肝臓細胞系AML-12においてISG誘導を刺激する
インターフェロン刺激遺伝子(ISG)は、タイプIインターフェロン(IFN)により、同様にIL-28およびIL-29ファミリー分子により誘導される遺伝子であり、IFNならびにIL-28およびIL-29が抗ウイルス活性に至る類似経路を誘導することを示唆している。ヒトタイプI IFN (IFNα1-4およびIFNβ)は、マウス細胞に対しほとんどまたは全く活性をもたず、これは種間反応性の欠如に起因するものと思われる。ヒトIL-28およびIL-29がマウス細胞に対し効果を及ぼすかどうかを試験するため、ヒトIL-28およびIL-29によるISG誘導をマウス肝臓由来の細胞系AML-12でのリアルタイムPCRにより評価した。
AML-12細胞を6ウェルプレート中の完全DMEM培地に細胞2×106個/ウェルの濃度で蒔いた。細胞を蒔いてから24時間後に、ヒトIL-28およびIL-29を20 ng/mlの濃度で培養物に加えた。対照として、細胞をマウスIFNα (陽性対照)または刺激なし(陰性)のいずれかで刺激した。CHO由来のヒトIL-28A (SEQ ID NO:2)またはIL-29 (SEQ ID NO:15)の添加から8、24、48および72時間後に細胞を収集した。RNAEasy-kit(登録商標) (Qiagen, Valencia, CA)を用いてRNAを細胞ペレットから単離した。RNAをDNase (Millipore, Billerica, MA)で処理して、RNAを任意の混入DNAから清浄化した。Perkin-Elmer RTミックスを用いてcDNAを作出した。マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーおよびプローブを用いリアルタイムPCRによって、ISG遺伝子の誘導を評価した。定量的なデータを得るため、HPRTリアルタイムPCRをISG PCRと二重にした。標準曲線は、IFN刺激マウスPBL由来のRNAの既知量を用いて得た。データは全て内部HPRT発現に比べた発現として示されている。
ヒトIL-28AおよびIL-29は、マウス肝細胞細胞系AML-12においてISG誘導を刺激し、タイプI IFNとは異なり、IL-28/29ファミリータンパク質が異種間反応性を示すことを実証した。
（表２２）
Figure 2008508310
示される全てのデータは、HPRT遺伝子発現に対する倍数として表されている。
OAS mRNAのng
内部HPRT mRNAのng
= ハウスキーピング遺伝子、HPRTに対するOAS mRNA量の正規化値
1例として、48時間時点のデータが示されている。
（表２３）
Figure 2008508310
細胞を20 ng/ml MetIL-29-PEGまたはmetIL-29C172S-PEGで24時間刺激した。
示されるデータはHPRTに対し正規化されており、非刺激細胞に比べた倍誘導として示されている。
実施例22
ISGはヒトIL-29を発現するトランスジェニックマウスの脾臓において効率的に誘導される
Eu-lckプロモーターのコントロール下でヒトIL-29を発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作出した。ヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物学的活性を有するかどうかを研究するため、ISGの発現をEu-lck IL-29トランスジェニックマウスの脾臓におけるリアルタイムPCRにより分析した。
トランスジェニックマウス(C3H/C57BL/6)は、Eu-lckプロモーターのコントロール下でヒトIL-29遺伝子を発現する構築体を用いて作出された。このプロモーターはT細胞およびB細胞において活性である。トランスジェニックマウスおよびその非トランスジェニック同腹仔(n=2/gp)を約10週齢で殺処理した。マウスの脾臓を単離した。RNAEasy-kit(登録商標) (Qiagen)を用いてRNAを細胞ペレットから単離した。RNAをDNaseで処理して、RNAを任意の混入DNAから清浄化した。Perkin-Elmer RT (登録商標)ミックスを用いてcDNAを作出した。マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーおよびプローブ(5'FAM、3'NFQ)を用いリアルタイムPCRによって、ISG遺伝子の誘導を評価した。定量的なデータを得るため、HPRTリアルタイムPCRをISG PCRと二重にした。さらに、標準曲線はIFN刺激マウスPBLの既知量を用いて得た。データは全て内部HPRT発現に比べた発現として示されている。
IL-29 Tgマウスから単離された脾臓は、その非Tg同腹仔対照と比較してISG OAS、PkrおよびMx1の高誘導を示し、ヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物学的に活性であることを示唆した。
（表２４）
Figure 2008508310
示される全てのデータはHPRT遺伝子発現に対する倍発現である。マウス2匹での平均発現が示されている。
実施例23
ヒトIL-28およびIL-29タンパク質はマウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現を誘導する
ヒトIL-28およびIL-29がインビボでインターフェロン刺激遺伝子を誘導するかどうかを測定するため、CHO由来ヒトIL-28AおよびIL-29タンパク質をマウスに注射した。さらに、大腸菌由来IL-29を同様に、MetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29-PEGを用いて上記のようにインビボアッセイで試験した。様々な時点でおよび異なる用量で、ISG遺伝子誘導をマウスの血液、脾臓および肝臓で測定した。
C57BL/6マウスに、用量範囲(10 μg〜250 μg)のCHO由来ヒトIL-28AおよびIL-29またはMetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29C16-C113-PEGを腹腔内にまたは静脈内に注射した。マウスを様々な時点(1時間〜48時間)で殺処理した。脾臓および肝臓をマウスから単離し、RNAを単離した。RNAを同様に、血球から単離した。細胞をペレット状にし、RNAEasy (登録商標)キット(Qiagen)を用いてRNAをペレットから単離した。RNAをDNase (Amicon)で処理して、RNAから任意の混入DNAを取り除いた。Perkin-Elmer RTミックス(Perkin-Elmer)を用いてcDNAを作出した。マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーおよびプローブを用いリアルタイムPCRによって、ISG遺伝子の誘導を測定した。定量的なデータを得るため、HPRTリアルタイムPCRをISG PCRと二重にした。標準曲線はIFN刺激マウスPBLの既知量を用いて計算した。データは全て内部HPRT発現に比べた発現として示されている。
ヒトIL-29は用量依存的にマウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現(OAS、Pkr、Mx1)を誘導した。ISGの発現は注射後の1〜6時間で頂点に達し、48時間まで対照マウスを超える持続的発現を示した。この実験では、ヒトIL-28AはISG遺伝子発現を誘導しなかった。
（表２５）
Figure 2008508310
示される結果はHPRT遺伝子発現に対する倍発現である。IL-29が250 μgの静脈内単回注射で肝臓においてOASを誘導したことを表すサンプルデータセットが示されている。示されるデータは異なる動物5匹/群の平均発現である。
（表２６）
Figure 2008508310
（表２７）
Figure 2008508310
マウスにタンパク質100 μgを静脈内注射した。示されるデータはマウス肝臓由来のHPRT発現に比べた倍発現である。同様のデータがマウスの血液および脾臓から得られた。
実施例24
IL-28およびIL-29はマウスにおいてISGタンパク質を誘導する
ISGタンパク質(OAS)の誘導に対するヒトIL-28およびIL-29の効果を分析するため、IL-28およびIL-29処置マウス由来の血清および血漿をOAS活性について試験した。
C57BL/6マウスにPBSまたは濃度範囲(10 μg〜250 μg)のヒトIL-28もしくはIL-29を静脈内に注射した。血清および血漿を様々な時点でマウスから単離し、Eiken Chemicals (Tokyo, Japan)のOAS放射免疫アッセイ(RIA)キットを用いてOAS活性を測定した。
IL-28およびIL-29がマウスの血清および血漿においてOAS活性を誘導したことから、これらのタンパク質がインビボで生物学的に活性であることが示された。
（表２８）
Figure 2008508310
OAS活性はヒトIL-29の単一濃度(250 μg)に対する血漿pmol/dLで示されている。
実施例25
シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを利用して、IL-28受容体とのヒトおよびマウスIL-28およびIL-29の機能的相互作用を測定することができる。ヒト胚性腎臓(HEK)細胞に、クラスIIサイトカイン受容体(ヒトDIRS1、IFNαR1、IFNαR2およびIL-28受容体を含む)に対するcDNAを含むpZP7発現ベクターの存在下または非存在下でルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を駆動するインターフェロン刺激応答配列(ISRE)を含むレポータープラスミドをトランスフェクトする。クラスIIリガンド(IL-28A (SEQ ID NO:2)、IL-29 (SEQ ID NO:4)、IL-28B (SEQ ID NO:6)、zcyto10、huIL10およびhuIFNa-2aを含む)を用いてのトランスフェクト細胞の刺激後のルシフェラーゼ活性は、細胞表面のトランスフェクトされたおよび天然のサイトカイン受容体とのリガンドの相互作用を反映している。結果および方法を以下に記述する。
細胞トランスフェクション
293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした：DMEM 2ミリリットル＋10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ18時間前に293細胞700,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、pISRE-ルシフェラーゼDNA (Stratagene) 1マイクログラム、サイトカイン受容体DNA 1マイクログラムおよびpIRES2-EGFP DNA (Clontech) 1マイクログラムを、DMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 9マイクロリットルに加えた。サイトカイン受容体DNAが含まれなかった場合、pIRES2-EGFP DNA 2マイクログラムを用いた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293細胞に30分後に加えた。24時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから取り除き、96ウェルマイクロタイタープレート中におよそ細胞25,000個/ウェルで蒔き直した。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5%FBSに交換した。
シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った：DMEM＋0.5%FBS中37℃で18時間インキュベーションの後、トランスフェクト細胞を以下のクラスIIリガンドの希釈物(DMEM＋0.5%FBS中)で刺激した；IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto10、huIL10およびhuIFNa-2a。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後に照度計で相対発光単位(RLU)を測定した。得られる結果は、培地のみの対照に比べた実験サンプルのRLUの倍誘導として示される(実験サンプルのRLU/培地のみのRLU = 倍誘導)。表29は、ISRE-ルシフェラーゼをトランスフェクトされた293細胞においてIL-28A、IL-29、およびIL-28BがISREシグナル伝達を誘導し、培地のみに比べてルシフェラーゼ活性が15〜17倍の誘導をもたらすことを示している。内在性CRF2-4 (SEQ ID NO:71)を用いた、トランスフェクション混合物へのIL-28受容体αサブユニットDNA (SEQ ID NO:11)の添加は、IL-28A、IL-29、およびIL-28BによるISREシグナル伝達の6〜8倍のさらなる誘導を引き起こし、結果的に104〜125倍の全体的誘導をもたらす。その他のトランスフェクトされたクラスIIサイトカイン受容体DNAのどれもISREシグナル伝達の増加を引き起こさなかった。これらの結果はIL-28A、IL-29、およびIL-28BがIL-28サイトカイン受容体と機能的に相互作用することを示唆している。表29は同様に、huIFNa-2aがISRE-ルシフェラーゼトランスフェクト293細胞においてISREシグナル伝達を誘導でき、結果的に培地のみと比較して205倍のルシフェラーゼ活性の誘導をもたらすことを示している。しかしながら、トランスフェクションへのIL-28受容体DNAの添加がISREシグナル伝達の11倍の低下(ISRE-ルシフェラーゼDNAのみと比較して)に至ることから、IL-28受容体の過剰発現がIL-28A、IL-29、およびIL-28Bシグナル伝達に対するIL-28受容体過剰発現の正の効果とは対照的に、インターフェロンシグナル伝達に負に影響を及ぼすことが示唆される。
（表２９）クラスIIサイトカイン刺激後のトランスフェクト293細胞のインターフェロン刺激応答配列(ISRE)シグナル伝達(倍誘導)
Figure 2008508310
実施例26
IL-29システイン突然変異体を用いたシグナル伝達アッセイ
細胞トランスフェクション
ヒトIL-28受容体を安定的に過剰発現する293HEK細胞を産生するため、293細胞を以下のようにトランスフェクトした：DMEM 2ミリリットル＋10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ6時間前に293細胞300,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、ヒトIL-28受容体αサブユニット(SEQ ID NO:11)のcDNAを含むpZP7発現ベクター 2マイクログラムを、DMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 6マイクロリットルに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクト細胞を2マイクログラム/ミリリットルのピューロマイシン選択下に置いた。ピューロマイシン耐性細胞が細胞の集団として持ち越された。
ヒトIL-28受容体を過剰発現する293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした：DMEM 2ミリリットル＋10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ18時間前に293細胞700,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を駆動するインターフェロン刺激応答配列(ISRE)を含むKZ157 1マイクログラムをDMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 3マイクロリットルに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293HEK細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン-EDTAによってプレートから除去し、500マイクログラム/ml G418 (Geneticin, Life Technologies)中に蒔き直した。ピューロマイシンおよびG418耐性細胞が細胞の集団として持ち越された。
シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った：ヒトIL-28受容体を過剰発現し、KZ157を含む293HEK細胞をトリプシン-EDTAで処理し、96ウェルマイクロタイタープレート中におよそ細胞25,000個/ウェルで蒔き直した。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5%FBSに交換した。
DMEM＋0.5%FBS中37℃で18時間のインキュベーションの後、トランスフェクト細胞を、異なるシステイン結合パターンを含む大腸菌由来zcyto21の異なる形態の希釈物(DMEM＋0.5%FBS中)で刺激した。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後に照度計で相対発光単位(RLU)を測定した。得られる結果は、培地のみの対照に比べた実験サンプルのRLUの倍誘導として示される(実験サンプルのRLU/培地のみのRLU = 倍誘導)。
表30は、全てSEQ ID NO:15を参照しながら、野生型大腸菌由来IL-29のC1-C3形態(C16-C113)が野生型C3-C5形態 (C113-C172)または野生型C1-C3形態およびC3-C5形態の混合物(C16-C113、C113-C172)よりもISREシグナル伝達をいっそうよく誘導できることを示している。
表31は、野生型大腸菌由来IL-29のC1-C3 (C16-C113)およびシステイン突然変異体(C172S)大腸菌由来IL-29 (SEQ ID NO:29)のC1-C3 (C16-C113; SEQ ID NO:15)が、ヒトIL-28受容体を過剰発現する293HEK細胞においてISREシグナル伝達を等しく誘導できることを示している。
（表３０）大腸菌由来IL-29の異なる形態によるISREシグナル伝達(倍誘導)
Figure 2008508310
（表３１）大腸菌由来IL-29の異なる形態によるISREシグナル伝達(倍誘導)
Figure 2008508310
実施例27
B細胞に対するヒトIL-29の効果およびIL-29サポリン毒素融合体
ヒトIL-29の効果を以下のヒトB細胞系で試験する：ヒトバーキットリンパ腫細胞系Raji (ATCC番号CCL-86)、およびRamos (ATCC番号CRL-1596)；ヒトEBV B細胞リンパ腫細胞系RPMI 1788 (ATCC番号CRL-156)；ヒト骨髄腫/形質細胞腫細胞系IM-9 (ATCC番号CRL159)；ならびにヒトEBV形質転換B細胞系DAKIKI (ATCC番号TIB-206)、およびHS Sultan細胞(ATCC番号CRL-1484)。IL-29による約2〜5日間の処理後の、細胞の表面マーカー発現の変化から、これらの細胞がIL-29に応答し得ることが示される。IL-29で処理したヒトB細胞系は、細胞培養皿に蒔き直す場合、未処理細胞よりもはるかにゆっくり増殖する。これらの細胞では同様に、フローサイトメトリーにより評価されたとおり(実施例27Dおよび実施例27E)、FASリガンドの発現が増加しており、活性化FAS抗体に対する感度が適度に増加している(実施例27A)。これらの結果から、IL-29は、いくつかのタイプのB細胞腫瘍を増殖性が低い状態におよび/またはFASリガンド感受性が高い状態に分化誘導することにより、それらの細胞をコントロールできたことが示唆される。さらに、IL-28受容体はいくつかのBおよびT細胞系の表面に発現している(実施例16)。したがって、IL-29およびヒトIL-29-サポリン免疫毒素複合体(下記、実施例27B)またはその他のIL-29-毒素融合体は、B細胞白血病およびリンパ腫で治療的に使用されることができよう。
A. B細胞系に対するヒトIL-29の効果
IM-9細胞を50 μg/ml精製ヒトIL-29 +/-で1 ml当たり細胞約50,000個として蒔く。3日間の増殖後、細胞を収集し、洗浄し、計数し、次いで96ウェルプレート中0、0.033、0.1または0.33 μg/ml 抗FAS抗体 (R & D Systems, Minneapolis)入りのウェルに細胞約2500個/mlとして蒔き直す。2日後、Alamar blue蛍光アッセイ(米国特許第6,307,024号を参照されたい)を行って、細胞の増殖を評価する。
IL-29処理IM-9細胞の増殖は、抗FAS抗体の非存在下では未処理細胞の増殖に比べて阻害される。0.33 μg/ml 抗FAS抗体の存在下では、IL-29処理細胞はさらに阻害される。
B. B細胞系に対するヒトIL-29-サポリン免疫毒素の効果
ヒトIL-29-サポリン免疫毒素複合体(IL-29-sap)の構築および精製は、実施例28に記述されている。ヒトIL-29-sapは、細胞増殖を阻害する際にサポリン単独よりもはるかに強力であった。処理細胞を3日間または4日間の処理後に蒔き直す場合、ヒトIL-29-sap処理細胞はあまり増殖しない。
IM-9、RamosおよびK562 (ATCC番号CCL-243)細胞を0〜250 ng/mlヒトzalpha11L-sap複合体または対照として0〜250 ng/mlサポリン(Stirpe et al., Biotechnology 10,:405〜412, 1992)のみの入った96ウェルプレートに細胞約2500個/ウェルとして蒔く。プレートを4日間インキュベートし、それからAlamar Blue増殖試験を行う(米国特許第6,307,024号)。最大濃度のヒトIL-29-sap複合体で、細胞の増殖が阻害される。フローサイトメトリーでIL-28受容体の発現が低い/陰性の細胞系は、IL-29-sapにより影響を受けず、したがって複合体の効果の特異性を示している。
IM-9細胞を、ヒトzalpha11L-sap複合体0 ng/mlおよび50 ng/mlで6ウェルプレートに細胞50,000個/mlとして蒔く。3日後、細胞を収集し、計数し、それからヒトIL-29-サポリン免疫毒素非存在下で2倍連続希釈、および細胞希釈当たり12ウェルで、1ウェル当たり細胞100〜0.8個に蒔き直す。6日後、各細胞希釈で増殖を伴うウェルの数をAlamar blue増殖アッセイの結果によりスコア化する。
Alamar blueアッセイにより細胞数を評価する場合、生き残った処理IM-9細胞の増殖は、蒔き直しによる、IL-29-sap免疫毒素の除去後でさえも著しく低下する。
ヒトIL-28受容体の組織分布が限定されていることや、受容体を発現している細胞系に対するIL-29-sapの作用の特異性から、この複合体がインビボでは寛容され得ることが示唆される。
C. B細胞系の生存性に対するヒトIL-29-サポリン免疫毒素の効果
HS Sultan細胞(ATCC番号CRL-1484)を12ウェルプレート中に1 ml当たり細胞約40,000個として蒔き、サイトカインを加えずにもしくは40 ng/ml精製ヒトIL-29もしくは25 ng/mlヒトIL-29-sap複合体(下記、実施例28)を加えてのいずれか、または20 ng/ml IFN-α(RDI)もしくはIL-29およびIFN-αを加えて5日間増殖させる。IL-29およびIFN-αサブユニットは細胞の増殖を阻害し、ヒトIL-29およびIFN-αの増殖阻害効果が相加的である可能性が示唆される。
上記の結果により、悪性腫瘍またはIL-28受容体を発現するその他の疾患、特にB細胞起源の疾患を治療するうえでIL-29またはヒトIL-29-sapを利用できる可能性が示唆される。IFN-αとのIL-29の組合せが、HS Sultan細胞の阻害におけるその相加効果により特に提案される。その他いくつかのタイプのリンパ性悪性腫瘍および疾患も同様に、活性化T細胞が同じくIL-28受容体のmRNAを発現するように、その受容体を発現する可能性があり、これらの疾患のうちのいくつかも同様にIL-29-毒素融合体治療のIL-29に反応する可能性がある。
D. ヒトB細胞系でのFAS (CD95)発現はヒトIL-29刺激により増加する
ヒトB細胞系HS Sultan (ATCC番号CRL-1484)、IM-9 (ATCC番号CRL159)、RPMI 8226 (ATCC番号CCL-155)、RAMOS (ATCC番号CRL-1596)、DAKIKI (ATCC番号TIB-206)、およびRPMI 1788 (ATCC番号CRL-156)を全て、10〜50 ng/ml精製ヒトIL-29を加えてまたは加えず2〜8日間処理する。次いで、製造元のプロトコルにしたがって、細胞をPE結合抗CD95抗体(PharMingen, San Diego, CA)で染色し、FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA)にて分析する。全ての細胞系で、ヒトIL-29による処理の後、抗CD95 (FASまたはAPO-1)抗体の染色が増加する。
E. 初代マウス脾臓B細胞でのFAS (CD95)発現はヒトIL-29刺激により増加する
初代マウス脾細胞は8〜12週齢のC57/BL6マウス由来の脾臓を細かく切って得る。この調製物を水で5秒間処理することで赤血球を溶解させ、次いで70ミクロン径のふるいに通す。残った脾細胞を洗浄し、前述のように、ヒトIL-29を加えたかまたは加えない、10% HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT)、IL-2 (R & D Systems)を加えたRPMI (JRH Bioscience)中に蒔く。次いで、これらを5% CO2中、37℃で5日間インキュベートした。脾細胞を収集し、製造元のプロトコルにしたがって、PE結合抗CD95抗体(PharMingen)およびFITC結合抗CD19抗体(PharMingen)で染色した。細胞をFACScalibur (Becton Dickinson)にてフローサイトメトリーにより分析する。
実施例28
IL-29毒素融合体の構築および精製
ヒトIL-29 10 mgを植物毒素サポリン(Stirpe et al., Biotechnology 10,:405-412, 1992)に結合させる。得られるンパク質複合体1.3 mgはヒトIL-29 1分子当たり1.1分子のサポリンからなり、20 nMリン酸ナトリウム、300 nM塩化ナトリウム、pH 7.2の中に1.14 mg/mlの濃度で配合される。
実施例29
インビボでのIL-29毒素融合体
A. マウスにおけるIL-29-サポリン複合体の試験
IL-29-サポリン複合体(実施例27)を異なる2つの用量、すなわち0.5および0.05 mg/kgでC57BL6マウス(雌性、12週齢、Taconicから購入)に投与する。0.1% BSA (ICN, Costa Mesa, CA)からなる媒体中で、静脈内に注射を行う。1週間にわたり3回の注射を行う(0、2、および7日目)。血液サンプルをマウスから0日目(注射前)にならびに2日目および8日目(注射後)に採血する。血液はヘパリン添加管(Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ)に採取し、細胞数は自動血球分析装置(Abbot Cell-Dynモデル番号CD-3500CS, Abbot Park, IL)を用いて測定する。動物は8日目の採血の後に、安楽死させて剖検する。組織病理検査のため、脾臓、胸腺、肝臓、腎臓および骨髄を採取する。脾臓および胸腺の重さを量り、さらに血液サンプルを血清分離管に採取する。血清を標準的な血液生化学的パネルで試験する。サンプルを同様に、本明細書において記述されるフローサイトメトリー分析のために収集する。
B. B細胞由来の腫瘍に対するIL-29サポリン毒素融合体のインビボ試験
ヒト腫瘍細胞に対するヒトIL-29およびヒトIL-29サポリン毒素融合体(実施例28)の効果を、本明細書において記述されるマウス異種移植片腫瘍モデルを用いてインビボで試験する。異種移植片モデルは実施例27に記述される細胞系のような、インビトロ実験に基づいて選択される細胞系を用いて最初に試験する。これらの細胞系には：ヒトバーキットリンパ腫細胞系Raji (ATCC番号CCL-86)、およびRamos (ATCC番号CRL-1596)；ヒト細胞系RPMI 1788 (ATCC番号CRL-156)；ヒト骨髄腫/形質細胞腫細胞系IM-9 (ATCC番号CRL159)；ヒト細胞系DAKIKI (ATCC番号TIB-206)、ならびにHS Sultan細胞(ATCC番号CRL-1484)が含まれるが、これらに限定されることはない。ヒト腫瘍から直接的に得られる細胞を同様に、このタイプのモデルで使用することができる。この方法では、IL-29による処理またはIL-29サポリン毒素融合体による処理に対する感度を目的に、患者サンプルのスクリーニングを利用して抗がん治療でのzalpha11の使用に最適な適応を選択することができる。
上記の適切な異種移植片インビボモデルの選択後、IL-29により誘発されるナチュラルキラー細胞の活性および/またはB細胞由来の腫瘍に対するIL-29の効果をインビボで評価する。本明細書において記述されるマウス異種移植片腫瘍モデルを用いて、ヒトIL-29を、B細胞由来の腫瘍に対する活性のある細胞傷害性エフェクター細胞(例えば、NK細胞)を作出するその能力について試験する。さらに、腫瘍に対するヒトIL-29の直接的な影響を評価することができる。実施される異種移植片モデルは上記のように選択する。細胞系または原発性腫瘍を接種したマウスで腫瘍細胞を枯渇させる効力およびそのマウスの生存性を促進させる効力を目的に、IL-29で刺激したヒト細胞を用いたプロトコルを開発し試験する。
実施例30
インビボでのB細胞由来腫瘍に対するIL-29の効果
A. 小型浸透圧ポンプを用いたIL-29の注入
小型浸透圧ポンプを介した持続注入によるIL-29の投与により、結果としてポンプに含まれるIL-29の濃度に比例した定常状態の血清濃度が得られる。リン酸緩衝生理食塩水(pH 6.0)中に2 mg/mlまたは0.2 mg/mlの濃度で含まれるヒトIL-29 0.22 mlを無菌条件下でAlzet小型浸透圧ポンプ(モデル2004; Alza corporation Palo Alto, CA)の中に添加する。背面皮膚の1 cmの切開部を通してポンプをマウスに皮下移植し、皮膚を無菌創縫合で閉鎖する。これらのポンプは、28日の期間にわたり1時間当たり0.25 μlの速度でその内容物を輸送するようにデザインされている。この投与方法により、腫瘍細胞を注射したマウスの生存性の著しい増加がもたらされる(下記)。
B. インビボでのB細胞由来腫瘍に対するIL-29の効果
ヒトIL-29の効果を、本明細書において記述されるマウス異種移植片腫瘍モデルを用いてインビボで試験する。試験される異種移植片モデルは、ヒトリンパ芽球様細胞系IM-9 (ATCC番号CRL159)である。C.B-17 SCIDマウス(雌性C.B-17/IcrHsd-scid; Harlan, Indianapolis, Indiana)を4群に分ける。0日目に、IM-9細胞(ATCC番号CRL159)を培養から収集し、尾静脈を介して、全てのマウス(マウス1匹当たり細胞約1,000,000個)に静脈注射する。1日目に、試験物質または対照物質を含む小型浸透圧ポンプをマウスに皮下移植する。群1〜3のマウス(1群当たりn=9)は漸増濃度のIL-29で処置する：群1は2.0 mg/mLのヒトIL-29を含み、1日当たり12 μgを輸送する；群2は0.20 mg/mLのヒトIL-29を含み、1日当たり1.2 μgを輸送する；群3は0.02 mg/mLのヒトIL-29を含み、1日当たり0.12 μgを輸送する。群4のマウス(n=9)は対照であり、媒体(PBS pH 6.0)で処置する。
12 μg/日または1.2 μg/日のIL-29の注入のいずれかにより処置したマウスは、媒体処置マウスと比べて生存性が増加している(生存時間関数のログランク検定により、12 μg/日または1.2 μg/日 対 媒体、それぞれp <.0001およびp <.005)。これらの結果から、IL-29はインビボでB細胞(由来)の腫瘍細胞の影響を著しく低下させ、結果的に著しく生存性を増加させることが示される。
実施例31
B16-F10黒色腫およびEG.7胸腺腫モデルにおけるIL-29のインビボ抗腫瘍効果
A. インビボでのB16-F10黒色腫の転移性増殖に対するマウスIL-29の効果
マウス(雌性、C57B16、9週齢; Charles River Labs, Kingston, NY)を3群に分ける。0日目に、B16-F10黒色腫細胞(ATCC番号CRL-6475)を培養物から収集し、尾静脈を介して、全てのマウス(マウス1匹当たり細胞約100,000個)に静脈注射する。次いで、マウスを試験物質または関連する媒体で、指示された溶液0.1 mlを腹腔内注射することにより処置する。第一群のマウス(n = 24)は媒体(PBS pH 6.0)で処置し、この媒体を0、2、4、6、および8日目に注射する。第二群のマウス(n = 24)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0、2、4、6、および8日目に75 μgの用量で注射する。第三群のマウス(n = 12)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0日目〜9日目まで毎日75 μgの用量で注射する。マウスは全て18日目に殺処理し、腫瘍の定量のため肺を採取する。各肺葉の全表面にある、直径が0.5 mmより大きな腫瘍増殖巣を計数する。zcyto24またはzcyto25で処置したマウスの両群では、肺に存在する腫瘍巣の平均数が、媒体で処置したマウスに比べて、著しく減少する。より頻繁に(すなわち、毎日)処置したマウスは、1日おきに処置したマウスよりも腫瘍巣がいっそう少ない。
これらの結果から、zcyto24またはzcyto25による処置がいずれも、B16黒色腫腫瘍の増殖を減速させるかまたは腫瘍細胞を破壊する免疫系の能力を促進させることが示唆された。腫瘍細胞に対する処置の効果は、IL-29に対する受容体を実際に保有する免疫系の細胞によって媒介される可能性が高い。
B. インビボでのEG.7胸腺腫増殖に対するマウスIL-29の効果
マウス(雌性、C57B16、9週齢; Charles River Labs, Kingston, NY)を3群に分ける。0日目に、EG.7細胞(ATCC番号CRL-2113)を培養から収集し、細胞1,000,000個を全てのマウスに腹腔内注射する。次いで、マウスを試験物質または関連する媒体で、指示された溶液0.1 mLを腹腔内注射することにより処置する。第一群のマウス(n = 6)は媒体(PBS pH 6.0)で処置し、この媒体を0、2、4、および6日目に注射する。第二群のマウス(n = 6)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0、2、4、および6日目に10 μgの用量で注射する。第三群のマウス(n = 6)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0、2、4、および6日目に75 μgの用量で注射する。zcyto24またはzcyto25で処置したマウスの両群では、生存時間が、媒体で処置したマウスに比べて著しく増加する。これらの結果から、zcyto24またはzcyto25による処置がいずれも、EG.7腫瘍の増殖を減速させるかまたは腫瘍細胞を破壊する免疫系の能力を促進させることが示唆される。
実施例32
IL-28受容体発現のフローサイトメトリー分析
非ホジキンリンパ腫(NHL)の標本から得た腫瘍性B細胞でのIL-28受容体の発現を評価する。複数のMAbを使用して、腫瘍性B細胞を同定するおよびIL-28受容体を共局在化する。抗IL-28受容体 MAbによるまたはビオチン-IL-29による免疫蛍光染色を平均ピーク蛍光として記録する。アイソタイプを適合させた対照MAbに対する平均ピーク蛍光のシフトを基に、定性的スコアを評価する。
抗IL-28受容体MAbまたはビオチン-IL-29を用いて、免疫蛍光染色により腫瘍性B細胞でIL-28受容体を検出する。染色シグナルの強度はIL-28受容体のレベルに相関する。これらのデータから、IL-28受容体が、非ホジキンリンパ腫の治療標的となることが示唆される。
実施例33
B細胞リンパ腫に対するIL-29のインビボ効果
ヒトBリンパ腫細胞系をインビトロで継代して増殖培地中で維持する。細胞をPBSで徹底的に洗浄して、培養液の成分を除去する。
SCIDマウスに尾静脈を介して(典型的には)ヒトリンパ腫細胞100万個を容量100マイクロリットルで注射する。注射する細胞の最適数を予備実験において実験的に決定し、所望の動態と一致する腫瘍の取込みをもたらす。その翌日、IL-29処置を、ALZET (登録商標)小型浸透圧ポンプ(ALZET, Cupertino, CA)の皮下移植によりまたはIL-29もしくは媒体の毎日の腹腔内注射により開始する。マウスを生存性および有意な病的状態についてモニターする。後肢麻痺のような実質的な病的状態を示すマウスのほか、その最初の体重の20%を超える体重が減少しているマウスを殺処理する。使用するリンパ腫細胞系にもよるが、未処置のマウスは通常、3〜6週間で死亡する。IgGまたはIgMを分泌するB細胞リンパ腫の場合、疾患の進行は同様に、週1回、採血を行って、ELISA法によりヒト免疫グロブリンの血清濃度を測定することでモニターすることができる。
IL-29用量反応/IM-9モデル
マウスにIM-9細胞1×106個を注射し、その翌日、28日用の小型浸透圧ポンプを移植する。ポンプに以下の濃度のIL-29を添加して輸送する：1用量群につきマウス8匹として1日当たり0、0.12、1.2または12 マイクログラム。IL-29はマウスを腫瘍細胞系から保護するうえで明らかな用量依存的効果を示す。IL-29の効果は用量依存的である。実験の終了時点で生存しているマウスには、疾患の徴候がなく、その血清中に検出可能なヒトIgGがない。
これらのデータから、SCIDマウスリンパ腫モデルにおけるIL-29の効力は、インビボでリンパ腫細胞系の増殖を阻害する能力と相関することが実証される。
実施例34
同系マウス卵巣がんモデルにおけるIL-29の効果
IL-29の効果は、Zhang et al., Am. J. of Pathol. 161:2295-2309, 2002に記述されている同系マウスモデルを用い、卵巣がんにおける効力について試験される。手短に言えば、レトロウイルス形質導入法および蛍光活性化細胞分離法を利用して、マウスVEGF164アイソフォームおよび強化緑色蛍光タンパク質(GFP)を安定的に過剰発現する、C57BL6マウスID8卵巣がん細胞系を作出する。VEGF164およびGFP cDNAを含むレトロウイルス構築体をBOSC23細胞にトランスフェクトした。細胞をFACS細胞分離により分析し、GFP高陽性細胞を同定する。
ID8 VEGF164/GFPがトランスフェクトされた細胞をサブコンフルエントまで培養し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)および冷MATRIGEL (BD Biosciences, Bedford, MA)中に単細胞性の懸濁液として調製する。6〜8週齢の雌性C57BL6マウスの脇腹に、細胞または非トランスフェクト対照細胞5×106個を皮下注射する。あるいは、マウスに細胞または対照細胞7×106個を腹腔内注射することができる。動物は生存を追跡するか、または接種から8週後に殺処理して、腫瘍増殖を評価する。腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。
実施例35
マウスRENCAモデルにおけるIL-29の効果
腎細胞がんモデルにおけるIL-29の効力は、本質的にはWigginton et al., J. Nat. Cancer Instit. 88:38-43, 1996に記述されているように、自然発生マウス腎がんのRENCA細胞が注射されたBALB/cマウスを用いて評価される。
手短に言えば、8〜10週のBALB/cマウスにRENCA細胞R 1×105個を、マウスの腎臓被膜の中へ注射する。腫瘍細胞の移植から12日後、マウスに腎摘出を施して、原発性腫瘍を取り出す。IL-29の投与前に、マウスを外科手術から回復させる。腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。あるいは、RENCA細胞は皮下(細胞5×105個)または静脈内(細胞1×105個)注射により導入されてもよい。
マウスを未処置マウスと比べ腫瘍反応について評価する。腫瘍容積を評価するほかに、生存性をKaplan-Meier法により比較する。
実施例36
マウス結腸直腸腫瘍モデルにおけるIL-29の効果
結腸直腸マウスモデルにおけるIL-29の効果は、Yao et al., Cancer Res. 63:586-592, 2003に記述されているように試験する。このモデルでは、MC-26マウス結腸腫瘍細胞をBALB/cマウスの脾臓被膜下に接種する。14日後、処置マウスにIL-29を投与する。腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。
本明細書において記述される標準的な方法を利用して、生存性を引き延ばすまたは腫瘍反応を促進させるうえでのIL-29の効力を評価する。
実施例37
マウス膵臓がんモデルにおけるIL-29の効果
マウス膵臓がんモデルにおけるIL-29の効力は、Mukherjee et al., J. Immunol. 165:3451-3460, 2000により開発されたプロトコルを用いて評価する。手短に言えば、MUC1トランスジェニック(MUC1. Tg)マウスを、膵臓腫瘍を自発的に発症するがん遺伝子発現マウス(ETマウス)と交配し、これをMET.MUC1.Tgマウスと表す。ETマウスはラットエラスターゼ・プロモーターのコントロール下でSV40ラージT抗原の最初の127 aaを発現する。動物の50%が、約21週齢までに致命的な膵臓腫瘍を発症する。MUC1の存在を目的に細胞をフローサイトメトリー法によりルーチンに試験する。マウスは全て、C57BL/6のバックグラウンドにある。3〜24週まで3週の間隔で、動物を殺処理し、特徴付ける。マウスを、昏睡状態、腹部膨張、飲食ができないこと、著しい体重減少、蒼白便、および猫背の姿勢を含む病身の徴候について注意深く観察する。
膵臓全体を脂肪およびリンパ節がないように切り裂いて、重さを量り、写真撮影のために吸収紙の上に拡げる。小結節を計数し、膵臓をメタカーン中で固定し、従来法、すなわち5 μmの薄片(およそ切片10枚/マウス脾臓)に切り、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡により検鏡する段階による顕微鏡検査のために処理する。腫瘍をMETマウスから、腫瘍進行の間の様々な時点で採取し、免疫組織化学法のため、メタカーン(60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸)中で固定し、パラフィン包埋して、薄片に切る。使用するMUC1抗体は、マウスおよびヒトのMUC1の細胞質側の末端領域を認識するウサギポリクローナル抗体のCT1、HMFG-2、BC2、ならびにSM-3であり、これらはMUC1のTRドメインの中にエピトープがある。
CTL活性の測定は、付加的なサイトカインを添加せずに、6日間のインビトロでのペプチド刺激後、標準的な51Cr放出法を用いて行われる。個々のMETマウスからの脾細胞は、ナイロン・メッシュに通して収集し、その後、RBCの溶解を行う。
METマウスの脾臓から得た単細胞は、リンパ球部分母集団：CD3、CD4、CD8、Fas、FasL、CD11c、ならびにMHCクラスIおよびIIの変化を目的に、2色免疫蛍光検査法により分析する。細胞内サイトカインレベルは、細胞をMUC1ペプチド(10 μg/ml、6日間)で刺激し、brefeldin-A (Golgi-Stopとも呼ばれる；PharMingen)で、製造元からの推奨事項(染色の前、37℃で3時間、4 μl/1.2×107細胞/6 ml)により指示される通りに処理した後に測定された。細胞をPharMingen透過化キットにより透過化し、PharMingenにより報告されるように、細胞内IFN-γ、IL-2、IL-4、およびIL-5に対して染色する。蛍光標識抗体は全て、PharMingenから購入される。フローサイトメトリー分析は、CellQuestプログラム (Becton Dickinson, Mountain View, CA)を用いたBecton Dickinson FACscanにて行う。
腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。
実施例38
マウス乳がんモデルにおけるIL-29の効果
乳がんのマウスモデルにおけるIL-29の効力は、Colombo et al., Cancer Research 62:941-946, 2002に記述されるような同系モデルを用いて行われる。手短に言えば、TS/A細胞、これはBALB/Cマウスに対する自然発生乳がんである。この細胞をおよそ1週間培養して、クローンを選択する。選択したTS/A細胞を増殖させ、マウスの脇腹へのTS/A細胞2×102個の皮下注射により、CD-1 nu/nu BRマウス(Charles River Laboratories)を攻撃するのに使用する。
腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。腫瘍を動物の殺処理後に切除して、容積ならびに組織化学検査および免疫組織化学検査の利用について分析する。
実施例39
マウス前立腺がんモデルにおけるIL-29の効果
Kwon et al., PNAS 96:15074-15079, 1999に記述されているものに類似のモデルを用いて、腫瘍反応に対するIL-29の効果をマウス前立腺がんモデルで評価する。このモデルにはトランスジェニックマウス前立腺がん(TRAMP)由来の前立腺がん細胞系TRAMP-C2の転移増殖があり、その細胞がC57BL/6マウスに接種される。原発性腫瘍のすぐ近くの排膿性リンパ節に主に起こる、転移再発は、信頼性がある。
手短に言えば、使用するC2細胞系は、前立腺に限定されるSV40抗原の発現に起因する自家腫瘍を自然に発病する、TRAMPマウス由来の継代早期の細胞系である。細胞を培養し、細胞2.5〜5×106個/0.1 ml培地としてC57BL/6マウスに皮下注射する。腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。腫瘍を動物の殺処理後に切除して、容積ならびに組織化学検査および免疫組織化学検査の利用について分析する。
実施例40
マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおけるIL-28およびIL-29の効果
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)はヒト多発性硬化症(MS)のマウスモデルである(Gold et al., Mol. Med. Today, 6:88-91, 2000; Anderton et al., Immunol. Rev., 169:123-137, 1999)。マウスにおいて疾患を誘発する方法は多数ある。このような方法の1つに、ミエリンタンパクのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG)のペプチドでマウスを免疫化するものがある。このタンパク質は髄鞘の外側に存在し、髄鞘の保護層として作用する。0日目、マウスにRIBIアジュバントに乳化させたMOGペプチド(MOG35-55)を皮下投与し免疫化した。続いて2日目、百日咳毒素(PT)を静注した。マウスは跛行、振戦に続いて前肢および後肢の麻痺に始まる麻痺症状を示し始めた。この症状を疾患の発症時期、範囲、重症度を測定する様々な指標によりスコア化した。発症遅延は、その薬物によってマウスの疾患過程が変化していることを示している。発症率の低下は、その薬物が発病中のマウスの数に効果があることを示している。臨床スコアの低下は、その薬物が疾患の重症度に効果があることを示している。マウス群にPBSまたはマウスIL28 (SEQ ID NO:8)もしくはヒトIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEGのいずれかを投与した。本モデルではIL-28/29処置マウスにおける症状の発症、疾患スコアの出現率および疾患スコアの重症度は、これらのパラメーターに対するIL-28/29の効果を示している。マウス(n=13/gp)に0日目、RIBIアジュバント中100 μgのMOG35-55ペプチドを皮下投与し免疫化した。全マウスに投与2日目、百日咳毒素200 ngを静注した。マウス群をPBS、ヒトIL29 C172S 25 μgにより1日目から18日目に1日おき(EOD)にまたはPBS、BSAもしくはマウスIL28により腹腔内で処置した。前述した通り、マウスを0日目から30日目まで毎日、臨床徴候と体重減少についてスコア化した。IL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEGまたはマウスIL28 (SEQ ID NO:8)処置マウスは、PBS処置動物に比べて発症遅延を示した。
（表３２）
Figure 2008508310
（表３３）
Figure 2008508310
（表３４）
Figure 2008508310
IL-29は多発性硬化症のマウスモデルにおいて疾患の発症を遅延する
A. 要約
ヒトIL-29が多発性硬化症に何らかの効果を及ぼすかどうか、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)を抑制するIL-29の能力を調べるため、マウスMSモデルを用いて試験を行った。十分定義されているC57BL/6マウスのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG) 35-55ペプチド免疫化モデルを用いた。この実験を行って、IL-29がEAEを遅延できるおよび/またはEAEの疾患スコアを抑制できることを確認した。IL-29がEAEモデルにおいて疾患の発症を遅延させたことから、IL-29の使用がMSにおいて有益でありうることが示唆された。
B. 研究デザイン
実験的自己免疫性脳炎(EAE)はMSのマウスモデルである。その1つのモデルでは、C57BL/6マウスにRIBIアジュバント中で乳化したMOGペプチド(MOG35-55) 100 μgを免疫する。PBS中のMOG35-55の0.5 mg/ml調製物2ミリリットルをRIBIのバイアルに添加し、十分にボルテックスして溶液を乳化する。マウスの背中の毛を剃り、MOG/RIBI 100 μgをマウスの背中に皮下注射した。免疫化の2日前および免疫化後の毎日、マウスの体重を量った。次いで、マウスに百日咳毒素(PT) 200 μl、終濃度200 ng/マウスを2日目に静脈注射した。臨床スコアについてマウスを毎日モニターした。0日目から18日目までマウスの群にPBS 200 μl、またはIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEG 25 μgを容量200 μlでEODに腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコアおよび罹患率を評価し解析用にプロットした。
C. 結果と結論
0日目から18日目までのEODでのIL-29の投与によって、このモデルで疾患の発症が遅延した。この遅延はPBS処置マウスに比べて有意であった(p=0.0006、Mantel-Cox検定)。
IL-28は多発性硬化症のマウスモデルにおいて疾患の発症を遅延する
A. 要約
マウスIL-28が多発性硬化症に何らかの効果を及ぼすかどうか、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)を抑制するIL-28の能力を調べるため、マウスMSモデルを用いて試験を行った。十分定義されているC57BL/6マウスのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG) 35-55ペプチド免疫化モデルを用いた。この実験を行って、IL-28がEAEを遅延できるおよび/またはEAEの疾患スコアを抑制できることを確認した。IL-28がEAEモデルにおいて疾患の発症を遅延させたことから、IL-28の使用がMSの治療において有益でありうることが示唆された。
B. 研究デザイン
実験的自己免疫性脳炎(EAE)はMSのマウスモデルである。その1つのモデルでは、C57BL/6マウスにRIBIアジュバント中で乳化したMOGペプチド(MOG35-55) 100 μgを免疫する。PBS中のMOG35-55の0.5 mg/ml調製物2ミリリットルをRIBIのバイアルに添加し、十分にボルテックスして溶液を乳化する。マウスの背中の毛を剃り、MOG/RIBI 100 μgをマウスの背中に皮下注射した。免疫化の2日前および免疫化後の毎日、マウスの体重を量った。次いで、マウスに百日咳毒素(PT) 200 μl、終濃度200 ng/マウスを2日目に静脈注射した。臨床スコアについてマウスを毎日モニターした。マウスの1つの実験群では、1日目から11日目までEODにPBS 200 μl、50 μgのmIL28または200 μgのmIL28 (SEQ ID NO:8)を容量200 μlで腹腔内注射した。マウスのもう1つの実験群では、1日目から21日目までEODにPBS 200 μl、130 μgのBSAまたは130 μgのmIL28 (SEQ ID NO:8)を容量200 μlで腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコアおよび罹患率を評価し解析用にプロットした。
C. 結果と結論
EODでのIL-28の投与によって、このモデルで用量依存的に疾患の発症が遅延した。この遅延はPBSまたはBSA処置マウスに比べて有意であった。
実施例41
肝細胞がん細胞系HepG2におけるIL-29およびIFNα2aのマイクロアレイ比較
A. 導入
タイプ1インターフェロン(IFN)はウイルスに対する身体の免疫応答の一部としてウイルス感染の後に誘導される。これらのタンパク質はウイルス複製を直接的に阻害するように作用するインターフェロン刺激遺伝子(ISG)の誘導を通じてウイルス複製を阻害し、NK細胞の溶解能を増大し(Biron, C. A. 1998. Role of early cytokines, including alpha and beta interferons (IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections. Semin Immunol 10:383-90)ならびにMHCクラスI発現を増加させて抗原提示を促進させることにより(Fellous, M., Nir, U., Wallach, D., Merlin, G., Rubinstein, M., and Revel, M. 1982. Interferon-dependent induction of mRNA for the major histocompatibility antigens in human fibroblasts and lymphoblastoid cells. Proc Natl Acad Sci USA 79:3082-6)、T細胞生存性を促進させることにより(Marrack, P., Kappler, J., and Mitchell, T. 1999. Type I interferons keep activated T cells alive. J Exp Med 189:521-30)、および樹状細胞成熟を刺激することにより(Buelens, C., Bartholome, E. J., Amraoui, Z., Boutriaux, M., Salmon, I., Thielemans, K., Willems, F., and Goldman, M. 2002. Interleukin-3 and interferon beta cooperate to induce differentiation of monocytes into dendritic cells with potent helper T-cell stimulatory properties. Blood 99:993-8)、適応免疫応答を調節する。ウイルス生活環に対するこの大きな効果のため、IFNα2aはC型肝炎の治療に有益な治療薬であることが証明されている。
ウイルス感染はタイプIインターフェロンに加えて、IFNαおよびIL-10の遠縁に当たる、最近発見された新たなクラスIIサイトカインのファミリーIL-28およびIL-29 (IFNλ 1-3)の産生を誘導する。タイプ1 IFNと同様に、IL28/29はいくつかのウイルスに対する抗ウイルス活性を有する(Sheppard, P. et al., 2003. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol 4:63-8; Kotenko, S. V. et al., 2003. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nat Immunol 4:69-77; およびRobek, M. D. et al., 2005. Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication. J Virol 79:3851-4)。本発明者らおよび他者らは、IL-29が初代ヒト肝細胞ならびにHuH7およびHepG2などのヒト肝細胞がん細胞系においてISG Mx1、PRKRおよびOASを誘導することを過去に明らかにしている。故に、IL28/29はIFNα2aに類似の生物学を制御しており、ヒト患者の慢性ウイルス性肝炎に対し治療的価値を有している可能性がある。しかしながら、IL-29およびIFNαが異なる受容体を利用していることで、これらの2つのサイトカインが他のサイトカイン特異的遺伝子のサブセットや生物学的過程を潜在的に制御しうることが可能になる。故に、これらの2つのサイトカインの遺伝子制御プロファイルを大域的な規模で比較することが関心対象であった。したがって、全RNAの単離およびDNAマイクロアレイ分析を用いた遺伝子制御の分析の前に、HepG2細胞を様々な時間IL-29およびIFNα2aで処理した。
B. 研究デザイン
肝細胞においてIL-29およびIFNα2aにより制御される遺伝子を同定するため、マイクロアレイ実験を肝細胞がん細胞系HepG2にて行った。これらの研究の場合、三つ組のHepG2細胞培養物を陰性対照として培地、50 μg/mlヒトIL-29 (SEQ ID NO:4)または5 μg/mlヒトIFNα2aで1、6または24時間処理した。刺激の後、QIAGENのRNeasy Miniキットを用いて全RNAを抽出し、RNA 6000 Nano Assay (Agilent)を製造元の使用説明書にしたがって用いAgilent 2100 BioanalyzerにてRNAの質と量を評価した。手短に言えば、AffymetrixのGeneChip (登録商標) One-Cycle Target LabelingおよびControl Reagentを用いてビオチン標識cRNAを合成した。各サンプルについて断片化されたcRNAをAffymetrix Human Genome Focus Arrayにハイブリダイズさせ、製造元の使用説明書にしたがって染色した。その後、アレイをAffymetrix GeneChip (登録商標) Scanner 3000にてスキャンし、Affymetrix GeneChip (登録商標) Operating Software (GCOS)データマイニングソフトウェアを用いて未加工のデータを得た。その後、データ解析の目的で未加工のデータをGeneSpring 7.0マイクロアレイ解析プログラム(Silicon Genetics)に読み込んだ。0.01未満の値は0.01の値に変換された。各アレイの強度は、欠落しておらず50またはそれ以上の未加工の値を有する全ての値を用い、全てのアレイについて第50百分位数に正規化された。遺伝子ごとの基準での値は、全てのアレイでの50またはそれ以上の未加工の値を有する値について計算された中央値に正規化された。フィルターされていないデータを用いて散布図を得た。IL-29により制御される遺伝子は、0.05以下の片側分散分析(ANOVA) p-値、600 (バックグラウンドの3倍)またはそれ以上のIL-29処理サンプルでの未加工の強度、および対応する時点で培地処理サンプルに比べて2またはそれ以上の倍変化を有するとして同定された。遺伝子の最も大きな誘導は6時間の時点で観測された。
C. 結果と考察
マイクロアレイの結果を解析することにより、HepG2細胞でのIL-29とIFNα2aの双方による遺伝子制御は一過性であって、6時間で頂点に達し、その後は徐々に落ち込むことが明らかとなった。IL-29処理サンプルのデータをIFNα2a処理サンプルのデータと比較した後に、全ての遺伝子がこの2つのサイトカインにより同じように制御されることが分かり、肝細胞ではIL-29およびIFNα2aが同一の遺伝子サブセットを制御することが示唆された。しかしながら、HepG2細胞でのIFNα2aによる誘導の程度は、IL-29により誘発されたものよりも大きかった。研究デザインに記載されている判定基準により決定された、IL-29によって上方制御されたと同定された全遺伝子のリストが以下、表35に記載されている。これらの遺伝子は、抗ウイルス応答(OAS遺伝子、MX遺伝子およびPRKR、ADAR)、増殖の制御(IFITM1、IFITM3、CEB1)、アポトーシス(TNFSF10)およびシグナル伝達(NMI、STAT1、IRF9)に関与するタンパク質をコードする公知のインターフェロン刺激遺伝子(ISG)でもっぱら構成されることが分かった。これらのデータから、IL-28受容体を発現する肝細胞などの細胞では、タイプ1インターフェロンによって制御されるものと同一の生物学をIL-29が媒介することが示唆される。
（表３５）
Figure 2008508310
実施例42
マウスIL28プラスミドはマウスにおいて腎細胞がんRENCA腫瘍の増殖を阻害する
A. 要約
IL28/IL29がマウスにおいて腫瘍増殖に効果を及ぼすかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。その後、マウスに流体力学的送達(HDD)により対照ベクタープラスミドまたはmIL28プラスミド(SEQ ID NO:7) 50 μgを5日目および12日目に注射した。腫瘍容積を5週間、3回/週でモニターした。血清中のマウスIL28タンパク質レベルをELISAにより測定した。mIL28プラスミドを注射したマウスは、対照プラスミド注射マウスに比べて有意に小さな腫瘍を示したことから、マウスIL28が抗腫瘍活性を有することが示唆された。
B. 研究デザイン
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。5日目および12日目に、マウス群(n=10/群)に流体力学的押圧方法を利用して空のpZP-7プラスミドまたはpZP-7/mIL28のいずれか50 μgを静脈内注射した(生理食塩水1.6 mlに再懸濁されたプラスミドを5〜8秒のうちに尾静脈を介して注射する)。プラスミド注射から24時間後(6日目および13日目)にマウスから採血して、ELISAにより血清mIL28レベルを評価した。腫瘍増殖をキャリパー計測により5週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
C. 結果と結論
mIL28プラスミドの注射は、プラスミド送達から24時間後に50〜200 ng/mlのタンパク質発現を結果的にもたらした。mIL28プラスミドの注射は、RENCAモデルにおいて腫瘍増殖を阻害した。対照プラスミド注射マウスとIL28プラスミド注射マウスとの間の腫瘍容積の違いは、統計的に有意であった(36日目に対照に比べてp=0.0125) (図1)。これらのデータから、IL28が抗腫瘍活性を有し、がんに対する治療用物質の可能性があることが示唆される。
実施例43
マウスIL28プラスミドおよびヒトIL29 C172S-PEGタンパク質はマウスにおいてRENCA腫瘍の増殖を阻害する
A. 要約
IL28/IL29がマウスにおいて腫瘍増殖に効果を及ぼすかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。その後、マウスに流体力学的送達(HDD)により対照ベクタープラスミド、mIL28プラスミド(SEQ ID NO:7)またはmIFNαプラスミド50 μgを5日目および12日目に注射した。別の担がんマウス群にヒトIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質25 μgを5日目〜21日目まで1日おき(EOD)に腹腔内注射により投与した。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。血清中のマウスIL28およびIFNαタンパク質レベルをELISAにより測定した。mIL28またはmIFNαプラスミドを注射したマウスは、対照プラスミド注射マウスに比べて有意に小さな腫瘍を示したことから、マウスIL28が抗腫瘍活性を有することが示唆された。さらに、IL29 C172S-PEGタンパク質を注射したマウスも対照に比べて腫瘍容積の減少を示した。これらのデータから、IL28およびIL29は双方とも抗腫瘍活性を有することが示唆される。
B. 研究デザイン
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。5日目および12日目に、マウス群(n=10/群)に流体力学的押圧方法を利用して空のpZP-7プラスミド、pZP-7/mIL28またはpORF/mIFNaのいずれか50 μgを静脈内注射した(生理食塩水1.6 mlに再懸濁されたプラスミドを5〜8秒のうちに尾静脈を介して注射する)。別のマウス群(n=10)にヒトIL29 C172S-PEG 25 μgを5日目〜21日目までEODに腹腔内注射した。腹腔内注射は全量200 μlで施した。プラスミド注射から24時間後(6日目および13日目)にマウスから採血して、ELISAにより血清mIL28およびmIFNαレベルを評価した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
C. 結果と結論
mIL28またはmIFNαプラスミドの投与は、このRENCAモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した(28日目に対照群に比べて3群全てに対しp<0.001) (図2)。ヒトIL29 C172S-PEGタンパク質の注射も対照に比べて腫瘍増殖を有意に阻害した。これらのデータから、mIL28およびヒトIL29が抗腫瘍活性を有し、がんに対する治療用物質の可能性があることが示唆される。
実施例44
ヒトIL29タンパク質の異なる2形態の低用量でRENCAモデルにおいて抗腫瘍活性を示す
A. 要約
IL29の抗腫瘍活性が上記よりも低い用量で達成されうるかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。担がんマウス群(n=10/群)にヒトIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)またはヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質1 μg、5 μg、25 μgを5日目〜23日目まで1日おき(EOD)に腹腔内注射により投与した。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。IL29 C172S-PEGタンパク質1、5または25 μgを注射したマウスは、対照に比べて腫瘍容積の減少を示した。さらに、ヒトIL29 C172S d2-7-PEGタンパク質1、5または25 μgを注射したマウスも対照に比べて有意に腫瘍増殖の減少を示した。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質の異なる2形態の低用量でマウスにおいて抗腫瘍活性を有することが示唆される。
B. 研究デザイン
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。マウス群(n=10/群)にヒトIL29 C172S-PEGまたはヒトIL29 C172S d2-7-PEG 1 μg、5 μg、または25 μgを5日目〜23日目までEODに腹腔内注射した。腹腔内注射は全量200 μlで施した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
C. 結果と結論
ヒトIL29 C172S-PEGタンパク質1 μg、5 μg、または25 μgの投与は、腫瘍増殖を有意に阻害した。さらに、IL29 C172S d2-7-PEGタンパク質1 μg、5 μgまたは25 μgの注射も媒体処置マウスに比べて腫瘍増殖を阻害した(図3)。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍に対する潜在的な治療用物質であるという証拠が得られる。
実施例45
ペグ化ヒトIL29を用いた治療的処置はRENCAモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す
A. 要約
IL29を用いた治療的処置が抗腫瘍活性を誘導できるかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。100 mm3の腫瘍容積に到達した時点で、マウスに媒体、ヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質5 μgもしくは25 μgを1日おき(EOD)に10回の注射で、またはヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質5 μgを毎日(ED) 20回の注射で投与した。対照として、マウスの1群は腫瘍注射の5日目に始めて20日間(5〜23日目)ヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgでEODに予防的に処置した。各個々のマウスはその腫瘍容積が100 mm3に到達して初めて注射を受けた。タンパク質の注射は全て腹腔内投与によるものであった。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。5 μgもしくは25 μgをEODにまたは5 μgをEDに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示した。前の結果と一致して、IL29 5 μgによる予防的処置を与えたマウスも対照に比べて腫瘍増殖の減少を示した。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質を用いた治療的処置がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することが示唆される。
B. 研究デザイン
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。マウス群(n=10/群)に、およそ100 mm3の腫瘍容積から始めて媒体、ヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgもしくは25 μgを20日間EODにまたはヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgを20日間EDに腹腔内注射した。別のマウス群に、実験の5日目に始めてヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgを20日間EODに投与した(予防的処置)。腹腔内注射は全量200 μlで施した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
C. 結果と結論
5 μgもしくは25 μgをEODにまたは5 μgをEDに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示した。前の結果と一致して、IL29 5 μgによる予防的処置を与えたマウスも対照に比べて腫瘍増殖の減少を示した(図4)。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍に対する潜在的な治療用物質であるという証拠が得られる。
実施例46
ペグ化ヒトIL29を用いた予防的処置はE.G7胸腺腫モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
A. 要約
IL29がその他の腫瘍において抗腫瘍活性を誘導できるかどうか確認するため、マウス群にE.G7腫瘍を0日目に皮下注射した。マウス群に媒体またはヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質25 μgをEODに10回の注射で投与した(1〜18日目)。タンパク質の注射は全て腹腔内投与によるものであった。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。25 μgをEODに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示した。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質を用いた処置がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することが示唆される。
B. 研究デザイン
10週齢の雌性C57BL/6マウス(Charles River Laboratories)にE.G7細胞0.4×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。マウス群(n=10/群)に、媒体またはヒトIL29 C172S d2-7-PEG 25 μgを20日間EODに腹腔内注射した。腹腔内注射は全量200 μlで施した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
C. 結果と結論
25 μgをEODに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示し、同様に対照動物に比べてマウスの長期生存性を示した(図5Aおよび5B)。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍に対する潜在的な治療用物質であるという証拠が得られる。
本明細書において引用される全ての特許、特許出願および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料(例えば、GenBankアミノ酸およびヌクレオチド配列の登録)の完全な開示は参照により組み入れられる。先の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。本明細書から不必要な限定が理解されるべきではない。当業者には明らかな変形が特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれるので、本発明は、示されているおよび記述されている全くの細部に限定されることはない。
5日目および12日目にマウスIL-28プラスミドを注射したマウスがインビボでRENCA腫瘍増殖を阻害することを示す。 マウスIL-28プラスミド、マウスIFN-αプラスミド、および20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172Sポリペプチドを注射したマウスがインビボでRENCA腫瘍増殖を阻害することを示す。プラスミド注射は5日目および12日目である。タンパク質を5日目〜21日目まで1日おきに与えた。 20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172Sポリペプチドおよび20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド1 μg、5 μgおよび25 μgを注射したマウスがインビボでRENCA腫瘍増殖を阻害することを示す。タンパク質は全て5日目〜23日目まで1日おきに与えた。 腫瘍容積が100 mm3に到達したら20日間1日おきに、媒体を注射したマウス(■)、20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド5 μgを注射したマウス(▼)、および20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド25 μgを注射したマウス(◆)、腫瘍容積が100 mm3に到達したら20日間毎日20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド5 μgを注射したマウス(●)、ならびに腫瘍注射の5日目に始めて20日間1日おきに20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド5 μgを予防的に投与したマウス(▲)を示す。 図5Aは、0日目に始めて20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド25 μgまたは媒体を注射し、その後10回の腹腔内注射を1日おきにしたマウスが、E.G7胸腺腫モデルにおいてマウスの生存を引き延ばすことを示す。図5Bは、0日目に始めて20 kDのメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドにN-末端結合されたヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド25 μgまたは媒体を注射し、その後10回の腹腔内注射を1日おきにしたマウスが、E.G7胸腺腫モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することを示す。

Claims (27)

  1. Figure 2008508310
    の群から選択されるポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  2. ポリペプチドがポリエチレングリコールをさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. ポリエチレングリコールがポリペプチドとアミノ末端に共有結合的に連結される、請求項2記載の方法。
  4. ポリエチレングリコールが約20 kD、30 kD、または40 kDである、請求項2記載の方法。
  5. ポリエチレングリコールが直鎖状または分枝状である、請求項2記載の方法。
  6. ポリエチレングリコールがモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドである、請求項2記載の方法。
  7. 患者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
  8. 患者がヒトである、請求項7記載の方法。
  9. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  10. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド；ならびに
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって;
    がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  11. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド;
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって;
    がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  12. 第2のポリペプチドがインターフェロンである、請求項11記載の方法。
  13. 第2のポリペプチドがインターフェロン-α、インターフェロン-β、またはインターフェロン-γである、請求項12記載の方法。
  14. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの進行を阻害する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  15. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド;
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの進行を阻害する方法であって;
    がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  16. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの発症を遅らせる方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  17. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド;
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの発症を遅らせる方法であって;
    がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  18. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの重症度を軽減する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  19. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド;
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの重症度を軽減する方法であって;
    がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  20. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  21. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド;
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって;
    がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される、方法。
  22. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹、寝汗、不明熱、体重減少、および極度の疲労の群から選択される、方法。
  23. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド；ならびに
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって;
    状態または症状の少なくとも1つが頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹、寝汗、不明熱、体重減少、および極度の疲労の群から選択される、方法。
  24. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが背痛、身長低下、貧血、腎臓障害、反復性呼吸器感染症、および高カルシウム血症の群から選択される、方法。
  25. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド；ならびに
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって;
    状態または症状の少なくとも1つが背痛、身長低下、貧血、腎臓障害、反復性呼吸器感染症、および高カルシウム血症の群から選択される、方法。
  26. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位、嚥下困難、呼吸または発話の問題、口内の麻痺感、鼻血、持続性の耳痛、難聴、および口内または頸部の腫脹または瘤の群から選択される、方法。
  27. Figure 2008508310
    の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
    第2のポリペプチド；ならびに
    薬学的に許容される媒体
    を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって;
    状態または症状の少なくとも1つが数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位、嚥下困難、呼吸または発話の問題、口内の麻痺感、鼻血、持続性の耳痛、難聴、および口内または頸部の腫脹または瘤の群から選択される、方法。
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