JP2008508310A - がんおよび自己免疫障害を治療するためのil−28およびil−29の使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
サイトカインは一般に、造血系細胞の増殖もしくは分化を刺激するかまたは体内の免疫および炎症応答機構に関与する。造血に影響を及ぼすサイトカインの例は、赤血球の増殖を刺激するエリトロポエチン(EPO);巨核球系細胞の増殖を刺激するトロンボポエチン(TPO);および好中球の増殖を刺激する顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である。これらのサイトカインは、貧血症、血小板減少症、および好中球減少症に苦しむ患者における正常な血液細胞レベルの回復、またはがんに対する化学療法の受容において有用である。
以下に続く説明のなかで、いくつかの用語が広く使用される。以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。
IL-28に言及する場合、この用語はIL-28AとIL-28Bの両方を意味するものとする。以前には、IL-28Aはzcyto20 (SEQ ID NO:1および2)と称されており、これらの用語は本明細書において同義的に使用され、IL-29はzcyto21 (SEQ ID NO: 3および4)と称されており、これらの用語は本明細書において同義的に使用され、およびIL-28Bはzcyto22 (SEQ ED NO:5および6)と称されており、これらの用語は本明細書において同義的に使用される(PCT出願WO 02/086087およびSheppard et al., 前記を参照されたい)。IL-28のマウス相同分子種はzcyto24 (SEQ ID NO:7および8)、zcyto25 (SEQ ID NO:9および10)と以前には称されていた。
に示されるIL-29ポリヌクレオチド分子によってコードされる、
を含み、SEQ ID NO:119に示されるシグナル配列またはSEQ ID NO:121に示されるシグナル配列をさらに含み得る。さらなるIL-29ポリペプチドは、SEQ ID NO:40および41を含む。SEQ ID NO:119のシグナル配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO:118として示されている。SEQ ID NO:120のシグナル配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO:121として示されている。
のヌクレオチド配列を有する核酸分子にまたは
に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズさせることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定配列に対する熱融解点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50%が、完璧に適合するプローブにハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度およびpH下での)である。
のヌクレオチド配列をそれぞれ有する核酸分子(またはその相補体)と、洗浄のストリンジェンシーが55℃で0.1%SDS入りの0.5×SSC、または65℃で0.1%SDS入りの2×SSCを含め、55〜65℃での0.1%SDS入りの0.5×〜2×SSCに同等であるストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイズする。当業者は、例えば、洗浄溶液中のSSCに代えてSSPEを用いることで同等の条件を容易に考え出すことができる。
のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)と、洗浄のストリンジェンシーが50℃で0.1%SDS入りの0.1×SSC、または65℃で0.1%SDS入りの0.2×SSCを含め、50〜65℃での0.1%SDS入りの0.1×〜0.2×SSCに同等である高度にストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイズする。
それぞれに対し実質的に類似の配列同一性を有するIL-28またはIL-29ポリペプチドを提供する。「実質的に類似の配列同一性」という用語は、
にそれぞれ示される配列、またはその相同分子種に対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%、96%、97%、98%、99%、もしくは99.5%を超える配列同一性を含むポリペプチドを示すよう本明細書において使用される。本発明は同様に、本発明のポリペプチドまたはその断片に対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%の、または99.5%を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドを含む。本発明はそのようなポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む。本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、組換えポリペプチドであることが好ましい。別の局面では、本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続的アミノ酸を有する。例えば、本発明のIL-29ポリペプチドは
由来の少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続的アミノ酸を有するポリペプチドに関する。同一性の割合を決定する方法は以下に記述されている。
のアミノ酸配列をそれぞれ有するコードポリペプチドとの間の類似性の判定、および/またはハイブリダイゼーションアッセイを用いて同定できる変異体核酸分子を企図する。そのような変異体は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが55〜65℃で0.1% SDS入りの0.5×〜2×SSCに同等であるストリンジェントな洗浄条件の下で、
のヌクレオチド配列をそれぞれ有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズする核酸分子、あるいは(2)
のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%、96%、97%、98%、99%もしくは99.5%を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。または、変異体は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが50〜65℃で0.1% SDS入りの0.1×〜0.2×SSCに同等である高度にストリンジェントな洗浄条件の下で、
のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズする核酸分子、および(2)
のアミノ酸配列それぞれに対し少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%、96%、97%、98%、99%もしくは99.5%を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴付けることができる。
の対応領域に対し少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、およびより好ましくは少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%または99.5%を超えて同一である配列を含んだポリペプチドを含む。アフィニティータグを含んだポリペプチドは、IL-28およびIL-29ポリペプチドとアフィニティータグとの間にタンパク質分解切断部位をさらに含むことができる。好ましいそのような部位としては、トロンビン切断部位および第Xa因子切断部位が挙げられる。
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、インターフェロン-αに類似した抗ウイルス効果を有することが明らかにされている(WO 04/037995を参照されたい)。インターフェロンは自己免疫疾患、尖圭コンジローマ、慢性C型肝炎、膀胱がん、子宮頸がん、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、慢性B型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスに感染している患者におけるカポジ肉腫、悪性黒色腫、有毛細胞白血病、および多発性硬化症の治療用に米国で承認されている。さらに、IL-28およびIL-29ポリペプチドは細胞増殖を阻害することにより、アテローム性動脈硬化などの、動脈硬化の形態を治療するのに使われてもよい。したがって、本発明はそのような状態を治療するため、および網膜症を治療するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28またはIL-29ポリペプチド、融合タンパク質、およびその断片の使用を企図する。本発明は、例えば、B細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病を含む、リンパ増殖性障害と関連する状態もしくは症状を治療するため、予防するため、その状態もしくは症状の進行を阻害するため、その状態もしくは症状の発症を遅らせるため、および/またはその状態もしくは症状の少なくとも1つを軽減するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28およびIL-29タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの使用を提供する。さらに、本発明は、腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん(例えば、小細胞肺がん、扁平上皮細胞がん、腺がんおよび大細胞がんなどの非小細胞肺がん、ならびに中皮腫)、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択されるそれらのがんと関連する状態もしくは症状を治療するため、予防するため、その状態もしくは症状の進行を阻害するため、その状態もしくは症状の発症を遅らせるため、および/またはその状態もしくは症状の重症度を軽減するためもしくはその状態もしくは症状の少なくとも1つを阻害するためのIL-28およびIL-29活性を有するIL-28およびIL-29タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの使用をさらに提供する。
の群から選択されるポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんを治療する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの進行を阻害する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの進行を阻害する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの発症を遅らせる方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの発症を遅らせる方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの重症度を軽減する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの重症度を軽減する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、がんがB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞がん、子宮頸がん、黒色腫、甲状腺がん、悪性神経膠腫、乳がん、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がんの群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、がんの状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、がんが腎細胞がん、子宮頸がん(例えば、扁平上皮型および腺がん)、頭頸部腫瘍(例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇口腔がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、ならびに唾液腺がん)、黒色腫(例えば、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、および悪性黒子型黒色腫などの悪性黒色腫)、甲状腺がん(例えば、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がん)、悪性神経膠腫(例えば、多形性膠芽腫および未分化星状細胞腫)、乳がん(例えば、腺管がん)、結腸がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、精巣がん、カポジ肉腫、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫)の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹、寝汗、不明熱、体重減少、および極度の疲労の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが頸部、腋窩部または鼠径部リンパ節の無痛性の腫脹、寝汗、不明熱、体重減少、および極度の疲労の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが背痛、身長低下、貧血、腎臓障害、反復性呼吸器感染症、および高カルシウム血症の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが背痛、身長低下、貧血、腎臓障害、反復性呼吸器感染症、および高カルシウム血症の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位、嚥下困難、呼吸または発話の問題、口内の麻痺感、鼻血、持続性の耳痛、難聴、および口内または頸部の腫脹または瘤の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
の群から選択される配列と少なくとも90%または95%の配列同一性を有するポリペプチド、第2のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含んだ製剤の治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも1つを阻害する方法であって、状態または症状の少なくとも1つが数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍または疼痛部位、嚥下困難、呼吸または発話の問題、口内の麻痺感、鼻血、持続性の耳痛、難聴、および口内または頸部の腫脹または瘤の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドは
に対し少なくとも15個、少なくとも30個、少なくとも45個、または少なくとも60個の連続アミノ酸を有することができる。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。第2のポリペプチドはインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γなどのインターフェロン分子、IL-2および/もしくはIL-21などの別の治療薬、またはそれらの組合せであり得る。
表在拡大型黒色腫は最もよく見られるタイプの黒色腫である。約10分の7 (70%)がこのタイプである。それらは中年の人々に多く生じる。女性では最もよく見られる場所は脚上であるが、男性では胴体、具体的には背部によく見られる。それらは皮膚表面のいたる所に拡がることで始まる傾向があり、これは放射状増殖期として知られている。黒色腫がこの時期に除去されれば、回復の見込みが非常に高い。黒色腫が除去されなければ、それは皮膚層中のさらに奥底に向かって増殖し始めると考えられる。ひいては、黒色腫が血流またはリンパ系の中を身体の他の部分にまで拡がる危険性がある。結節型黒色腫は胸部または背部に生じることが最も多い。これは中年の人々に最もよく見られる。これは除去されなければ、皮膚中のさらに奥底に向かってかなり急速に増殖する傾向がある。このタイプの黒色腫は皮膚表面の残部上に隆起することが多く、瘤のような感触がする。これはとても暗い褐色から黒色または黒色になることがある。悪性黒子型黒色腫は顔面に、特に高齢者に最もよく見られる。これはゆっくり増殖し、発症するのに数年かかることがある。末端性黒色腫は手のひら、足の裏または足の爪の周りに見られることが多い。その他の非常に稀有なタイプの皮膚黒色腫としては、メラニン欠乏性黒色腫(この場合には黒色腫はその色素を喪失し、白色領域として現れる)および線維形成性黒色腫(これは線維性瘢痕組織を含む)が挙げられる。悪性黒色腫は皮膚以外の身体の部分から生じることがあるが、これは極めて稀有である。影響を受ける可能性がある身体の部分は眼、口、爪の下部(爪下黒色腫として知られる)、外陰部もしくは膣組織、または内部的にである(cancerbacupインターネットウェブサイト)。
本発明は
の群から選択されるポリペプチドの治療的有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、自己免疫障害と関連する状態もしくは症状を治療する、予防する、その状態もしくは症状の進行を阻害する、その状態もしくは症状の発症を遅らせる、および/またはその状態もしくは症状の少なくとも1つを軽減する方法であって、自己免疫障害が多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群から選択される方法を提供する。ポリペプチドはポリエチレングリコール成分をさらに任意で含んでもよく、その成分はポリペプチドと(例えば、アミノ末端に)共有結合的に連結させることができる。ポリエチレングリコールは直鎖状または分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールは約20 kD、30 kD、または40 kDの分子量を有することができる。ポリエチレングリコールはモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドであり得る。ポリペプチドが投与される患者は、ヒトなどの、哺乳動物であり得る。
関節リウマチは、身体の免疫応答が身体自身のタンパク質、具体的にはコラーゲン、つまり多くの組織、とりわけ関節の基礎となるタンパク質に向けられる自己免疫障害である。こうして生じたコラーゲンに対する免疫応答は、関節破壊の原因となる。長期にわたると患者は手足を動かすことができなくなり、関節や膝に激痛を覚える。関節炎患者の血清中ではTNFα(tumor necrosis factor)の量とコラーゲンに対する抗体量が増加するが、このどちらも慢性疾患の指標というだけでなく疾患の病態にも寄与する(Smolen and Stein+er G, Nat. Rev. Drug Discov., 2:473-488, 2003; Firestein, Nature 423:356-361, 2003.)。さらに、この疾患はCD4+ T細胞により惹起され媒介される。DCはCD4+ T細胞にコラーゲンを抗原として提示する。コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、ヒトの場合に見られるこの疾患をかなりの程度まで反映している関節リウマチのマウスモデルである(Moore, Methods Mol. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol., 56:12-34, 2002)。CFAに乳化させたコラーゲンを尾基部に2回投与してマウスに免疫する。この結果、足に腫脹が生じ、この腫脹は一定期間にわたって増大し、目視評価とキャリパーによる測定が可能である。IL-28A、IL-28B、またはIL-29をコラーゲン免疫マウス群に投与し、疾患スコアに対する効果を評価する。IL-28A、IL-28B、およびIL-29による足部スコアと足部腫脹の阻害は、進行中の自己免疫応答に対するその阻害効果を示すものである。
炎症性腸疾患(IBD)として知られる、免疫制御不全に起因する腸内の炎症は、2つの大きな疾患定義、つまりクローン病(CD)と潰瘍性大腸炎(UC)に特徴付けられる。一般的に、CDはTh1応答の制御の不全が原因であると思われており、UCはTh2応答の制御の不全が原因であると考えられている。複数のサイトカイン、ケモカイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼは、IBD患者由来の炎症病変部で上方制御されることが明らかにされている。これらにはIL-1、 IL-12、 IL-18、 IL-15、 TNF-α、 IFN-γ、 MIP1α、 MIP1β、およびMIP2が含まれる。現在のところREMICADE(登録商標) (Centocor, Malvern, PA)は、CD患者を治療する際に疾患そのものを標的とするよう成功裏に用いられている唯一の薬物であり、その他の治療は患者の生活の質を一般に向上させる。IBDに関連する自己免疫応答のIL-28A、IL-28B、およびIL-29による阻害は、マウスDSSモデル、マウスTNBSモデル、マウスCD4+CD45Rbhiモデル、マウスmdr 1a-/-モデルおよびマウス移植片対宿主病(GVHD)腸炎症モデルなどの、IBDモデルで実証されている(Stadnicki A and Colman RW, Arch Immunol Ther Exp 51:149-155, 2003; Pizarro TT et al., Trends in Mol Med 9:218-222. 2003)。ヒトIBDの実験モデルの1つは、齧歯類へのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の経口投与である。DSSは、ヒトでの組織学的所見に幾分似た特徴を有する急性と慢性の両方の潰瘍性大腸炎を誘発する。DSSにより誘発される大腸炎は、腸内細菌、マクロファージおよび好中球に影響し、T細胞およびB細胞の役割は小さい(Mahler et al., Am. J. Physiol. 274:G544-G551, 1998; Egger et al., Digestion 62:240-248, 2000)。TNBS誘発大腸炎はTh1媒介性疾患と考えられており、したがってヒトでのUCよりもCDに似ている。トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を様々な用量(系統依存的)でマウスに直腸内注入して、Th1様サイトカインIL-12、IL-18およびIFNγの分泌を伴う、抗原(TNBS)特異的なT細胞応答を誘発する。大腸炎は、炎症部位への抗原特異的T細胞、マクロファージおよび好中球の動員を伴う(Neurath et al., Int. Rev. Immunol., 19:51-62, 2000; Dohi T et al., J. Exp. Med. 189:1169-1179, 1999)。別の比較的新しい大腸炎モデルは、SCIDマウスへのCD4+CD45RBhi移入モデルである。CD4+ T細胞はCD45Rbの発現に基づき2種に大別することができる。CD4+CD45RBhi細胞はナイーブT細胞と考えられるが、CD4+CD45Rbloは制御性T細胞と考えられる。同系SCIDマウスへのCD4+ T細胞全体の移入では大腸炎の症状が誘発されない。しかしながら、CD4+CD45RBhi T細胞のみがSCIDマウスに注射されれば、マウスは3〜6週間かけて大腸炎を発症する。ナイーブT細胞に加えてCD4+CD45Rblo制御性T細胞を同時移入することで大腸炎が阻害されることから、制御性T細胞が免疫応答の制御に重要な役割を果たしていることが示唆される(Leach et al., Am. J. Pathol., 148:1503-1515, 1996; Powrie et al., J. Exp. Med., 179:589-600, 1999)。このモデルは、IL-28A、IL-28B、およびIL-29がマウスで寛容原性DCを生み出すその能力を介しT制御性機能を上方制御することによって大腸炎を阻害することを実証すると考えられる。骨髄移植に付随する、臨床的に関連のある大腸炎モデルはGVHD誘発大腸炎である。移植片対宿主病(GVHD)は、免疫不適格性の、組織適合性レシピエントのエフェクター細胞で発症し、その細胞が増殖して宿主細胞を攻撃する。同種骨髄移植を受けた患者または重篤な再生不良性貧血患者はGVHDの危険性がある。マウスでもヒトでも、下痢はこの症候群の共通した深刻な症状である。ヒトでは結腸と小腸の両方の疾患が認められている。マウスGVHD誘発大腸炎モデルは、ヒトで見られるような類似の組織学的疾患を示す。したがって、これらのマウスモデルを利用して、GVHDに対する大腸炎阻害薬の効力を評価することができる(Eigenbrodt et al., Am. J. Pathol., 137:1065-1076, 1990; Thiele et al., J. Clin. Invest., 84:1947-1956, 1989)。
全身性エリテマトーデス(SLE)は、偏在性の自己抗原(抗dsDNA)に対する慢性的なIgG抗体産生を特徴とする免疫複合体関連の障害である。SLEの影響は特定臓器に局在化するというより、むしろ全身性である。多数の染色体座がこの疾患に関連しており、抗dsDNA抗体や糸球体腎炎などの、疾患の様々な局面に寄与すると考えられる。CD4+ T細胞は、マウスSLEモデルにおいて積極的な役割を果たすことが明らかにされている(Horwitz, Lupus 10:319-320, 2001; Yellin and Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 2000)。CD8+ T細胞の役割は明確には定義されていないが、「サプレッサー」CD8+ Tの機能が狼瘡患者では損なわれていることを示唆する証拠がある(Filaci et al., J. Immunol., 166:6452-6457, 2001; Sakane et al., J. Immunol., 137:3809-3813, 1986)。
乾癬は慢性の炎症性皮膚疾患であり、増殖性表皮角化細胞やCD4+記憶T細胞、好中球およびマクロファージを含む、浸潤性単核球と関連する(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996)。環境抗原が疾患の病態の開始や原因に重要な役割を果たすと現在では考えられている。しかしながら、乾癬の病態を媒介すると思われるのは自己抗原に対する寛容の喪失である。樹状細胞およびCD4+ T細胞は、病態をもたらす免疫応答を媒介する抗原の提示と認識で重要な役割を果たすと思われる。CD4+CD45RB移入モデルに基づく乾癬のモデルが最近になって開発された(Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672 (2002))。乾癬誘導細胞を注射されているマウスにIL-28A、IL-28B、またはIL-29を投与し、臨床スコア(皮膚疾患)に対する効果を評価し、IL-28A、IL-28B、およびIL-29の有益な効果を明らかにする。
実施例1
哺乳動物発現プラスミド
zcyto20およびzcyto21を含む発現プラスミドは、相同組換えを介して構築された。zcyto20およびzcyto21 cDNAの断片は、PCR増幅を利用して作出された。PCRのプライマーは以下の通りであった:
zcyto20/pZMP21: zc40923およびzc43152、それぞれSEQ ID NO:42および43;ならびにzcyto21/pZMP21: zc40922およびzc43153、それぞれSEQ ID NO:72および73。
CHO細胞での哺乳動物構築体の発現
zcyto20/pZMP21およびzcyto21/pZMP21の構築体200 μgを37℃で3時間 Pvu I 200単位を用いて消化し、その後、IPAで沈殿させて、1.5 mL遠心管中でスピンダウンした。上清をペレットからデカント除去し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機中14,000 RPMで10分間スピンし、上清をペレットから吸引除去した。その後、ペレットを無菌環境中でPF-CHO培地750 μlに再懸濁し、60℃で30分間インキュベートさせた。CHO細胞をスピンダウンし、DNA-培地液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションした:950 μF、高電気容量、および300 V。その後、PF-CHO培地を用いてキュベットの内容物を取り出し、25 mLにまで希釈し、125 mL振盪フラスコに入れた。このフラスコを振盪機上で37℃、6% CO2のインキュベーターに入れて、120 RPMで振盪させた。
zcyto20-CHOタンパク質の精製および分析
A. Zcyto20-CHOタンパク質の精製
組換えzcyto20 (IL-28A)タンパク質は、DXB11-CHO細胞系のプールから産生された。培養物を収集し、培地を0.2 μmフィルターにより滅菌ろ過した。
SDS-PAGE (Nupage 4〜12%ビストリス, Invitrogen, Carlsbad, CA)およびzcyto20-CHOタンパク質に交差反応する一次抗体としてウサギ抗zcyto21-CEE-BV IgGを用いたウエスタンブロットにより、組換えzcyto20タンパク質を分析した。ゲルをInvitrogen社のXcell IIミニセル(Carlsbad, CA)を用いて電気泳動し、Invitrogen社のXcell IIブロットモジュールを機器マニュアルに提供されている使用法にしたがって用い0.2 μmのニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に転写した。転写は25 mMトリスベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含有する緩衝液中50分間500 mAで行った。この膜を10%脱脂粉乳の1×PBS液で10分間ブロッキングし、次いで一次抗体の2.5%脱脂粉乳含有1×PBS液を用いてプローブした。ブロットを振盪させながら室温で1時間標識した。二次抗体標識のため、ブロットをPBSで3回各10分間洗浄し、次いでヤギ抗ウサギIgG-HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を用いて1時間プローブした。ブロットを1×PBSで3回各10分間洗浄し、SuperSignal(登録商標) ULTRA試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)の1:1混合液を用いて発色させ、Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Germany)を用いてシグナルを捕捉した。
CHO培地から精製されたzcyto20タンパク質は非還元条件下、4〜12%ビストリスゲルでおよそ20 kDaに二重線および約38 kDaに少ない三重線の二量体として主に移動した。それらはみな、還元条件下では単一の20 kDaのバンドにまとまった。MSペプチドマッピングにより、ジスルフィド結合に関して2つの異性体の混合物およびO-結合型グリコシル化部位の存在が示唆された。
zcyto21-CHOタンパク質の精製および分析
A. Zcyto21-CHOタンパク質の精製
組換えzcyto21は安定なDXB11-CHO細胞系から産生された。培養物を収集し、培地を0.2 μmフィルターにより滅菌ろ過した。疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーに先立ち、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組合せから始めることにより、タンパク質を馴化培地から精製した。Poros 50 HSカラム(Applied Biosystems, Framingham, MA)に負荷する前に、DXB111-CHO培地をpH 6.0に調整した。カラムを1×PBS、pH 6で洗浄し、結合タンパク質を5×PBS、pH 8.4で溶出した。溶出した画分を収集し、SDS-PAGEによりクマシー染色を用いてzcyto21タンパク質の存在を確認した。その後、この画分を13 mSの伝導度にまで希釈し、そのpHを8.4に調整し、Poros 50 HQカラム(Applied Biosystems, Framingham, MA)に通した。次いで、zcyto21タンパク質を含有する素通り画分(flow-through)を硫酸アンモニウムで約127 mSに調整し、Toyopearl Phenyl 650Sカラム(TosoH, Montgomeryville, PA)に負荷した。Zcyto21タンパク質を硫酸アンモニウムの逓減的勾配により溶出し、純粋なzcyto21を含む画分をプールし、Superdex 75カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)への注入を目的に濃縮した。最終精製タンパク質の濃度をBCAアッセイ(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)およびHPLC-アミノ酸分析により測定した。
SDS-PAGE (Nupage 4〜12%ビストリス, Invitrogen, Carlsbad, CA)および一次抗体としてウサギ抗zcyto21-CEE-BV IgGを用いたウエスタンブロットにより、組換えzcyto21タンパク質を分析した。ゲルをInvitrogen社のXcell IIミニセル(Carlsbad, CA)を用いて電気泳動し、Invitrogen社のXcell IIブロットモジュールを機器マニュアルに提供されている使用法にしたがって用い0.2 μmのニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に転写した。転写は25 mMトリスベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含有する緩衝液中50分間500 mAで行った。この転写ブロットを10%脱脂粉乳の1×PBS液で10分間ブロッキングし、次いで一次抗体の2.5%脱脂粉乳含有1×PBS液を用いてプローブした。ブロットを振盪させながら室温で1時間標識した。二次抗体標識のため、ブロットをPBSで3回各10分間洗浄し、次いでヤギ抗ウサギIgG-HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を用いて1時間プローブした。ブロットを1×PBSで3回各10分間洗浄し、SuperSignal(登録商標) ULTRA試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)の1:1混合液を用いて発色させ、Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Germany)を用いてシグナルを捕捉した。
CHO培地から精製されたzcyto21タンパク質は還元および非還元の両条件下、4〜12%ビストリスゲルで2本またはそれ以上のおよそ28 kDaのバンドとして移動した。MSペプチドマッピングにより、ジスルフィド結合に関して2つの異性体の混合物ならびに1つのN-結合型グリコシル化部位およびいくつかのO-結合型グリコシル化部位の存在が示唆された。
IL-29型の同定
精製されたIL-29プール由来のピーク画分を、シークエンシンググレードのトリプシン(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)をおよそpH 6.3のリン酸緩衝液中で用い37℃で一晩消化して、ジスルフィド再構成を抑えた。各消化物を四重極飛行時間ハイブリッド型質量分析計(Micromass, Milford MA)にインライン連結された逆相HPLC (Agilent, Palo Alto, CA)により分析した。スペクトルを収集し、質量対電荷比から質量に変換し、IL-29のトリプシン消化から生じる全ての理論的なペプチドおよびジスルフィド結合ペプチドの組合せと比較した。還元前後のスペクトルを適切な質量の帰属と比較することにより、ジスルフィドをIL-29のジスルフィド結合ペプチドに帰属した。画分#20由来の材料物質はS-グルタチオニルシステインとして観測されたC171とともにジスルフィドパターンC15-C112およびC49-C145 (全てSEQ ID NO:4を参照されたい)を示した。画分#51由来の材料物質はS-グルタチオニルシステインとして観測されたC15とともにジスルフィドパターンC49-C145およびC112-C171 (SEQ ID NO:4を参照されたい)を示した。
大腸菌発現プラスミド
発現ベクターpTAP237の構築
プラスミドpTAP237は相同組換えによりpTAP186のSma I部位にPCR生成リンカーを挿入することで生成された。プラスミドpTAP186はプラスミドpRS316 (サッカロマイセスセレビシエ・シャトルベクター)ならびにpMAL-c2、つまりpKK223-3に由来し、tacプロモーターおよびrrnBターミネーターを含む大腸菌発現プラスミドから得られた。プラスミドpTAP186は、Sma I部位が破壊されているカナマイシン耐性遺伝子を含み、酵母ARS-CEN6およびURA3配列に隣接するNot IおよびSfi I部位を有しており、Not Iを用いた消化によるプラスミドからのその除去が容易である。PCR生成リンカーにより、pTAP186の発現カプラー配列を合成RBS II配列に置き換えた。それはSEQ ID NO:44および45に示される、それぞれ、オリゴヌクレオチドzc29,740およびzc29,741の各100 pmol、ならびにSEQ ID NO:46および47に示される、それぞれ、オリゴヌクレオチドzc29,736およびzc29,738の各およそ5 pmolから調製された。これらのオリゴヌクレオチドは94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃30秒間を10サイクル、その後4℃に浸漬のPCRにより結合された。得られたPCR産物を2倍量の100%エタノールを用いた沈殿によって濃縮した。Sma Iで消化されたレシピエントベクターpTAP186に組入れるために用いられるようペレットを水10 μLに再懸濁して、合成RBS II配列を含む構築体を産生した。PCR生成リンカーおよそ1 μgおよびSma Iで消化されたpTAP186 100 ngをともに混合し、コンピテント酵母細胞(S.セレビシエ)に形質転換した。酵母を次いで-URA Dプレートに蒔き、約72時間室温で放置した。その後、単一プレート由来のUra+形質転換体をH2O 1 mLに再懸濁し、短時間スピンして、酵母細胞をペレット状にした。細胞ペレットを溶解緩衝液0.5 mlに再懸濁した。DNAを回収し、大腸菌MC1061に形質転換した。SEQ ID NO:44および45に示される、それぞれオリゴヌクレオチドzc29,740およびzc29,741を各20 pmol用いて上記に開示されているコロニーPCRにより、クローンをスクリーニングした。アガロースゲルで正確なサイズのバンドを示すクローンを配列解析に供した。正確なプラスミドをpTAP237と名付けた。
IL-29システイン突然変異体のコドン最適化
A. IL-29野生型発現構築体のコドン最適化生成
天然ヒトIL-29遺伝子配列は、大腸菌株W3110では十分に発現されなかった。IL-29のコード配列で使われるコドンの検討から、その配列はCAI値が0.206に等しく大腸菌で使用頻度が最も低いコドンを過剰に含むことが示唆された。CAIは同義語コドンの偏りの統計的尺度であり、タンパク質産生のレベルを予測するのに使用することができる(Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95, 1987)。高度に発現されるタンパク質をコードする遺伝子は、高いCAI値(>0.6)を持つ傾向がある一方で、低いCAI値(≦0.2)を有する遺伝子によってコードされるタンパク質は一般に非効率的に発現される。このことから大腸菌でIL-29の産生が低いことの理由が示唆された。さらに、稀有なコドンが遺伝暗号の後半に密集しており、翻訳失速、翻訳の早期終了、およびアミノ酸の誤取込みの可能性が高くなる(Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):494-500, 1995)。
から構築された。これらの重複オリゴヌクレオチドのプライマー伸長後のPCR増幅によって、コドンが大腸菌での発現用に最適化された完全長のIL-29遺伝子が産生された。最終PCR産物を酵母相同組換えにより発現ベクターpTAP237に挿入した。発現構築体を酵母から抽出し、コンピテント大腸菌MC1061に形質転換した。カナマイシンに耐性のクローンをコロニーPCRにより同定した。陽性クローンを配列決定により検証し、その後に産生宿主菌株W3110に形質転換した。最適化済のIL-29配列を有する発現ベクターをpSDH184と命名した。得られた遺伝子は大腸菌で非常によく発現された。新たな構築体での発現レベルは250 mg/L前後にまで増加した。
zcyto21 C172Sシステイン突然変異体を作出するために使われた戦略は、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)に基づく。プライマーは製造元の指示に基づいてC172S突然変異を導入するようデザインされた。これらのプライマーをZG44,340 (SEQ ID NO:58)およびZG44,341 (SEQ ID NO:59)と名付けた。QuikChange Mutagenesisの使用説明書にしたがいPCRを行って、zcyto21 C172Sシステイン突然変異体を作出した。同一の50 μlの反応液5つを用意した。1反応当たりpSDH175 (酵母ベクターの骨格配列を欠く) DNA 2.5 μlを鋳型として使用した。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを作成した:10×PCR緩衝液30 μl、ZG44,340 125 ng (27.42 μl)、ZG44,341 125 ng (9.18 μl)、dNTP 6 μl、Pfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA) 6 μl、および水206.4 μl。このカクテル47.5 μlを各反応液に等分した。PCR条件は次の通りであった:95℃30秒間を1サイクル、その後95℃30秒間、55℃1分間、68℃7分間を16サイクル、その後68℃7分間を1サイクル、および4℃維持で終了。5つのPCR反応液の全てを1本のチューブにまとめた。製造元の使用説明書の通り、制限酵素Dpn I 5 μlをPCR反応液に加え、37℃で2時間インキュベートした。10% 3 M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールを加えることで、DNAを沈殿させた。沈殿は-20℃で20分間行われた。DNAを14,000 rpmで5分間スピンし、ペレットを高速真空乾燥した。DNAペレットを水20 μlに再懸濁した。PCRから生じたDNAを大腸菌株DH10Bに形質転換した。DNA 5 μlをElectroMAX DH10B細胞(Invitrogen) 40 μlと混合した。次いで、細胞およびDNA混合物を1.75 kV、100 Ω、および25 μFに設定されたBio-Rad Gene Pulser II (商標)により0.1 cmのキュベット(Bio-Rad)中でエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を37℃で1時間増殖させた。混合物をLB + 25 μg/mlのカナマイシンプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。10クローンをzcyto21 C172Sインサートの存在についてスクリーニングした。QIAprep (商標) Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いてDNAを10クローンの全てから単離し、制限酵素Xba IおよびPst Iを用い切断することによりインサートの存在について分析した。9クローンがインサートを含んでおり、これらを配列決定して、zcyto21 C172S突然変異が導入されていることを確実にした。クローンを配列検証し、その後にpSDH188と名前を付けた。
大腸菌IL-29発現構築体
野生型配列を含むIL-29のDNA断片はPCRを用いて単離した。41塩基対(bp)のベクターフランキング配列およびIL-29のアミノ末端に対応する24 bpを含んだプライマーzc41,212 (SEQ ID NO:60)、ならびにzcyto21インサートを含むベクターの3'末端に対応する38 bpを含んだプライマーzc41,041 (SEQ ID NO:61)を反応で使用した。PCR条件は次の通りであった:94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃1分間を25サイクル、その後4℃浸漬。分析のためPCRサンプルのうちの少量サンプル(2〜4 μL)を1×TBE緩衝液を用いて1%アガロースゲルで泳動したところ、予想されたおよそ500 bp断片のバンドが見られた。反応液100 μLのうちの残存容量を無水エタノール200 μLで沈殿した。上記に開示されるようにSma Iで切断されたレシピエントベクターpTAP238に組入れるために用いられるようペレットを水10 μLに再懸濁して、zcyto21をコードする構築体を産生した。正確な配列を有するクローンをpTAP377と名付けた。クローンpTAP377をNot 1/Nco 1 (37℃で1時間、DNA 10 μl、buffer 3 New England BioLabs 5 μl、Not 1 2 μL、Nco 1 2 μL、水31 μL)で消化し、T4 DNAリガーゼ緩衝液で再連結した(先の消化物7 μL、5×緩衝液2 μL、T4 DNAリガーゼ1 μL)。この段階により酵母配列CEN-ARSを除去して、ベクターを簡素化した。pTAP337 DNAをPvu 2およびPst 1で診断的に消化して、酵母配列が存在しないことを確認した。過剰コピーの稀有な大腸菌tRNA遺伝子を保有する宿主菌株である大腸菌株W3110/pRAREに、P/taP377 DNAを形質転換した。
大腸菌IL-28A発現構築体
zcyto20の野生型配列(SEQ ID NO:1に示される)を含むDNA断片はPCRを用いて単離した。41 bpのベクターフランキング配列およびzcyto20のアミノ末端に対応する24 bpを含んだプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)、ならびにzcyto20インサートを含むベクターの3'末端に対応する38 bpを含んだプライマーzc43,437 (SEQ ID NO:63)。PCR条件は次の通りであった:94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃1分間を25サイクル、その後4℃浸漬。分析のためPCRサンプルのうちの少量サンプル(2〜4 μL)を1×TBE緩衝液を用いて1%アガロースゲルで泳動したところ、予想されたおよそ500 bp断片のバンドが見られた。反応液100 μLのうちの残存容量を無水エタノール200 μLで沈殿した。上記に開示されるようにSma Iで切断されたレシピエントベクターpTAP238に組入れるために用いられるようペレットを水10 μLに再懸濁して、zcyto20をコードする構築体を産生した。正確な配列を有するクローンをpYEL7と名付けた。これをNot 1/Nco 1 (37℃で1時間DNA 10 μl、buffer 3 New England BioLabs 5 μl、Not 1 2 μL、Nco 1 2 μL、水31 μL)で消化し、T4 DNAリガーゼ緩衝液で再連結した(先の消化物7 μL、5×緩衝液2 μL、T4 DNAリガーゼ1 μL)。この段階により酵母配列CEN-ARSを除去して、ベクターを簡素化した。再連結されたpYEL7 DNAをPvu 2およびPst 1で診断的に消化して、酵母配列が存在しないことを確認した。PYEL7 DNAを大腸菌株W3110/pRAREに形質転換した。
zcyto21 C172Sシステイン突然変異体発現構築体
zcyto21 C172Sシステイン突然変異体(SEQ ID NO:28)を作出するために使われた戦略は、QuikChange (登録商標) Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)に基づく。プライマーは製造元の指示に基づいてC172S突然変異を導入するようデザインされた。これらのプライマーをZG44,327およびZG44,328 (それぞれSEQ ID NO:64および65)と名付けた。QuikChange Mutagenesisの使用説明書にしたがいPCRを行って、zcyto21 C172Sシステイン突然変異体を作出した。同一の50 μlの反応液5つを用意した。1反応当たりpTAP377 (酵母ベクターの骨格配列を欠く) DNA 2.5 μlを鋳型として使用した。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを作成した:10×PCR緩衝液30 μl、ZG44,327 (SEQ ID NO:64) 125 ng (27.42 μl)、ZG44,328 (SEQ ID NO:65) 125 ng (9.18 μl)、dNTP 6 μl、Pfu Turboポリメラーゼ(Strategene) 6 μl、および水206.4 μl。このカクテル47.5 μlを各反応液に等分した。PCR条件は次の通りであった:95℃30秒間を1サイクル、その後95℃30秒間、55℃1分間、68℃7分間を16サイクル、その後68℃7分間を1サイクル、および4℃維持で終了。5つのPCR反応液の全てを1本のチューブにまとめた。製造元の使用説明書の通り、制限酵素Dpn I 5 μlをPCR反応液に加え、37℃で2時間インキュベートした。10% 3 M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノール(Aaper Alcohol, Shelbyville, KY)を加えることで、DNAを沈殿させた。沈殿は-20℃で20分間行われた。DNAを14,000 rpmで5分間スピンし、ペレットを高速真空乾燥した。DNAペレットを水20 μlに再懸濁した。PCRから生じたDNAを大腸菌株DH10Bに形質転換した。DNA 5 μlをElectroMAX DH10B細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 μlと混合した。次いで、細胞およびDNA混合物を1.75 kV、100 Ω、および25 μFに設定されたBio-Rad Gene Pulser II (商標)により0.1 cmのキュベット(Bio-Rad, Hercules, CA)中でエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を37℃で1時間増殖させた。混合物をLB + 25 μg/mlのカナマイシンプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。10クローンをIL-29インサートの存在についてスクリーニングした。QIAprep (商標) Spin Miniprep Kit (Qiagen)を用いてDNAを10クローンの全てから単離し、制限酵素Xba I (Roche)およびPst I (New England Biolabs)を用い切断することによりインサートの存在について分析した。9クローンがインサートを含んでおり、これらを配列決定して、zcyto21 C172S突然変異が導入されていることを確実にした。クローン(isolet#6)を配列検証し、その後にpSDH171と名前を付けた。類似の戦略を実践してzcyto21 C15S突然変異体を作出することができる。
zcyto20 C49Sシステイン突然変異体発現構築体
zcyto20 C49Sシステイン突然変異体のコード配列は、重複PCRにより作出された(SEQ ID NO:20)。野生型IL-28A配列(SEQ ID NO:1)の最初の187塩基は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc45,399 (SEQ ID NO:66)を用いPCR増幅によって作出された。塩基105〜531の第二のDNA断片は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45,398 (SEQ ID NO:68)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いPCR増幅によって作出された。プライマーzc45,399 (SEQ ID NO:66)およびzc45,398 (SEQ ID NO:68)には、49位のシステインをセリンに換えた特定の改変配列が含まれていた。これらの2つのPCR産物を混ぜ合わせ、オリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いて重複PCR増幅した。最終PCR産物を酵母相同組換え(Raymond et al. Biotechniques. Jan. 26(1):134-8, 140-1, 1999)により発現ベクターpTAP238に挿入した。発現構築体を酵母から抽出し、コンピテント大腸菌DH10Bに形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによりスクリーニングした。陽性クローンを配列決定により検証し、その後に産生宿主菌株W3110/pRAREに形質転換した。zcyto20 C49Sシステイン突然変異体のコード配列を有する発現構築体をpCHAN9と命名した。
zcyto20 C51Sシステイン突然変異体発現構築体
zcyto20 C51Sシステイン突然変異体のコード配列は、重複PCRにより作出された(SEQ ID NO:24)。野生型IL-28A配列の最初の193塩基は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc45,397 (SEQ ID NO:63)を用いPCR増幅によって作出された。塩基111〜531の第二のDNA断片は、pYEL7 (SEQ ID NO:67)を鋳型としてならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45,396 (SEQ ID NO:70)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いPCR増幅によって作出された。プライマーzc45,397 (SEQ ID NO:69)およびzc45,396 (SEQ ID NO:70)には、51位のシステインをセリンに換えた特定の改変配列が含まれていた。これらの2つのPCR産物を混ぜ合わせ、オリゴヌクレオチドプライマーzc43,431 (SEQ ID NO:62)およびzc43,437 (SEQ ID NO:63)を用いて重複PCR増幅した。最終PCR産物を酵母相同組換え(Raymond et al. 前記)により本発明者らの社内発現ベクターpTAP238に挿入した。発現構築体を酵母から抽出し、コンピテント大腸菌DH10Bに形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによりスクリーニングした。陽性クローンを配列決定により検証し、その後に産生宿主菌株W3110/pRAREに形質転換した。zcyto20 C50Sシステイン突然変異体のコード配列を有する発現構築体をpCHAN10と命名した。
大腸菌でのIl-28A、IL-29およびCysからSerへのシステイン突然変異体の発現
別の実験では、実施例6〜9に記述される発現ベクターの各々を用いて形質転換された大腸菌を0.01% Antifoam 289 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)、30 μg/mlカナマイシン、35 μg/mlクロラムフェニコール入りのSuperbroth II培地(Becton Dickinson, San Diego, CA) 100 mLに植菌し、37℃で一晩培養した。植菌液5 mLを2 L培養フラスコ中の同一培地500 mLに加え、培養物のOD600が4に達するまでフラスコを37℃にて250 rpmで振盪させた。その後、IPTGを1 mMの終濃度にまで加え、振盪をさらに2.5時間続けた。細胞を4℃で10分間4,000×gにて遠心分離した。後で使用するまで、細胞ペレットを-80℃で凍結した。
IL-28のリフォールディングおよび精製
A. 封入体調製
ヒト野生型IL-29は前述のように大腸菌株W3110で封入体として発現された。流加発酵由来の細胞ペレットを50 mMトリス, pH 7.3に再懸濁した。懸濁液を8000 psiで3回APV-Gaulinホモジナイザー(Invensys APV, Tonawanda, New York)に通した。不溶性の材料物質を15,000 gで30分間の遠心分離により回収した。このペレットを50 mMトリス、1% (v/v) Triton X100、pH 7.3および4 M尿素で連続的に洗浄した。その後、封入体を室温で1時間50 mMトリス、6 M塩酸グアニジン、5 mM DTTに分散させた。この材料物質を次に15,000 gで1時間遠心分離した。この段階の上清には、還元された可溶性IL-29が含まれる。
可溶化されたIL-29を50 mMトリス、pH 8、0.75 Mアルギニン、0.05% PEG3350、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、0.4 mM KCl、10 mM NaCl、4 mM還元グルタチオン、0.8 mM酸化グルタチオンに撹拌しながら室温で徐々に希釈した。このリフォールディング緩衝液中のIL-29の終濃度は0.1 mg/mlであった。リフォールディング混合物を室温で一晩放置した。その後、濃縮酢酸を用いてこの懸濁液のpHを5に調整した。懸濁液を次いで、0.2 μmフィルターに通してろ過した。リフォールディング混合物のRP-HPLC分析により、2本の顕著なピークが示された。
リフォールディング混合物を50 mM NaOAcによってpH 5にインライン希釈(1:2)し、Pharmacia SP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラム(North Peapack, NJ)に負荷した。カラムを50 mM NaOAc、400 mM NaCl、pH 5の3カラム容量で洗浄した。結合したIL-29を50 mM NaOAc、1.4 M NaCl、pH 5で溶出させた。固体(NH4)2SO4を陽イオン交換段階の溶出プールに、(NH4)2SO4の終濃度が0.5 Mとなるように加えた。次いで、この材料物質をToyoPearl Phenyl 650S HICカラム(Tosoh Biosep, Montgomery, PA)に負荷した。次に、カラムを50 mM NaOAc、1 M (NH4)2SO4、pH 5の3カラム容量で洗浄した。50 mM NaOAc、1 M (NH4)2SO4、pH 5から50 mM NaOAc、pH 5までの10カラム容量の直線勾配を利用して、結合したzcyto21を溶出させた。画分を溶出液から集めた。2本の顕著なピークがこの段階で観測された。溶出画分のRP-HPLC分析を行った。2つのジスルフィド結合異性体に相当する2つの産物がPBS、pH 7.3への最後の緩衝液交換の後に得られた。
IL-29システイン突然変異体のリフォールディングおよび精製
実施例3に記述されているように、IL-29の精製により2つのジスルフィド結合異性体を得た。HIC FPLC段階を利用して、2つの形態を分離した。この分離はベースライン分割されなかった。実質的に純粋な異性体(>95%)を得るために厳格な「ピークカット(Peak Shaving)」が用いられなければならなかった。この段階の、ひいてはその過程全体の収率が悪化した。最終の収率はC15-C112形態およびC112-C171形態のそれぞれに対し8%および9%であった。CHOおよびバキュロウイルス(BV)系で産生された野生型IL-29も類似の現象を示した。異性体のC15-C112形態はジスルフィド結合パターンがタイプI IFNのものと相同であることが立証された。C15-C112形態は同様に、ISREアッセイでC112-C171形態よりも30倍高い生物活性を実証した(以下を参照されたい)。
zcyto21 C172Sポリペプチド(SEQ ID NO:29)の封入体調製、リフォールディングおよび精製は、本質的にIL-29野生型(SEQ ID NO:4)のものと同じである。突然変異タンパク質のリフォールディング混合物のRP-HPLC分析では、野生型IL-29のC15-C112形態に相当する顕著なピーク1本しか示されなかった。その後のHICクロマトグラフィーにより、単一のピークしか示されていない。したがって、厳格な「ピークカット」を利用する必要はなかった。その過程全体の最終の収率は50%に近い。zcyto21 Cys172Serポリペプチド(SEQ ID NO:29)は、実施例16で示されるISREアッセイでの野生型IL-29のC15-C112形態に等しい生物活性を示した。
肝臓およびリンパ球サブセットでのIL-28RA mRNAの発現
IL-28RAに対するmRNAの分布をさらに調べるため、SDS 7900HTシステム(Applied Biosystems, CA)を用いて半定量RT-PCRを行った。各サンプルに対する全RNA 100 ngおよび遺伝子特異的プライマーを用いて、一段階RT-PCRを行った。Bjab RNAを用い各プライマーセットについて標準曲線を作成し、全てのサンプル値をHPRTに対し正規化した。IFNAR2およびCRF2-4に対する正規化値も示される。
マウスIL-28はマウスB細胞に増殖抑制効果を及ぼさない
MACS磁気ビーズを用いてCD43+細胞を枯渇させることで、マウスB細胞を2つのBalb/C由来脾臓(7月齢)から単離した。精製されたB細胞をLPS、抗IgMまたは抗CD40モノクローナル抗体とともにインビトロで培養した。マウスIL-28またはマウスIFNαを培養物に加え、3H-チミジンを48時間の時点で加え、3H-チミジンの取込みを72時間の培養後に測定した。
骨髄増殖アッセイ
新鮮なヒト骨髄単核細胞(Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.)をαMEM、10%FBS、50マイクロモルβ-メルカプトエタノール、2 ng/ml FLT3L中37℃で2時間プラスチックに付着させた。非付着細胞を、その後、1000 ng/ml IL-29-CEE、100 ng/ml IL-29-CEE、10 ng/ml IL-29-CEE、100 ng/ml IFN-α2a、10 ng/ml IFN-α2aまたは1 ng/ml IFN-α2aの存在下または非存在下でαMEM、10%FBS、50マイクロモルβ-メルカプトエタノール、2 ng/ml FLT3L中25,000〜45,000個の細胞/ウェル(96ウェル組織培養プレート)に蒔いた。これらの細胞を様々なサイトカインとともにインキュベートして、骨髄由来造血細胞の増殖または分化について試験した(20 ng/ml IL-2、2 ng/ml IL-3、20 ng/ml IL-4、20 ng/ml IL-5、20 ng/ml IL-7、20 ng/ml IL-10、20 ng/ml IL-12、20 ng/ml IL-15、10 ng/ml IL-21またはサイトカインの添加なし)。8〜12日後、Alamar Blue (Accumed, Chicago, Ill)を20マイクロリットル/ウェルで添加した。プレートを37℃、5%COで24時間さらにインキュベートした。プレートをFmax (商標)プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.)に載せ波長544 (励起)および590 (発光)で、SoftMax (商標) Proプログラムを用い測定した。Alamar Blueは細胞の代謝活性に基づいて蛍光分析による読出しをもたらし、したがって、陰性対照に比べた細胞増殖の直接的測定である。
可溶性受容体(zcytoR19/CRF2-4)を用いたIL-28およびIL-29シグナル伝達の阻害
A. シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを利用して、zcyto20、zcyto21およびzcyto24シグナル伝達に対するzcytor19-Fc4ホモ二量体およびzcytor19-Fc/CRF2-4-Fcヘテロ二量体可溶性受容体の阻害特性を示すことができる。zcytor19受容体を過剰発現するヒト胚性腎臓(HEK)細胞にルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を駆動するインターフェロン刺激応答配列(ISRE)を含むレポータープラスミドをトランスフェクトする。リガンド(zcyto20 (SEQ ID NO:2)、zcyto21 (SEQ ID NO:15)、zcyto24 (SEQ ID NO:8)を含む)を用いてのトランスフェクト細胞の刺激後のルシフェラーゼ活性は、可溶性受容体とのリガンドの相互作用を反映している。
zcytor19を過剰発現する293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした:DMEM 2ミリリットル+10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ18時間前に293細胞700,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、pISRE-ルシフェラーゼDNA (Stratagene) 1マイクログラムおよびpIRES2-EGFP DNA (Clontech) 1マイクログラムを、DMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 6マイクロリットルに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293細胞に30分後に加えた。24時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから取り除き、96ウェルマイクロタイタープレート中におよそ細胞25,000個/ウェルで蒔き直した。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM+0.5%FBSに交換した。
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った:DMEM+0.5%FBS中37℃で18時間インキュベーションの後、トランスフェクト細胞を10 ng/ml zcyto20、zcyto21またはzcyto24および10マイクログラム/mlの以下の可溶性受容体で刺激した;ヒトzcytor19-Fcホモ二量体、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4-Fcヘテロ二量体、ヒトCRF2-4-Fcホモ二量体、マウスzcytor19-Igホモ二量体。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後に照度計で相対発光単位(RLU)を測定した。得られる結果は、PBSのみの存在下でのシグナル伝達に対する可溶性受容体の存在下でのリガンド誘導性のシグナル伝達の阻害割合として示される。表16は、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4ヘテロ二量体の可溶性受容体が、zcyto20、zcyto21およびzcyto24誘導性のシグナル伝達を対照の16〜45%阻害できることを示している。ヒトzcytor19-Fcホモ二量体の可溶性受容体もzcyto21誘導性のシグナル伝達を45%阻害することができる。huCRF2-4-Fcまたはmuzcytor19-Igホモ二量体の可溶性受容体では有意な効果は見られなかった。
IL-28およびIL-29によるインターフェロン刺激遺伝子の誘導
A. ヒト末梢血単核細胞
新たに単離されたヒト末梢血単核細胞をIL-29 (20 ng/mL)、IFNα2a (2 ng/ml) (PBL Biomedical Labs, Piscataway, NJ)の存在下で、または培地のみで増殖させた。細胞を6、24、48、または72時間インキュベートし、その後、全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。Taqman One-Step RT-PCR Master Mix (登録商標)試薬および遺伝子特異的プライマーを製造元(Applied Biosystems, Branchburg, NJ)により推奨されるように利用し、全RNA 100 ngをOne-Step Semi-Quantitative RT-PCR (登録商標)の鋳型として用いた。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表17は、IL-29が、試験された全ての時点でヒト末梢血単核細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
ヒトT細胞はPan T-cell Isolation (登録商標)キットを製造元(Miltenyi, Auburn, CA)の使用説明書にしたがって用い、新たに収集された末梢血単核細胞から陰性選択により単離された。T細胞を、その後、プレートに結合した抗CD3、可溶性抗CD28 (0.5 ug/ml) (Pharmingen, San Diego, CA)およびインターロイキン2 (IL-2; 100 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN)で5日間活性化し増殖させて、洗浄し、その後、IL-2とともにさらに5日間増殖させた。活性化および増殖の後、細胞をIL-28A (20 ng/ml)、IL-29 (20 ng/ml)または培地のみで3、6、または18時間刺激した。全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。One-Step Semi-Quantitative RT-PCR (登録商標)を上記の実施例で記述されているように行った。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表18は、IL-28およびIL-29が、試験された全ての時点で活性化ヒトT細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
2人の別個のドナー(Cambrex, Baltimore, MDおよびCellzDirect, Tucson, AZ)由来の新たに単離されたヒト肝細胞をIL-28A (50 ng/ml)、IL-29 (50 ng/ml)、IFNα2a (50 ng/ml)、または培地のみで24時間刺激した。刺激後、全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。One-step semi-quantitative RT-PCRを上記の実施例で前述されているように行った。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表19は、IL-28およびIL-29が24時間の刺激後に初代ヒト肝細胞でインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
HepG2およびHuH7細胞(ATCC NOS. 8065, Manassas, VA)をIL-28A (10 ng/ml)、IL-29 (10 ng/ml)、IFNα2a (10 ng/ml)、IFNB (1 ng/ml) (PBL Biomedical Piscataway, NJ)、または培地のみで24または48時間刺激した。別個の培養では、HepG2細胞を20 ng/mlのMetIL-29C172S-PEGまたはMetIL-29-PEGで上記のように刺激した。全RNAを単離し、RNase不含のDNaseで処理した。全RNA 100 ngをone-step semi-quantitative RT-PCRの鋳型として前述のように用いた。結果はHPRTに対し正規化されており、各時点について培地のみの対照に比べた倍誘導として示されている。表20は、IL-28およびIL-29が24および48時間後にHepG2およびHuH7肝臓肝細胞がん細胞系においてISG発現を誘導することを示している。
示されるデータは24時間の培養後の20 ng/mlの、IL-29のmetIL-29-PEGおよびmetIL-29C172S-PEGバージョンを表す。
示されるデータはHPRTに対し正規化されており、非刺激細胞に比べた倍誘導として示されている。
IL-28、IL-29、metIL-29-PEGおよびmetIL-29C172S-PEGはマウス肝臓細胞系AML-12においてISG誘導を刺激する
インターフェロン刺激遺伝子(ISG)は、タイプIインターフェロン(IFN)により、同様にIL-28およびIL-29ファミリー分子により誘導される遺伝子であり、IFNならびにIL-28およびIL-29が抗ウイルス活性に至る類似経路を誘導することを示唆している。ヒトタイプI IFN (IFNα1-4およびIFNβ)は、マウス細胞に対しほとんどまたは全く活性をもたず、これは種間反応性の欠如に起因するものと思われる。ヒトIL-28およびIL-29がマウス細胞に対し効果を及ぼすかどうかを試験するため、ヒトIL-28およびIL-29によるISG誘導をマウス肝臓由来の細胞系AML-12でのリアルタイムPCRにより評価した。
示される全てのデータは、HPRT遺伝子発現に対する倍数として表されている。
OAS mRNAのng
内部HPRT mRNAのng
= ハウスキーピング遺伝子、HPRTに対するOAS mRNA量の正規化値
1例として、48時間時点のデータが示されている。
細胞を20 ng/ml MetIL-29-PEGまたはmetIL-29C172S-PEGで24時間刺激した。
示されるデータはHPRTに対し正規化されており、非刺激細胞に比べた倍誘導として示されている。
ISGはヒトIL-29を発現するトランスジェニックマウスの脾臓において効率的に誘導される
Eu-lckプロモーターのコントロール下でヒトIL-29を発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作出した。ヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物学的活性を有するかどうかを研究するため、ISGの発現をEu-lck IL-29トランスジェニックマウスの脾臓におけるリアルタイムPCRにより分析した。
ヒトIL-28およびIL-29タンパク質はマウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現を誘導する
ヒトIL-28およびIL-29がインビボでインターフェロン刺激遺伝子を誘導するかどうかを測定するため、CHO由来ヒトIL-28AおよびIL-29タンパク質をマウスに注射した。さらに、大腸菌由来IL-29を同様に、MetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29-PEGを用いて上記のようにインビボアッセイで試験した。様々な時点でおよび異なる用量で、ISG遺伝子誘導をマウスの血液、脾臓および肝臓で測定した。
IL-28およびIL-29はマウスにおいてISGタンパク質を誘導する
ISGタンパク質(OAS)の誘導に対するヒトIL-28およびIL-29の効果を分析するため、IL-28およびIL-29処置マウス由来の血清および血漿をOAS活性について試験した。
シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを利用して、IL-28受容体とのヒトおよびマウスIL-28およびIL-29の機能的相互作用を測定することができる。ヒト胚性腎臓(HEK)細胞に、クラスIIサイトカイン受容体(ヒトDIRS1、IFNαR1、IFNαR2およびIL-28受容体を含む)に対するcDNAを含むpZP7発現ベクターの存在下または非存在下でルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を駆動するインターフェロン刺激応答配列(ISRE)を含むレポータープラスミドをトランスフェクトする。クラスIIリガンド(IL-28A (SEQ ID NO:2)、IL-29 (SEQ ID NO:4)、IL-28B (SEQ ID NO:6)、zcyto10、huIL10およびhuIFNa-2aを含む)を用いてのトランスフェクト細胞の刺激後のルシフェラーゼ活性は、細胞表面のトランスフェクトされたおよび天然のサイトカイン受容体とのリガンドの相互作用を反映している。結果および方法を以下に記述する。
293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした:DMEM 2ミリリットル+10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ18時間前に293細胞700,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、pISRE-ルシフェラーゼDNA (Stratagene) 1マイクログラム、サイトカイン受容体DNA 1マイクログラムおよびpIRES2-EGFP DNA (Clontech) 1マイクログラムを、DMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 9マイクロリットルに加えた。サイトカイン受容体DNAが含まれなかった場合、pIRES2-EGFP DNA 2マイクログラムを用いた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293細胞に30分後に加えた。24時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから取り除き、96ウェルマイクロタイタープレート中におよそ細胞25,000個/ウェルで蒔き直した。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM+0.5%FBSに交換した。
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った:DMEM+0.5%FBS中37℃で18時間インキュベーションの後、トランスフェクト細胞を以下のクラスIIリガンドの希釈物(DMEM+0.5%FBS中)で刺激した;IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto10、huIL10およびhuIFNa-2a。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後に照度計で相対発光単位(RLU)を測定した。得られる結果は、培地のみの対照に比べた実験サンプルのRLUの倍誘導として示される(実験サンプルのRLU/培地のみのRLU = 倍誘導)。表29は、ISRE-ルシフェラーゼをトランスフェクトされた293細胞においてIL-28A、IL-29、およびIL-28BがISREシグナル伝達を誘導し、培地のみに比べてルシフェラーゼ活性が15〜17倍の誘導をもたらすことを示している。内在性CRF2-4 (SEQ ID NO:71)を用いた、トランスフェクション混合物へのIL-28受容体αサブユニットDNA (SEQ ID NO:11)の添加は、IL-28A、IL-29、およびIL-28BによるISREシグナル伝達の6〜8倍のさらなる誘導を引き起こし、結果的に104〜125倍の全体的誘導をもたらす。その他のトランスフェクトされたクラスIIサイトカイン受容体DNAのどれもISREシグナル伝達の増加を引き起こさなかった。これらの結果はIL-28A、IL-29、およびIL-28BがIL-28サイトカイン受容体と機能的に相互作用することを示唆している。表29は同様に、huIFNa-2aがISRE-ルシフェラーゼトランスフェクト293細胞においてISREシグナル伝達を誘導でき、結果的に培地のみと比較して205倍のルシフェラーゼ活性の誘導をもたらすことを示している。しかしながら、トランスフェクションへのIL-28受容体DNAの添加がISREシグナル伝達の11倍の低下(ISRE-ルシフェラーゼDNAのみと比較して)に至ることから、IL-28受容体の過剰発現がIL-28A、IL-29、およびIL-28Bシグナル伝達に対するIL-28受容体過剰発現の正の効果とは対照的に、インターフェロンシグナル伝達に負に影響を及ぼすことが示唆される。
IL-29システイン突然変異体を用いたシグナル伝達アッセイ
細胞トランスフェクション
ヒトIL-28受容体を安定的に過剰発現する293HEK細胞を産生するため、293細胞を以下のようにトランスフェクトした:DMEM 2ミリリットル+10%ウシ胎児血清中でのトランスフェクションのおよそ6時間前に293細胞300,000個/ウェル(6ウェルプレート)を蒔いた。1ウェル当たり、ヒトIL-28受容体αサブユニット(SEQ ID NO:11)のcDNAを含むpZP7発現ベクター 2マイクログラムを、DMEM計100マイクロリットル中のFugene 6試薬(Roche Biochemicals) 6マイクロリットルに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め蒔かれた293細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクト細胞を2マイクログラム/ミリリットルのピューロマイシン選択下に置いた。ピューロマイシン耐性細胞が細胞の集団として持ち越された。
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った:ヒトIL-28受容体を過剰発現し、KZ157を含む293HEK細胞をトリプシン-EDTAで処理し、96ウェルマイクロタイタープレート中におよそ細胞25,000個/ウェルで蒔き直した。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM+0.5%FBSに交換した。
B細胞に対するヒトIL-29の効果およびIL-29サポリン毒素融合体
ヒトIL-29の効果を以下のヒトB細胞系で試験する:ヒトバーキットリンパ腫細胞系Raji (ATCC番号CCL-86)、およびRamos (ATCC番号CRL-1596);ヒトEBV B細胞リンパ腫細胞系RPMI 1788 (ATCC番号CRL-156);ヒト骨髄腫/形質細胞腫細胞系IM-9 (ATCC番号CRL159);ならびにヒトEBV形質転換B細胞系DAKIKI (ATCC番号TIB-206)、およびHS Sultan細胞(ATCC番号CRL-1484)。IL-29による約2〜5日間の処理後の、細胞の表面マーカー発現の変化から、これらの細胞がIL-29に応答し得ることが示される。IL-29で処理したヒトB細胞系は、細胞培養皿に蒔き直す場合、未処理細胞よりもはるかにゆっくり増殖する。これらの細胞では同様に、フローサイトメトリーにより評価されたとおり(実施例27Dおよび実施例27E)、FASリガンドの発現が増加しており、活性化FAS抗体に対する感度が適度に増加している(実施例27A)。これらの結果から、IL-29は、いくつかのタイプのB細胞腫瘍を増殖性が低い状態におよび/またはFASリガンド感受性が高い状態に分化誘導することにより、それらの細胞をコントロールできたことが示唆される。さらに、IL-28受容体はいくつかのBおよびT細胞系の表面に発現している(実施例16)。したがって、IL-29およびヒトIL-29-サポリン免疫毒素複合体(下記、実施例27B)またはその他のIL-29-毒素融合体は、B細胞白血病およびリンパ腫で治療的に使用されることができよう。
IM-9細胞を50 μg/ml精製ヒトIL-29 +/-で1 ml当たり細胞約50,000個として蒔く。3日間の増殖後、細胞を収集し、洗浄し、計数し、次いで96ウェルプレート中0、0.033、0.1または0.33 μg/ml 抗FAS抗体 (R & D Systems, Minneapolis)入りのウェルに細胞約2500個/mlとして蒔き直す。2日後、Alamar blue蛍光アッセイ(米国特許第6,307,024号を参照されたい)を行って、細胞の増殖を評価する。
ヒトIL-29-サポリン免疫毒素複合体(IL-29-sap)の構築および精製は、実施例28に記述されている。ヒトIL-29-sapは、細胞増殖を阻害する際にサポリン単独よりもはるかに強力であった。処理細胞を3日間または4日間の処理後に蒔き直す場合、ヒトIL-29-sap処理細胞はあまり増殖しない。
HS Sultan細胞(ATCC番号CRL-1484)を12ウェルプレート中に1 ml当たり細胞約40,000個として蒔き、サイトカインを加えずにもしくは40 ng/ml精製ヒトIL-29もしくは25 ng/mlヒトIL-29-sap複合体(下記、実施例28)を加えてのいずれか、または20 ng/ml IFN-α(RDI)もしくはIL-29およびIFN-αを加えて5日間増殖させる。IL-29およびIFN-αサブユニットは細胞の増殖を阻害し、ヒトIL-29およびIFN-αの増殖阻害効果が相加的である可能性が示唆される。
ヒトB細胞系HS Sultan (ATCC番号CRL-1484)、IM-9 (ATCC番号CRL159)、RPMI 8226 (ATCC番号CCL-155)、RAMOS (ATCC番号CRL-1596)、DAKIKI (ATCC番号TIB-206)、およびRPMI 1788 (ATCC番号CRL-156)を全て、10〜50 ng/ml精製ヒトIL-29を加えてまたは加えず2〜8日間処理する。次いで、製造元のプロトコルにしたがって、細胞をPE結合抗CD95抗体(PharMingen, San Diego, CA)で染色し、FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA)にて分析する。全ての細胞系で、ヒトIL-29による処理の後、抗CD95 (FASまたはAPO-1)抗体の染色が増加する。
初代マウス脾細胞は8〜12週齢のC57/BL6マウス由来の脾臓を細かく切って得る。この調製物を水で5秒間処理することで赤血球を溶解させ、次いで70ミクロン径のふるいに通す。残った脾細胞を洗浄し、前述のように、ヒトIL-29を加えたかまたは加えない、10% HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT)、IL-2 (R & D Systems)を加えたRPMI (JRH Bioscience)中に蒔く。次いで、これらを5% CO2中、37℃で5日間インキュベートした。脾細胞を収集し、製造元のプロトコルにしたがって、PE結合抗CD95抗体(PharMingen)およびFITC結合抗CD19抗体(PharMingen)で染色した。細胞をFACScalibur (Becton Dickinson)にてフローサイトメトリーにより分析する。
IL-29毒素融合体の構築および精製
ヒトIL-29 10 mgを植物毒素サポリン(Stirpe et al., Biotechnology 10,:405-412, 1992)に結合させる。得られるンパク質複合体1.3 mgはヒトIL-29 1分子当たり1.1分子のサポリンからなり、20 nMリン酸ナトリウム、300 nM塩化ナトリウム、pH 7.2の中に1.14 mg/mlの濃度で配合される。
インビボでのIL-29毒素融合体
A. マウスにおけるIL-29-サポリン複合体の試験
IL-29-サポリン複合体(実施例27)を異なる2つの用量、すなわち0.5および0.05 mg/kgでC57BL6マウス(雌性、12週齢、Taconicから購入)に投与する。0.1% BSA (ICN, Costa Mesa, CA)からなる媒体中で、静脈内に注射を行う。1週間にわたり3回の注射を行う(0、2、および7日目)。血液サンプルをマウスから0日目(注射前)にならびに2日目および8日目(注射後)に採血する。血液はヘパリン添加管(Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ)に採取し、細胞数は自動血球分析装置(Abbot Cell-Dynモデル番号CD-3500CS, Abbot Park, IL)を用いて測定する。動物は8日目の採血の後に、安楽死させて剖検する。組織病理検査のため、脾臓、胸腺、肝臓、腎臓および骨髄を採取する。脾臓および胸腺の重さを量り、さらに血液サンプルを血清分離管に採取する。血清を標準的な血液生化学的パネルで試験する。サンプルを同様に、本明細書において記述されるフローサイトメトリー分析のために収集する。
ヒト腫瘍細胞に対するヒトIL-29およびヒトIL-29サポリン毒素融合体(実施例28)の効果を、本明細書において記述されるマウス異種移植片腫瘍モデルを用いてインビボで試験する。異種移植片モデルは実施例27に記述される細胞系のような、インビトロ実験に基づいて選択される細胞系を用いて最初に試験する。これらの細胞系には:ヒトバーキットリンパ腫細胞系Raji (ATCC番号CCL-86)、およびRamos (ATCC番号CRL-1596);ヒト細胞系RPMI 1788 (ATCC番号CRL-156);ヒト骨髄腫/形質細胞腫細胞系IM-9 (ATCC番号CRL159);ヒト細胞系DAKIKI (ATCC番号TIB-206)、ならびにHS Sultan細胞(ATCC番号CRL-1484)が含まれるが、これらに限定されることはない。ヒト腫瘍から直接的に得られる細胞を同様に、このタイプのモデルで使用することができる。この方法では、IL-29による処理またはIL-29サポリン毒素融合体による処理に対する感度を目的に、患者サンプルのスクリーニングを利用して抗がん治療でのzalpha11の使用に最適な適応を選択することができる。
インビボでのB細胞由来腫瘍に対するIL-29の効果
A. 小型浸透圧ポンプを用いたIL-29の注入
小型浸透圧ポンプを介した持続注入によるIL-29の投与により、結果としてポンプに含まれるIL-29の濃度に比例した定常状態の血清濃度が得られる。リン酸緩衝生理食塩水(pH 6.0)中に2 mg/mlまたは0.2 mg/mlの濃度で含まれるヒトIL-29 0.22 mlを無菌条件下でAlzet小型浸透圧ポンプ(モデル2004; Alza corporation Palo Alto, CA)の中に添加する。背面皮膚の1 cmの切開部を通してポンプをマウスに皮下移植し、皮膚を無菌創縫合で閉鎖する。これらのポンプは、28日の期間にわたり1時間当たり0.25 μlの速度でその内容物を輸送するようにデザインされている。この投与方法により、腫瘍細胞を注射したマウスの生存性の著しい増加がもたらされる(下記)。
ヒトIL-29の効果を、本明細書において記述されるマウス異種移植片腫瘍モデルを用いてインビボで試験する。試験される異種移植片モデルは、ヒトリンパ芽球様細胞系IM-9 (ATCC番号CRL159)である。C.B-17 SCIDマウス(雌性C.B-17/IcrHsd-scid; Harlan, Indianapolis, Indiana)を4群に分ける。0日目に、IM-9細胞(ATCC番号CRL159)を培養から収集し、尾静脈を介して、全てのマウス(マウス1匹当たり細胞約1,000,000個)に静脈注射する。1日目に、試験物質または対照物質を含む小型浸透圧ポンプをマウスに皮下移植する。群1〜3のマウス(1群当たりn=9)は漸増濃度のIL-29で処置する:群1は2.0 mg/mLのヒトIL-29を含み、1日当たり12 μgを輸送する;群2は0.20 mg/mLのヒトIL-29を含み、1日当たり1.2 μgを輸送する;群3は0.02 mg/mLのヒトIL-29を含み、1日当たり0.12 μgを輸送する。群4のマウス(n=9)は対照であり、媒体(PBS pH 6.0)で処置する。
B16-F10黒色腫およびEG.7胸腺腫モデルにおけるIL-29のインビボ抗腫瘍効果
A. インビボでのB16-F10黒色腫の転移性増殖に対するマウスIL-29の効果
マウス(雌性、C57B16、9週齢; Charles River Labs, Kingston, NY)を3群に分ける。0日目に、B16-F10黒色腫細胞(ATCC番号CRL-6475)を培養物から収集し、尾静脈を介して、全てのマウス(マウス1匹当たり細胞約100,000個)に静脈注射する。次いで、マウスを試験物質または関連する媒体で、指示された溶液0.1 mlを腹腔内注射することにより処置する。第一群のマウス(n = 24)は媒体(PBS pH 6.0)で処置し、この媒体を0、2、4、6、および8日目に注射する。第二群のマウス(n = 24)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0、2、4、6、および8日目に75 μgの用量で注射する。第三群のマウス(n = 12)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0日目〜9日目まで毎日75 μgの用量で注射する。マウスは全て18日目に殺処理し、腫瘍の定量のため肺を採取する。各肺葉の全表面にある、直径が0.5 mmより大きな腫瘍増殖巣を計数する。zcyto24またはzcyto25で処置したマウスの両群では、肺に存在する腫瘍巣の平均数が、媒体で処置したマウスに比べて、著しく減少する。より頻繁に(すなわち、毎日)処置したマウスは、1日おきに処置したマウスよりも腫瘍巣がいっそう少ない。
マウス(雌性、C57B16、9週齢; Charles River Labs, Kingston, NY)を3群に分ける。0日目に、EG.7細胞(ATCC番号CRL-2113)を培養から収集し、細胞1,000,000個を全てのマウスに腹腔内注射する。次いで、マウスを試験物質または関連する媒体で、指示された溶液0.1 mLを腹腔内注射することにより処置する。第一群のマウス(n = 6)は媒体(PBS pH 6.0)で処置し、この媒体を0、2、4、および6日目に注射する。第二群のマウス(n = 6)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0、2、4、および6日目に10 μgの用量で注射する。第三群のマウス(n = 6)はzcyto24またはzcyto25で処置し、これを0、2、4、および6日目に75 μgの用量で注射する。zcyto24またはzcyto25で処置したマウスの両群では、生存時間が、媒体で処置したマウスに比べて著しく増加する。これらの結果から、zcyto24またはzcyto25による処置がいずれも、EG.7腫瘍の増殖を減速させるかまたは腫瘍細胞を破壊する免疫系の能力を促進させることが示唆される。
IL-28受容体発現のフローサイトメトリー分析
非ホジキンリンパ腫(NHL)の標本から得た腫瘍性B細胞でのIL-28受容体の発現を評価する。複数のMAbを使用して、腫瘍性B細胞を同定するおよびIL-28受容体を共局在化する。抗IL-28受容体 MAbによるまたはビオチン-IL-29による免疫蛍光染色を平均ピーク蛍光として記録する。アイソタイプを適合させた対照MAbに対する平均ピーク蛍光のシフトを基に、定性的スコアを評価する。
B細胞リンパ腫に対するIL-29のインビボ効果
ヒトBリンパ腫細胞系をインビトロで継代して増殖培地中で維持する。細胞をPBSで徹底的に洗浄して、培養液の成分を除去する。
マウスにIM-9細胞1×106個を注射し、その翌日、28日用の小型浸透圧ポンプを移植する。ポンプに以下の濃度のIL-29を添加して輸送する:1用量群につきマウス8匹として1日当たり0、0.12、1.2または12 マイクログラム。IL-29はマウスを腫瘍細胞系から保護するうえで明らかな用量依存的効果を示す。IL-29の効果は用量依存的である。実験の終了時点で生存しているマウスには、疾患の徴候がなく、その血清中に検出可能なヒトIgGがない。
同系マウス卵巣がんモデルにおけるIL-29の効果
IL-29の効果は、Zhang et al., Am. J. of Pathol. 161:2295-2309, 2002に記述されている同系マウスモデルを用い、卵巣がんにおける効力について試験される。手短に言えば、レトロウイルス形質導入法および蛍光活性化細胞分離法を利用して、マウスVEGF164アイソフォームおよび強化緑色蛍光タンパク質(GFP)を安定的に過剰発現する、C57BL6マウスID8卵巣がん細胞系を作出する。VEGF164およびGFP cDNAを含むレトロウイルス構築体をBOSC23細胞にトランスフェクトした。細胞をFACS細胞分離により分析し、GFP高陽性細胞を同定する。
マウスRENCAモデルにおけるIL-29の効果
腎細胞がんモデルにおけるIL-29の効力は、本質的にはWigginton et al., J. Nat. Cancer Instit. 88:38-43, 1996に記述されているように、自然発生マウス腎がんのRENCA細胞が注射されたBALB/cマウスを用いて評価される。
マウス結腸直腸腫瘍モデルにおけるIL-29の効果
結腸直腸マウスモデルにおけるIL-29の効果は、Yao et al., Cancer Res. 63:586-592, 2003に記述されているように試験する。このモデルでは、MC-26マウス結腸腫瘍細胞をBALB/cマウスの脾臓被膜下に接種する。14日後、処置マウスにIL-29を投与する。腫瘍移植後、3〜14日から開始して、または腫瘍の生着および増殖率が確定された時点で、マウスを組換えzcyto24またはzcyto25で処置する。処置量0.5〜5 mg/kgが5〜14日間、毎日投与されるものと思われるが、その後、中和抗体の形成の痕跡が見られない場合には、継続して行われてもよい。
マウス膵臓がんモデルにおけるIL-29の効果
マウス膵臓がんモデルにおけるIL-29の効力は、Mukherjee et al., J. Immunol. 165:3451-3460, 2000により開発されたプロトコルを用いて評価する。手短に言えば、MUC1トランスジェニック(MUC1. Tg)マウスを、膵臓腫瘍を自発的に発症するがん遺伝子発現マウス(ETマウス)と交配し、これをMET.MUC1.Tgマウスと表す。ETマウスはラットエラスターゼ・プロモーターのコントロール下でSV40ラージT抗原の最初の127 aaを発現する。動物の50%が、約21週齢までに致命的な膵臓腫瘍を発症する。MUC1の存在を目的に細胞をフローサイトメトリー法によりルーチンに試験する。マウスは全て、C57BL/6のバックグラウンドにある。3〜24週まで3週の間隔で、動物を殺処理し、特徴付ける。マウスを、昏睡状態、腹部膨張、飲食ができないこと、著しい体重減少、蒼白便、および猫背の姿勢を含む病身の徴候について注意深く観察する。
マウス乳がんモデルにおけるIL-29の効果
乳がんのマウスモデルにおけるIL-29の効力は、Colombo et al., Cancer Research 62:941-946, 2002に記述されるような同系モデルを用いて行われる。手短に言えば、TS/A細胞、これはBALB/Cマウスに対する自然発生乳がんである。この細胞をおよそ1週間培養して、クローンを選択する。選択したTS/A細胞を増殖させ、マウスの脇腹へのTS/A細胞2×102個の皮下注射により、CD-1 nu/nu BRマウス(Charles River Laboratories)を攻撃するのに使用する。
マウス前立腺がんモデルにおけるIL-29の効果
Kwon et al., PNAS 96:15074-15079, 1999に記述されているものに類似のモデルを用いて、腫瘍反応に対するIL-29の効果をマウス前立腺がんモデルで評価する。このモデルにはトランスジェニックマウス前立腺がん(TRAMP)由来の前立腺がん細胞系TRAMP-C2の転移増殖があり、その細胞がC57BL/6マウスに接種される。原発性腫瘍のすぐ近くの排膿性リンパ節に主に起こる、転移再発は、信頼性がある。
マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおけるIL-28およびIL-29の効果
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)はヒト多発性硬化症(MS)のマウスモデルである(Gold et al., Mol. Med. Today, 6:88-91, 2000; Anderton et al., Immunol. Rev., 169:123-137, 1999)。マウスにおいて疾患を誘発する方法は多数ある。このような方法の1つに、ミエリンタンパクのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG)のペプチドでマウスを免疫化するものがある。このタンパク質は髄鞘の外側に存在し、髄鞘の保護層として作用する。0日目、マウスにRIBIアジュバントに乳化させたMOGペプチド(MOG35-55)を皮下投与し免疫化した。続いて2日目、百日咳毒素(PT)を静注した。マウスは跛行、振戦に続いて前肢および後肢の麻痺に始まる麻痺症状を示し始めた。この症状を疾患の発症時期、範囲、重症度を測定する様々な指標によりスコア化した。発症遅延は、その薬物によってマウスの疾患過程が変化していることを示している。発症率の低下は、その薬物が発病中のマウスの数に効果があることを示している。臨床スコアの低下は、その薬物が疾患の重症度に効果があることを示している。マウス群にPBSまたはマウスIL28 (SEQ ID NO:8)もしくはヒトIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEGのいずれかを投与した。本モデルではIL-28/29処置マウスにおける症状の発症、疾患スコアの出現率および疾患スコアの重症度は、これらのパラメーターに対するIL-28/29の効果を示している。マウス(n=13/gp)に0日目、RIBIアジュバント中100 μgのMOG35-55ペプチドを皮下投与し免疫化した。全マウスに投与2日目、百日咳毒素200 ngを静注した。マウス群をPBS、ヒトIL29 C172S 25 μgにより1日目から18日目に1日おき(EOD)にまたはPBS、BSAもしくはマウスIL28により腹腔内で処置した。前述した通り、マウスを0日目から30日目まで毎日、臨床徴候と体重減少についてスコア化した。IL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEGまたはマウスIL28 (SEQ ID NO:8)処置マウスは、PBS処置動物に比べて発症遅延を示した。
A. 要約
ヒトIL-29が多発性硬化症に何らかの効果を及ぼすかどうか、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)を抑制するIL-29の能力を調べるため、マウスMSモデルを用いて試験を行った。十分定義されているC57BL/6マウスのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG) 35-55ペプチド免疫化モデルを用いた。この実験を行って、IL-29がEAEを遅延できるおよび/またはEAEの疾患スコアを抑制できることを確認した。IL-29がEAEモデルにおいて疾患の発症を遅延させたことから、IL-29の使用がMSにおいて有益でありうることが示唆された。
実験的自己免疫性脳炎(EAE)はMSのマウスモデルである。その1つのモデルでは、C57BL/6マウスにRIBIアジュバント中で乳化したMOGペプチド(MOG35-55) 100 μgを免疫する。PBS中のMOG35-55の0.5 mg/ml調製物2ミリリットルをRIBIのバイアルに添加し、十分にボルテックスして溶液を乳化する。マウスの背中の毛を剃り、MOG/RIBI 100 μgをマウスの背中に皮下注射した。免疫化の2日前および免疫化後の毎日、マウスの体重を量った。次いで、マウスに百日咳毒素(PT) 200 μl、終濃度200 ng/マウスを2日目に静脈注射した。臨床スコアについてマウスを毎日モニターした。0日目から18日目までマウスの群にPBS 200 μl、またはIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEG 25 μgを容量200 μlでEODに腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコアおよび罹患率を評価し解析用にプロットした。
0日目から18日目までのEODでのIL-29の投与によって、このモデルで疾患の発症が遅延した。この遅延はPBS処置マウスに比べて有意であった(p=0.0006、Mantel-Cox検定)。
A. 要約
マウスIL-28が多発性硬化症に何らかの効果を及ぼすかどうか、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)を抑制するIL-28の能力を調べるため、マウスMSモデルを用いて試験を行った。十分定義されているC57BL/6マウスのミエリン希突起膠細胞糖タンパク(MOG) 35-55ペプチド免疫化モデルを用いた。この実験を行って、IL-28がEAEを遅延できるおよび/またはEAEの疾患スコアを抑制できることを確認した。IL-28がEAEモデルにおいて疾患の発症を遅延させたことから、IL-28の使用がMSの治療において有益でありうることが示唆された。
実験的自己免疫性脳炎(EAE)はMSのマウスモデルである。その1つのモデルでは、C57BL/6マウスにRIBIアジュバント中で乳化したMOGペプチド(MOG35-55) 100 μgを免疫する。PBS中のMOG35-55の0.5 mg/ml調製物2ミリリットルをRIBIのバイアルに添加し、十分にボルテックスして溶液を乳化する。マウスの背中の毛を剃り、MOG/RIBI 100 μgをマウスの背中に皮下注射した。免疫化の2日前および免疫化後の毎日、マウスの体重を量った。次いで、マウスに百日咳毒素(PT) 200 μl、終濃度200 ng/マウスを2日目に静脈注射した。臨床スコアについてマウスを毎日モニターした。マウスの1つの実験群では、1日目から11日目までEODにPBS 200 μl、50 μgのmIL28または200 μgのmIL28 (SEQ ID NO:8)を容量200 μlで腹腔内注射した。マウスのもう1つの実験群では、1日目から21日目までEODにPBS 200 μl、130 μgのBSAまたは130 μgのmIL28 (SEQ ID NO:8)を容量200 μlで腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコアおよび罹患率を評価し解析用にプロットした。
EODでのIL-28の投与によって、このモデルで用量依存的に疾患の発症が遅延した。この遅延はPBSまたはBSA処置マウスに比べて有意であった。
肝細胞がん細胞系HepG2におけるIL-29およびIFNα2aのマイクロアレイ比較
A. 導入
タイプ1インターフェロン(IFN)はウイルスに対する身体の免疫応答の一部としてウイルス感染の後に誘導される。これらのタンパク質はウイルス複製を直接的に阻害するように作用するインターフェロン刺激遺伝子(ISG)の誘導を通じてウイルス複製を阻害し、NK細胞の溶解能を増大し(Biron, C. A. 1998. Role of early cytokines, including alpha and beta interferons (IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections. Semin Immunol 10:383-90)ならびにMHCクラスI発現を増加させて抗原提示を促進させることにより(Fellous, M., Nir, U., Wallach, D., Merlin, G., Rubinstein, M., and Revel, M. 1982. Interferon-dependent induction of mRNA for the major histocompatibility antigens in human fibroblasts and lymphoblastoid cells. Proc Natl Acad Sci USA 79:3082-6)、T細胞生存性を促進させることにより(Marrack, P., Kappler, J., and Mitchell, T. 1999. Type I interferons keep activated T cells alive. J Exp Med 189:521-30)、および樹状細胞成熟を刺激することにより(Buelens, C., Bartholome, E. J., Amraoui, Z., Boutriaux, M., Salmon, I., Thielemans, K., Willems, F., and Goldman, M. 2002. Interleukin-3 and interferon beta cooperate to induce differentiation of monocytes into dendritic cells with potent helper T-cell stimulatory properties. Blood 99:993-8)、適応免疫応答を調節する。ウイルス生活環に対するこの大きな効果のため、IFNα2aはC型肝炎の治療に有益な治療薬であることが証明されている。
肝細胞においてIL-29およびIFNα2aにより制御される遺伝子を同定するため、マイクロアレイ実験を肝細胞がん細胞系HepG2にて行った。これらの研究の場合、三つ組のHepG2細胞培養物を陰性対照として培地、50 μg/mlヒトIL-29 (SEQ ID NO:4)または5 μg/mlヒトIFNα2aで1、6または24時間処理した。刺激の後、QIAGENのRNeasy Miniキットを用いて全RNAを抽出し、RNA 6000 Nano Assay (Agilent)を製造元の使用説明書にしたがって用いAgilent 2100 BioanalyzerにてRNAの質と量を評価した。手短に言えば、AffymetrixのGeneChip (登録商標) One-Cycle Target LabelingおよびControl Reagentを用いてビオチン標識cRNAを合成した。各サンプルについて断片化されたcRNAをAffymetrix Human Genome Focus Arrayにハイブリダイズさせ、製造元の使用説明書にしたがって染色した。その後、アレイをAffymetrix GeneChip (登録商標) Scanner 3000にてスキャンし、Affymetrix GeneChip (登録商標) Operating Software (GCOS)データマイニングソフトウェアを用いて未加工のデータを得た。その後、データ解析の目的で未加工のデータをGeneSpring 7.0マイクロアレイ解析プログラム(Silicon Genetics)に読み込んだ。0.01未満の値は0.01の値に変換された。各アレイの強度は、欠落しておらず50またはそれ以上の未加工の値を有する全ての値を用い、全てのアレイについて第50百分位数に正規化された。遺伝子ごとの基準での値は、全てのアレイでの50またはそれ以上の未加工の値を有する値について計算された中央値に正規化された。フィルターされていないデータを用いて散布図を得た。IL-29により制御される遺伝子は、0.05以下の片側分散分析(ANOVA) p-値、600 (バックグラウンドの3倍)またはそれ以上のIL-29処理サンプルでの未加工の強度、および対応する時点で培地処理サンプルに比べて2またはそれ以上の倍変化を有するとして同定された。遺伝子の最も大きな誘導は6時間の時点で観測された。
マイクロアレイの結果を解析することにより、HepG2細胞でのIL-29とIFNα2aの双方による遺伝子制御は一過性であって、6時間で頂点に達し、その後は徐々に落ち込むことが明らかとなった。IL-29処理サンプルのデータをIFNα2a処理サンプルのデータと比較した後に、全ての遺伝子がこの2つのサイトカインにより同じように制御されることが分かり、肝細胞ではIL-29およびIFNα2aが同一の遺伝子サブセットを制御することが示唆された。しかしながら、HepG2細胞でのIFNα2aによる誘導の程度は、IL-29により誘発されたものよりも大きかった。研究デザインに記載されている判定基準により決定された、IL-29によって上方制御されたと同定された全遺伝子のリストが以下、表35に記載されている。これらの遺伝子は、抗ウイルス応答(OAS遺伝子、MX遺伝子およびPRKR、ADAR)、増殖の制御(IFITM1、IFITM3、CEB1)、アポトーシス(TNFSF10)およびシグナル伝達(NMI、STAT1、IRF9)に関与するタンパク質をコードする公知のインターフェロン刺激遺伝子(ISG)でもっぱら構成されることが分かった。これらのデータから、IL-28受容体を発現する肝細胞などの細胞では、タイプ1インターフェロンによって制御されるものと同一の生物学をIL-29が媒介することが示唆される。
マウスIL28プラスミドはマウスにおいて腎細胞がんRENCA腫瘍の増殖を阻害する
A. 要約
IL28/IL29がマウスにおいて腫瘍増殖に効果を及ぼすかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。その後、マウスに流体力学的送達(HDD)により対照ベクタープラスミドまたはmIL28プラスミド(SEQ ID NO:7) 50 μgを5日目および12日目に注射した。腫瘍容積を5週間、3回/週でモニターした。血清中のマウスIL28タンパク質レベルをELISAにより測定した。mIL28プラスミドを注射したマウスは、対照プラスミド注射マウスに比べて有意に小さな腫瘍を示したことから、マウスIL28が抗腫瘍活性を有することが示唆された。
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。5日目および12日目に、マウス群(n=10/群)に流体力学的押圧方法を利用して空のpZP-7プラスミドまたはpZP-7/mIL28のいずれか50 μgを静脈内注射した(生理食塩水1.6 mlに再懸濁されたプラスミドを5〜8秒のうちに尾静脈を介して注射する)。プラスミド注射から24時間後(6日目および13日目)にマウスから採血して、ELISAにより血清mIL28レベルを評価した。腫瘍増殖をキャリパー計測により5週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
mIL28プラスミドの注射は、プラスミド送達から24時間後に50〜200 ng/mlのタンパク質発現を結果的にもたらした。mIL28プラスミドの注射は、RENCAモデルにおいて腫瘍増殖を阻害した。対照プラスミド注射マウスとIL28プラスミド注射マウスとの間の腫瘍容積の違いは、統計的に有意であった(36日目に対照に比べてp=0.0125) (図1)。これらのデータから、IL28が抗腫瘍活性を有し、がんに対する治療用物質の可能性があることが示唆される。
マウスIL28プラスミドおよびヒトIL29 C172S-PEGタンパク質はマウスにおいてRENCA腫瘍の増殖を阻害する
A. 要約
IL28/IL29がマウスにおいて腫瘍増殖に効果を及ぼすかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。その後、マウスに流体力学的送達(HDD)により対照ベクタープラスミド、mIL28プラスミド(SEQ ID NO:7)またはmIFNαプラスミド50 μgを5日目および12日目に注射した。別の担がんマウス群にヒトIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質25 μgを5日目〜21日目まで1日おき(EOD)に腹腔内注射により投与した。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。血清中のマウスIL28およびIFNαタンパク質レベルをELISAにより測定した。mIL28またはmIFNαプラスミドを注射したマウスは、対照プラスミド注射マウスに比べて有意に小さな腫瘍を示したことから、マウスIL28が抗腫瘍活性を有することが示唆された。さらに、IL29 C172S-PEGタンパク質を注射したマウスも対照に比べて腫瘍容積の減少を示した。これらのデータから、IL28およびIL29は双方とも抗腫瘍活性を有することが示唆される。
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。5日目および12日目に、マウス群(n=10/群)に流体力学的押圧方法を利用して空のpZP-7プラスミド、pZP-7/mIL28またはpORF/mIFNaのいずれか50 μgを静脈内注射した(生理食塩水1.6 mlに再懸濁されたプラスミドを5〜8秒のうちに尾静脈を介して注射する)。別のマウス群(n=10)にヒトIL29 C172S-PEG 25 μgを5日目〜21日目までEODに腹腔内注射した。腹腔内注射は全量200 μlで施した。プラスミド注射から24時間後(6日目および13日目)にマウスから採血して、ELISAにより血清mIL28およびmIFNαレベルを評価した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
mIL28またはmIFNαプラスミドの投与は、このRENCAモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した(28日目に対照群に比べて3群全てに対しp<0.001) (図2)。ヒトIL29 C172S-PEGタンパク質の注射も対照に比べて腫瘍増殖を有意に阻害した。これらのデータから、mIL28およびヒトIL29が抗腫瘍活性を有し、がんに対する治療用物質の可能性があることが示唆される。
ヒトIL29タンパク質の異なる2形態の低用量でRENCAモデルにおいて抗腫瘍活性を示す
A. 要約
IL29の抗腫瘍活性が上記よりも低い用量で達成されうるかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。担がんマウス群(n=10/群)にヒトIL29 C172S (SEQ ID NO:29)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)またはヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質1 μg、5 μg、25 μgを5日目〜23日目まで1日おき(EOD)に腹腔内注射により投与した。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。IL29 C172S-PEGタンパク質1、5または25 μgを注射したマウスは、対照に比べて腫瘍容積の減少を示した。さらに、ヒトIL29 C172S d2-7-PEGタンパク質1、5または25 μgを注射したマウスも対照に比べて有意に腫瘍増殖の減少を示した。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質の異なる2形態の低用量でマウスにおいて抗腫瘍活性を有することが示唆される。
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。マウス群(n=10/群)にヒトIL29 C172S-PEGまたはヒトIL29 C172S d2-7-PEG 1 μg、5 μg、または25 μgを5日目〜23日目までEODに腹腔内注射した。腹腔内注射は全量200 μlで施した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
ヒトIL29 C172S-PEGタンパク質1 μg、5 μg、または25 μgの投与は、腫瘍増殖を有意に阻害した。さらに、IL29 C172S d2-7-PEGタンパク質1 μg、5 μgまたは25 μgの注射も媒体処置マウスに比べて腫瘍増殖を阻害した(図3)。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍に対する潜在的な治療用物質であるという証拠が得られる。
ペグ化ヒトIL29を用いた治療的処置はRENCAモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す
A. 要約
IL29を用いた治療的処置が抗腫瘍活性を誘導できるかどうか確認するため、マウス群にRENCA腫瘍を0日目に皮下注射した。100 mm3の腫瘍容積に到達した時点で、マウスに媒体、ヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質5 μgもしくは25 μgを1日おき(EOD)に10回の注射で、またはヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質5 μgを毎日(ED) 20回の注射で投与した。対照として、マウスの1群は腫瘍注射の5日目に始めて20日間(5〜23日目)ヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgでEODに予防的に処置した。各個々のマウスはその腫瘍容積が100 mm3に到達して初めて注射を受けた。タンパク質の注射は全て腹腔内投与によるものであった。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。5 μgもしくは25 μgをEODにまたは5 μgをEDに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示した。前の結果と一致して、IL29 5 μgによる予防的処置を与えたマウスも対照に比べて腫瘍増殖の減少を示した。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質を用いた治療的処置がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することが示唆される。
10週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)にRENCA細胞0.1×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。マウス群(n=10/群)に、およそ100 mm3の腫瘍容積から始めて媒体、ヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgもしくは25 μgを20日間EODにまたはヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgを20日間EDに腹腔内注射した。別のマウス群に、実験の5日目に始めてヒトIL29 C172S d2-7-PEG 5 μgを20日間EODに投与した(予防的処置)。腹腔内注射は全量200 μlで施した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
5 μgもしくは25 μgをEODにまたは5 μgをEDに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示した。前の結果と一致して、IL29 5 μgによる予防的処置を与えたマウスも対照に比べて腫瘍増殖の減少を示した(図4)。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍に対する潜在的な治療用物質であるという証拠が得られる。
ペグ化ヒトIL29を用いた予防的処置はE.G7胸腺腫モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
A. 要約
IL29がその他の腫瘍において抗腫瘍活性を誘導できるかどうか確認するため、マウス群にE.G7腫瘍を0日目に皮下注射した。マウス群に媒体またはヒトIL29 C172S d2-7 (SEQ ID NO:159)-PEG (20 kDのN-末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド)タンパク質25 μgをEODに10回の注射で投与した(1〜18日目)。タンパク質の注射は全て腹腔内投与によるものであった。腫瘍容積を4週間、3回/週でモニターした。25 μgをEODに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示した。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質を用いた処置がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することが示唆される。
10週齢の雌性C57BL/6マウス(Charles River Laboratories)にE.G7細胞0.4×106個を0日目に右脇腹に皮下注射した。マウス群(n=10/群)に、媒体またはヒトIL29 C172S d2-7-PEG 25 μgを20日間EODに腹腔内注射した。腹腔内注射は全量200 μlで施した。腫瘍増殖をキャリパー計測により4週間、3回/週でモニターした。腫瘍容積を式1/2*(B)2*L (mm3)により計算した。
25 μgをEODに注射したマウスは、対照に比べて有意に低い腫瘍増殖を示し、同様に対照動物に比べてマウスの長期生存性を示した(図5Aおよび5B)。これらのデータから、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍に対する潜在的な治療用物質であるという証拠が得られる。
Claims (27)
- ポリペプチドがポリエチレングリコールをさらに含む、請求項1記載の方法。
- ポリエチレングリコールがポリペプチドとアミノ末端に共有結合的に連結される、請求項2記載の方法。
- ポリエチレングリコールが約20 kD、30 kD、または40 kDである、請求項2記載の方法。
- ポリエチレングリコールが直鎖状または分枝状である、請求項2記載の方法。
- ポリエチレングリコールがモノメトキシPEGプロピオンアルデヒドである、請求項2記載の方法。
- 患者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
- 患者がヒトである、請求項7記載の方法。
- 第2のポリペプチドがインターフェロンである、請求項11記載の方法。
- 第2のポリペプチドがインターフェロン-α、インターフェロン-β、またはインターフェロン-γである、請求項12記載の方法。
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